JP2004516928A5 - - Google Patents

Description

【書類名】 明細書
【発明の名称】 混合モード吸着法及び混合モード吸着剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】 イオン交換によって水性液体から物質を除去する方法であって、当該方法が、
上記物質が荷電状態で存在する液体を準備する工程と、
２種以上の構造の異なるリガンドを含む吸着マトリックスであって、少なくとも１つの弱イオン交換体又は少なくとも１つの強イオン交換体を含む吸着マトリックスを準備する工程と、
上記物質を上記マトリックスへ吸着させるのに十分な期間上記液体を上記マトリックスと接触させる工程と、
上記物質を上記マトリックスから脱着させる溶出剤を加える工程と
を含んでおり、各々のリガンドが吸着工程の際に上記物質と相互作用し、かつ上記リガンドの少なくとも１つが荷電されていて上記物質とイオン相互作用することができるものである、方法。
【請求項２】 １つの荷電リガンドが陰イオン交換体であり、除去される前記物質が最初は負に荷電されていて、吸着条件が、その負に荷電した物質のｐＩよりも高いｐＨ及びリガンドの正荷電基のｐＫａよりも低いｐＨによって規定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】 前記物質についての吸着容量が、すべての荷電基が第四級アンモニウム基（ｑ−基）である対応する対照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の１００％以上である、請求項２記載の方法。
【請求項４】 前記脱着が、イオン強度の増加する勾配をもつ溶出剤を加えることによって実施される、請求項２又は請求項３記載の方法。
【請求項５】 １つの荷電リガンドが陽イオン交換体であり、除去される前記物質が最初は正に荷電されていて、吸着条件が、その正に荷電した物質のｐＩよりも低いｐＨ及びリガンドに対応する負に荷電した酸のｐＫａよりも高いｐＨによって規定される、請求項１記載の方法。
【請求項６】 前記物質についての吸着容量が、すべての荷電基がスルホプロピル基である対応する対照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の１００％以上である、請求項５記載の方法。
【請求項７】 前記脱着が、イオン強度の増加する溶出剤を加えることによって実施される、請求項５又は請求項６記載の方法。
【請求項８】 前記吸着が０．１０ＭのＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一又は高いイオン強度で実施される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】 前記リガンドが、０．２５ＭのＮａＣｌに相当するイオン強度の水性対照液中で前記物質を結合することができる、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】 １以上のリガンドが、疎水性及び／又は電子供与体−受容体相互作用によって前記物質と相互作用する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】 前記リガンドが荷電可能であって、前記マトリックスからの前記物質の脱着がｐＨスイッチによって実施される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】 前記溶出剤の極性は、前記物質が除去される水性液体の極性よりも低い、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】 １以上のリガンドが、
（ｃ）前記物質との電荷−電荷引力相互作用を与える第一のモードの部位と、
（ｄ）前記物質との電荷−電荷引力相互作用及び／又は疎水性相互作用及び／又は電子供与体−受容体相互作用を与える第二のモードの部位と
を含む混合モードリガンドである、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】 請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法であって、当該方法が、液体から生体高分子構造を除去するためのものであり、該構造が炭水化物構造、ペプチド構造、ペプチド核酸（ＰＮＡ）構造及び核酸構造からなる群から選択される、方法。
【請求項１５】 ｐＨ依存性の電荷をもつ生体高分子を除去するための、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】 両性物質を除去するための、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】 請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法での使用に適した吸着剤であって、分離すべき物質との電子供与体−受容体相互作用に関与する１以上の官能基を含む第一及び第二のリガンドを含んでおり、該官能基が、
（ｉ）以下のような供与体原子／基：
自由電子対を有する酸素、
自由電子対を有する硫黄、
自由電子対を有する窒素、
ハロゲン、及び
ｓｐ−及びｓｐ^２−混成炭素、又は
（ｉｉ）受容体原子／基、即ち、電子不足原子又は基
からなる群から選択される、吸着剤。
【請求項１８】 任意の対の組について置換度の比が０．０２〜５０内である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】 第一及び第二のリガンドが、支持マトリックスの少なくとも一部に、互いにランダムに存在するように導入されている、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、水性液体（Ｉ）中に存在する荷電物質を除去する方法に関する。この方法は、
（ｉ）液体をイオン交換吸着剤（１）と、吸着剤と物質とが結合する条件下で接触させる工程、及び
（ｉｉ）液体（ＩＩ）を使用して吸着剤から上記脱着させる工程
を含む。
【０００２】
本発明は、新規で革新的な方法に使用できる新規イオン交換吸着剤にも関する。
本発明の吸着剤は、同じベースマトリックス上に結合した２種以上の異なるリガンドを含む。リガンドは官能基及び／又は構造元素に関して異なる。「混合モードリガンド」及び「バイモーダルリガンド」という用語は、結合すべき物質と相互作用する２以上の異なる部位を与えることのできるリガンドをいう。これらの部位は官能基及び／種類に関して異なる。
【０００３】
荷電物質は典型的には生体有機物質及び／又は両性物質である。物質中の荷電基の数に関しては、２以上の荷電基（例えば、１又は２以上の正荷電基及び／又は１又は２以上の負荷電基）が存在していると、最大の利点が得られる。物質の分子量に関しては、分子量が１，０００ダルトン以上（例えば、５，０００ダルトン以上又は１０，０００ダルトン以上）であれば、最大の利点が得られる。
【０００４】
【背景技術】
上記で規定した方法としては、一体構造又は粒子状の吸着剤を充填床又は流動床の形態で使用するクロマトグラフィー法、並びに通例粒子状吸着剤のみを含む回分法が挙げられる。一体構造の吸着剤としては、多孔質膜、多孔質プラグ及び管壁その他の形態の一体型マトリックスが挙げられる。これらの方法の目的は、荷電物質の精製であることがあり、そうした場合、物質は工程（ｉ）で吸着剤に結合され、必要に応じて、吸着剤から脱着した後でさらに精製される。もう一つの目的は、液体（Ｉ）から望ましくない成分である物質を除去することである。この場合、液体を工程（ｉ）の後でさらに処理してもよい。いずれの場合も、所望に応じて、結合した物質を脱着した後で吸着剤を再使用してもよい。
【０００５】
他の用途は、荷電物質又は液体（Ｉ）中の残留物質のいずれかの測定を行うアッセイ法である。
【０００６】
２種以上のリガンドで官能化された吸着剤について記載した刊行物は数多く存在する。
・ＷＯ９６００７３５、ＷＯ９６０９１１６及びＵＳ５，６５２，３４８（Ｂｕｒｔｏｎ等）には、疎水性相互作用に基づく分離法及び媒体が開示されている。一実施形態では、媒体はイオン化性及び非イオン化性のリガンドの両方を含有してもよい。主な思想は、ローディング（添加）を疎水性相互作用を促進する条件下で行い（中性炭化水素リガンド）、吸着したタンパク質とは反対の電荷でリガンドを荷電させるためのｐＨスイッチ（反発）によって脱着を行うことである。そこで、ＷＯ００／６９８７２では、マトリックス上の２種類のリガンドを利用して、その一方は吸着時に核酸と相互作用をし、もう一方は核酸の反発による脱着に利用される。
・Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５６（１） （１９９７） ４５−５５には、
（ａ）荷電できるが吸着の際には本質的に荷電していない芳香族炭化水素リガンド（第二級アミン／アンモニウム）、又は
（ｂ）荷電できない芳香族リガンドに加えて、未反応スペーサーに対応する別の陽イオン交換リガンド（−ＣＯＯ⁻／ＣＯＯＨ）（芳香族リガンドの導入に使用されたもの）
を含む吸着剤でキモシンを精製する試みが記載されている。
・Ｉｓｓａｑ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． １１（１４） （１９８８） ２８５１−２８６１； Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５４ （１９８６） ５７０−５７７；及びＢｕｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍ． ＆ Ｒｅｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（１５） （１９９７） ２３２１−２３２５には、２種類のリガンド（イオン−交換リガンド及び疎水性（アルキル）相互作用リガンド）で誘導体化されたシリカ粒子のクロマトグラフィー特性が記載されている。
・Ｔｅｉｃｈｂｅｒｇ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍｔｏｇ． ５１０ （１９９０） ４９−５７には、正荷電リガンドが、正荷電反発リガンドも有している吸着剤上の中性アフィニティーリガンドと相互作用するアフィニティー反発クロマトグラフィーが記載されている。
・ＷＯ９８３９０９４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）及びＷＯ９８３９３６４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）には、一実施形態として、表面層に１種類の荷電リガンドが存在し、ビーズの内部は反対の電荷をもつリガンドで官能化されたビーズが開示されている。ビーズは生体分子の吸着用として提案されている。
・分離マトリックスへのアフィニティーリガンドの導入において、カップリング反応の非効率性のため２種以上の基及び／又は残留基が導入されることが多いことが知られている。塩化Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルと多糖マトリックスとの反応は、例えば、典型的に（ａ）１つの第三級アンモニウム基しか含有しないリガンドを（ｂ）第三級及び第四級アンモニウム基の両方を含有するリガンドと一緒に導入する。我々の知る限り、高い塩濃度を含むイオン交換条件下での異常に高い破過容量は、このタイプの従来のイオン交換体については従前報告されていない。Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５６（１） （１９９７） ４５−５５と比較されたい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、
ａ）比較的高いイオン強度で、イオン交換リガンドを有する吸着剤への、荷電物質（タンパク質など）の吸着／結合を達成すること、
