JP5306568B2 - 吸着方法およびリガンド - Google Patents
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Description
本発明は、異常に高いレベルのイオン強度において物質を吸着/結合する新種の陽イオン交換体に関する。これらの陽イオン交換体は、正荷電物質、例えば生物有機物質、を好ましくは水性である液体から除去する新方法を可能にする。
陽イオン交換吸着は、発酵ブロス等の大規模処理において長年の間興味を持たれてきた。この種の液体は典型的に高いイオン強度を有し、それらが従来のイオン交換体に直接応用するのを不適切にする。一つの理由は、従来のイオン交換体は中庸のイオン強度、例えばNaClで0.1もしくはそれ以下、においてのみタンパク質および他の生体高分子を吸着することである。これは、大容量の処理になるプロセス液体の希釈およびプロセス設備での巨額の投資を意味する。
WO 9965607(Amersham Pharmacia Biotech AB)は、直列の陽イオン交換リガンド−A−X−Y(−Z)nがある陽イオン交換体を開示しているが、式中、nは>1の整数であり、Aはスペーサーであり、そしてXは−O−、−SR'−もしくは−N(R')(R'')(R'およびR''はH、遊離電子対およびヘテロ原子に直接取り付けられる炭素を与える或る基である)であり、Yは、それらの幾らかは−O−もしくは−S−であるXと結合しない免責条項を持つ、或るヒドロカルビル基であり、そして最後にZは陽イオン交換基である。WO 9965607に記載された発明は、リガンドの規定された基の中では、従来の陽イオン交換体とは対照的に、対照スルホプロピル陽イオン交換体に比べて200%までの溶出イオン強度を必要とする陽イオン交換リガンドが在るという発見に基づいている。対照陽イオン交換体の200%以上の溶出イオン強度を必要とする極端なリガンドが見出されるかもしれないと推測される。
この発明の目的は、
a)タンパク質のような正荷電化合物の比較的高いイオン強度における陽イオン交換体への吸着/結合;
b)吸着/結合した化合物の高いイオン強度におけるおよび/もしくは広いイオン強度区間内での溶出/脱着;
c)高い漏出点容量、タンパク質の良好な回収率(多くの場合、興味のあるタンパク質の添加量の95%まで)等を有する陽イオン交換体;
d)高いイオン強度の試料を陽イオン交換体上で処理しかつ簡略化脱塩手順を達成すべきときに広範な希釈の必要性を低下すること;
e)支持マトリックスに結合するとき、対照陽イオン交換体を持つ同一の物質に対して得られるのと少なくとも同一程度の大きさであるところの漏出点容量を持つ正荷電物質を吸着する、陽イオン交換体/陽イオン交換リガンドを発見する方法;等
を達成することである。
この比較はこの分野で従来のものと相対的である。
我々は驚くべきことに、上述の目的(c)で表される性質(これらの性質を適切にスクリーニングするとして)の一つもしくはそれ以上を有する陽イオン交換体を与える、数多くの陽イオン交換リガンドが在ることを今や発見している。(実験の部を参照)。
(i)該物質を陽イオン交換により該陽イオン交換リガンドへ結合させることに至る条件下に液体(I)を陽イオン交換体(1)と接触させ、そして
(ii)可能ならば該物質の引き続いた脱着を続ける、
ことを含む。
この方法は、使用する陽イオン交換体(1)は、(a)0.3M NaClに相当するイオン強度において水性対照液体(II)中で陽イオン交換により該物質に結合しそして、
(b)スルホプロピル基−CH2CH2CH2SO3 −を含む対照陽イオン交換体(2)についての物質の漏出点容量の>200%、例えば>300%もしくは>500%もしくは>1000%、で該物質の漏出点容量を容認する能力があることを特徴とする。
使用する陽イオン交換体(1)は複数の陽イオン交換リガンドを典型的に含むが、それらは、しばしば共有結合的にそして典型的には或る種のスペーサーを介して、支持マトリックスに強固に取り付けられる。用語“強固に取り付けられる”は、適用した吸着/脱着の間リガンドはいかなる有意な程度でも取り外れてはならないことを意味する。
かくして、第一の分岐(1)は、スルホネート(−SO3−/−SO3H)、スルフェート(−OSO3 −/−OSO3H)、カルボキシレート(−COO−/−COOH)、ホスフェート(−OPO3 2−/−OPO3H−/−OPO3H2)およびホスホネート(−PO3 2−/−PO3H−/−PO3H2)から選ばれる陽イオン交換基を含む。いわゆる弱陽イオン交換体、即ち3以上のpKaを有する陽イオン交換体、が好適である。典型的な例は、カルボキシレート(−COO−/−COOH)、ホスフェート(−OPO3 2−/−OPO3H−/−OPO3H2)およびホスホネート(−PO3 2−/−PO3H−/−PO3H2)である。この好適性はこの発明の種々な他の態様にもまた適用される。
sp−およびsp2−混成炭素は疎水性相互作用ならびに水素結合に関与してもよい。
