JP5948627B2 - 線維芽細胞成長因子（ｆｇｆ）のリモデリングと糖質ペグ化 - Google Patents

線維芽細胞成長因子（ｆｇｆ）のリモデリングと糖質ペグ化 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は２００４年１０月２９日に出願の米国仮特許出願６０／６２３，３４２に関連し、全体を多目的のために本出願に関して参考として組み入れる。
線維芽細胞成長因子（FGF）は広範囲の細胞組織型の成長、増殖、生存及び分化を増進する。原型線維芽細胞成長因子（FGF）のFGF―1及びFGF―2は最初脳と下垂体から線維芽細胞用分裂促進因子として単離された。しかしFGF―1、FGF―2及び線維芽成長因子は通常成長組織や成人組織で広く発現され、血管新生、有糸分裂誘発、細胞分化及び組織損傷修
復を含む多重生物活性を有する（例えばベイアード、エイ等（Baird, A. et.al.）、キャンサーセル（Cancer Cells）、3巻、２３９−２４３頁（１９９１）及びバーゲス、ダブリュエッチ等（Burgess, W.H., et al.）、アニュアルレビュオブバイオケミストリー（Annu. Rev. Biochem.）、５８巻、５７５−６０６頁（１９８９）参照）。
公開文献によると、FGFファミリーは少なくともFGF―1からFGF―２５の２５の構成員からなる。FGF群における２５の構成員の分子量は１７キロダルトン乃至３４キロダルトンの範囲で、13乃至７１％のアミノ酸同一性を共有する。FGFは脊椎動物種間で遺伝子構造とアミノ酸配列両者を高度に保存する。
哺乳類FGFファミリーの２５の構成員は多くの組織で差別的に発現される。その構成員は個々にはユニークではあるが類似発現様式を有するサブファミリーに分かれる。あるFGFは胚発生時にのみに発現される（例えばFＧＦ３，４、８、１５、１７及び１９）一方、他は胚組織及び成人組織で発現される。例えばFGF―16伝令RNAは主として成人組織のラット心臓で発現される。しかしラットの胚ではFGF―16伝令RNAは褐色脂肪組織で主として発現される（例えば三宅、エイ等（Miyake A, et al.）、バイオケミストリーバイオフィジックリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１９９８年、２４３巻、１４８−１５２頁参照）。
大部分のFGF（FGF３−８、１０、１５、１７−１９及び２１−２５）はアミノ末端シグナルペプチドを有し細胞から容易に分泌されるが、FGF９、１６及び２０は明白なアミノ末端シグナルペプチドを欠くにもかかわらず分泌される（例えば、宮本、エム等（Miyamaoto,M., et al.）、モレキュラーセルバイオロジー（Mol. Cell. Biol.）、１３巻、４２５１−４２５９頁参照）。FGFの第三サブセット（FGF１１−１４）はシグナル配列を欠き細胞内に留まると考えられる。
上記のごとくFGF―９、FGF―１６及びFGF―２０からなるFGFタンパク質のサブファミリーは、核局在化シグナルを含むが古典的シグナル配列に欠け分泌される。これらのFGFは発育神経系と成人神経系で発現され、神経系の成長と機能での役割を示唆する（例えば、スモールウッド、ピーエム等（Smallwood P.M., et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、（１９９６年）、９３巻、９８５０−９８５７頁参照）。実際にFGFコード化相補DNAがラットの脳から単離された（例えば米国特許６，７９７，６９５参照）。FGFファミリー構成員中でFGF―２０はFGF―９とFGF―１６と最も類似している（それぞれ７０％と６２％のアミノ酸同一性）。
ヒト疾患での多くの研究と同様に遺伝子ノックアウトマウスでの研究により、FGFは末梢神経系と中枢神経系両者の細胞に神経栄養性であり、哺乳類骨格系の発育に重要である。神経系発育と機能での役割は、FGF―２０伝令RNAが脳の黒質緻密部で優先的に発現されることを示すインサイツハイブリッド形成研究により支持される。試験管内組み換えラットFGF―２０が培養物中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を強めることを示す研究により、更に神経系機能が支持されることが見出された。
他の研究では高度のFGF―２１伝令RNA発現が肝臓で起こることが示され、ヒトFGF―２１が肝疾患発生と回復で役立つ。FGF―２１は又精巣と胸腺で発現し、それ故精巣機能障害や胸腺由来細胞機能の発生か回復に役立つ（例えば米国特許６，７１６，６２６参照）。
これらの広範囲で強力な活性により、FGFは筋骨格状態、骨折、靱帯組織修復、腱炎、滑液包炎等のような創傷治癒、例えば、火傷、切り傷、裂傷、褥瘡、遅効治癒性潰瘍のような皮膚状態、組織保護、修復、心筋梗塞と虚血時の血管新生誘導、炎症状態と炎症疾患（例えば炎症性腸疾患を含む腸炎症、例えばジェファーズ等（Jeffers, M., et al.）、ガストロエンテロロジー（Gastroenterology）、２００２年、１２３巻、１１５１−１１６２頁参照）、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）、および脳卒中のような神経性状態の治療、黄斑変性症を含む眼疾患治療、癌症状と治療（例えばジェファーズ、エム等（Jeffers, M., et al.）、キャンサーリサーチ（Cancer Research）、６１巻、３１３１―３１３８頁、４月１日、（２００１年）及びジェファーズ等（Jeffers,, et al.）、エキスパートオピニオンオンセラピューティックターゲット（Expert Opinion on Therapeutic Targets）、（２００２年）、６巻（４号）、４６９−４８２頁参照）及び糖尿病の治療を含む多くの異なる徴候用治療薬として探求されている。残念ながら疾患や状態治療用FGF―９、FGF―１８、FGF―２０及びFGF―２１のような治療用タンパク質の投与は、例えば短い半減期と変異原性物性により複雑になり得る。
ポリエチレングリコール（“PEG”）はポリペプチドと複合化された代表的ポリマーである。ペプチド治療剤誘導化でのPEGの使用により、ペプチド免疫原性の減少と半減期を含む薬動力学の改良が示された。例えば米国特許４，１７９，３３７（デイビス等（Davis, et al.））はポリエチレングリコール（PEG）かポリプロピレングリコールと結合した酵素やペプチドのような非免疫原性ポリペプチドに関する。ポリペプチド１モル当たり１０乃至１００モルの間のポリマーを使用し、少なくとも１５％の生理活性を維持した。更に問題のポリペプチドPEG複合物大きさの増加により循環時のクリアランス時間が延長された。デイビス等（Davis, et al.）開示の方法は化学的ペグ化法である。
ペプチドの化学修飾はしばしばペプチド修飾に用いた化学の非選択性により好ましくないペプチド活性の損失が生じる。例えば修飾基が水溶性ペプチド、例えばPEGである場合、ペプチドに対するPEGとその誘導体付着の主様式では、ペプチドアミノ酸残基による非特異的結合となる。水溶性ポリマーとインターロイキン―２との複合物（フィッシャー等（Fisher et al.）、ブリティッシュジャーナルオブヘマトロジー（Br. J. Haematol.）、８２巻、６５４頁（１９９２年））、顆粒球コロニー刺激因子との複合物（佐竹石川等（Satake−Ishikawa et al.）、セルストラクチャーアンドファンクション（Cell Struct. Funct.）、１７巻、１５７頁（１９９２年））、腫瘍壊死因子との複合物（堤等（Tsutsumi et al.）、ブリティッシュジャーナルオブキャンサー（Bri. J. Cancer）、７１巻、９６３頁、（１９９６年））及び線維芽細胞成長因子との複合物（クラーク等（Clark et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻２１９６９頁（１９９６年））の研究で、これらタンパク質の化学的ペグ化によりペプチドとの生体内受容体結合活性が低下することが示された。
多くの化学的ペグ化法でポリエチレングリコールが実質的に無作為に非特異的にペプチドバックボーン上の反応性残基に付加する。治療用ペプチド産生には特異的標識化した容易に特性化できる実質的に均質な産物を形成する誘導化戦略を用いることが明らかに望ましい。特異的に標識化したペプチドを産生する有望な手段は、糖転移酵素のような酵素を通して修飾糖成分をペプチドに付加することである。
酵素ベースの合成は位置選択性と立体選択性で利点を有する。更に非保護基質を用いて酵素合成を行う。炭水化物合成で二つの主要種酵素である糖転移酵素（例えば、シアル酸転移酵素、オリゴ糖転移酵素、N−アセチルグルコサミニル転移酵素）とグリコシダーゼを用いる。グリコシダーゼは更にエキソグリコシダーゼ（例えば、β―マンノシダーゼ、β―グリコシダーゼ）とエンドグリコシダアーゼ（例えば、エンドA、エンドM）に分類される。この種酵素のそれぞれをうまく合成に用いて炭水化物が産生された。一般的総説についてはクロート等（Crout et al.）、カレントオピニオンオンオンケミカルバイオロジー（Curr. Opin. Chem. Biol.）、２巻、９８−１１１頁（１９９８年）を参照。
糖転移酵素は糖ペプチド上のオリゴ糖構造を修飾し、立体化学的、位置化学的に良く制御された特異的産物を産生する。糖転移酵素を用いてオリゴ糖を産生し、特に哺乳類細胞に産生の糖ペプチド上の末端Ｎ−連結及びO−連結炭水化物構造を修飾する。例えば、糖ペプチドの末端オリゴ糖が完全にシアル酸付加し且つ／又はフコシル化され、糖ペプチドの薬動力学や種々の他生物物性が改良された一貫性のある糖構造を提供する。例えば、β―１，４−ガラクトシル基転移酵素を用いて、炭水化物合成での糖転移酵素利用の実例であるラクトサミンが合成された（例えばウオン等（Wong et al.）、ジャーナルオブオルガニックケミストリー（J. Org. Chem.）、４７巻、５４１６−５４１８（１９８２年）参照）。更に多くの合成法でα―シアル酸転移酵素を利用してシチジン―５‘−一リン酸―N―アセチルノイラミン酸からガラクトースの３―水酸基位か６−水酸基位にシアル酸を転移した（例えば、ケビン等（Kevin et al.）、ケミストリオブヨーロピアンジャーナル（Chem. Eur. J.）、２巻、１３５９―１３６２頁（１９９６年）参照）。フコースユニットをグアノシン―５’―二リン酸フコースから糖類受容体の特定水酸基に転移する合成経路でフコシル基転移酵素を用いる。例えば市川（Ichikawa）はクローン化フコシル転移酵素によるシアル酸付加ラクトサミンのフコシル化を伴う方法を用いて、シアリルルイス―Ｘを産生した（市川等（Ichikawa et al.）、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）、１１４巻、９２８３−９２９８（１９９２年））。治療用複合糖質の最近の進歩に関する検討は、ケラー等（Koeller et al.）、ネーチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、１８巻、８３５―８４１頁（２０００年）参照。又米国特許５，８７６，９８０、米国特許６，０３０，８１５、米国特許５，７２８，５５４、米国特許５，９２２，５７７及びWO/９８３１８２６参照。