ｂ）標的物質を結合する十分な容量を保持しつつ、リガンド含量を低減することができるイオン交換媒体を提供すること、
ｃ）イオン交換体に吸着／結合した物質の広いイオン強度範囲での溶出／脱着を可能にすること、つまり選択性を増加させること、
ｄ）高い破過容量（典型的には、＞２ｍｇ／ｍｌ湿潤ゲル、３００ｃｍ／時のフロースルーで１０％破過）、タンパク質の良好な回収率（しばしば９５％以上）等を有するイオン交換体を設計すること、
ｅ）高い塩濃度でイオン交換によって結合し、クロマトグラフィー特性をさほど損なわずに、アルカリ性（ｐＨ≦１３）及び／又は酸性（ｐＨ≧３）溶液での再生及び／又は洗浄に耐えることができるイオン交換体を設計すること、
ｆ）低いイオン強度が必要とされるプロセスに用いられるイオン強度の比較的高い試料の大幅な希釈を不要にすること、
ｇ）簡略化脱塩法を提供すること、
ｈ）例えば、生産性の向上及び／又はプロセス装置及び投資のコストを低減させるため、イオン交換体を用いる簡略化プロセスを提供すること、
ｉ）例えばイオン交換体で１リットルを超える試料量（＝液体（Ｉ））を添加して処理する大規模プロセスなどでの分取用途に適合したイオン交換体を提供すること、
ｊ）イオン交換工程後の疎水性相互作用吸着などの、高い塩濃度でのイオン交換体吸着剤の溶出に基づく新規な分離原理の組合せのための機会を提供すること
である。
【０００８】
これらの目的の一以上は、比較的高い塩濃度及び比較的高いイオン強度で吸着するイオン交換体が利点を有するとの知見に基づく。これは、主に脱着を達成するため高い塩濃度及び高いイオン強度を利用する伝統的なイオン交換体とは対照的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述の目的の一以上は、特許請求の範囲に規定する方法を用いて達成できる。そこで、本発明は、できるイオン交換によって水性液体から物質を除去する方法であって、当該方法が、
上記物質が荷電状態で存在する液体を準備する工程と、
２種以上の構造の異なるリガンドを含む吸着マトリックスであって、少なくとも１つの弱イオン交換体又は少なくとも１つの強イオン交換体を含む吸着マトリックスを準備する工程と、
上記物質を上記マトリックスへ吸着させるのに十分な期間上記液体を上記マトリックスと接触させる工程と、
上記物質を上記マトリックスから脱着させる溶出剤を加える工程と
を含んでおり、各々のリガンドが吸着工程の際に上記物質と相互作用し、かつ上記リガンドの少なくとも１つが荷電されていて上記物質とイオン相互作用することができるものである、方法に関する。
【００１０】
したがって、２種類のリガンドを使用するがその一方だけが核酸を吸着するのに有効であるＷＯ００／６９８７２と対比すると、本発明では、吸着時に関心物質と両方共に有効に相互作用する２種類のリガンドを使用する。
【００１１】
さらに、本発明は主としてイオン相互作用を利用するので、本方法は、疎水性相互作用を利用する上述のＷＯ９６／０９１１６とも異なる。ＷＯ９６／０９１１６の実験では同じ条件を用いて幾つかのリガンドを試験しているが、その各々は組合せではなく単独で試験されており、１種類のリガンドしかもたない吸着剤が示唆されている。さらに、この文献の溶出は、疎水性相互作用クロマトグラフィーで典型的にみられるように、塩濃度を下げることによって実施される。これとは対照的に、本発明では、溶出に塩濃度の増加を利用できるが、これは本吸着の主な相互作用がイオン型であることを示している。
【００１２】
一実施形態では、１以上の荷電リガンドは陰イオン交換体であり、除去される物質は最初は負に荷電されていて、吸着条件は、その負に荷電した物質のｐＩよりも高いｐＨ及びリガンドの正荷電基のｐＫａよりも低いｐＨによって規定される。本発明の利点は、その吸着効率が予期し得ないほど高いことが判明したことである。例えば、負荷電物質についての吸着容量は、本質的にすべての荷電基が第四級アンモニウム基（ｑ−基）である対応する対照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の≧１００％と高く、≧２００％であることもある。
【００１３】
別の実施形態では、１以上の荷電リガンドは陽イオン交換体であり、除去される物質は最初は正に荷電されていて、吸着条件は、その正に荷電した物質のｐＩよりも低いｐＨ及びリガンドに対応する負に荷電した酸のｐＫａよりも高いｐＨによって規定される。この場合、この物質についての吸着容量は、本質的にすべての荷電基がスルホプロピル基である対応する対照イオン交換体における同じ物質の吸着容量の≧１００％と高く、≧２００％であることもある。
【００１４】
本文脈において、吸着容量は、本出願において時々使用されている破過容量と同じ変数をいうことを理解すべきである。動的吸着容量は、水性液体を吸着剤を通して流す際のクロマトグラフィー法における容量をいう。同様に、静的吸着容量は回分法について用いられる。
【００１５】
本方法の一実施形態では、吸着は、０．１０ＭのＮａＣｌ、好ましくは０．２０ＭのＮａＣｌ又は０．３０ＭのＮａＣｌの水溶液のイオン強度と同一又は高いイオン強度で実施される。
別の実施形態では、リガンドは、０．２５ＭのＮａＣｌに相当するイオン強度の水性対照液中で関心物質を結合することができることで特徴付けることができる。
【００１６】
特定の実施形態では、１以上のリガンドは疎水性及び／又は電子供与体−受容体相互作用によって物質と相互作用する。該リガンドは好ましくは荷電可能であり、マトリックスから物質の脱着はｐＨスイッチによって実施される。
本方法のさらに別の実施形態では、溶出剤の極性は、物質が除去される水性液体の極性よりも低い。
【００１７】
有利な実施形態では、本方法は液体から生体高分子構造を除去するためのものであり、該構造は炭水化物構造、ペプチド構造、ペプチド核酸（ＰＮＡ）構造及び核酸構造からなる群から選択される。特定の実施形態では、本方法は、ｐＨ依存性の電荷をもつ生体高分子の除去のためのものである。
本方法は、両性物質の除去にも使用できる。
【００１８】
本発明はまた、本発明の方法での使用に好適な、２種以上のリガンドを含む吸着剤であって、１以上のリガンドが混合モードリガンドである吸着剤に関する。かかる混合モードリガンドは、
（ａ）物質との電荷−電荷引力相互作用を与える第一のモード部位、及び
（ｂ）物質との電荷−電荷引力相互作用及び／又は疎水性相互作用及び／又は電子供与体−受容体相互作用を与える第二のモード部位
を含む。
【００１９】
一実施形態では、本吸着剤は、分離すべき物質との電子供与体−受容体相互作用に関与する１以上の官能基を含む第一及び第二のリガンドを含んでおり、該官能基が、
（ｉ）以下のような供与体原子／基：
・ヒドロキシ、エーテル、ニトロ、カルボキシなどのカルボニル、エステル（−Ｏ−及び−ＣＯ−Ｏ−）及びアミドのように、自由電子対を有する酸素、
・チオエーテル（−Ｓ−）のように、自由電子対を有する硫黄、
・アミン、スルホンアミドを始めとするアミドのように、自由電子対を有する窒素、
・ハロゲン（フッ素、塩素、臭素及びヨウ素）、並びに
・ｓｐ−及びｓｐ^２−混成炭素、又は
（ｉｉ）受容体原子／基、即ち、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素、例えばＨＯ−（ヒドロキシ、カルボキシ等）、−ＮＨ−（アミド、アミン等）、ＨＳ−（チオール等）等のように陰性原子に結合した水素のような、電子不足原子又は基
からなる群から選択される。
【００２０】
一実施形態では、吸着剤における任意の対の組について置換度の比は０．０２〜５０内である。一実施形態では、第一及び第二のリガンドは、支持マトリックスの少なくとも一部に、互いに本質的にランダムに存在するように導入される。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の態様
以下、本発明の理解を図り、さらに様々な実施形態を例示するため、番号を付した工程を参照してさらに詳しく説明する。そこで、本発明者が見出した事項は、イオン交換吸着剤（１）を、
（ａ）液体（Ｉ）によって与えられる条件下で、１以上のリガンドが物質に存在する電荷と反対の電荷を有し、
（ｂ）液体（Ｉ）によって与えられる条件下で、各リガンドが物質と結合のため相互作用することができる
２種以上の異なるリガンド（リガンド１、リガンド２）で官能化されたベースマトリックスを含むことを特徴とするイオン交換吸着剤の中から選択すれば、技術分野の項で定義したプロセスによって上記目的の一以上を達成できることである。
上記相互作用は、もう一方のリガンドから独立したもの及びもう一方のリガンドと共同的なもののいずれかである。
【００２２】
本発明の文脈で意図される典型的なリガンドの分子量は＜１０００ダルトン（例えば＜７００）である。存在し得るハロゲンの分子量の寄与は上記の範囲には含まれていない。
【００２３】
リガンド１は荷電リガンド、つまり工程（ｉ）の条件下で荷電した単一及び混合モードリガンドから選択される（第一カテゴリー）。
リガンド２は、リガンド１とは異なる種類のリガンドであり、例えば、
（ａ）電荷−電荷引力相互作用を伴わずに相互作用できるもの（第二カテゴリー）、つまり工程（ｉ）の条件下で荷電しないリガンド、又は
（ｂ）電荷−電荷相互作用による相互作用できる電荷を有するが、リガンド１とは異なる種類のもの、つまり第一カテゴリーから選択されるもの
である。
（ａ）については、相互作用は、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用及び／又は電子供与体−受容体相互作用を伴うものでもよい。
【００２４】
本発明の方法で使用するイオン交換吸着剤のもう一つの特徴は、吸着剤が、
（Ａ）０．２５ＭのＮａＣｌに相当するイオン強度の水性対照液中で関心物質を結合することができ、しかも
（Ｂ）物質が上記電荷を有するｐＨ範囲２〜１２の部分範囲における物質に対する最大破過容量が、
（ａ）本質的に全ての荷電リガンドがＱ−リガンドである対応する陰イオン交換体（吸着剤２ａ）、又は
（ｂ）本質的に全ての荷電リガンドがＳＰ−リガンドである、対応する陽イオン交換体（吸着剤２ｂ）
での物質の破過容量の≧１００％（例えば、≧２００％又は≧３００％又は≧５００％又は≧１０００％）となる
ように、複数のリガンドの組合せが（置換の種類及び置換度に応じて）選択されていることである。
【００２５】
「ＳＰ基」という用語は、アリル基と亜硫酸水素塩との反応で得ることができるスルホプロピル基を意味し、ＳＰ基としては、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３ ⁻及びそのスルホン酸異性体が挙げられる。
「Ｑ基」という用語は、−ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２をハロゲンと反応させた後トリメチルアミンと反応させることによって得ることができる第四級アンモニウム基を意味し、Ｑ基としては、−ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３及び第四級トリメチルアンモニウム基を含有するその異性体が挙げられる。
【００２６】
吸着剤２ａは物質の電荷が負であるときに、吸着剤２ｂは物質の電荷が正であるときに使用される。水性対照液は、ＮａＣｌ、緩衝剤及び荷電した関心物質を含有する。
【００２７】
上記の比較とは、イオン交換体（１）と（２ａ）及びイオン交換体（１）と（２ｂ）に対して本質的に同じ条件下で実施される測定をいい、ｐＨ、温度、溶媒組成、流速などは（１）と（２ａ）の間及び（１）と（２ｂ）の間で同じである。破過容量は、フロースルー方式で同じ相対濃度の物質で（例えば、３００ｃｍ／時の流速でｃ／ｃ_０＝１０％、ｃ／ｃ_０については実施例を参照）測定される。
【００２８】