(b)Aは、もしA基中に陽イオン交換基(X')が在れば、そのような陽イオン交換基(X')からの鎖は常にA'より短いかもしくは同一の長さを有するという条件で、Xから支持マトリックスへ伸びる有機鎖(A')を含む有機基を表す;
(c)HBは、少なくとも一つの炭素原子プラス陽イオン交換基(X)から1〜7原子の距離に位置する、少なくとも一つの水素結合原子を含む基である。
上で規定した水素結合原子は、次の二つの形態のどちらかでAのA'部分中に存在してもよい:
(a)A'鎖の部分として、もしくは
(b)A'中の原子に結合しかつ鎖から突き出ている原子として。
タイプ(a)の水素結合原子はまた、芳香環中でヘテロ原子(硫黄、窒素もしくは酸素)を含む。ヘテロ芳香環の例示的な例はチオフェン、フランおよびピリジンである。
(i)以下の基中の酸素
(i.1)炭素、硫黄および窒素はA'の部分である、−CO−、−SO−、−SO2−および−SO2NH−;
(i.2)A'の部分である炭素に直接取り付けられている、アルコール性もしくはフェノール性のヒドロキシル;そして
(i.3)A'の部分である炭素に取り付けられている、ニトロ(−NO2)ならびに≡は三つの一重結合を表しそして窒素はA'の部分である、アミンオキシド(≡N→O);
(ii)A'中の炭素に結合している、フルオロ、クロロ、ブロモもしくはヨードのようなハロゲン(フルオロが好適である);そして
(iii)A'中に存在する同種の炭素原子に直接取り付けられている、sp−およびsp2−混成炭素。
sp2−混成炭素(上のiii)は典型的に芳香環の部分である。カルボニル基(−CO−)はケト、エステルもしくはアミド基の部分でもよい。
HBならびに水素結合原子の適切な選択および位置に関しては、A'に対する規則と類似する規則を適用する。
式中、
(a)X''は、スルホネート(−SO3−/−SO3H)、スルフェート(−OSO3 −/−OSO3H)、カルボキシレート(−COO−/−COOH)、ホスフェート(−OPO3 2−/−OPO3H−/−OPO3H2)およびホスホネート(−PO3 2−/−PO3H−/−PO3H2)から選ばれる陽イオン交換基であり、そして
(b)Dは、支持マトリックスにX''を連鎖させる有機鎖D'を含む基であるが、該有機鎖D'は、陽イオン交換基(X'')から1〜7原子(好ましくは1〜5原子)の距離に位置するチオエーテルを含み、そしてD'中の炭素は非−芳香族性である。
分岐したおよび分岐していない陽イオン交換リガンドについて上で議論した水素結合原子は、陽イオン交換基(X、X'、X''等)から7、6、5、4、3、2および1原子の距離に位置してもよい。
A基(およびA'鎖)ならびにD基(およびD'鎖)は、存在すれば、スペーサーを含むであろう。上で議論してきた線で、スペーサーは支持マトリックから出発しそしてXから7、6、5、4、3および2原子のような1〜8原子の距離で終結する(実験の部を参照)。
典型的には、スペーサーは直鎖の、分岐したもしくは環状の二価の炭化水素基を含む。炭素鎖は、プロセスサイクルの間に陽イオン交換体が受ける条件(加水分解条件は典型的に最も有害なものである)に耐えることができる、エーテル酸素もしくは、チオエーテルおよびアミドのような、或る他の基により一つもしくはそれ以上の位置において割り込みされてもよい。加水分解安定性についての要求は、多くの好ましいスペーサーにおいて、一つおよび同一の炭素原子に結合している酸素および硫黄から選ばれる、せいぜい一つの原子があることを意味する。
この発明の陽イオン交換体/陽イオン交換リガンドは陽イオン交換吸収を含むプロセスに典型的に適用される条件に耐えるに違いない。一般的な経験則として、これは、この発明に従う陽イオン交換体は、全体のイオン結合能力に本質的に減少無しでもって、少なくとも10時間水中の0.1もしくは1MのNaOHに耐えることができるに違いない。“全体のイオン結合能力に本質的に減少無し”は、全体のイオン結合能力はせいぜい10%しか減少しないことを意図している。構造的用語では、これは、上で規定した陽イオン交換基に加えて陽イオン交換リガンドは単に、純正のヒドロカルビル(ホモ芳香族またはヘテロ芳香族構造を含む)、チオエーテルおよびエーテル基、ジスルフィド基、ヒドロキシ基、スルホキシドもしくはスルホン基、カルボキサミド基、スルホンアミド基、アセタールおよびケタール基ならびに同様な加水分解安定性を持つ基を含むべきであることを意味する。