グリコシダーゼは又糖類産生に使用できる。グリコシダーゼは通常グリコシド結合加水分解を触媒する。しかし適切条件下ではグリコシダーゼはこの結合形成に使用できる。炭水化物合成に用いる大部分のグリコシダーゼはエキソグリコシダアーゼである。グリコシル転移が基質の非還元性末端で起こる。このグリコシダーゼはグリコシル酵素中間体でグリコシル供与体を取り込み、水により妨害されて加水分解物を生ずるか、又は受容体により新規グリコシドかオリゴ糖を生ずる。エキソグリコシダーゼを用いる典型的経路は、β―マンノシダーゼ作用で形成した取り扱いにくいβ―マンノシド結合を含む全N―結合糖ペプチドのコア三糖合成である（シン等（Singh et al.）、ケミカルコミュニケーション（Chem. Commun.）、９９３−９９４頁（１９９６年））。
グリコシド結合形成にグリコシダーゼを用いる他の代表的な適用では、変異グリコシダーゼを産生して活性部位内の正常な求核的アミノ酸を非求核的アミノ酸に変える。変異酵素はグリコシド結合を加水分解せずにこの結合をまだ形成できる。変異グリコシダーゼを用いてα―フッ化グリコシル供与体とグリコシド受容体分子を用いたオリゴ糖を産生する（ウイザーズ等（Withers et al.）、米国特許５，７１６，８１２）。変異グリコシダーゼは遊離オリゴ糖形成には有用であるが、この酵素によりグリコシル供与体がグリコシル化ペプチドか非グリコシル化ペプチドに付加できるか、或いはこれら酵素は非活性化グリコシル供与体と一緒には用いられないかを示す必要が未だある。
その使用はエキソグリコシダーゼ使用に比しまれであるが、エンドグリコシダアーゼは又炭水化物産生に用いられる。エンドグリコシダアーゼ使用に基づく方法は単糖よりむしろオリゴ糖が転移される利点がある。エンド―Fやエンド―Mのようなエンド―β―N―アセチルグルコサミンを用いて、オリゴ糖断片が基質に付加された（ウオン等（Wang et al.）、テトラヘドロンレター（Tetrahedron Lett.）、３７巻、１９７５―１９７８及び羽田等（Haneda et al.）、カーボハイドレートリサーチ（Carbohydr. Res.）、２９２巻、６１−７０頁（１９９６年））。
炭水化物産生での使用以外に、上で検討の酵素は同様に糖ペプチド合成に応用される。均質糖鎖栄養素のリボヌクレアーゼB合成が報告された（ビッテ、ケイ等（Witte K. et al.）、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）、１１９巻、２１１４―２１１８頁（１９９７年））。リボヌクレアーゼBの高マンノースコアがその糖ペプチドをエンドグリコシダアーゼHで処理して切断した。この切断は二つのコアGlcNAｃ残基間で特異的に起こった。次いで四糖シアリルルイスXがβ―１，４−ガラクトシル基転移酵素、α―２，３―シアル酸転移酵素、α―１，３−フコシル基転移酵素Vを順次用いて、均質タンパク質上の残留GlcNAcアンカー部位に酵素的に再構築された。酵素触媒の各段階は高収率で進んだ。
化学的合成要素と酵素的合成要素の両者を組み合わす方法も又知られている。例えば山本と共同研究者（カーボハイドレートリサーチ（Carbohydr. Res.）、３０５巻、４１５−４２２頁（１９９８年））はエンドグリコシダアーゼを用いて糖ペプチドであるグリコシル化ペプチドTの化学酵素的合成を報告した。純粋に化学的手段でN―アセチルグルコサミニルペプチドが合成された。次いでこのペプチドをヒトトランスフェリン糖ペプチドのオリゴ糖で酵素的に産生した。エンド―β―N―アセチルグルコサミニダーセで処理して糖部分をこのペプチドに付加した。生成グルコシル化ペプチドは、ペプチドTやN―アセチルグルコサミニルペプチドTに比してタンパク質分解に対し非常に安定且つ耐性であった。
ペプチド構造をレポーター群で修飾するためにグルコシル転移酵素の使用が探求された。例えば、ブロッスマー等（Brossmer et al.）（米国特許５，４０５，７５３）はシアル酸蛍光標識化シチジン一リン酸（“CMP”）誘導体形成と、シアル酸転移酵素活性と細胞表面、糖タンパク質及びガングリオシドの蛍光標識のためのアッセイでの蛍光性グリコシドの使用を開示した。グロス等（Gross et al.）（アナリティカルバイオケミストリー（Analyt. Biochem.）、１８６巻、１２７頁（１９９０年）は類似のアッセイを記述している。ビーン等（Bean et al.）（米国特許５，４３２，０５９）は不完全グリコシル化タンパク質の再グリコシル化を用いるグリコシル化欠損症のアッセイを開示している。蛍光標識化CMPグリコシドによりこの欠損タンパク質を再グリコシル化する。各蛍光性シアル酸誘導体を９位か、通常シアル酸ではアセチル化されたアミン位のいずれかで蛍光性成分と置換する。蛍光性シアル酸誘導体を用いる方法はグリコシル転移酵素の存在又は非グリコシル化糖タンパク質又は不適切グリコシル化糖タンパク質に対するアッセイである。アッセイを少量の酵素か生物起源試料の糖タンパク質上で行う。修飾シアル酸を用いた実験規模又は工業規模でのグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドの酵素的誘導体化に付いては、これらの文献のいずれでも開示も示唆もされていない。
糖ペプチド質上グリコシル残基をそれに続く化学的産生で活性化するために又酵素法が用いられた。グリコシル残基は通常ガラクトース酸化酵素を用いて活性化され、末端ガラクトース残基を相応アルデヒドに変換する。このアルデヒドは次いでアミン含有修飾基と結合する。例えばカサレス等（Casares et al.）（ネーチャーバイオテクノロジー（Nature Biotech.）、１９巻、１４２頁（２００１年））は、ドキソルビシンを組み換え型MHCIIペプチドキメラの酸化ガラクトース残基に付着した。
グリコシル残基は又ケトン基を有するように修飾された。例えば、マハル（Mahal）と共同研究者（サイエンス（Science）、２７６巻、１１２５頁（１９９７年））は天然基質では通常アセチル基が占める位置にケトン機能性を有するN―レブリノイルマンノサミン（“ManLev”）を産生した。細胞をこのManLevで処理してケトン基を細胞表面に組み入れた。サクソン等（Saxon et al.）、サイエンス（Science）、２８７巻、２００７頁（２０００年）、ハン等（Hang et al.）ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）、１２３巻、１２４２頁（２００１年）、ヤレマ等（Yarema et al.）、ジャーナルオブオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７３巻、３１１６８頁（１９９８年）及びチャーター等（Charter et al.）、グリコバイオロジー（Glycobiology）、１０巻、１０４９頁（２０００年）参照。
炭水化物は幾つかの方法で糖ペプチドに付着するが、アスパラギンとのN−結合、セリンとスレオニンとのムチン型O−結合が組換え型糖タンパク質治療剤と最も良く関連する。明らかにタンパク質領域と構造を含む他因子も役割を果たすが、タンパク質のグリコシル化開始に関する決定因子は一次配列状況である。N−結合グリコシル化は共通配列NXS/Tで起こり、ここでXはプロリン以外の任意アミノ酸である。
本発明は新規導入のＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位含有のFGF変異体を提供し、これら組換え型FGF変異体のグリコシル化及び／又は糖質ペグ化に柔軟性を提供することでこれらの必要性に答える。更に該発明はＮ−連結又はO−連結変異FGFペプチドを水溶性ポリマー、治療成分、生体分子及び類似体のような修飾基で修飾する工業的実用法を提供する。特に興味があるのは、修飾変異FGFが改良物性を有し治療薬や診断薬としての使用を強化する方法である。
さて一個以上の修飾基（例えば、非グルコシド修飾基）で線維芽細胞成長因子を制御修飾することで、対応天然（非修飾）FGFに比し改良された薬動力学物性を有する新規FGFペプチド複合体が得られることが見出された。更に該発明のFGFペプチド複合体を信頼性と再現性のある費用効率の高い産生法が見出され且つ開発された。
一様態では該発明はFGFペプチドとFGFペプチドのアミノ酸残基に付着したグリコシル結合基―ポリエチレングリコールカセットからなるFGF複合体を提供する。
典型的実施形態では該発明の複合糖質化FGF分子は、グリコシル化FGFペプチド又は非グリコシル化FGFペプチドと、その構造内にポリマー型修飾基、例えばポリエチレングリコールのような修飾基を含む酵素的転移可能な糖成分間で複合体を酵素仲介により形成して産生する。この修飾基は直接か（即ち二つの反応基の反応により形成する単一基を通して）、又はリンカー成分、例えば置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル等を通して糖成分と付着する。
一様態では本発明はPEG成分と技術的に認知のFGFと同じかさもなければ類似の生体内活性を有するペプチド間の複合体を提供する。該発明のこの複合体では、PEG成分はグリコシル連結基か無傷グリコシル連結基を通してペプチドと共有結合で付着する。典型的無傷グリコシル連結基としてはPEGで誘導体化したシアル酸成分が挙げられる。