「対応する陰イオン交換体／陽イオン交換体」という用語は、支持マトリックスが同一であることを意味し、支持材料、ビーズ径、孔径、孔容積、充填法などは同一である。イオン交換体１の１以上の荷電リガンドについての全置換度は対照イオン交換体（２ａ又は２ｂ）（それぞれ、塩化物及びナトリウムイオンとして測定される）におけるものと本質的に同じである。対イオンも同じにすべきである。スペーサー及びカップリング化学は異なっていてもよい。ある種のカップリング化学は支持マトリックスの架橋を招いて、さらに硬質のマトリックスを生じることがある。この場合には、比較を行う流れの条件はマトリックスが本質的に圧縮されていないレベルで選択される。
【００２９】
典型的には、物質に対する有用な破過容量は、
（ａ）０．１８〜０．２５ｍｍｏｌ／ｍｌゲルの塩化物イオン容量を有する市販の陰イオン交換体であるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製（スウェーデン、ウプサラ））、及び／又は
（ｂ）０．１８〜０．２５ｍｍｏｌ／ｍｌゲルのナトリウムイオン容量を有する市販の陰イオン交換体であるＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製（スウェーデン、ウプサラ））
で該物質が呈する最大破過容量よりも高い。
【００３０】
これら２種類の対照イオン交換体におけるベースマトリックスはビーズ状のエピクロロヒドリン架橋アガロースである。ビーズは４５〜１６５μｍの範囲内の直径を有する。球状タンパク質についての排除限界は４×１０^６である。
【００３１】
実用的見地から、上記の事項は、流速３００ｃｍ／時及び０．２５Ｍ ＮａＣｌでの１０％破過について、物質に対する破過容量が＞２ｍｇ／ｍｌ湿潤ゲル（例えば＞４ｍｇ／ｍｌ湿潤ゲル）であるべきであることを意味する。
破過容量は、室温つまり約２５℃で実施された測定値をいう。
【００３２】
同一の試薬及び条件を用いて（例えば同一条件で並列に）導入されるリガンドは、たとえそれらが構造的に異なっていたとしても、同一の種類であるとみなされる。これは、特に形成されるリガンドが異性体である場合に当てはまる。
【００３３】
残留基（未反応基）を最小限にするために大過剰の誘導化試薬を使用した後でも残留基（未反応基）であるリガンドは存在しないとみなされる。典型的には、このタイプの基は、誘導化される基の出発量に比較して１０％以下（例えば５％以下）のモル量で存在する。
典型的には、異なるリガンド同士のモル比は０．０１〜１００の範囲内であり、０．０２〜５０の範囲内にあるのが往々にして好ましい。
【００３４】
第一カテゴリー：工程（ｉ）の条件下で荷電する単一及び混合モードリガンド
このカテゴリーのリガンドは、荷電原子又は基及び／又は近接した１〜７原子（例えば近接した１〜３原子）の１原子以上に関して異なり、
（ａ）正に荷電した各種窒素（例えば、第一級アンモニウム、第二級アンモニウム、第三級アンモニウム、第四級アンモニウム及びアミジニウム）、
（ｂ）正に荷電した各種硫黄（例えば、スルホニウム）、
（ｃ）負に荷電した各種酸素（例えば、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、ホスホネート又はホスフェート（それぞれ、−ＰＯ_３ ^２−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ_２ ⁻及び−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ_２ ⁻、−ＯＰＯ_３ ^２−）、スルホネート又はスルフェート（それぞれ、−ＳＯ_３ ⁻及び−ＯＳＯ_３ ⁻）、−アリール−Ｏ⁻（フェノラート／アリーロラート）などの基における酸素）
である。
自由結合（原子価）は、基をベースマトリックスに結合する鎖の一部である炭素に直接結合する。
【００３５】
異なる種類の荷電リガンドの概念には、以下の相違点：
（ｉ）上記の（ａ）及び／又は（ｂ）の荷電原子が線状又は環状構造の一部であるか、或いは環状構造が芳香族もしくは非芳香族及び／又は４員環、５員環、６員環、７員環、８員環などの環を含んでいること、
（ｉｉ）上記の（ａ）又は（ｂ）の荷電原子又は上記の（ｃ）の荷電基に連結する鎖が、これらの原子／基に隣接して、炭素原子及び／又はヘテロ原子の種類が異なる１〜３個の原子の一部を有すること、
（ｉｉｉ）リガンドがは単一又は混合モードリガンドであること
も含まれる。
（ｉｉ）で概説した相違点は、全て又は一部の炭素原子がｓｐ^３−、ｓｐ^２−及びｓｐ−混成炭素から選択されること、或いはチオエーテル硫黄、エーテル酸素及びハロゲンから選択されるヘテロ原子が存在していても存在していしなくてもよいことを含む。
【００３６】
リガンドはｐＫａ値に関して異なっていてもよい。適切な相違は、典型的には≧０．５ｐＨ単位（例えば、≧１又は≧２ｐＨ単位）である。
ｐＨ依存性の電荷を有するリガンドは酸及び塩基の形態で存在する。ｐＨ依存性の電荷を有するイオン交換リガンドに対しては、以下のことがいえる。
ａ）イオン交換リガンド及びその対応する塩基の両方は、液体（Ｉ）のｐＨが≦ｐＫａ＋２である限り、同じ種類のリガンドであるとみなされる。
ｂ）イオン交換リガンド及びその対応する酸の両方は、液体（Ｉ）のｐＨが≧ｐＫａ−２である限り同じ種類のリガンドであるとみなされる。
ｐＫａは、（ａ）リガンド（選択肢ａ）又はリガンドに相当する酸（選択肢ｂ）のｐＫａを意味する。液体（Ｉ）のｐＨがこれらの判定基準に適合しなければ、リガンドの荷電型は非本質的な量で存在する。
【００３７】
「単一モード荷電リガンド」という用語は、荷電原子（上記のａ又はｂ）又は荷電基（上記のｃ）をベースマトリックスに連結する鎖が、かかる原子又は基から７原子以内の距離にあるｓｐ^３−混成炭素及び単一のエーテル酸素から選択される原子からなることを意図する。鎖に結合した他の基は、主に水素及び／又はヒドロキシであり、さらにメチル及びメトキシであることもある。正の窒素原子は、例えば、水素及び／又はメチル又はエチルのような低級アルキル（Ｃ_１〜５）から選択される他の基と結合する。正荷電硫黄原子については、これらの追加的な基は、メチル又はエチルのような低級アルキル（Ｃ_１〜５）から主に選択される。
【００３８】
「混合モード荷電リガンド」という用語は、荷電原子（上記のａ又はｂ）から又は荷電基（上記のｃ）から７原子以内の距離にあるリガンドが、上記で定義した疎水性相互作用及び／又は電子供与体−受容体相互作用に関与することができる１又は２以上の原子又は基を有することを意図しているが、これらの原子又は基が単一のエーテル酸素、単一のヒドロキシ又はｓｐ^３−炭素でないことが条件とされる。典型的には、距離は１、２、３、４原子である。
【００３９】
疎水性相互作用としては、リガンドの純然たる炭化水素基と物質の疎水性基つまり脂質様基との間の相互作用が挙げられる。適当な純炭化水素基は、２、３、４、５又は６以上の炭素原子（純アルキル、純アリール、純アラルキル、純アルキルアリール、純アルケニル、純アルキニルなど、並びに２以上の自由結合（原子価）を含む対応する基）を含む。ファンデルワールス相互作用は、疎水性相互作用の重要な部分をなすであろう。
【００４０】
電子供与体−受容体相互作用としては、水素結合、π−π、電荷移動などの相互作用が挙げられる。電子供与体−受容体相互作用は、自由電子対を有する陰性原子が供与体として作用して、供与体の電子対に対する受容体として作用する電子不足原子に結合することを意味する。電子供与体−受容体相互作用に関する議論については、Ｋａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、「分離科学入門」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９７３）４２頁を参照されたい。
【００４１】
供与体原子／基の例示的な例は、
（ａ）ヒドロキシ、エーテル、カルボニル及びエステル（−Ｏ−及び−ＣＯ−Ｏ−）及びアミドのように、自由電子対を有する酸素、
（ｂ）チオエーテル（−Ｓ−）のように、自由電子対を有する硫黄、
（ｃ）アミン、スルホンアミド、カルバミド、カルバメート、アミジン等を含むアミド、シアノのように、自由電子対を有する窒素、
（ｄ）ハロゲン（フッ素、塩素、臭素及びヨウ素）、並びに
（ｅ）ｓｐ−及びｓｐ^２−混成炭素
である。
典型的な受容体原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素のような、電子不足原子又は基であり、またヒドロキシ及びカルボキシにあるＨＯ−、アミド及びアミンにある−ＮＨ−、チオールにあるＨＳ−などの陰性原子に結合した水素を含む。
【００４２】
供与体及び受容体の原子又は基は、
・荷電原子又は荷電基をベースマトリックスに連結する鎖、
・上記鎖に結合した分枝、又は
・荷電原子又は基（特に陰イオン交換基／リガンドについて）に直接結合した別の置換基
に位置し得る。
電子供与体／受容体の原子又は基は、リガンドをベースマトリックスに連結する鎖に結合した分枝に、荷電原子又は荷電基から７原子以上の距離に存在し得る。かかる場合、完全な分岐は別のリガンドと考えられる。
【００４３】
特に興味深い混合モード荷電リガンドは、荷電原子又は基の上述の距離内に、チオエーテル（−Ｓ−）及び／又は芳香族炭素のようなｓｐ^２−混成炭素を有する。例えば、本願出願人の係属中の国際特許出願のＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）及びＰＣＴ／ＥＰ００／１１６０６（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）（両方とも陰イオン交換リガンドについて記載）、並びに２０００年７月１７日に出願したＳＥ ０００２６８８−０（陽イオン交換リガンド）及びＷＯ９９６５０７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）（陽イオン交換リガンド）を参照されたい。ＷＯ９７２９８２５（ＵＳ６，０９０，２８８）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）には、１以上のヒドロキシ及び／又はアミノ／アンモニウム窒素を第一級、第二級又は第三級アンモニウム窒素から２〜３炭素の位置に有する混合モード陰イオン交換リガンドが開示されている。本特許の方法で潜在的に有用である混合モードイオン交換リガンドは、ＷＯ９８０８６０３（Ｕｐｆｒｏｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＷＯ９６００７３５、ＷＯ９６０９１１６及びＵＳ５，６５２，３４８（Ｂｕｒｔｏｎ等）に記載されている。この段落で参照した全ての出版物は出典明示により本明細書の一部とする。
【００４４】
上記に示したチオエーテル（−Ｓ−）において、自由結合（原子価）の各々はｓｐ^２−又はｓｐ^３−混成炭素に結合するが、ｓｐ^２−又はｓｐ^３−混成炭素は、環状構造（芳香族又は非芳香族のいずれでもよい）の一部であっても、一部でなくてもよい。ここでいう「チオエーテル」という用語は、チオフェン、並びに環原子として硫黄を含む他の複素環式芳香族環を包含する。
上述の距離内に３、４、５以上の炭素原子を含むアルキル型の純粋な炭化水素基もあり得る。
【００４５】
上記に示した芳香族環構造は、１以上の芳香族環、例えば、フェニル、ビフェニル又はナフチル構造及び縮合環又は二環式構造を含む他の芳香族環系を含んでもよい。芳香族環は、複素環式つまり１以上の窒素、酸素又は硫黄を含むものでもよく、置換基を有していてもよい。これら他の置換基は、例えば水素結合及び／又は他の電子供与体−受容体相互作用を可能ならしめる電子供与体又は受容体の原子又は基を含有してもよい。例示的な芳香族環構造は、ヒドロキシフェニル（２−、３−及び４−）、２−ベンズイマドゾイル、メチルチオキシフェニル（２−、３−及び４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−及び４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、４−スルホンアミドフェニルなどである。
【００４６】