支持マトリックスは有機もしくは無機の材料をベースにしてもよい。親水性であることおよび水に不溶性で多少は膨潤性であるポリマーの形態にあることが望ましい。親水性になるように誘導体化されている疎水性のポリマーはこの規定に含まれる。適切なポリマーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン等のような多糖をベースにするポリヒドロキシポリマー、ならびにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)、ポリビニルアルコールおよびスチレンとジビニルベンゼンをベースにするポリマー、ならびに上述のポリマーに相当する二つ以上の単量体が含まれるコポリマー、である。水溶性のポリマーは、例えば、架橋によりおよび吸着もしくは共有結合による不溶性体へのカップリングにより、不溶性になるように誘導体化されてもよい。OHへ変換し得る基を示す単量体の重合により、もしくは、例えば、親水性ポリマーのような適切な化合物の吸着による最終ポリマーの親水性化によって、親水性基を疎水性ポリマー上に(例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンのコポリマー上に)導入することができる。
支持マトリックスに使用される適切な無機材料は、シリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタル等である。
支持マトリックスは多孔性でも非−多孔性でもよい。これは、マトリックスは完全にもしくは部分的に浸透性(多孔性)であるかもしくは除去すべき物質に対して完全に非浸透性(非−多孔性)であってもよいことを意味する。
マトリックスの内部おおび/もしくは外部の表面上の親水性被膜は概念上支持マトリックスに属する。この被膜は、例えばWO 9833572(Amersham Pharmacia Biotech AB)に記載されているような、形状増量剤中にあってもよい。
先行する節に示した範囲は、ナトリウムイオンに結合する完全荷電型のマトリックスのついての容量をいう。
吸着おおび/もしくは脱着プロセスを、バッチ操作として、即ち、マトリックスを液体中に多少とも完全に分散した微粒子体をもって、実施してもよい。これに代えて、陽イオン交換マトリックスを一体式体でまたは充てんもしくは流動床の形態の粒子として用いそして液体Iもしくは脱着液(液体III)をプラグ流れ条件下で通過させる、クロマトグラフ操作としてプロセスを操作してもよい。
吸着の間に、正荷電物質を含む液体試料を、陽イオン交換(陽イオン交換条件)媒介リガンドにこの物質を結合させるような条件下で陽イオン交換体(上で規定した)と接触させる。この物質が、少なくとも部分的に、正に荷電し、そして少なくとも一部の陽イオン交換体が負に荷電するように(上を参照)、pHを選択する。好ましい変形において、弱陽イオン交換体(例えば、X=−COO−)を、pKa±2、例えば±1、pH単位に緩衝化した液体のpHで使用する。陽イオン交換体のpH値は、この陽イオン交換体をNaOHで滴定するときに変曲点として求められる。典型的に、イオン強度(塩濃度もしくは伝導度として測定する)は、陽イオン交換体、結合すべき物質、温度とpH、溶媒組成等の特別な組合わせについての溶出イオン強度以下である。この発明の恩恵の一つは、上に規定した二項性の陰イオン交換体を用いることにより、従来の陽イオン交換体、例えば、上で議論した対照スルホプロピル陽イオン交換体、について通例行ってきたものと比較してより高いイオン強度においてもまた吸着/結合を操作することが可能であるだろうということである。陽イオン交換体を除去すべき物質とマッチングさせることにより、対照陽イオン交換体を用いるときより高い(同一のpHおよびさもなければ同一の条件で測定した)イオン強度において、吸着を実施し得る。陽イオン交換体の漏出点容量次第で、対照陽イオン交換体で得られる陽イオン交換体の漏出点容量の>200%、例えば、>300%もしくは>500%および>1000%さえ、を達成し得る。
この分野で確立した手順にしたがって脱着を行ってもよい。好ましくは、この脱着プロセスは以下の条件の少なくとも一つを含む:
(A)脱着に必要とされる最少溶出イオン強度より上に塩濃度(イオン強度)を増加すること、
(B)リガンドの負電荷を下げるためにpHを減少すること、
(C)物質上の正電荷を減少させるためにpHを増加すること、および
(D)使用する水性液体の極性を減少する、リガンド類似体もしくは試剤(例えば溶媒添加物)を含むこと。
これらの変更は物質を含む水性液体(上の水性液体I)に相対的である。
(a)脱着に用いる液体(III)は、脱着すべき物質の少なくとも一部分は正に荷電するような条件(例えばpH)を提供すること、および
(b)イオン強度を、これらの条件について最少の溶出イオン強度の上の値にセットすること。
両性の化合物については、オプション(a)はpH>pI、例えばpH>pI+0.5を意味する。
大抵の場合には、WO 9600735およびWO 9609119(Burton等)に記載されているように、陽イオン交換リガンドが完全に脱電荷されるか、もしくは興味のある物質が正味の負電荷を有するようにpHを変更することは不可能でありそして必要ではない。
(a)イオン強度の増加おおび/もしくは
(b)吸着液体(I)から脱着液体(III)へ変更するときに、脱着すべき化合物の正電荷を減少するためにpHの減少
を意味する。選択肢(a)には、脱着ステップの間の減少した、一定のもしくは増加したpHが挙げられる。選択肢(b)には、減少した、増加したもしくは一定のイオン強度が挙げられる。