ポリマー型修飾基を有する糖成分はFGFグリコシル成分の任意位置で付着できる。更にポリマー型修飾基は野生型ＦＧＦペプチド又は変異ＦＧＦペプチドのアミノ酸配列の任意位置でグリコシル残基と結合できる。
典型的実施形態では該発明によりポリマー型修飾基とグリコシル連結基で複合化したFGFペプチドが得られる。典型的FGFペプチド複合物としては以下から選んだ式を有するグリコシル連結基が挙げられる。

式Iと式IIでR2は水素原子、CH2OR７、COOR7、COO−M+又はOR7で、R7は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキルである。記号R3、R４、R５、R６、及びR６‘は独立に水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、OR8、NHC(O)R9を表す。M+は金属である。指数ｄは０か１である。R８とR９は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル又はシアル酸から独立に選ばれる。R3、R４、R５、R６又はR６‘の少なくとも一つはポリマー型修飾基、例えば、PEGを含む。代表的実施形態ではR６とR６’はこれらが付着した炭素原子と共にシアリル成分側鎖成分である。更なる代表的実施形態ではこの側鎖はポリマー型修飾基で官能化される。
ここで検討するように該発明の複合物で用いるPEGは直鎖状でも分岐状でも良い。該発明の本実施形態による分岐PEG含有ペプチド複合物形成に用いる典型的前駆体は以下の式を有する。


この式による分岐ポリマー種は実質的に水溶性ポリマーである。X3'はイオン化可能基（例えばOH、COOH、H2PO4、HSO3、NH2及びその塩など）又は他反応性官能基、例えば以下の基を含む成分である。Cは炭素原子である。X5、R１６及びR１７は非反応性基（例えば、水素原子、非置換アルキル又は非置換ヘテロアルキル）とポリマーアーム（例えばPEG）から独立に選ぶ。X２及びX４は好ましくは生理的条件下では実質的に非反応性で、同一又は異なっても良い結合断片である。代表的リンカーとしては芳香族成分もエステル成分も含まれれない。代わりにこれら結合は生理関連条件下で分解するように設計した一つ以上の成分、例えばエステル、ジスルフィドなどが挙げられる。X２及びX４によりポリマーアームR16とR１７を炭素原子と連結する。X3'がリンカー−糖又はリンカー−糖カセットのような補足反応性を持つ反応性官能基と反応する場合、X3'は結合断片成分X3に変換する。
代表的実施形態ではポリマー型修飾基は、通常グリコシルコア上のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子）により以下に示すようにリンカーＬを通してグリコシル連結基と結合する。


R1はポリマー型修飾基であり、Lは一つの結合及び一つの連結基から選ぶ。指数ｗは１―６、好ましくは１―３、より好ましくは１―２から選んだ整数を表す。代表的連結基としては置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル成分及びシアル酸が挙げられる。リンカーの代表的成分はアシル成分である。他の代表的連結基はアミノ酸残基（例えば、システイン、セリン、リシン及び短鎖オリゴペプチド、例えば、Lys―Lys、Lys―Lys―Lys、Cys―Lys、Ser―Lys等）である。
Lが結合の場合、R1前駆体上の反応性官能基とグリコシル連結基前駆体上の補足的反応性を持つ反応性官能基との反応でＬは形成される。Lが非ゼロ次連結基の場合、LはR1前駆体と反応する前にグリコシル基上に配置されても良い。代わりにR1とL前駆体を予め形成したカセットに組み込み、次いでグリコシル成分に付着しても良い。ここに示すように適切な反応性官能基を持つ前駆体の選択作成は、技術の熟知者能力の範囲内である。更に該前駆体の連結は技術的に良く知られる化学により進められる。
他様態では本発明により変異線維芽細胞成長因子をコードするポリヌクレオチドからなる単離核酸が得られる。該変異線維芽細胞成長因子は野生型線維芽細胞成長因子には存在しない一つ以上のＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む。幾つかの実施形態では変異FGF―２０コード化核酸はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を有する野生型線維芽細胞成長因子をコードする相応野生型配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４。１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。幾つかの他実施形態では変異FGF―２１コード化核酸はSEQIDNO:１４６のアミノ酸配列を有する野生型線維芽細胞成長因子をコードする相応野生型配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
他様態では本発明により核酸、例えば、変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列を含む単離核酸からなる発現カセットや細胞が得られる。変異線維芽細胞成長因子としては野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のＮ−連結グリコシル化部位又はO−連結グリコシル化部位が挙げられる。
他様態では本発明により野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子が得られる。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１４６のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。
他様態では本発明により野生型線維芽細胞成長因子に存在しないＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子作成法が提供される。本方法は変異線維芽細胞成長因子を組み換え的に産生する段階と、新規グリコシル化部位で変異線維芽細胞成長因子をグリコシル化する段階を含む。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１４６のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。
更なる様態では本発明は野生型線維芽細胞成長因子に存在しないＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む治療有効量の変異線維芽細胞成長因子を有する薬剤組成を提供する。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１４６のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。
上記様態のそれぞれで変異線維芽細胞成長因子は一つ以上の修飾基、好ましくは複合糖質化により一つ以上の修飾基と任意に複合化し、該グリコシル化部位と該修飾基間にグリコシル連結基を生成しても良い。代表的修飾基はポリエチレングリコールである。
図１Aに異なる温度、時間、ベクター及び大腸菌株でのヒトFGF―２０誘導のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS―PAGE）分析結果を示す。、レーン１及び１４：分子量マーカー（キロダルトンの大きさで表示）（誘導温度）；レーン２−９及び１５−１８：37℃；レーン１０−１３及び１９−２２：20℃。使用株：レーン２−４、６−８及び１０−１２、W3110；レーン５，９及び１３、BL21（DE3）；レーン１５−１７及び１９−２１、大腸菌（trxb、gor、supp）；レーン１８及び２２では大腸菌（trxb、gor、supp）（DE3）。使用ベクター：レーン２，６，１０、１５及び１９ではベクター＃１を使用し、レーン３，７、１１、１６及び２０ではベクター＃２を使用し、レーン４，８、１２、１７及び２１ではベクター＃３を使用し、レーン５，９、１３、１８及び２２ではベクター＃４を使用する。
図１Bに異なる温度と大腸菌株でのヒトFGF―２１溶解度のSDS―PAGE分析結果を示し、レーン１は分子量マーカー（キロダルトンの大きさ）である。偶数はペレットを表し、奇数は上澄みを表す。使用誘導温度：レーン２−３：２０℃；レーン４−５：30℃；レーン６−７：37℃、レーン８−９では37℃。使用株：レーン６−７、BL21（DE3）；レーン２−５及び８−９、大腸菌（trxb、gor、supp）（DE3）。ベクター＃４を使用した。
図１に異なる温度、時間、ベクター及び大腸菌株でのヒトFGF―２０誘導のSDS―PAGE分析結果を示す。レーン１及び１５：分子量マーカー（キロダルトンの大きさ）；レーン２；非誘導であり（誘導温度）；レーン３−１０及び１６−２０：37℃、レーン１１−１４及び２１−２３：20℃。使用株：レーン３−５、７−９及び１１−１３、W3110；レーン６，１０及び１４、BL21（DE3）；レーン１６−１９及び２１−２３、大腸菌（trxb、gor、supp）；レーン２０、大腸菌（trxb、gor、supp）（DE3）。使用ベクター：レーン３，７，１１，１７及び２１ではベクター＃１であり、レーン４，８、１２，１８及び２２ではベクター＃２であり、レーン５，９，１３，１９及び２３ではベクター＃３であり、レーン６、１０，１４及び２０ではベクター＃４である。
図１Dに異なる温度と大腸菌株でのヒトFGF―２１溶解度のSDS―PAGE分析結果を示す。レーン１＋１ｂ：分子量マーカー（キロダルトンの大きさ）。偶数はペレットを表し、奇数は上澄みを表す。使用誘導温度；レーン２−３及び６−７；37℃、レーン４−５及び８−９；20℃、レーン１１−１２；18℃。使用株；レーン２−５、W3110；レーン６−１２、大腸菌（trxb、gor、supp）（DE3）。ベクター＃３を使用した。
図２は該発明の複合糖質形成、例えば、修飾シアル酸によるペプチドのペグ糖質G化で使用の代表的シアル酸転移酵素を示す表である。
発明を実施するための最良形態
（略語）
PEG、ポリエチレングリコール；PPG、ポリプロピレングリコール；Ara、アラビノシル