好ましい陰イオン交換リガンド及び好ましい陽イオン交換リガンドについて対応する酸のｐＫａは３以上の範囲にあり、好ましくは１１以下であり、好ましくはイオン交換リガンドを適切に脱荷電できるように４〜９の範囲内にある。
【００４７】
特に興味のある陰イオン交換リガンドはｐＨ依存性の電荷を有し、≦１２．０のｐＫａ値（例えば≦１０．５）を有する。これは、これらのリガンドは、好ましくは第一級又は第二級アンモニウム基又は第三級アンモニウム基から選択される荷電基を含むことを意味する。窒素が芳香族構造の部分である第三級アンモニウム基及びそのα−又はβ−位に芳香族炭素を有するアンモニウム基は、８以下のｐＫａ値を有してもよい。通常、陰イオン交換リガンドのｐＫａは≧３であり、例えば≧４である。
【００４８】
特に興味のある負荷電リガンドはｐＨ依存性の電荷を有する。対応する酸についてのｐＫａ値は通常≧３（例えば≧４）である。かくして、これらの種類のリガンドは、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、ホスホネート又はホスフェート（それぞれ、−ＰＯ_３ ^２−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ_２ ⁻及び−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ_２ ⁻、−ＯＰＯ_３ ^２−）、−アリール−Ｏ⁻（フェノラート／アリーロレート）並びに他の弱酸基から選択される荷電基を含むべきである。
【００４９】
ただし、これは、
・強酸（ｐＫａ≦３、例えば≦２又は≦０）（対応する塩基は陽イオン交換リガンドとして作用する）、及び
・弱酸（ｐＫａ≧１０、例えば≧１２）又はｐＨに依存しない電荷を有するリガンド
に対応するイオン交換リガンドも、我々の新しい革新的な脱塩方法に用いるイオン交換体中にそれらを導入したときに、利点を有するであろうことを除外するものではない。他のイオン交換基については、これらの利点は脱塩すべき物質の性質、例えば、その等電点及びイオン交換体とのその相互作用の強度などに依存する。
リガンドのｐＫａ値は、問題とするリガンドの５０％が滴定されたときのｐＨとして得られる。
【００５０】
第二カテゴリー：工程（ｉ）の条件下で荷電しないが所望の荷電物質と相互作用することができるリガンド
主として２種類の非荷電リガンドがある：即ち
（ａ）ｐＨスイッチによって荷電し得るリガンド（クラスＩ）、及び
（ｂ）ｐＨスイッチでは荷電できないリガンド（クラスＩＩ）
である。
【００５１】
クラスＩは、ｐＨ依存性電荷を有することができる非荷電型リガンドを含む。上記を参照されたい。
クラスＩＩリガンドは、上述の通り、疎水性相互作用及び電子供与体−受容体相互作用を起こすことのできる１以上の構造要素を含有する。典型的なクラスＩＩリガンドにおいては、上記で定義したような２、３又は４以上の電子供与体−受容体原子又は基がある。各原子又は基は、電子供与体−受容体原子又は基から、互いに直接連結した２、３又は４以上のｓｐ^３−混成炭素だけ離れている。
【００５２】
クラスＩＩのリガンドは、ベースマトリックから突き出ていてかつ前段落の定義に適合する基の最も外側の部分として定義される。「最も外側」という用語は上記で定義したアルキル基を伴う電子供与体−受容体相互作用又は疎水性相互作用に関与できる最も外側の原子から１〜７原子の距離にある原子を意図する。
【００５３】
かくして、第二のカテゴリーの各リガンドは、そのリガンドが電子供与体−受容体相互作用及び／又は疎水性相互作用を可能にする１以上の原子を含むという条件で、イオン交換体におけるリガンド２として使用することができる。存在し得る原子及び／又は基の例は、フェニル基を含み、置換又は未置換であってもよいアリール、純粋なアルキル及び純粋なアルキレン（Ｃ_３以上で好ましくはＣ_８以下）、チオエーテル、エーテル、非荷電アミノ、ヒドキシ、アミド（スルホンアミド、カルバミド、カルバメート等を含むカルボキサミド）、ニトロ、スルホン、非荷電カルボキシなどである。この種類のリガンドにおいて、上記原子又は基は、直接結合した２以上のｓｐ^３−混成炭素原子によって互いに隔てられていることが多い。
【００５４】
確率的（stochastic）イオン交換体における各種リガンドは、支持マトリックス又はその一部で互いに多少なりともランダムに存在し得る。導入方法に応じて、リガンド量の比は変動し得るが、マトリックスの実質的な部分において２種以上のリガンドについて常に０．０１〜１００でなければならず、０．０２〜５０が好ましい。支持体内で各種リガンドの不均一又は層状の分布を達成するため、ＷＯ９８３９３６４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）に概説された一般原理を用いることができる。これら二つの特許文献における主な目的である鋭い層が導入されないように、反応性、拡散率及びリガンド形成試薬の濃度に関してしかるべき配慮を取らねばならない。ＷＯ９８３９３６４は出典明示により本明細書の一部とする。
【００５５】
特に興味がある確率的イオン交換体は、リガンド１として強イオン交換リガンドを、かつリガンド２としてｐＨスイッチによって荷電／脱荷電し得るリガンドを含む。２つの典型的な組合せは、
（ａ）リガンド１としての強陽イオン交換リガンドとリガンド２としての弱陰イオン交換リガンドとの組合せ、又は
（ｂ）リガンド１としての強陰イオン交換リガンドとリガンド２としての弱陽イオン交換リガンド
である。
この文脈において、強陽イオン交換リガンドはｐＫａ＜３〜４の対応する酸を有する。強陰イオン交換リガンドの例は、第四級アンモニウムリガンド及び、ｐＫａ＞１０（例えば≧１１又は≧１２）の陰イオン交換リガンドである。他の種類のイオン交換リガンドは弱と考えられる。
【００５６】
他の興味ある組合せは、例えば、同じベースマトリックス上で同様なｐＫａをもつ２種類の異なる弱陰イオン−又は陽イオン−交換リガンド、又は同じマトリックスに結合した弱陰イオン−及び弱陽イオン−交換リガンドを有する確率的イオン交換体である。リガンドは、ｐＫａの差が２、３又は４ｐＨ単位よりも小さく又は大きくなるように選択できる。
【００５７】
異なる種類のリガンドを組合せる最大の利点は両性物質の脱塩に関する。典型的に、リガンドは、一方のリガンドは荷電される（リガンド１）が、もう一方（リガンド２）は工程（ｉ）では荷電せずに、工程（ｉｉ）で解離する物質と同じ電荷で荷電されるようになるように組み合わされる。これは、適切な組合せが脱塩すべき物質の等電点（ｐＩ）に依存するという結果になる。さらに下記を参照されたい。
【００５８】
支持マトリックス／ベースマトリックス
支持マトリックスはベースマトリックス及びベースマトリックスにリガンドを結合する任意のスペーサーを含む。
ベースマトリックスは有機及び／又は無機材料に基づく。
【００５９】
ベースマトリックスは、好ましくは親水性であって、水に不溶性でかつ多少膨潤性であるポリマーの形態にある。親水性になるように誘導化された疎水性ポリマーはこの定義に含まれる。適当なポリマーは、例えば、アガロース、デキストリン、セルロース、でんぷん、プルランなどの多糖類系のポリヒドロキシポリマー、並びにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）及びポリメタクリレート（例えば、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール並びにスチレン及びジビニルベンゼン系のポリマー、及び上述のポリマーに相当する２以上のモノマーが含まれるコポリマーのような完全に合成されたポリマーである。水に可溶性のポリマーは、例えば、架橋及び吸着又は共有結合によって不溶性となるように誘導化できる。ＯＨに転換し得る基を有するモノマーの重合によって或いは例えば親水性ポリマーのような適当な化合物の吸着による最終ポリマーの親水性化によって、疎水性ポリマーに（例えば、モノビニル及びジビニルベンゼン上に）親水性基を導入することができる。
【００６０】
ベースマトリックに使用される適当な無機材料はシリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタラムなどである。
好ましいマトリックスは、シラン、エステル、アミド基及びシリカに存在する基のように、加水分解に不安定な基を含まない。これは特に、使用される液体に直接接触する基に関して当てはまる。
【００６１】
マトリックスは多孔質又は非多孔質であってもよい。これは、マトリックスが、除去すべき物質に対して完全又は部分的に浸透性（多孔質）であっても、或いは完全に非浸透性（非多孔質）であってもよいことを意味し、マトリックスは除去すべき物質に対して０．４０〜０．９５の範囲内のＫａｖを有しているべきである。ただし、これは、Ｋａｖがさに低くてもよいこと（例えば０．１０まで、又は例えば増量剤を有する特定のマトリックスではさらに低くてもよい）を除外するものではない。例えば、ＷＯ９８３３５７２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）を参照されたい。
【００６２】
本発明の特に興味深い実施形態では、マトリックスは、１〜１０００μｍ、好ましくは高速用途には５〜５０μｍ、分取用には５０〜３００μｍの範囲の粒径をもつ不規則又は球状の形態にある。
これに代えて、マトリックスは、管又は或る他の種類の容器の壁、多孔質プラグ、多孔質膜又はフィルターのように、一体構造であってもよい。
【００６３】
マトリックスは、工程（ｉ）で使用する液体よりも密度の大きいビーズ／粒子の形態であってもよい。この種類のマトリックスは、特に、流動床クロマトグラフィー用及び様々な回分法（例えば攪拌タンク中）での大規模操作に特に応用できる。流動床法はＷＯ９２１８２３７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）及びＷＯ９２００７９９（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｋ）に記載されている。
【００６４】
「親水性マトリックス」という用語は、マトリックスの接近可能な表面が、水性液体はマトリックスに浸透できるという点で親水性であることを意味する。典型的には、親水性ベースマトリックスの接近可能な表面は、例えば酸素及び／又は窒素原子を含む複数の極性基を露出する。かかる極性基の例は、ヒドキシル、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル（（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）_ｎＨなど、ただしｎは整数である。）である。
【００６５】
スペーサーはベースマトリックスから、上記で定義したリガンドへと伸びる。
かかるスペーサーは伝統的なイオン交換体におけるように従来型であり、かくして、上述の通り、線状、分岐、環状飽和、不飽和及び芳香族の炭化水素基（例えば、炭素原子数１〜２０（例えば１〜１０）のもの）を含んでもよい。これらの基は、上述のタイプの純粋な炭化水素基、ヒドロキシ基、アルコキシ及びアリールオキシ並びに対応するチオ類似体、及び／又はアミノ基を含んでもよい。炭化水素基における炭素鎖は、１箇所以上でエーテル酸素及びチオエーテル硫黄で中断されていてもよい。また、アミド及びケトン基におけるようなカルボニル基並びに加水分解に対して比較的安定な基であってもよい。酸素、硫黄及び窒素から選択される１個以下の原子が好ましくは１つの同じｓｐ^３−混成炭素原子に結合する。
【００６６】
スペーサーは、上述のように例えば水素結合への関与などによって、イオン交換体への所望の物質の結合を促進する１以上の電子供与体又は受容体の原子又は基を与えてもよいことは明らかである。便宜上、この種類の原子又は基はスペーサーの一部とみなす。また、１以上のリガンドを１つの同じスペーサーに結合してもよい。上記の「分岐」を参照されたい。
【００６７】
リガンド密度