上で議論した条件の変更を、一つもしくはそれ以上のステップで(段階的勾配)もしくは連続的に(連続的勾配)達成することができる。マトリックスと接触する液体の種々の変数を一つずつもしくは組合せて変更してもよい。
脱着はまた、脱着液体(III)中に陽イオン交換リガンドの可溶性構造類似体(リガンド類似体)を含むことにより助成され得る。そのような類似体の必要な濃度は吸着液体(I)のその濃度より少なくとも大きい。
従属態様において、本発明方法は、吸着物質の高回収率、例えば、80%以上もしくは90%以上のような、60%以上の回収率を可能にする。回収率は、吸着/結合ステップにおいて陽イオン交換体に加えた物質の量に比較して脱着された物質の量である。多くの場合には、回収率は95%さえを越すかもしくは本質的に定量的であることができる。これは、陽イオン交換体に加えるべき物質の量を物質にたいする陽イオン交換体の全結合容量以下に調整することにより達成される。典型的には、陽イオン交換体に加える物質の量は、全容量の10〜80%、例えば20〜60%、の間隔にある。脱着は、この分野で確立された手順にしたがって、例えば上で略述したように、行われる。多くの場合には、イオン強度の増加より他の手段により、例えば、物質の正電荷を減少させるかもしくは陽イオン交換リガンドの負電荷を減少させるためのpHの変更により、脱着を助ける必要がある。
この態様は、支持マトリックスに取り付けられる複数の陽イオン交換リガンドを含む陽イオン交換体(1)を含む。このリガンドは、スルホネート(−SO3−/−SO3H)、スルフェート(−OSO3 −/−OSO3H)、カルボキシレート(−COO−/−COOH)、ホスフェート(−OPO3 2−/−OPO3H−/−OPO3H2)およびホスホネート(−PO3 2−/−PO3H−/−PO3H2)の中から選ばれた陽イオン交換基を含む。特色は、陽イオン交換体(1)が少なくとも一つの対照タンパク質の人血清アルブミン、リゾチームおよびIgGに対する漏出点容量を有することであるが、これは、スルホプロピル陽イオン交換体(陽イオン交換体2)について得られる相当する漏出点容量の>200%、例えば>300%もしくは>500%もしくは>1000%、である。同一の支持マトリックス、置換度、対イオン等は、上で議論したのと同一の意味で本質的に同一である。陽イオン交換体(1)および陽イオン交換体(2)の漏出点容量を決定する操作条件は、この本文のどこかで議論したのと本質的に同一である。
この態様において除外するのは、陽イオン交換基のそれぞれがただ一つの位置においてチオエーテル硫黄により割り込みされている非−置換直鎖の炭素原子を介して支持マトリックスに結合する、陽イオン交換体である。
この態様は、それぞれが二項性である、複数の分岐した陽イオン交換リガンドを含むことを特徴とする新規の陰イオン交換体に関する。かくして、このタイプのそれぞれの個別なリガンドは、上で議論したような二種類の分岐を(一つの分岐は陽イオン交換基を含みそしてもう一つの分岐は陽イオン交換基から1〜7原子もしくはそれより短く離れて水素結合原子を含む)を含む。
この態様は、第二および第三の態様の陽イオン交換体を、該物質を溶解した形態で含む水性液体(1)から正荷電物質を除去する方法に使用することを含む。この方法は、
(i)物質をリガンドに結合させる陽イオン交換条件下に液体(1)を陽イオン交換体(1)に接触させること、および
(ii)可能ならば、該物質の引き続く脱着に続けること
を含む。
種々の構造的特徴/変数および操作条件は第一の態様の方法に対するものと同一である。
この態様は、一つもしくはそれ以上の陽イオン交換体が液体から物質を除去することについての適切性をテストする(スクリーニングする)方法であり、該方法は:
(a)(i)それぞれの陽イオン交換体がリガンドの種類(リガンド1,2,3,4、......n;n=>0の整数)に関して異なる、テストすべき一つもしくはそれ以上の陽イオン交換体(交換体1,2,3,4、......n)、および(ii)交換体1,2,3,4、....nおよび対照陽イオン交換体において本質的に同一である、対照リガンド、支持マトリックス、置換度、対イオン等を有する対照陽イオン交換体を含むライブラリーを提供し;
(b)予め決めた条件において物質についての交換体1の漏出点容量を決定し;
(c)ステップ(b)におけると同一の条件において物質についての対照陽イオン交換体の漏出点容量を決定し;
(d)ステップ(b)および(c)で得た漏出点容量の間の関係から、陽イオン交換体1は物質を除去するために使用するのに適切かどうかを結論し;そして
(e)必要ならば、少なくとも一つの交換体2,3,4、...nについてステップ(b)、(d)および(e)を繰り返す
ステップを含む。
二つ以上の陽イオン交換体1〜nをこの方法において並行してもしくは連続してテストしてもよい。
対照陽イオン交換体はこの発明の第一から第四の態様のいずれか一つにおいて規定されている、リガンドを有してもよい。
このスクリーニング方法により見出された陽イオンリガンドは、上述の方法態様のいずれにおいてもこの発明の様式で用いることができる。