；Fru、フルクトシル；Fuc、フコシル；Gal、ガラクトシル；GalNAｃ、N―アセチルガラクトサミニル；Glc、グルコシル；GlcNAｃ、N―アセチルグルコサミニル；Man、マンノシル；ManAc、マンノサミニルアセテート；Xyl、キシロシル；NeuAc、シアリル又はN―アセチルノイラミニル；Sia、シアリル又はN―アセチルノイラミニル及びそれら誘導体と類似体。
（定義）
別に定義しない限りここに用いた全技術科学用語は、通常本発明が属する技術の通常技量者が一般に理解するのと同じ意味を有する。通常ここで用いた細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学とハイブリダイゼーションでの命名法と実験室手順は、技術的によく知られ通常的に使用されるものである。核酸とペプチド合成に標準的技法が用いられる。その技法と手順は技術的に在来法と本文書を通じて提供される種々の一般文献（サムブロック等（Sambrook, et al.）、モレキュラークローニング：ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、2版（1989年）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）ニューヨーク（N.Y.）を通常参照し、ここに文献として取り入れる）により実施する。通常ここで用いた以下に記載の分析化学と有機化学での命名法と実験手順は技術的によく知られ通常的に使用されるものである。化学合成と化学分析に標準法やそれらの修正法が用いられる。
“核酸”又は“ポリヌクレオチド”という用語は単鎖型か二重鎖型のデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）及びそれらのポリマーを意味する。特に制限しない限り該用語は参照核酸と類似の結合特性をもち、自然発生ヌクレオチドと同じように代謝する既知天然ヌクレオチド類似体を含む。別なように示さない限り特定核酸配列は、又それらの保守的修正変種（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基遺伝子多形体（SNP）及び相補配列、更には明示的に示した該配列も暗黙に包含する。具体的には一つ以上の選択（又は全ての）コドンの３位を混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を産生して、縮重コドン置換体が得られる（バッツー等（Batzer et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic acid Res.）、19巻、５０８１頁（１９９１年）；大塚等（Ohtsuka et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６０巻、２６０５−２６０８（１９８５年）及びロッソリーニ等（Rossolini et al.）、モレキュラーアンドセルラープローブス（Mol. Cell. Probes）、８巻、９１−９８頁（１９９４年））。核酸という用語は遺伝子、相補DNA（ｃDNA）及び遺伝子コード化伝令RNA（ｍRNA）と互換的に用いる。
“遺伝子”という用語はポリペプチド鎖産生に関わるDNAセグメントを意味する。コード領域（リーダーとトレイラー）に先行及び後続領域と同様に各コードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも良い。
“単離された”という用語が核酸やタンパク質に適応した場合、該核酸又はタンパク質は自然状態で関連する他細胞成分が実質的に存在しないことを意味する。乾燥でも水溶液のいずれであっても良いが、好ましくは均一状態である。純度と均一性は通常ポリアクリルアミドゲル電気泳動や高速液体クロマトグラフィのような分析化学技法を用いて決定する。調整時に存在する主要種であるタンパク質は実質的に精製される。特に該遺伝子をフランクし興味遺伝子以外のタンパク質をコードする読み取り枠から単離遺伝子を分離する。“精製された”という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルで実質的に単一バンドを生じることを意味する。特に該核酸又はタンパク質が少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９９％であることを意味する。
“アミノ酸”という用語は天然発生アミノ酸及び合成アミノ酸、更には天然発生アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸擬態物を意味する。天然発生アミノ酸は遺伝子コードでコードしたものであり、更には後に修飾したアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ―カルボキシグルタミン酸及びO―ホスホセリンである。アミノ酸類似体は天然発生アミノ酸と同一基本化学構造、即ち水素原子、カルボキシル基、アミノ基及びR基と結合するα炭素原子を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルスルホニウムメチオニンを意味する。この類似体は修飾R基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチドバックボーンを有するが、天然発生アミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。以下の特許出願に記載のアミノ酸類似体は該発明のFGFペプチド複合物及び変異FGF配列に組み入れることができる：米国特許出願１１／０９４６７７（２００５年３月２９日出願）；米国特許出願１１／０９４６７６（２００５年３月２９日出願）；米国特許出願１１／０９３７９８（２００５年３月２９日出願）；米国特許出願１１／０９３７９７（２００５年３月２９日出願）；米国特許出願１０／９６５２１８（２００４年１０月１３日出願）；米国特許出願１１／０９３７９７（２００５年３月２９日出願）；米国特許出願１１／００９６３５（２００４年１２月１０日出願）；米国特許出願１１／０１６３４８（２００４年１２月１６日出願）；米国特許出願１０／８２５８６７（２００４年４月１６日出願）；米国特許出願１０／８２６９１９（２００４年４月１６日出願）及び米国特許出願１０／６８６９４４（現米国特許６，９２７，０４２、２００５年８月９日発行）。これら出願に記載の方法を用いて、又該発明のFGFペプチド複合物及び変異FGF配列が産生できる。“アミノ酸擬態物”はアミノ酸一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然発生アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。
非天然アミノ酸誘導体や類似体を部位特異的な形でポリペプチド鎖に組み入れ得る技術の種々の既知法がある。WO０２／０８６０７５参照。
ここでアミノ酸は一般的に知られた三文字記号か国際純正応用化学連合―国際生化学連合（IUPAC―IUB）生化学命名法委員会推奨の一文字記号のいずれかに基づくことができる。同様にヌクレオチドも通常容認された単一文字表記に従う。
“保存型修飾変種”はアミノ酸配列と核酸配列両者に適応する。特定の核酸配列に関しては“保存型修飾変種”は同一アミノ酸又は実質的に同一のアミノ酸をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は実質的に同一配列のものを意味する。遺伝子コードの縮重性により多数の機能的に同一の核酸は任意の所定タンパク質をコードする。例えばコドンGCA、GCC、GCG及びGCU全てがアミノ酸アラニンをコードする。従ってコドンにより特定されたアラニンの位置全てで、コード化ポリペプチドを変化すること無しに該コドンは記載の対応コドンのいずれかに変化できる。この核酸変形物は“サイレント変形物”であり、保存型修飾変形物の一種である。ポリペプチドをコードするここでの核酸配列全ては、又該核酸の可能な全てのサイレント変形物を記述する。技術者には核酸中の各コドンは（通常メチオニン用の唯一のコドンであるAUG及びトリプトファン用の唯一のコドンであるTGGを除いて）、機能的に同一分子を生じるように修飾できることが分かる。その結果ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変形物は各記載配列に潜在する。
アミノ酸配列に関して技術者は変化により化学的類似アミノ酸によるアミノ酸置換を生ずる場合、コード化配列中の単一アミノ酸又はほんの一握りのアミノ酸を変化、付加又は削除する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列との置換、削除又は付加のそれぞれが、“保存型修飾変種”であることが分かる。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表が技術的に良く知られている。この保存型修飾変種はそれ以外に該発明の多形変種、種間類似体及び対立遺伝子を除きはしない。
以下の８つの各グループは互いに保存型置換体であるアミノ酸を含む。
アラニン（A）、グリシン（G）；
アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
アルギニン（R）、リシン（K）；
イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
セリン（S）、スレオニン（T）及び
システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、クレイトン（Creighton）、プロテイン（Proteins）（１９８４年）参照）。
ここでアミノ酸は一般的に知られた三文字記号かIUPAC―IUB生化学命名法委員会推奨の一文字記号のいずれかに基づくことができる。同様にヌクレオチドも通常容認された単一文字表記に従う。
本出願ではアミノ酸残基は非修飾野生型ポリペプチド配列では最末端N残基に番号１をつけ、それからの相対位置により番号付けする。
ここで用いる“プロリン残基に近接する”とは、プロリン残基から約１０個のアミノ酸より少なく隔たった、好ましくはプロリン残基から約９，８、７、６又は５個のアミノ酸より少なく隔たった、より好ましくはプロリン酸残基から約４，３，２又は１個のアミノ酸より少なく隔たった、アミノ酸を意味する。“プロリン残基に近接する”アミノ酸はプロリン残基のＣ末端側又はN末端側に位置できる。