本発明で使用する吸着剤のイオン交換リガンドのレベルは、通常０．００１〜４ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスの範囲内（例えば０．００２〜０．５ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックス）で普通選択され、０．００５〜０．３ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスが好ましい。好ましい範囲は、特に、マトリックスの種類、リガンドの種類、吸着すべき物質によって決まる。「ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックス」という表現は、水で飽和した完全に沈降したマトリックスをいう。リガンド密度の範囲は、十分にプロトン化／荷電した形態のマトリックスがナトリウムイオン及び／又は塩化物イオンのような普通の対イオンを結合できる容量をいい、特に、存在する陰イオン及び／又は陽イオンリガンドに依存する。
【００６８】
最良の形態
本発明の様々な最良の実施形態は関心物質に応じて変わる。これまでに判明した最良の形態は実施例で提示する。
【００６９】
使用するイオン交換体の安定性
本発明で使用するイオン交換体／イオン交換リガンドは、イオン交換吸着を含むプロセスで典型的に適用される条件に耐えなければならない。一般側として、これは、本発明の吸着剤は０．１又は１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に少なくとも１０時間、全イオン結合容量を実質的に低下させずに、耐えることができなければならないことを意味する。「全イオン結合容量を実質的に低下させずに」とは、全イオン結合容量が最大でも１０％しか低下しないことを意図する。これは、イオン交換リガンド並びにベースマトリックスは、純粋な炭化水素基（ホモ芳香族及び複素環式芳香族構造を含む）、チオエーテル及びエーテル基（アセタール及びケタール基を含む）、ヒドロキシ基、スルホン基、カルボキサミド基、スルホンアミド基並びに同様な加水分解安定性をもつ基から選択される構造のみを含んでいるべきであることを意味する。
【００７０】
吸着／脱着
吸着及び／又は脱着工程は、一体構造の形態或いは充填又は流動床の形態の粒子としての陰イオン交換体マトリックスによるクロマトグラフィー法として実施できる。粒状マトリックスについては、これらの工程は、液体中で多少なりとも完全に分散した粒子による回分式モードで行ってもよい。
工程（ｉ）及び（ｉｉ）で使用する液体は水性つまり水であり、水混和性の溶媒と混合したものであってもよい。
【００７１】
吸着
吸着の際に、荷電物質を含有する液体試料は、好ましくはイオン交換によって、吸着（結合）する条件下で上記で定義したイオン交換体と接触させる。換言すれば、物質は、吸着工程（ｉ）の際に荷電される傾向の強いリガンドとは反対に荷電される１以上の基又は原子を有する。
【００７２】
好ましくは、物質の正味電荷は工程（ｉ）の間イオン交換体の正味電荷とは反対である。水性液体中に存在する両性物質については、陰イオン交換条件は典型的にｐＨ≧ｐＩ−０．５、好ましくはｐＨ≧ｐＩ、陽イオン交換条件はｐＨ≦ｐＩ＋０．５、好ましくはｐＨ≦ｐＩを意味する。
【００７３】
本発明の利点の一つは、従来のイオン交換体（例えば、上記で定義した対照陰イオン交換体）で慣用されてきたものよりも高いイオン強度でも吸着／結合を実施できることである。絶対値では、これは、本発明の吸着は１５又は２０ｍＳ／ｃｍ以上又は以下のイオン強度で実施できることを意味する。イオン強度は３０ｍＳ／ｃｍを超えてもよく、場合によっては４０ｍＳ／ｃｍを超えることもある。有用なイオン強度はしばしば≧０．１のＮａＣｌ濃度（純水）に相当し、例えば≧０．３又は≧０．５のこともある。用いる伝導率／イオン強度はリガンドの組合せ、マトリックス上のそれらの密度、結合すべき物質及びその濃度等に依存する。
【００７４】
脱着
脱着プロセスは以下の方法の少なくともいずれかを含むべきである。
（Ａ）塩濃度（イオン強度）の増加、
（Ｂ）所望の物質とリガンドとの相互作用を緩和するためのｐＨ変化、
（Ｃ）水性液体（Ｉ）の極性を低下させるリガンド類似体又は試薬（例えば溶媒）の添加。
方法（Ｂ）は、（ａ）イオン−イオン引力相互作用によって所望の物質と結合するリガンドの電荷を減少させること、並びに（ｂ）反対電荷を有するリガンドに結合する所望の物質の基の電荷を減少させることを含んでもよい。ｐＨの変化は、工程（ｉｉ）でリガンドと物質が同じ電荷をもつように、何度も行うことができる。
【００７５】
（Ａ）〜（Ｃ）で与えられる条件を組合せて又は単独で使用してもよい。適切な選択は、
（１）脱着すべき物質と、
（２）イオン交換体（リガンド、マトリックスの種類、スペーサー及びリガンド密度）と、
（３）水性液体ＩＩの各種変数（濃度、極性、温度、ｐＨ等）と
の具体的な組合せに依存する。
そこで、水性液体（Ｉ）（吸着緩衝液）を水性液体（ＩＩ）（脱着緩衝液）で置き換えることは、脱着が起こるように他の条件は変化させずに保持したまま、温度、ｐＨ、極性、イオン強度、可溶性リガンド類似体などの１以上の変数を変更することを意味する。
【００７６】
最も簡単な場合には、これは、水性液体Ｉから水性液体ＩＩへ変更する際に、
（ａ）イオン強度の増加、及び／又は
（ｂ）上記で概説したｐＨの変更
を意味する。選択肢（ａ）はｐＨの減少、維持又は増加を含む。選択肢（ｂ）はイオン強度の低下、増加又は維持を含む。
【００７７】
クロマトグラフィー及び／又は回分法において、脱着すべき物質が結合したマトリックスは、液体（Ｉ）に接触するカラムその他の適当な容器内に存在する。次いで、その液体によって与えられる条件を、所望の物質がマトリックスから溶出されるまで、上述の通り変更する。典型的な脱着プロセスは、吸着時に用いたものよりもイオン強度を増加させ、多くの場合、他の変数を全く変更しない場合には、０．４Ｍ以上のＮａＣｌ（例えば０．６ＭのＮａＣｌ）に相当することを意味する。溶出／脱着についての実際のイオン強度値は、好ましい事例では、さらに低くてもよく、上述の様々な要因に依存する。適切なリガンドを選択すれば、リガンド及び／又は物質の正味電荷をそれらが反対の電荷となるように変更するのにｐＨの変更で十分とすることができる。これは、使用する緩衝液の濃度と本質的に同じ程度となるように塩濃度を低下できることを意味する。
【００７８】
脱着のために増加したイオン強度を用いる条件は、水性液体ＩＩによって与えられる条件に応じて緩和することができる。下記を参照されたい。
液体（Ｉ）から液体（ＩＩ）への変更は１以上の段階で（段階的勾配）又は連続的に（連続勾配）達成できる。マトリックスと接触する液体の様々な変数は個々に又は組合せて変更できる。
【００７９】
イオン強度の変更に使用される典型的な塩は、アルカリ金属又はアンモニウムイオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩等から選択される。
ｐＨの変更に使用される緩衝成分は関与するリガンドの種類に依存し、典型的には吸着工程の間は同じである。例えば、イオン交換リガンドが陽イオン性である場合には、緩衝作用をもつ酸−塩基対は、好ましくは、緩衝成分がリガンドに結合できない酸−塩基対、即ち、ピペラジン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミンなどから選択される。同様に、イオン交換リガンドが陰イオン性である場合に緩衝作用をもつ酸−塩基対は、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などである。
【００８０】
脱着は、液体（ＩＩ）の極性を吸着液体（Ｉ）の極性よりも低い値に調整することによって促進できる。これは、液体ＩＩの中に水混和性の及び／又は低親水性の有機溶媒を配合することによって達成できる。
【００８１】
かかる溶媒の例は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アクリロニトリルなどである。水性液体ＩＩの極性の低下（水性液体Ｉに比較して）は恐らく脱着を促進し、マトリックスからの物質の解離に必要なイオン強度を減少させる。
【００８２】
脱着は、使用されるリガンドの１以上の可溶性構造類似体を配合することによっても促進できる。液体（ＩＩ）中の構造類似体の濃度は水性液体（Ｉ）中のその濃度よりも高くすべきである。「リガンドの構造類似体」又は「リガンド類似体」は、リガンドと構造的類似性を有し、可溶性の形態であり、リガンドと除去すべき物質との結合を阻害することができる物質である。
【００８３】
重要な変形例
変形例１：リガンド１はｐＨ依存性の負電荷を有する陽イオン交換リガンドであり、リガンド２は荷電し得ないか又は相当部分が工程（ｉ）のｐＨでは未荷電である荷電可能な塩基である。リガンド１に相当する酸のｐＫａはリガンド２（荷電可能な場合）に相当する酸のｐＫａよりも低い。吸着される物質は、リガンド２のｐＫａよりも高いｐＩを有する。液体（Ｉ）のｐＨは、物質が正の正味電荷を有し、イオン交換体に吸着するように選択される。ｐＨを下げることによって、物質及び恐らくまたリガンド２はプロトン化されて、正電荷が増す。これは、中程度のｐＨで物質の解離を促進して、液体（ＩＩ）中の低い塩濃度での脱着を可能にする。
【００８４】
変形例２：リガンド１はｐＨ依存性の正電荷を有する陰イオン交換リガンドを含んでおり、リガンド２は完全に荷電し得ないか又は相当部分が工程（ｉ）のｐＨでは未荷電である荷電可能な酸である。リガンド２のｐＫａはリガンド１のｐＫａよりも高い。吸着される（脱塩される）物質のｐＩはリガンド１のｐＫａ及びリガンド２のｐＫａのいずれよりも低い。液体（Ｉ）（工程（ｉ））のｐＨは、物質が負の正味電荷を有し、リガンド２が本質的に未荷電のままで、リガンド１が正電荷を有するようにする。こうして、物質は工程（ｉ）で吸着される。ｐＨを増加させると、リガンド２は負に荷電されるが、これは液体（ＩＩ）中の低い塩濃度で物質が脱着することを意味する。
【００８５】
回収率
副態様において、本発明方法は吸着された物質の高回収率、例えば８０％以上又は９０％以上のような６０％以上の回収率を可能にする。回収率は、吸着／結合工程でイオン交換体に添加した物質の量に対する脱着した物質の量である。多くの例において、回収率は、本発明の効果にしたがい、９５％を超え、本質的に定量的とすることができる。典型的には、イオン交換体に添加する物質の量は、物質に対するイオン交換体の全結合容量の１０〜８０％の範囲内（例えば、２０〜６０％）にある。
【００８６】
液体（Ｉ）から除去される物質
本発明は主として、上記で定義したリガンドと相互作用できる幾らかの構造ユニットを有する高分子量物質のためのものである。適切な物質は１０００ダルトン以上の分子量を有し、生体有機及び高分子である。１分子当りの荷電基の数は典型的に１以上であり、ｐＨに依存する。分子量及び電荷の数に関する詳細は「技術分野」の項に記載されている。物質は両性でもよい。典型的に、物質はペプチド構造（例えば、オリゴ−又はポリペプチド構造）、核酸構造、炭水化物構造、脂質構造、ステロイド構造、アミノ酸構造、ヌクレオチド構造、その他荷電又はｐＨ−スイッチによって荷電し得る生体有機構造から選択される構造を含む。
【００８７】
物質は水性媒体に溶解しても、或いは小さな生物粒子の形態（例えばコロイドディメンションのもの）でもよい。生物粒子の例示的な例は、ウイルス、細胞（細菌その他の単細胞生物を含む）並びに細胞凝集体及び細胞小器官を含む細胞の部分である。
本発明は特に、関心物質を高濃度の塩と共に含む生物学的流体から得られる水性液体に適用できると思料される。
【００８８】
上述の種類の生体有機物質を含む、高イオン強度の典型的な液体は、例えば細胞培養からの発酵ブロス／液、及びそれから得られる液体である。細胞は、哺乳動物のような脊椎動物、又は無脊椎動物（例えば、チョウ及び／又はそれらの幼虫からの細胞のような培養昆虫細胞）、又は微生物（例えば、培養真菌、細菌、酵母等）に由来するものでもよい。また、植物細胞その他の好ましくは培養生体細胞も包含される。