本発明は、上に規定して使用した二項性の陽イオンリガンドと相互作用ができる、幾らかな構造ユニットを持つ大分子量物質を主に対象としている。適切な化合物は、500ダルトン以上、例えば1000ダルトン以上、の分子量を典型的に有する。典型的な化合物は生体有機的および/もしくはポリマー的である。物質分子当たりの正荷電基の数は典型的には一つもしくはそれ以上である。物質の電荷は、最も良く適合した場合(即ち、物質は両性である)におけるpHに依存する。正荷電生体有機物質の中で、ポリペプチド構造、脂質構造および/もしくは炭水化物構造を有するものは、この発明の方法態様に従って液体から除去することが通常可能である。原理的に、この発明は、上記の構造的要求を満たす限り、他の生体有機および有機物質にもまた応用可能である。
この発明は付属する特許請求の範囲でさらに規定される。
(実験の部)
1.陽イオン交換体の合成
リガンド−形成化合物を表面へ固定化する多種類の方法があるが[Hermanson, G. T., Mallia, A. K. & Smith, P. K., (Eds.)、固定化アフィニティリガンド技法、Academic Press, INC, 1992]、これらの多くは我々の目的に応用可能である。以下において、我々は、実施例として役に立つように我々が新系列の弱陽イオン交換体(カルボン酸をベースとした)を作製するために採用している方法を説明する。ベースマトリックスとして、我々はSepharose 6 Fast Flow (AmershamPharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を使用しているが、以後これをSepharose6 FFという。
これは、WO 97/29825(Amersham Pharmacia Biotech AB)に本質的に記載されているように、アルカリ性の条件下でアリルグリシジルエーテルをSepharose 6 FFと反応させることにより実施される。適切な反応容器中で、Sepharose 6 FF 80gをNaBH40.5g,Na2SO413gおよび50%(w/w)NaOH水溶液40mLと混合した。この混合液を50℃で1時間攪拌し、そしてアリルグリシジルエーテル100mLを加えた。懸濁液を50℃でさらに18時間攪拌した。混合液をろ過し、そしてゲルを蒸留水500mL、エタノール500mL、蒸留水200mL、0.2M酢酸200mLおよび最後に蒸留水500mLで順次洗浄した。滴定による分析の結果、置換度はゲル1mL当りアリル基0.3mmolであった。以下においてこのアリル−置換Sepharose 6 FFを生成物Iという。
これは、カルボキシル基を含む反応性の求核試薬(例えばメルカプトプロピオン酸)を生成物Iにカップリングすることにより達成されることができる。また、アルカリ性条件下におけるSepharose 6 FFのクロロ酢酸との従来のカルボキシメチル化により達成することもできる。得られた生成物は、そのような陽イオン交換体として使用するか、もしくはアミド連鎖を介して他の陽イオン交換体を合成するための中間体として役立てることができる。下記の手順はメルカプトプロピオン酸を生成物I(アリル−誘導体化Sepharose 6 FF)にカップリングするための実施例を提供する。
典型的な手順において、生成物100mL、酢酸ナトリウム4gおよび蒸留水100mLの攪拌した懸濁液に、消えない黄色が得られるまで,臭素水を加えた。淡い黄色が消えるまで、懸濁液にギ酸ナトリウムを加えることにより過剰の臭素の還元を達成した。反応混合液をろ過し、そしてアリル−誘導体化ゲルを蒸留水500mLで洗浄した。
活性化したゲル(生成物I)に続けてメルカプトプロピオン酸17.5mL(アリル基当り6当量)および4M NaCl50mLの混合液を反応容器へ移した。この混合液のpHを、活性化ゲルに加える前に、50%(w/w)NaOH水溶液でpH11.5に調節した。懸濁液を50℃で18時間攪拌してからろ過した。ゲルを蒸留水500mLで洗浄し、そしてカルボキシル基の含量を滴定により測定した。ゲル1mL当りCOOH基約0.29mmolの置換度を得た。この生成物は生成物IIという。
これは、リガンド−形成化合物(アミノおよびカルボキシル機能の両者を含む)を固体支持体へアミド結合を介してカップリングさせるための代わりの方法を提供する。この手順は2つのステップを伴い、下記に記述する。
メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF(生成物II)100mLを1M NaCl300mL、0.1M HC1500mL、50%アセトン水溶液500mLおよびアセトン500mLで順次洗浄した。ゲルを沈ませ、そして上澄み液をサイホンで除いた。それから、このゲルに続けて、アセトン80mL中ドロキシスクシンイミド15.2gの溶液およびアセトン80mL中ジシクロヘキシルカルボジイミド29.9gのもう一つの溶液を反応容器へ定量的に移した。スラリーを30℃で18時間攪拌した。混合液をろ過し、そしてゲルを10部のイソプロパノール150mLで8時間の期間に洗浄した(重力流により)。