ここでは“ポリペブチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”は互換的に用い、その単量体がアミノ酸でアミド結合により一緒に結合したポリマーを意味し、代わりにポリペプチドと呼ばれる。更に非天然アミノ酸、例えば、β―アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも又含まれる。遺伝子コードされないアミノ酸も又本発明に使用できる。更に反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療成分、生体分子及び類似体を含むように修飾したアミノ酸も該発明で使用できる。本発明で用いるアミノ酸の全てはD異性体かL異性体のいずれであっても良い。L異性体が通常好ましい。更に他ペプチド擬態物も又本発明で使用できる。ここで用いる“ペプチド”とはグルコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドを意味する。又ペプチドを発現する系による不完全グルコシル化ペプチドも含まれる。一般的総説に関してはスパトラ、エイエフ（Spatola, A.F.）、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学と生化学（Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins）、ワインシュタイン、ビー（Weinstein, eds.）編、マーセルデッカー（Marcel Dekker）、ニューヨーク（New York）、２６７頁（１９８３年）参照。
“ペプチド複合物”という用語はペプチドがここに示した修飾糖と複合化した該発明種を意味する。
“FGF”又は“線維芽細胞成長因子”という用語は２５個の既知野生型ペプチドファミリーのいずれかを意味する。該用語は又この野生型配列に比して同数か、少ないか又は追加のアミノ酸を持つアミノ酸配列を意味する。天然又は非天然の追加アミノ酸はこのアミノ酸配列の始まり、中間又は終端に挿入できる。
一つ又は複数の追加Ｎ−連結又はO−連結グリコシル化部位の野生型線維芽細胞成長因子への導入に関連して用いる“変異する”又は“変異”という用語は、生成線維芽細胞成長因子アミノ酸配列が対応野生型線維芽細胞成長因子には存在しない少なくとも一つのＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含むように、化学手段、酵素手段又は他手段によりそれぞれ野生型線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列又は野生型線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列で、任意のヌクレオチド又はアミノ酸残基を削除、挿入又は置換することを意味する。アミノ酸置換の場合、同類置換又は非同類置換を用いてＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含むFGF変異体を創生しても良い。
新規Ｎ−連結又はO−連結グリコシル化部位を導入する変異用部位は、該ポリペプチド中の何処に位置しても良い。線維芽細胞成長因子変異体用の典型的アミノ酸配列はSEQ ID NO:９−１４、１８−２２、２３−４５、４８−６５、６９−１０９、１１２―１４５、１６１―２１４、２２０―３２０及び３２３―３６０に示される。従って本発明の“変異線維芽細胞成長因子”は少なくとも一つのアミノ酸置換、アミノ酸挿入又は変異アミノ酸残基を含む。一方コード配列が変異線維芽細胞成長因子を産生するように修飾した野生型線維芽細胞成長因子は、本出願では“対応野生型線維芽細胞成長因子”又は単に“野生型ペプチド”と云うことができる。例えばSEQ ID NO:１はSEQ ID NO:９−１４、１８−２２、２３−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５のアミノ酸配列を有する変異線維芽細胞成長因子に対する対応野生型線維芽細胞成長因子―２０のアミノ酸配列である。同様にSEQ ID NO:１４６はSEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−のアミノ酸配列を有する変異線維芽細胞成長因子に対する対応野生型線維芽細胞成長因子―２１のアミノ酸配列である。
“有効量”、“に有効な量”又は“治療有効量”或いは任意の文法的に等価な用語は、物質の投与により治療効果を生ずる量を意味する。該効果は疾患／病気及び関連合併症の症状進行がいずれかの検知可能な程度に防止、補正又は阻害されることを含む。正確な量は治療目的に依存し、既知の方法を用いる技術の熟知者により確かめられる（例えば、リーバーマン（Lieberman）、医薬品投与形態（Pharmaceutical Dosage Forms）、（１−３巻、１９９２年）；ロイド（Lloyd）、医薬品配合方法、科学と技術（The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding）、（１９９９年）及びピッカー（Pickar）、投与量計算（Dosage Calculations）、（１９９９年）参照）。
ここで用いる“修飾糖”という用語は該発明工程でペプチドのアミノ酸か、グリコシル残基に酵素的に付加した天然発生又は非天然発生炭水化物を意味する。該修飾糖は限定はされないが、糖ヌクレオチド（一リン酸塩、二リン酸塩及び三リン酸塩）、活性化糖（例えばハロゲン化グリコシル、グリコシルメシラート）及び活性化もされずヌクレオチドでもない糖類を含む多数の酵素基質から選ぶ。該“修飾糖”は“修飾基”により共有結合的に機能化される。有用な修飾基は限定はされないが、水溶性ポリマー（PEG成分）、治療成分、診断成分、生体分子及び類似体を含む。該修飾基は好ましくは天然発生炭水化物でも非修飾炭水化物でもない。該修飾基による機能化座位は、該“修飾糖”がペプチドに酵素的に付加するのを妨げないように選ぶ。
“水溶性”という用語はある程度検出可能な水溶解度を有する成分を意味する。水溶解度の検出／定量法は技術的によく知られている。代表的水溶性ポリマーとしてはペプチド、糖類、ポリエーテル、ポリアミン、ポリカルボン酸及び類似体が挙げられる。ペプチドは単一アミノ酸、例えばポリリシンからなる混合配列を有しても良い。代表的糖類はポリシアル酸である。代表的ポリエーテルはポリエチレングリコール、例えば、ｍ−PEGである。ポリエチレンイミンは代表的ポリアミンであり、ポリアクリル酸は代表的ポリカルボン酸である。
水溶性ポリマーのポリマーハックボーンはポリエチレングリコール（即ちPEG）でも良い。しかし他の関連ポリマーも又本発明実施の使用に適し、PEG又はポリエチレングリコールという用語の使用は、この点に関して排他的でなく包括的であることを意図すると理解する必要がある。PEGという用語はアルコキシPEG、二官能性PEG、多分岐PEG、フォーク型PEG、分岐PEG、ペンダントPEG（即ちポリマーバックボーンにつり下がった一つ以上の官能基を有するPEG又は関連ポリマー）又はその中に分解可能結合を持つPEGを含む任意形のポリエチレングリコールを含む。
該ポリマーバックボーンは線型でも分岐形でも良い。分岐ポリマーバックボーンは通常技術的に知られている。典型的には分岐ポリマーは中心分岐コア成分と、該中心分岐コアに結合した複数の線状ポリマー鎖を有する。通常ＰＥＧは酸化エチレンをグリセリン、ペンタエリスリトール及びソルビトールのような種々のポリオールに付加して合成できる分岐形で使用される。中心分岐コアはまたリシンのような幾つかのアミノ酸から誘導できる。分岐ポリエチレングリコールは一般形R(―PEG―OX)ｍとして表され、Rはグリセリンやペンタエリスリトールのようなコア成分を表し、Xはキャッピング基又は末端基を表し、ｍはアーム数を表す。全体をここに文献として取り入れた米国特許５，９３２，４６３に記載のような多分岐PEG分子もまたポリマーバックボーンとして使用できる。
多くの他ポリマーが又該発明に適する。非ペプチドで且つ水溶性で、２から約３００末端のポリマーバックボーンが該発明で特に有用である。適切なポリマー例は限定はされないが、ここに全体を文献として取り入れた米国特許５，６２９，３８４に記載のようなポリプロピレングリコール（“PPG”）、エチレングリコールとプロピレングリコール共重合体及び類似体のような他ポリアルキレングルコール、ポリオキシエチル化ポリオール）、ポリオレフィンアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリα―ヒドロキシ酸、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリN―アクリロイルモルフォリン、それらの共重合体、三元重合体及び混合物を含む。該ポリマーバックボーン各鎖の分子量は異なっても良いが、通常約１００ダルトン乃至約１００，０００ダルトン、しばしば約６０００ダルトン乃至約８００００ダルトンの範囲である。
“シアル酸”又は“シアリル”という用語は炭素数９のカルボキシル化糖類ファミリの任意構成員を意味する。該シアル酸ファミリの最も普通の構成員は、N―アセチルノイラミン酸（５−アセタミド―３，５−ジデオキシ―D―グリセロ―D―ガラクト―２―ノヌロソン酸）（しばしばNeu5Ac、NeuAc又はNANAと略記される）である。該ファミリの第二構成員はNeuAcの該Nアセチル基が水酸化されているN―グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc又はNeuGc）である。第三のシアル酸ファミリ構成員は３−デオキシ―２―ノヌロソン酸（KDN）である（ナダノ等（Nadano et al.）（１９８６年）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６１巻、１１５５０―１１５５７頁；金森等（Kanamori, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、２１８１１―２１８１９（１９９０年））。又９−O―ラクチル―Neu5Ac、９−Ｏ−アセチル―Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ―９―フルオロ―Neu5Ac及び９−アジド―９−デオキシ―Neu5Acのような９−O―C1―C6アシル―Neu5Acのような９−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリの総説に関しては、例えば、ヴァルキ（Varki）、グリコバイオロジー（Glycobiology）、２巻、２５−４０頁（１９９２年）；シアル酸：化学、代謝及び機能（Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and function）、シャウアー、アール（R. Schauer ed.）編（スプリンガーフェルラーグ（Springer−Verlag）、ニューヨーク（New York）、（１９９２年）参照。シアリル化法でのシアル酸化合物の合成と使用に関しては、１９９２年１０月１日発行の国際出願WO９２／１６６４０に開示された。