【００８９】
液体（Ｉ）が不都合な異物を含有する場合には、流動床技術を利用することが有益であろう。これは特に、液体（Ｉ）が（ａ）細胞の培養からの発酵ブロス／液、（ｂ）溶菌細胞を含む液体、（ｃ）細胞及び／又は組織のホモジネートを含む液体、並びに細胞から得られるペーストに由来するときに当てはまる。
【００９０】
本明細書で説明したイオン交換体は、塩濃度の高い水性出発組成物よりも塩濃度の低い生体有機物質含有水性組成物の製造に特に適している。この種のプロセスは問題の物質の脱塩を意味する。この出願に並行して出願して、表題「低濃度の塩を含む組成物の製造方法」を有する本願出願人のＳＥ特許出願をさらに参照されたい。
【００９１】
本発明の第二の態様
この態様は、２種以上の異なるリガンド（リガンド１、リガンド２）で官能化された支持マトリックスを含むことを特徴とするイオン交換吸着剤から選択されるイオン交換吸着剤（１）を包含し、１以上のリガンドは荷電（ｐＨ依存性であってもなくてもよい）を有する。
【００９２】
リガンド１は荷電されていて、単一又は混合モードのイオン交換種に属する。したがって、リガンド１は、該リガンドがファンデルワールス相互作用及び／又は電子供与体−受容体相互作用に関与できるようにする中性基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。関与する原子及び／又は基は本発明の第一の態様について上記で定義したのと同じである。
【００９３】
リガンド２は中性であっても荷電していてもよい。荷電している場合、このリガンドの荷電原子又は基は典型的にはリガンド１の荷電原子又は基とは異なる種類に属する。関連する相違点については、本発明の第一の態様を参照されたい。荷電リガンドは、リガンド１と同様に単一モード又は混合モードのリガンドであってもよい。荷電しているか否かとは無関係に、リガンド２は、上記の本発明の第一の態様でリガンド１について説明したように、リガンドが疎水性相互作用及び／又は電子供与体−受容体相互作用に関与できるようにする非荷電基及び／又は原子を含んでいてもよい。
【００９４】
この態様のイオン交換体は、オバルブミン、コンアルブミン、ウシ血清アルブミン、β−ラクトアルブミン、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、ＩｇＧ、大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）から選択され対照物質の１種以上に対して、
（Ａ）０．２５ＭのＮａＣｌに相当するイオン強度の水性対照液体中で上記１種以上の対照物質を結合することができ、かつ
（Ｂ）ｐＨ範囲２〜１２の部分範囲において、荷電リガンドと反対の正味電荷を有する上記１種以上の対照物質に対する最大破過容量が、
（ａ）物質の正味電荷が負であってイオン交換吸着剤の正味電荷が正である場合にはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（イオン交換体２ａ）、及び／又は
（ｂ）物質の正味電荷が正であってイオン交換吸着剤の正味電荷が負である場合にはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（イオン交換体２ｂ）
での上記１種以上の物質の破過容量の≧１００％（例えば≧２００％又は≧３００％又は≧５００％又は≧１０００％）であることをさらに特徴とする。
原理的に、水性対照液体は、ＮａＣｌ、緩衝成分及び荷電した関心物質を含有する。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ及びＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗについては、本発明の第一の態様で説明した。
【００９５】
上記の比較は、イオン交換体（１）と（２ａ）又はイオン交換体（１）と（２ｂ）について本質的に同じ条件下で実施される測定をいい、ｐＨ、温度、溶媒組成、対イオン及び流速は同一である。破過容量は、フロースルー方式で同じ相対濃度の物質で（例えば、ｃ／ｃ_０＝１０％、ｃ／ｃ_０については実施例を参照）測定される。
【００９６】
典型的には、本発明のこの態様のイオン交換体に対して１種、２種又は３種以上の対照物質についての破過容量（３００ｃｍ／時の流速のフロースルーで１０％）は＞２ｍｇ／ｍｌゲル（例えば＞３又は４ｍｇ／ｍｌゲル）である。
【００９７】
様々な実施形態及びそれらの優先性は、本発明の第一の態様について定義されたイオン交換体に対するものと同じである。
以下、本発明を実施例で例示する。本発明は特許請求の範囲でさらに定義される。
【００９８】
【実施例】
１．確率的イオン交換吸着剤の合成
概要：
マトリックスの容積は沈降床の容積をいう。グラム単位で示すマトリックスの重量は吸引した乾燥重量をいう。大規模反応では、攪拌をモーター駆動式攪拌機で実施した。小規模反応（ゲル２０ｍｌまで）は振盪テーブル上の密封バイアル中で実施した。イオン交換体のアルキル化、エポキシ化、置換度の測定は従来法で実施した。必要に応じて、特に硫黄について元素分析を行った。
合成したイオン交換吸着剤は、ベースマトリックスとしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＡＰＢｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社製（スウェーデン、ウプサラ））を有していた。
【００９９】
１．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでのアリル基の導入
アリル化をアリルグリシジルエーテルで実施した。他の代替経路、例えば臭化アリルとの反応も存在する。
【０１００】
１．１．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換度、フェニル２０μｍｏｌ／ｍｌゲル）でのアリル基の導入
ａ）低度アリル置換
水１０ｍｌ中の５０ｇ（固形ゲル５０ｍｌ）のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換度、フェニル２０μｍｏｌ／ｍｌゲル）をＮａＯＨ含有（５０％）水溶液２０ｍｌ、ＮａＢＨ_４０．２ｇ及びＮａ_２ＳＯ_４０．５ｇと共に混合した。混合液を５０℃で１時間攪拌した。アリルグリシジルエーテル７ｍｌの添加後、懸濁液を激しい攪拌下に５０℃でさらに１８時間置いた。混合液を濾過後、ゲルを蒸留水５×５０ｍｌ、エタノール５×５０ｍｌ、蒸留水２×５０ｍｌ、０．２Ｍ酢酸２×５０ｍｌ及び蒸留水５×５０ｍｌで順次洗浄した。置換度はアリル０．１３ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）中程度アリル置換
手順は、アリルグリシジルエーテル２８ｍｌを使用したこと以外は、１．１．１．ａと同じであった。置換度はアリル０．２２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｃ）高度アリル含量
手順は、アリルグリシジルエーテル５０ｍｌを使用したこと以外は、１．１．１．ａと同じであった。置換度はアリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０１】
１．１．２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）でのアリル基の導入
ａ）低度アリル含量
水１０ｍｌ中の５０ｇ（固形ゲル５０ｍｌ）のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）をＮａＯＨ含有（５０％）水溶液２０ｍｌ、ＮａＢＨ_４０．２ｇ及びＮａ_２ＳＯ_４０．５ｇと共に混合した。混合液を５０℃で１時間攪拌した。アリルグリシジルエーテル７ｍｌの添加後、懸濁液を激しい攪拌下に５０℃でさらに１８時間置いた。混合液を濾過後、ゲルを蒸留水５×５０ｍｌ、エタノール５×５０ｍｌ、蒸留水２×５０ｍｌ、０．２Ｍ酢酸２×５０ｍｌ及び蒸留水５×５０ｍｌで順次洗浄した。置換度はアリル０．１７ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）中程度アリル含量
手順は、アリルグリシジルエーテル２８ｍｌを使用したこと以外は、１．１．２．ａと同じである。置換度はアリル０．２２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｃ）高度アリル含量
手順は、アリルグリシジルエーテル５０ｍｌを使用したこと以外は、１．１．２．ａと同じである。置換度はアリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０２】
１．２．スルホプロピルＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの調製
１．２．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換度、フェニル２０μｍｏｌ／ｍｌゲル）でのスルホプロピルの導入
ａ）１．１．１．ａで調製した中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ３と呼ぶ。
二亜硫酸ナトリウム９ｇを、水１５ｍｌ中の４５ｇ（固形ゲル４５ｍｌ）のアリル低置換度アリル（アリル０．１３ｍｍｏｌ／ｍｌゲル）低置換度Ｐｈｅｎｙｌ（フェニル２０μｍｏｌ／ｍｌゲル）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのスラリーに加えた。ＮａＯＨ水溶液（５０％）を添加してｐＨを６．５に調整した。反応混合液を室温で攪拌下にゆっくり空気を吹き込みながら１８時間保持した。混合液を濾過後、ゲルを蒸留水４×５０ｍｌ、０．５Ｍ ＨＣｌ２×５０ｍｌ及び１ｍＭ ＨＣｌ３×５０ｍｌで順次洗浄した。置換度はスルホプロピル０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）１．１．１．ｂで調製した中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ４と呼ぶ。
手順は、アリルの置換度が０．２２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであり、反応時間が１７時間であったこと以外は、１．２．１．ａと同じである。置換度はスルホプロピル０．１８ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０３】
１．２．２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）でのスルホプロピルの導入
ａ）１．１．２．ａで調製した中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ１と呼ぶ。
手順は、アリルの含量がアリル０．１７ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであり、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を使用したこと以外は、１．２．１．ａと同じである。置換度はスルホプロピル０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）１．１．２．ｂで調製した中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ２と呼ぶ。
手順は、アリルの含量がアリル０．２２ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであり、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高度置換、フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を使用したこと以外は、１．２．１．ａと同じである。置換度はスルホプロピル０．１５ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０４】