生成物IIの活性化の程度は、NH4OHとの反応で評価するとき、約75%であった。ここで得た生成物(即ちNHS−活性化メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF)を生成物IIIという。
ここに略述する手順はアミド連鎖を介してリガンド−形成化合物をカップリングする一般方法の実施例を提供する。チエニルセリン(蒸留水80mL中2g)の溶液を1M NaHCO38mLおよびエタノール10mLと混合し、そしてこのpHを50%NaOH水溶液の注意深い添加によりpH0.5に調節した。生成物III(NHS−活性化メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF)25mLをガラスろ過漏斗上で氷冷した1mM HCl水溶液50mLで素早く洗浄した。それから、このゲルをエルレンマイヤーフラスコに移し、そしてこれにチエニルセリンの溶液を加えた。それから、反応混合液を中庸の速度で18時間室温で振り混ぜた。
この検討において、3つの精製タンパク質[塩基性(リゾチーム=Lys)、中性から弱塩基性(IgG)および酸性(BSA)を代表する]を使用して、新系列の“高塩”陽イオン交換体を2つの重要なパラメター、即ち、それらに加えるタンパク質の漏出点容量(Qb10%)および回収率に関して特性化した。リゾチームの結合および溶出を正常な操作手順下に、即ち、吸着を中性pHにおいてそして溶出を同一のpHにおいて高塩(例えば2M NaCl)を含む緩衝液で、行った。IgGはpH4.5で結合させ、そして比較的低い塩濃度(0.1M)を含むpHの緩衝液で溶出した。IgGは、相当多量を種々の媒体に吸着させ得るので、低pHで結合させた。BSAは、それが正電荷を持つ(BSAのpI=4.9)pH4.0で結合させ、そして,IgGの場合と同様に、pHを7.0に上げて溶出させた。BSAをpH4.0においてBSAを結合するために用いる手順は“逆操作手順”と考えられることができて、そして負の電荷を持つ色素および他の不純物を組換え型たんぱく質、例えば、酵母中で生成するHSA、の除去のために広く採用されている(例えば、EP 0 570 916 A2およびEP 0 699 687 A2)。そのような低分子量の不純物は、さもなければ、それらはHSAと丁度同様に負の電荷を持つので、生理的pH下でHSAから分離するのは困難である。新系列の“高塩”リガンドについての漏出点容量、およびそれらに結合したタンパク質の回収率、を測定するために用いた手順を下に略述する。
陽イオン交換リガンドを“高塩”リガンドとして指定するための主な規準の一つは、同一の条件下で操作する対照陽イオン交換体に比べて、比較的高い濃度の塩(例えば0.3M NaCl)の存在下でタンパク質に対するその結合容量である。これは、下記のように、前端分析の方法を用いて測定される。
I.緩衝溶液
緩衝溶液1:20mMリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、pH6.8
緩衝溶液2:20mM酢酸ナトリウム、0.25M NaCl、pH4.0
緩衝溶液3:20mM酢酸ナトリウム、0.25M NaCl、pH4.5
緩衝溶液4:20mMリン酸ナトリウム、2M NaCl、pH6.8(リゾチームの溶出用)
緩衝溶液5:100mMリン酸ナトリウム、pH7.0(BSAおよびIgGの溶出用)
1.リゾチーム:緩衝液1中で4mg/mL
2.BSA:緩衝液2中で4mg/mL
3.IgG:緩衝液3中で4mg/mL
全ての緩衝液およびタンパク質溶液を使用前に0.45μmのMillipore Millex HAフィルターを通してろ過した。
全ての実験を、Unicorn 3.1ソフトウェア−を装備したAekta Explorer 100クロマトグラフィーシステムを用いて室温で実施した。試料を150mLのスーパーループを経由してカラムに加えた。1mL/分(約300cm/時間)の流速をずっと用いた。10mmのフローセルを用いる280nmでの吸光度測定により、溶出液を連続的にモニターした。
それぞれの試作陽イオン交換体をHR5/5カラム中に充てんし(充てん床容量=1mL)、そして適切なpHおよび塩濃度の緩衝液で平衡化した。適切なタンパク質溶液を非−結合条件下でカラムに加えることにより、システムのボイド容量を測定した。溶出液のA280が加えたタンパク質のA280の10%に達するまでの時間をシステムのボイド容量(分で表す)とする。
吸光度極大の10%レベルにおける漏出点容量(Qb10%)を以下の関係式を用いて計算した:
Qb10%=(TR10%−TRD)×C/Vc
式中: TR10%=吸光度極大の10%における保持時間(分)、
TRD=システムのボイド容量(分)、
C=供給タンパク質の濃度(4mg/mL)および、
Vc=カラムの充てん床の体積(mL)。