ここでペプチド薬剤の患者への投与関連で用いる“曲線下面積”又は“AUC”は、患者体循環した場合の薬剤濃度のゼロから無限大への時間関数として描いた曲線下全面積と定義する。
ここでペプチド薬剤の患者への投与関連で用いる“半減期”又は“ｔ１／２”という用語は患者血漿中薬剤濃度が半分に減少するに必要な時間と定義する。複数のクリアランス機構、再分配及び技術的に良く知られた他機構により、ペプチド薬剤関連の半減期は一つより多くても良い。通常アルファ半減期とベータ半減期をアルファ相が再分配関連、ベータ相がクレアランス関連と定義する。しかしタンパク質薬剤は大部分が血流に限定されるので、少なくとも二つのクリアランス半減期がある。あるグリコシル化ペプチドでは急速なベータ相クレアランスがマクロファージ上受容体、又は末端ガラクトース、N―アセチルガラクトサミン、N―アセチルグルコサミン、マンノース又はフコースを認識する内皮細胞により仲介される。遅速なベータ相クリアランスが有効半径２nmより小さい分子（約６８キロダルトン）に対する腎糸球体濾過及び／又は組織の特異的又は非特異的取り込みと代謝により起こる。糖質ペグ化により末端糖類（例えばガラクトース又はN―アセチルガラクトサミン）をキャップし、その結果これら糖類を認識する受容体により急速なアルファ相クリアランスを遮断できる。糖質ペグ化により又より大きな有効半径が与えられ、その結果分配と組織取り込み体積を減じ、その結果後期ベータ相が延びる。従ってアルファ相半減期とベータ相半減期に対する糖質ペグ化の正確な影響は、技術的によく知られているように大きさ、グリコシル化状態及び他パラメーターにより異なる。“半減期”の追加説明は薬学生物工学（Pharmaceutical Biotechnology）（１９９７年、クロッメリン、ディエフエイ（Crommelin, DFA）及びシンデラー、アールディ編（Sindelar, RD, ed.）、ハーウッド出版社（Harwood Publishers）、アムステルダム（Amsterdam）、１０１−１２０頁）に見いだせる。
ここで用いた“複合糖質化”という用語は、修飾糖種のポリペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基、例えば、本発明の変異線維芽細胞成長因子への酵素仲介による複合化を意味する。“複合糖質化”の亜属は、修飾糖の修飾基がポリエチレングリコール、PEGのアルキル誘導体（例えば、ｍ―PEG）又はそれらPEGの反応性誘導体（例えば、H2N―PEG、HOOC―PEG）の“糖質ペグ化”である。
“大規模”及び“工業的規模”という用語は互換的に用い、1回の反応サイクル完了により少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｇの複合糖質を産生する反応サイクルを意味する。
ここで用いた“グリコシル連結基”という用語は、修飾基（例えば、PEG成分、治療成分、生体分子）が共有結合的に付着したグリコシル残基を意味する。グリコシル連結基は該修飾基を複合物残部と連結する。該発明法では該“グリコシル連結基”はグリコシル化ペプチドか非グリコシル化ペプチドに共有結合的に付着し、その結果該試薬をペプチドのアミノ酸及び／又はグリコシル残基に連結する。“グリコシル連結基”は通常“修飾糖”をペプチドのアミノ酸及び／又はグリコシル残基に酵素的に付着し“修飾糖”から誘導する。グリコシル連結基は修飾基―修飾糖カセット形成時に分解する（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）糖類由来構造であるか、又はグリコシル連結基は原型のままでも良い。 “無傷グリコシル連結基”は該修飾基と連結する糖類単量体のグリコシル成分に由来し、過ヨウ素酸塩で分解しない、例えば酸化されない複合体残部を意味する。該発明の“無傷グリコシル連結基”は天然発生オリゴ糖から一つ又は複数のグリコシル単位を付加するか、又は親糖構造から一つ以上のグリコシル単位を除去して得られる。
ここで用いた“非グリコシド型修飾基”はグリコシル連結基と直接連結した天然発生糖を含まない修飾基を意味する。
ここで用いた“放射性試薬”は腫瘍診断又は破壊に有効な任意の放射性同位体を含む。例としては限定はされないが、インジウム１１１、コバルト６０が挙げられる。更に通常放射性同位体混合物を表すウラン、ラジウム及びトリウムのような天然発生放射性元素は放射性試薬の適例である。金属イオンは通常有機キレート化成分とキレート化する。
多くの有用なキレート化基、クラウンエーテル、クリプタンド及び類似体が技術的に知られており、該発明化合物（例えばEDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等及びDTPP、EDTP、HDTP、NTP等のようなそれらのホスホン酸塩類似体）に組み入れられる。例えばピット等（Pitt, et al.）、“鉄過剰治療のためのキレート化剤のデザイン（The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload）”、生物と医学における無機化学（Inorganic Chemistry in Biology and Medicine）、マーテル編（Martell, ed.）、アメリカ化学会（American Chemical Society）、ワシントンディシィ（Washington, D.C.）、１９８０年、２７９−３１２頁；リンドイ（Lindoy）、大環状リガンド錯体の化学（The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes）、ケンブリッジユニバーシティプレス（Cambridge University Press）、ケンブリッジ（Cambridge）、１９８９年；デゥガス（Dugas）、生物有機化学（Bioorganic Chemistry）、スプリンガーフェルラーグ（Springer−Verlag）、ニューヨーク（New York）、１９８９年、及びそこに含まれる文献を参照。
更にキレート化剤、クラウンエーテル及びシクロデキストリンを他分子に付着できる種々の経路が技術的な熟知者は利用できる。例えば、メアーズ等（Meares, et al.）、“生体内キレート標識化タンパク質とポリペプチドの性質”（Properties of In Vivo Chelate−Tagged Proteins and Polypeptides）、タンパク質の修飾：食糧的、栄養的及び薬学的性状（Modification of Proteins: Food, Nutritional and Pharmacological Aspects）、フィーニー等編（Feeney, et al. eds.）、アメリカ化学会（American Chemical Society）、ワシントンディシィ（Washington, D.C.）、１９８２年、３７０−３８７頁；カシナ等（Kasina, et al.）、バイオコンジュゲートケミストリ（Bioconjugate Chem.）、９巻、１０８−１１７頁（１９９８年）；ソング等（Song, et al.）、バイオコンジュゲートケミストリ（Bioconjugate Chem.）、８巻、１０８−１１７頁（１９９７年）参照。
ここで用いた“製薬的容認担体”としては該複合体と組み合わした場合、該複合体活性を保持し、且つ被験者の免疫系と反応しない任意の材料が挙げられる。例としては限定はされないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン及び種々の形の湿潤剤のような標準的製薬担体のいずれかが挙げられる。他担体としては又無菌溶液、コート化錠剤を含む錠剤及びカプセルが挙げられる。通常この担体は澱粉、乳汁、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウムかステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪か植物性油、ゴム、グリコール又は他の既知賦形剤のような賦形剤を含む。この担体は又香味添加物、着色添加物又は他材料が挙げられる。この担体を構成する組成は良く知られた在来法で調合する。
ここで用いた“投与する”とは経口投与、吸入、座薬のような投与、局所接触、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病巣内投与、鼻腔無い投与又は皮下投与、或いは緩放徐装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの被験者への埋め込みを意味する。投与は非経口的と経粘膜的（例えば、経口、経鼻、経膣、経直腸又は経皮）を含む任意経路による。非経口投与としては、例えば静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、側脳室内及び脳内が挙げられる。更に注射が腫瘍治療、例えば、アポトーシスを誘導する場合には、該腫瘍及び又は該腫瘍周囲の組織に直接投与できる。他形式の送達としては限定されないが、リポソーム処方、静脈内点滴、経皮貼附等が挙げられる。
“改善している”又は“改善する”という用語は、症状の寛解、緩解又は減少或いは患者の身体的健康や精神的安らぎの改善のような目的パラメーター又は主観的パラメーターを含む病理や病気治療におけるいずれかの成功の印を意味する。症状の改善は健康診断及び／又は精神鑑定結果を含む目的パラメーター又は主観的パラメーターを基にする。