１．３．アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの活性化
５０ｍｌのアリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲル）、蒸留水５０ｍｌ及び酢酸ナトリウム２ｇの攪拌した懸濁液中に、持続する黄色が得られるまで臭素を加えた。次いで、ギ酸ナトリウムを懸濁液が十分に脱色するまで加えた。反応混合液を濾過し、ゲルを蒸留水２５０ｍｌで洗浄した。次いで、活性化ゲルを反応容器へ移して、適切なリガンド形成化合物とさらに反応させた。
【０１０５】
１．４．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗから得られる陰イオン交換体
１．４．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでの１，３−ジアミノプロパン由来のアミンリガンドの導入
ａ）１．１．２．ｃで調製した中間生成物から。得られた生成物をＡｎ１と呼ぶ。
５ｍｌの臭素活性化、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲル；フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を１，３−ジアミノプロパン（７．５ｍｌ、リガンド形成化合物）を含有する反応バイアルに移した。反応を攪拌下５５℃で１７時間続けた。反応混合液を濾過後、ゲルを蒸留水３×１０ｍｌ、０．５Ｍ ＨＣｌ３×１０ｍｌ及び最後に蒸留水３×１０ｍｌで順次洗浄した。置換度はイオン交換リガンド０．１５ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）１．１．１．ｃで調製した中間生成物から。得られた生成物をＡｎ２と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲル；フェニル２０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を使用したこと以外は、１．４．１．ａと同じである。置換度はイオン交換リガンド０．２５ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０６】
１．４．２．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン由来のアミンリガンドの導入
ａ）１．１．２．ｃで調製した中間生成物から。得られた生成物をＡｎ３と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲル；フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）及び、１，３−ジアミノプロパンの代わりに、蒸留水（１．５ｍｌ）中１，３−ジアミノ−２−プロパノール（３ｇ）の溶液を使用したこと以外は、１．４．１．と同じである。置換度はイオン交換リガンド０．１６ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）１．１．１．ｃで調製した中間生成物から。得られた生成物をＡｎ４と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４ｍｍｏｌ／ｍｌゲル；フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を使用したこと以外は、１．４．２．ａと同じである。置換度はイオン交換リガンド０．１６ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０７】
１．５．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗから得られる陽イオン交換体
１．５．１．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでのメルカプトプロピオン酸由来のカルボキシリガンドの導入
ａ）１．１．１．ｃで調製した中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ５と呼ぶ。
１００ｍｌの臭素活性化、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４２ｍｍｏｌ／ｍｌゲル；フェニル４０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を反応容器へ移し、１７．５ｍｌのメルカプトプロピオン酸（アリル基当り６当量）及びＮａＣｌ１２ｇの水溶液（蒸留水５０ｍｌ）と反応させた。添加の前に、ｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液で１１．５に調整した。反応を攪拌下５０℃で１８時間続けた。反応混合液の濾過及び蒸留水５００ｍｌでの洗浄によって、イオン交換ゲルを得た。置換度はＣＯ_２Ｈリガンド０．２７ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
ｂ）１．１．１．ｃで調製した中間生成物から。得られた生成物をＣａｔ５と呼ぶ。
手順は、アリル化Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４１ｍｍｏｌ／ｍｌゲル；フェニル２０μｍｏｌ／ｍｌゲル）を使用し、バッチサイズが５０％であったこと以外は、１．５．１．ａと同じであった。置換度はＣＯ_２Ｈリガンド０．２８ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０８】
１．６．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでのメルカプトプロピオン酸由来のカルボキシリガンド及び２−メルカプトピリジン由来のピリジルリガンドの導入
１．６．１．アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの調製
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ８０ｇをＮａＢＨ_４０．５ｇ、Ｎａ_２ＳＯ_４１３ｇ及び５０％ＮａＯＨ水溶液５０ｍｌと共に混合した。混合液を５０℃で１時間攪拌した。アリルグリシジルエーテル１００ｍｌの添加後、懸濁液を激しい攪拌下に５０℃でさらに１８時間置いた。混合液を濾過後、ゲルを蒸留水５００ｍｌ、エタノール５００ｍｌ、蒸留水２００ｍｌ、０．２Ｍ酢酸２００ｍｌ及び蒸留水５００ｍｌで順次洗浄した。置換度はアリル０．４１ｍｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０９】
１．６．２．アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの臭素化による活性化
これは、アリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用したこと以外は、上記１．３に記載の通り実施した。
【０１１０】
１．６．３．２−メルカプトピリジン由来のピリジルリガンド（低置換度）及びメルカプトプロピオン酸由来のカルボキシリガンドで置換されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの合成。生成物をＣａｔＡｎ１と呼ぶ。
反応バイアル中で、０．５Ｍ重炭酸ナトリウム５ｍｌ中の２−メルカプトピリジン０．５ｍｍｏｌの溶液のｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨ１０．５に調整した。別に、蒸留水１ｍｌ中３−メルカプトプロピオン酸１．２ｇの溶液を調製し、そのｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液の添加によって１１に調整した。２−メルカプトピリジン溶液を含有するバイアルに、１０ｍｌの臭素活性化、アリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル０．４１ｍｍｏｌ／ｍｌゲル）を加え、反応を攪拌下５０℃で継続した。１．５時間後、３−メルカプトプロピオン酸を含有する溶液を加え、混合液を４５℃で１６時間攪拌した。反応混合液を濾過し、ゲルを蒸留水５×１０ｍｌで洗浄した。微量分析により、ピリジンリガンドについて４３μｍｏｌ／ｍｌゲル及びプロピオン酸リガンドについて２５１μｍｏｌ／ｍｌゲルの置換度を得た。
【０１１１】
１．６．４．２−メルカプトピリジン由来のピリジルリガンド（中程度置換）及びメルカプトプロピオン酸由来のカルボキシリガンドで置換されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの合成。生成物をＣａｔＡｎ２と呼ぶ。
手順は、２−メルカプトピリジンの量を２倍に増したこと以外は、１．６．３．と同じであった。微量分析により、ピリジンリガンドについて８６μｍｏｌ／ｍｌゲル及びプロピオン酸リガンドについて２１５μｍｏｌ／ｍｌゲルの置換度を得た。
【０１１２】
１．６．５．２−メルカプトピリジン由来のピリジルリガンド（高度置換）及びメルカプトプロピオン酸由来のカルボキシリガンドで置換されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの合成。生成物をＣａｔＡｎ３と呼ぶ。
手順は、２−メルカプトピリジンの量を３倍に増したこと以外は、１．６．３．と同じであった。微量分析により、ピリジンリガンドについて１２７μｍｏｌ／ｍｌゲル及びプロピオン酸リガンドについて１７１μｍｏｌ／ｍｌゲルの置換度を得た。
【０１１３】
２．クロマトグラフィー
２．１．混合リガンド陽イオン交換媒体
３種類の精製タンパク質［塩基性（リゾチーム＝Ｌｙｓ）、中性〜弱塩基性（ＩｇＧ）及び酸性（ＢＳＡ）タンパク質を代表する］を使用して、新しいシリーズの「高塩」混合リガンド陽イオン交換媒体の破過容量（Ｑｂ_１０％）について特性決定した。リゾチームの結合及び溶出は、通常の陽イオン交換操作法、即ち、中性ｐＨでの吸着と、同じｐＨにおける高濃度の塩（例えば２ＭのＮａＣｌ）を含有する緩衝液での溶出によって実施した。ＩｇＧは、ｐＨ４．５で結合させ、比較的低濃度（０．１Ｍ）の塩を含有するｐＨ７．０の緩衝液で溶出させた。ＩｇＧは、高ｐＨよりも低ｐＨで各種媒体に対する吸着量を大幅に増すことができるので、低いｐＨで結合させた。ＢＳＡは、ＢＳＡが正に荷電されるｐＨ４．０（ＢＳＡのｐＩ＝４．９）で結合させ、ＩｇＧと同様に、ｐＨを７．０に上げることによって溶出させた。さらに、３種類の塩基性タンパク質（リボヌクレアーゼ、チトクロームＣ及びリゾチーム）の溶出伝導率を全ての混合リガンド陽イオン交換媒体について測定した。新しいシリーズの「高塩」混合リガンド陽イオン交換媒体について破過容量及び溶出伝導率の測定に使用した手順を以下に概説する。
【０１１４】
２．１．１．「高塩」条件下での破過容量（Ｑｂ _１０％ ）
混合リガンド陽イオン交換媒体が「高塩」媒体としての条件を満足するか否かの主な判定基準の一つは、同一条件下で操作される対照陽イオン交換体と比較して比較的高い濃度の塩の存在下でのタンパク質についての結合容量である。破過容量は以下に記載の先端分析（frontal analysis）の方法を用いて測定される。
【０１１５】
２．１．２．実験
緩衝液
緩衝液１：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８
緩衝液２：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０