“高塩”陽イオン交換リガンドはまた、それらに結合したタンパク質の回収率に関してスクリーニングされる。これは、比較的高い吸着容量を、加えたタンパク質の高いか定量的な回収率と結びつける、正しい種類のリガンドを選択するための追加的でかつ重要な規準である。下に略述するように回収率を測定した。
使用した、カラムの種類、充てん床体積、緩衝液、タンパク質溶液、流速および装置のタイプに関する詳細を2A:iおよび2A:ii項で略述する。リゾチームについては、カラムを緩衝液1で平衡化し、そして結合したタンパク質を緩衝液4で溶出した。BSAについては、カラムを緩衝液2で平衡化し、そして結合したタンパク質を緩衝液5で溶出した;IgGについては、カラムを緩衝液3で平衡化し、そして結合したタンパク質を緩衝液5で溶出した。
それぞれのタンパク質についての標準溶液を、カラム平衡化緩衝液中で0〜10mg/mLの濃度範囲をカバーして作製した。一連の希釈度のA280(BSAおよびIgG)もしくはA254(リゾチーム)を測定し、そしてx−軸にタンパク質濃度(mg/mL)をy−軸に吸光度を取って、検量線を作製した。それぞれの検量線についての一次方程式および回帰係数を計算した。これらの標準曲線に基づいて、溶出試料中のタンパク質の濃度(mg/mL)を該試料のA280もしくはA254を測定し下記の関係式を用いて計算した。
CS=A/ε・b
式中: CS=溶出試料中のタンパク質の濃度(mg/mL)
A=吸光度(A280もしくはA254nmにおいて)
ε=特定の波長における分子吸光係数(M−1cm−1)
b=セル経路長(cm)
回収率、%=CS・VS/CL・VL
式中:
VS=溶出したタンパク質試料の容積(mL)
CL=加えた試料の濃度(mg/mL)
VL=加えた試料の容積(mL)
高塩条件における漏出点容量
一連の代表的な“高塩”陽イオン交換リガンドについての漏出点容量および回収率に対して得られた結果を表1に要約する。表1に示す実施例は、種々のリガンドの幾らかな特異的性質を例示するもので、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。過半数のこれらの新陽イオン交換体についてのリガンド置換度は充てんゲル1mL当り約0.18〜0.20mmolであった。少数のものが充てんゲル1mL当り0.27mmolと高い値を示した。対照陽イオン交換体として、市販のスルホプロピル(もしくはS)Sepharose 6 FFを用いたが、そのリガンド濃度は新系列の陽イオン交換体と同一の範囲(即ち、充てんゲル1mL当り約0.18〜0.20mmol)にある。
1.少数の例外を除いて、新陽イオン交換体は、対照陽イオン交換体SSepharose 6 FFに比較して、全ての3つのタンパク質に対してはるかに高いQb10%を有する。
2.リガンド1はLysに対して最高のQb10%を示した(60mg/mL);リガンド10はHSAに対して57mg/mLの最高値を示し、そしてリガンド12はIgGに対して33mg/mLの最高値を示した。これらの値は、対照陽イオン交換体(SSepharose 6 FF)に比して上の3つのリガンドについて、Lys,HSAおよびIgGに対して、それぞれ1295%、2092%および4025%の増加に相当する。
3.下に呈示する18のリガンドのうち、始めの5つは、他のものに比較して全て3つのタンパク質に対して相当高いQb10%を示した。これは、これらのリガンドは将来の“高塩”リガンドの構成のための基盤を形成することができることを示す。
4.幾らかのリガンドはIgGに対して比較的低いQb10%を示すが、他の2つのタンパク質に対しては高いQb10%値を示す(即ち、リガンド7、8および9)。
5.リガンド11はLysに対して高いQb10%値を有するが、他の2つのタンパク質に対しては非常に低い値を有する。逆はリガンド12、14および14について真である。かくして、これらの結果は、将来において“特異的”タイプの“高塩”陽イオン交換体の構成のためのガイドラインとして役立つことができる。
6.リガンド15,16,17および18は、LysもしくはIgGに対するより,HSAに対してはるかに高いQb10%を有する。この結果は、これらのリガンドはIgG製剤からHSAを除去するために有用であり得ることを示唆する。
HSAに対する回収率のデータは完全であるが、一方Lysに対するものはリガンドの約60%について測定されている。IgGに対するデータは少数の有望なリガンドについてのみ測定されている。得られた結果は以下のことを示す。
1.全てのリガンドは、一緒にして、用いたタンパク質に関係なく、65%より良い収率を与えた。
2.リガンド2は、Lys,BSAおよびIgGに対して、それぞれ100%、93%および79%の回収率をもたらした点で最も適切なリガンドであると見出され。
3.この結果はまた、pHもしくは塩との段階的溶出は高収率をもたらすことを示している。
陽イオン交換体を、
(a)リガンド−形成化合物1〜14,16および18を生成物IIのNHS−活性化体と反応させる、もしくは