“治療”という用語は疾患や状態が該疾患にかかりやすいが、まだ疾患症状に陥りも示しもしていない動物で起こるのを防ぎ（予防処置）、該疾患を阻害し（その発生を遅らすか抑止し）、該疾患の症状や副作用を除き（対症療法を含み）、且つ該疾患を解放する（該疾患後退させる）ことを含む疾患や状態を“治療する”か“治療”を意味する。
“単離された”という用語は材料を産生するのに用いた成分が実質的に又は本質的に含まれない材料を意味する。該発明のペプチド複合物での“単離された”という用語は、通常該ペプチド複合物産生に用いた混合物中の材料に伴う成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。通常該発明の単離ペプチド複合物は好ましくは範囲で表した純度レベルを有する。ペプチド複合物純度範囲の下限は約６０％、約７０％又は約８０％であり純度範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％より高い。
ペプチド複合物の純度が約９０％より高い場合には、その純度は又好ましくは範囲で表す。純度範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％又は約９８％である。純度範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約１００％である。
純度は技術的に容認された任意の分析法（例えば、銀染色ゲル、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC又は類似手段）で決定する。
ここで用いた“該集団の実質的な各構成員”により、ペプチドに付加した選択パーセントの修飾糖類を該ペプチド上の複数の同一受容体部位に付加した該発明のペプチド複合物集団の特性を記述する。“該集団の実質的な各構成員”により、修飾糖に複合化したペプチド部位の“均一性”が語られ、少なくとも約８０％均一、好ましくは少なくとも約９０％均一、及びより好ましくは少なくとも約９５％均一である該発明の複合体を意味する。
“均一性”は該修飾糖類が複合化した受容体成分集団全体での構造的一貫性を意味する。従って各修飾糖成分が、他の全修飾糖と複合化した受容体部位と同構造を有する受容体部位と複合化した該発明のペプチド複合物では、該ペプチド複合物は約１００％均一であると云われる。均一性は通常範囲で表す。ペプチド複合物の均一性範囲の下限は約６０％、約７０％又は約８０％であり、均一性範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％又は約９０％より高い。
ペプチド複合物の均一性が約９０％より高い場合には、その均一性は又好ましくは範囲で表す。均一性範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％又は約９８％である。均一性範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約１００％である。ペプチド複合物の均一性は通常技術の熟知者には既知の一つ以上の方法、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC―MS）、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間質量分析（MALDITOF）、キャピラリ電気泳動及び類似体で決定する。
“実質的に均一糖質栄養素”又は“実質的に均一グリコシル化パターン”とは、糖ペプチド種に関する場合、興味の糖転移酵素（例えば、フコシル基転移酵素）によりグリコシル化された受容体成分パーセントを意味する。例えば、α１，２フコシル基転移酵素の場合、実質的に全ての（以下に定義するように）Galβ１，４−GlcNAｃ−Rとそのシアル酸付加類似体が該発明のペプチド複合物でフコシル化されると、実質的に均一なフコシル化パターンとなる。該原料がグリコシル化受容体成分（例えば、フコシル化Galβ１，４−GlcNAｃ−R成分）を含有できることが技術の一熟知者には分かる。従ってグリコシル化の計算パーセントは該発明法によりグリコシル化された受容体成分と同様に原料で既にグリコシル化された受容体成分をも含む。
上で定義した“実質的に均一な”における“実質的に”という用語は通常特定糖転移酵素に対する受容体成分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％及び更により好ましくは少なくとも９５％がグリコシル化されていることを意味する。
置換基が在来の化学式で明記され左から右に書かれた場合、この基は右から左に構造を書いた化学的に同一の置換基も等しく含み、例えば−CH2O―は又―OCH2―と書くことを意図する。
“アルキル”という用語はそれ自身か他置換基の一部として別に記述しない限り完全に飽和か一不飽和かポリ不飽和で、指定炭素原子数（即ちC1−C10は炭素数１乃至１０）を有するジラジカル及び多ラジカルを含む直鎖又は分岐鎖、環状炭化水素ラジカル又はそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては限定されないが、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ―ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、sec―ブチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ―ペンチル、ｎ―ヘキシル、ｎ―ヘプチル、ｎ―オクチル及び類似体の同族体と異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は一つ以上の二重結合か三重結合を持つモノである。不飽和アルキル基の例は限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２―イソペンテニル、
２−ブタジエニル、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４―ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルと３−プロピニル、３−ブチニル及び高級同族体と異性体が挙げられる。“アルキル”という用語は別に記述しない限り、“ヘテロアルキル”のような以下により詳しく定義するアルキル誘導体を含むことを意味する。炭化水素基は限定したアルキル基は“ホモアルキル”と称する。
“アルキレン”という用語は、それ自身か他置換基の一部として限定はされないが、ーCH2CH2CH2CH2―で示されるようにアルカン由来の二価ラジカルを意味し、更に以下に記載の“ヘテロアルキレン”のような基を含む。通常アルキル（又はアルキレン）基は炭素原子１乃至２４個有し、本発明では１０以下の炭素原子を持つ基が好ましい。“低級アルキル”又は“低級アルキレン”とは通常８つ以下の炭素原子を有する短鎖アルキル又はアルキレン基である。
“アルコキシ”、“アルキルアミノ”及び“アルキルチオ”（又はチオアルコキシ）という用語は従来の意味で使用し、それぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子により該分子残部に結合するアルキル基を意味する。
“ヘテロアルキル”という用語はそれ自身か他置換基の一部として別に記述しない限り、記載数の炭素原子と酸素、窒素、ケイ素及び硫黄原子からなる一群から選んだ少なくとも一つのヘテロ原子からなる安定な直鎖、分岐鎖又は環状炭化水素ラジカル又はその組み合わせを意味し、該窒素原子と硫黄原子は酸化されていても良く、且つ該窒素ヘテロ原子は4級化されていても良い。一つ又は複数の該酸素、窒素、硫黄及びケイ素ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の内側位にあっても又該アルキル基が該分子残部と結合した位置にあっても良い。例としては限定はされないが、―CH2―CH2―O―CH３、―CH2―CH2―NH―CH３、―CH2CH2―N(CH3) ―CH３、―CH2―S―CH2―CH３、―CH2―CH2―S(O) ―CH３、―CH2―CH2―S(O)２―CH３、―CH＝CH―O―CH３、―Si(CH3)3、―CH2―CH＝N―OCH３及び―CH＝CH―N(CH3) ―CH３が挙げられる。例えば、―CH2―NH―OCH３及び、―CH2―O―Si（CH３）３のような二つまでのヘテロ原子が連続しても良い。同様に“ヘテロアルキレン”という用語はそれ自身か他置換基の一部として限定はされないが、―CH2―CH2―S―CH2―CH2―及び―CH2―S―CH2―CH2―NH―CH2―で示されるようにヘテロアルキル由来の二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基においてヘテロ原子は該鎖末端の片側か両側のいずれかを占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ及び類似体）。更にアルキレン及びヘテロアルキレン連結基において該連結基式の書く方向によっては連結基の配向は示唆されない。例えば式―C(O)2R'―は―C(O)2R'― と―R'C(O)2―両者を表す。
“シクロアルキル”及び“ヘテロシクロアルキル”という用語は、それら自身又は他用語との組み合わせで別に云わない限り、それぞれ“アルキル”と“ヘテロアルキル”の環状バージョンを表す。更にヘテロシクロアルキルにおいてヘテロ原子は、該ヘテロ環が該分子残部と結合した位置を占め得る。シクロアルキルの例としては限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル及び類似体が挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフランー２−イル、テトラヒドロフランー３−イル、テトラヒドロチエン―２−イル、テトラヒドロチエン―３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル及び類似体が挙げられる。
“ハロ”又は“ハロゲン” という用語は、それ自身か他置換基の一部として別に記述しない限り、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味する。更に“ハロアルキル”のような用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、“ハロ（C1―C4）アルキル”という用語は限定はされないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル及び類似体を含む。