緩衝液３：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．５
緩衝液４：２０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８
緩衝液５：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
【０１１６】
タンパク質溶液
１．リゾチーム：緩衝液１中４ｍｇ／ｍＬ
２．ＢＳＡ：緩衝液２中４ｍｇ／ｍＬ
３．ＩｇＧ：緩衝液３中４ｍｇ／ｍＬ
全ての緩衝液及びタンパク質溶液は、使用前に、０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＨＡフィルターで濾過した。
【０１１７】
２．１．３．クロマトグラフィーシステム
全ての実験は、Ｕｎｉｃｏｒｎ ３．１ソフトウエア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社製（スウェーデン、ウプサラ））を装備したＡｅｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００クロマトグラフィーシステムを用いて室温で実施した。試料を１５０ｍＬスーパーループからカラムに加えた。溶出液を１０ｍｍフローセルを用いて２８０ｎｍにおける吸光度測定により連続的にモニターした。
【０１１８】
先端分析
「高塩」混合リガンド陽イオン交換媒体の各々のプロトタイプをＨＲ５／５カラム（充填床容積＝１ｍＬ）に充填し、適切なｐＨ及び塩濃度（緩衝液１、２又は３）の緩衝液で平衡化した。適切なタンパク質溶液を１ｍＬ／分（即ち３００ｃｍ／時）の流速でカラムに供給した。試料の添加は、溶出液のＡ_２８０がカラムに加えた試料のＡ_２８０の１０％レベルに達するまで継続した。試料についての最大ＵＶシグナルは、ＵＶ検出器に試験溶液を直接注入することによって評価した。こうして得たデータに基づいて（式１参照）、添加タンパク質の濃度の１０％レベルにおける充填ゲルの破過容量（Ｑｂ_１０％）を計算できる。こうして得られた結果は、多数の「高塩」混合リガンド陽イオン交換媒体をスクリーニングするための基礎をなし、以下、３種類のタンパク質、即ち、リゾチーム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）について例示する。
【０１１９】
最大吸光度の１０％レベルでの破過（Ｑｂ_１０％）は以下の関係式を用いて計算した。
Ｑｂ_１０％＝（ＴＲ_１０％−Ｔ_ＲＤ）×Ｃ／Ｖ_Ｃ （１）
ＴＲ_１０％＝最大吸光度の１０％での保持時間（分）
Ｔ_ＲＤ＝系のボイド容積（分）
Ｃ＝供給タンパク質の濃度（４ｍｇ／ｍＬ）
Ｖ_Ｃ＝カラムの充填床容積（ｍＬ）
【０１２０】
２．１．５．機能試験
混合リガンド陽イオン交換媒体を１．０ｍＬのＨＲ５／５カラムに充填し、２０カラム容積の緩衝液Ａ（２０ｍＭピペラジン緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化した。５０μｌのタンパク質混合液（６ｍｇ／ｍＬリボヌクレアーゼ、２ｍｇ／ｍＬチトクロームＣ及び２ｍｇ／ｍＬリゾチーム）をカラムに加えて、１００％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａプラス２．０ＭのＮａＣｌ）への直線的勾配（勾配容積＝２０カラム容積）により溶出させた。流速は０．３ｍＬ／分（１００ｃｍ／時）に保持した。
【０１２１】
２．２．混合リガンド陰イオン交換媒体
本発明で提案される媒体が対照陰イオン交換体よりも高いイオン強度でタンパク質を吸着することを検証するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の破過容量を測定した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに結合した陰イオン交換リガンドをベースとする新しい「高塩」混合リガンドをこの試験のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗと比較した。加えて、ＢＳＡの回収率（脱着できる吸着ＢＳＡの量、詳細について以下を参照）についても試験した。さらに、３種類のタンパク質、即ち、コンアルブミン（Ｃｏｎ Ａ）、ラクトアルブミン（Ｌａｃｔａｌｂ）及び大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）、の溶出伝導率をまた全ての陰イオン交換体について測定した。この機能試験を用いて、他のタンパク質について高塩条件下での遅延についても同様に検証した。
【０１２２】
２．２．１．高塩条件下での破過容量（Ｑｂ _１０％ ）
Ｑｂ_１０％値は、同一条件下で操作される対照陰イオン交換体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗと対比して比較的高い塩濃度で評価した。様々な陰イオン交換媒体についてのＱｂ_１０％値は以下に記載の先端分析の方法を用いて測定した。
【０１２３】
ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍＬ）の溶液は、０．２５ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭピペラジン（ｐＨ＝６．０）中で調製した。緩衝液及びタンパク質溶液は使用前に０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＨＡフィルターで濾過し、実験は２．１．３．に記載したものと同一の装置及び機器設定で実施した。
【０１２４】
混合リガンド陰イオン交換媒体の各プロトタイプをＨＲ５／５カラム（充填床容積＝１ｍＬ）に充填し、ピペラジン緩衝液（２０ｍＭピペラジン、ｐＨ＝６．０、０．２５ＭのＮａＣｌを含有）で平衡化した。ＢＳＡ試料溶液の最大吸光度の１０％レベルにおける破過容量（Ｑｂ_{１０％ＢＳＡ}）を２．１．４．に記載の手順で計算した。
【０１２５】
２．２．２．回収率
カラムのタイプ、充填床容積、緩衝液、タンパク質溶液、流速及び機器の種類は上記の通りである。ピペラジン緩衝液（２０ｍＭピペラジン、ＨＣｌ、ｐＨ＝６．０、０．２５ＭのＮａＣｌ）で平衡化したカラムに、ＢＳＡ溶液を５０ｍＬスーパールーフから、その破過容量の３０％に相当する量が添加されるまで、加えた。次いで、カラムを２床容積の平衡緩衝液で洗浄し、結合したＢＳＡを脱着緩衝液（２０ｍＭピペラジン、ｐＨ＝６．０、２．０ＭのＮａＣｌ）で溶出した。溶出したＢＳＡの量を計算し、ＢＳＡの回収率を以下の関係式を用いて確定した。
溶出したＢＳＡの濃度は次の式２で計算した。
Ｃ_Ｓ＝Ａ／ε・ｂ （２）
Ｃ_Ｓ＝溶出したＢＳＡ試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ａ＝２８０ｎｍにおける吸光度
ε＝特定の波長におけるモル吸光率、Ｍ^−１ｃｍ^−１
ｂ＝光路長、ｃｍ
次の式３をＢＳＡの回収率の計算に使用した。
回収率、％＝Ｃ_Ｓ・Ｖ_Ｓ／Ｃ_Ｌ・Ｖ_Ｌ （３）
Ｖ_Ｓ＝溶出したＢＳＡ溶液の容積、ｍＬ
Ｃ_Ｌ＝添加したＢＳＡ溶液の濃度、ｍｇ／ｍＬ
Ｖ_Ｌ＝添加したＢＳＡ溶液の容積、ｍＬ
【０１２６】
２．２．３．機能試験
「高塩」混合リガンド陰イオン交換媒体をＨＲ５／５カラム（１ｍＬ床容積）に充填し、２０カラム容積のＡ−緩衝液（２０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化した。５０μｌのタンパク質混合液（６ｍｇ／ｍＬＣｏｎ Ａ、４ｍｇ／ｍＬラクトアルブミン及び６ｍｇ／ｍＬＳＴＩ）をカラムに加えて、１００％のＢ−緩衝液（Ａ−緩衝液プラス２．０ＭのＮａＣｌ）への直線的勾配（勾配容積＝２０カラム容積）により溶出させた。流速を０．３ｍＬ／分（１００ｃｍ／時）に保持した。
【０１２７】
２．３．結果
２．３．１．高塩条件下での混合リガンド陽イオン交換媒体の破過容量及び通常の陽イオン交換クロマトグラフィー条件下での溶出伝導率
一連の代表的な「高塩」混合リガンド陽イオン交換媒体（表１参照）についての破過容量について得られた結果を表２にまとめた。表１は、本発明の幾らかの基本概念を例示するために用いた様々な媒体の幾らかの特定のリガンド性質を示す。大多数のこれらの新しい混合リガンド陽イオン交換体のリガンド比は３〜１４の範囲内にあった。対照陽イオン交換体として、市販のＳｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ（又はＳＰ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用した。そのリガンド濃度は約０．２２ｍｍｏｌ／充填ゲルｍＬであった。結果（表２）は以下の傾向を示す。
１．新しい陽イオン交換リガンドは、１種類を除いて、対照陽イオン交換体ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比較して、３種類のタンパク質すべてに対して格段に高いＱｂ_１０％を有する。
２．ＣａｔＡｎ３はＬｙｓ（５４ｍｇ／ｍＬ）に対して、Ｃａｔ５及びＣａｔ６はＨＳＡ（４５ｍｇ／ｍＬ）に対して、ＣａｔＡｎ１はＩｇＧ（２６ｍｇ／ｍＬ）に対して、最大Ｑｂ_１０％を与えた。これらの値は、上記４種類の媒体で、対照陽イオン交換体（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）に比べて、Ｌｙｓ、ＨＳＡ及びＩｇＧについてそれぞれ１３００％、１５００％及び２６００％の増加に相当する。
３．媒体Ｃａｔ１、Ｃａｔ２及びＣａｔ３は、ＩｇＧよりもＢＳＡに対して格段に高いＱｂ_１０％を有する。これらの結果は、これらの媒体がＩｇＧ製剤からＢＳＡを除去するのに有用であることを示唆する。
４．３種類の媒体ＣａｔＡｎ１〜３は、リゾチーム及びＩｇＧのＱｂ_１０％値が２つの混合リガンド（メルカプトプロピオン酸及びメルカプトピリジン）のリガンド比にどのように関係しているかを示す。リガンド比（メルカプトプロピオン酸のリガンド密度／メルカプトピリジンのリガンド密度）が減少すると、Ｑｂ_{１０％Ｌｙｓ}は増加し、Ｑｂ_{１０％ＩｇＧ}は減少する（表１及び表２）。３種類のタンパク質の通常の陽イオン交換クロマトグラフィーにおける溶出伝導率（表２）も、媒体ＣａｔＡｎ１〜３のリガンド比により選択性に大きい変動を示す。
【０１２８】
２．３．２．高塩条件下での混合リガンド陰イオン交換媒体の破過容量及び通常の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける溶出伝導率
一連の代表的な「高塩」混合リガンド陰イオン交換媒体（Ａｎ１〜４）についての破過容量について得られた結果を表３にまとめ、リガンドの構造を表１に示した。対照陰イオン交換体として、市販のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用した。結果は以下の傾向を示す。
１．新しい混合−リガンド陰イオン交換媒体は、対照陰イオン交換体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比べて、３種類のタンパク質すべてに対して格段に高い溶出伝導率を有する（表３）。
２．新しい陰イオン交換リガンドは、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比較して、ＢＳＡに対して格段に高い破過容量（Ｑｂ_{１０％ＢＳＡ}）を有する。最大Ｑｂ_１０％値を与える媒体は、対照陰イオン交換体に比べて２９００％の増加に相当する。表３に示す媒体の中で最も低いＱｂ_１０％値を与えた媒体は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比べて２２００％の増加を示した。
３．回収率のデータは、吸着ＢＳＡが塩工程によって７１％を超える回収率で溶出できることを示す（表３）。
【０１２９】
【表１】

【０１３０】
【表２】

【０１３１】
【表３】