(b)リガンド−形成化合物15および17を生成物Iの臭素−活性化体と反応させる
ことにより創成した。
変形(a)は、リガンド−形成化合物がアミド基を介してマトリックスに連鎖したことを意味する。変形(b)はチオエーテルを介する連鎖を意味する。
対照陽イオン交換体:SSepharose 6 FF(スルホプロピルSepharose 6 FF):Qb10%:Lys=4.3mg/mL,BSA=2.6mg/mL、IgG=0.8mg/mL。
原子における上付き文字としてのM、Z、HBおよびHB'は、この基がこの原子に結合していることを示す。
Claims (8)
- 水性液体(I)に含まれる正荷電物質が陽イオン交換体(1)と結合する条件下で上記水性液体を陽イオン交換体(1)と接触させ、適宜上記物質の脱着を行うことによって、上記水性液体から上記正荷電物質を除去する方法であって、上記物質がポリペプチド構造であり、上記陽イオン交換体が、
(i)0.3M NaClに相当するイオン強度の水性対照液(II)中で陽イオン交換体に上記物質が結合するとともに、
(ii)上記物質に対する漏出点容量が、スルホプロピル基−CH2CH2CH2SO2O-を含む対照陽イオン交換体(2)での上記物質の漏出点容量の >200%となる
能力をもつように選択されており、かつ
上記陽イオン交換体が、支持マトリックスに強固に結合した複数の陽イオン交換リガンドを含んでいて、該陽イオン交換リガンドが分岐していてバイモーダル機能を有しており、
・第一の分岐(I)が、スルホネート(−SO3−/−SO3H)、スルフェート(−OSO3 -/−OSO3H)、カルボキシレート(−COO-/−COOH)、ホスフェート(−OPO3 2-/−OPO3H-/−OPO3H2)及びホスホネート(−PO3 2-/−PO3H-/−PO3H2)から選択される陽イオン交換基を含んでおり、
・第二の分岐(II)が、第一の分岐の陽イオン交換基から1〜7原子の距離に位置する1以上の水素結合原子を含む官能基を含んでいて、該水素結合原子が、ヘテロ原子、sp−及びsp2−混成炭素、並びにハロゲンから選択されることを特徴とする方法。
- 前記水性液体(I)が、0.1M NaClの溶液で与えられるイオン強度以上のイオン強度を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 請求項1又は請求項2記載の方法であって、前記陽イオン交換体を、以下の条件(a)及び(b)の少なくともいずれかを満足する水性液体(III)と接触させることによって、前記物質を陽イオン交換体(1)から脱着させることを特徴とする方法。
(a)結合時の液体(I)よりも増大したイオン強度を有する水性液体、及び/又は
(b)前記物質の正電荷を減少させる及び/又は前記陽イオン交換体の負電荷を減少させる変更pHを有する水性液体。
- 前記水素結合原子が、酸素、窒素及び硫黄、sp−及びsp2−混成炭素、並びにフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードから選択される請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 前記脱着が、ステップ(i)に関して、(a)前記物質の正電荷を減少させる、又は(b)負荷電基の数を減少させる、又は(c)陽イオン交換体の負電荷を減少させる、pHで実施することを特徴とする請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 脱着ステップの際の水性溶液のイオン強度を結合ステップよりも低下させて前記物質の脱塩及び濃縮を行うことを特徴とする請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 前記水性液体(I)が、希釈又は未希釈の発酵ブロスであることを特徴とする請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。
- ポリペプチド構造を有する正荷電物質を含む水性溶液(I)と接触させることによって上記正荷電物質を水性溶液(I)から除去するための、支持マトリックスに強固に結合した複数の陽イオン交換リガンドを含む陽イオン交換体であって、該陽イオン交換リガンドが分岐していてバイモーダル機能を有しており、
・第一の分岐が、スルホネート(−SO3−/−SO3H)、スルフェート(−OSO3 -/−OSO3H)、カルボキシレート(−COO-/−COOH)、ホスフェート(−OPO3 2-/−OPO3H-/−OPO3H2)及びホスホネート(−PO3 2-/−PO3H-/−PO3H2)から選択される陽イオン交換基を含んでおり、
・第二の分岐が、第一の分岐の陽イオン交換基から1〜7原子の距離に1以上の水素結合原子を含む基からなり、該水素結合原子が、ヘテロ原子、sp−及びsp2−混成炭素、並びにハロゲンから選択される
ことを特徴とする陽イオン交換体。
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