“アリール”という用語は別に記述しない限り、単環か一緒に縮合するか共有結合した多環（好ましくは１乃至３環）のポリ不飽和芳香族置換基を意味する。“ヘテロアリール”という用語は酸素、窒素、ケイ素及び硫黄原子から選んだ１乃至４個のヘテロ原子を含む
アリール基（又は複数環）を意味し、該窒素原子と硫黄原子は酸化されていても良く、且つ一つ又は複数の該窒素原子は4級化されていても良い。ヘテロアリール基はヘテロ原子により該分子残部と結合できる。アリール基とヘテロアリール基の非制限例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル―４―オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２―ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノオキサリニル、５−キノオキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ[ｂ]フラニル、ベンゾ[ｂ]チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ[１，４]ダイオキシン―６―イル、ベンゾ[１，３]ダイオキソール―５―イル及び６−キノリルが挙げられる。上記の各アリールとヘテロアリール環系に対する置換基は以下に記載の容認置換基群から選ぶ。
“アリール”という用語が他用語と組み合わして用いる場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、略して上に定義したようにアリール環とヘテロアリール環両者を含む。従って“アリールアルキル”とは、アリール基が、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子で置換されたアルキル基（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル及び類似体）を含むアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル及び類似体）と結合したラジカルを含むことを意味する。
上記用語のそれぞれ（例えば、“アルキル”、“ヘテロアルキル”、“アリール”及び“ヘテロアリール”）は、表示ラジカルでの置換形及び非置換形を含むことを意味する。各形のラジカルでの好ましい置換基は以下に提供する。
アルキルラジカルとヘテロアルキルラジカル（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと云われる基も含む）での置換基は、通常“アルキル基置換基”と云われ限定はされないが、以下のから選んだ一つ以上の種々の基である。―OR'、＝O、＝NR'、＝N―OR'、―NR'R''、―SR'、―ハロゲン、―SiR'R''R'''、―OC(O)R'、―C(O)R'、―CO2R',―CONR'R''、―OC(O)NR'R''.―NR''C(O)R'、―NR' ―C(O)NR''R'''、―NR''C(O)2R'、―NR―C(NR'R''R''')=NR'''',―NR―C(NR'R'')=NR'''、―S(O)R'、―S(O)2R'、―S(O)2NR'R''、―NRSO2R', ―CN及びーNO2で、その数はゼロから２ｍ’＋１で、ｍ’はそのラジカルの炭素原子総数である。R'、R''、R'''及びR''''はそれぞれ好ましくは独立に、水素原子、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、例えば１乃至３個のハロゲン置換アリール、置換又は非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を意味する。該発明化合物が一つより多いR基を含む場合、例えば、各R基はR'、R''、R'''及びR''''基が一つより多い場合にはそれぞれ独立に選ぶ。R'とR''が同一窒素原子と結合する場合、窒素原子と結合して５員環、６員環又は７員環を形成できる。例えば、―NR'R''は限定はされないが１−ピロリジニルと４−モルホリニルを含むことを意味する。置換基に関する上記の検討から技術の一熟知者には、”アルキル“という用語はハロアルキル（例えば―CF3及び―CH2CF3）やアシル（例えば―C(O)CH3、―C(O)CF3、―C(O)CH2CH3及び類似体）のような水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基が含まれることを意味することが分かる。
アルキルラジカルで記載の置換基と同様に、アリール基とヘテロアリール基での置換基は通常“アリール基置換基”と称する。該置換基は例えば、以下から選ぶ。―OR'、＝O、＝NR'、＝N―OR'、―NR'R''、―SR'、―ハロゲン、―SiR'R''R'''、―OC(O)R'、―C(O)R'、―CO2R'、―CONR'R''、―OC(O)NR'R''、―NR''C(O)R'、―NR' ―C(O)NR''R'''、―NR''C(O)2R'、―NR―C(NR'R''R''')=NR'''',―NR―C(NR'R'')=NR'''、―S(O)R'、―S(O)2R'、―S(O)2NR'R'、―NRSO2R', ―CN及び―NO2、―R'、―N3、―CH(Ph)2、フルオロ（C1―C4）アルコキシ及びフルオロ（C1―C4）アルキルで、その数はゼロから芳香族環系の空き原子価総数の範囲である。R'、R''、R'''及びR''''はそれぞれ好ましくは、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール及び置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選ぶ。該発明化合物が一つより多いR基を含む場合、例えば、各R基はR'、R''、R'''及びR''''基が一つより多い場合にはそれぞれ独立に選ぶ。以下の図式で記号Xは上記のように”R“を表す。
アリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上置換基の二つは、式―T―C(O) ―(CRR')u―U―置換基で置換されても良く、TとUは独立に―NR―、―O―、―CRR'―又は単結合であり、uはゼロ乃至３の整数である。代わりにアリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上置換基の二つは、式―A―(CH2)r―B―置換基で置換されても良く、AとBは独立に―CRR' ―、―O―、―NR―、―S―、―S(O) ―、―S(O)2―、―S(O)2NR' ―又は単結合であり、ｒは１乃至４の整数である。新しい形成環の単結合の一つは二重結合で置換しても良い。代わりにアリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上置換基の二つは、式―（CRR'z―X―(CR'R''')d―置換基で置換されても良く、ｚとｄは独立にゼロ乃至３の整数であり、Xは―O―、―NR' ―、―S―、―S(O)―、―S(O)2―又は―S(O)2NR' ―である。置換基R、R'、R''及びR'''は好ましくは独立に水素原子又は置換か非置換（C1−C6）アルキルから選ぶ。
ここで用いた“ヘテロ原子”という用語は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）及びケイ素（Si）を含むことを意味する。
（序論）
FGF―9は脳と子宮内膜で分泌蛋白質として発現する線維芽細胞成長因子である。２０８アミノ酸ヘパリン結合タンパク質は、野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。FGF―9は運動ニューロンと前立腺で見られるように、グリア細胞発達とFGF受容体を発現する他細胞増殖活性化で、自己分泌／パラ分泌成長因子として重要な役割を果たす。
FGF―18はFGFファミリの他構成員である。これは肝増殖と腸増殖刺激に関与し、骨軟骨分化の必須制御因子である。FGF―9のようにこのものは又野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。この２０７アミノ酸タンパク質は又筋線維芽細胞増殖分化を刺激して出生後の肺発達に関与する。FGF―18はカルシニュリンにより誘導されてノギン発現を阻止する能力があり、有効な神経保護剤として働く。
FGF―20は脳（例えば小脳と黒質緻密部）で分泌蛋白質として発現し、見掛け分子量が２３キロダルトン単量体として大腸菌で発現する新規線維芽細胞成長因子である。この２１１アミノ酸ヘパリン結合タンパク質は、野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。その生物活性としては、神経発生、神経保護、中枢神経系（CNS）再生、抗炎症作用（例えば、腸抗炎症剤）及び創傷治癒が挙げられ、パーキンソン病やアルツハイマー症のような疾患治療用の有効薬剤となりうる。FGF―20は例えば化学療法及び放射線療法、核テロ／放射性物質テロ、放射線事故などで生ずる胃腸部や体の他部分での放射線毒性に対して、又は予防薬か緩和薬として用い得る。幾つかの研究でFGF―20は又穏和な紅斑から重症の有痛潰瘍形成範囲の症状を示す病気である口腔粘膜炎防止治療への有効性が示された。
FGF−21は新規線維芽細胞成長因子で肝組織、胸腺組織及び精巣組織で発現される。２０９アミノ酸タンパク質は又野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。最近の研究でFGF―21はヒト脂肪細胞でのブドウ糖取り込みを制御することが示され、代謝制御因子としての役割を示唆する。インスリン活性に対するその効果と脂質代謝制御により、FGF―21は2型糖尿病と肥満症の有効な治療となる。このものは細胞組織や器官機能の完全損失又は部分損失、更には細胞及び／又は組織機能か数の異常という特徴を持つ種々の疾患と関わる。FGF―21は又以下に述べるように多数の他治療用途を有する。
FGF―21治療を受け入れる疾患は虚血性血管障害である。このペプチドによる治療により、血管新生を誘導するか、又は心筋虚血／心筋梗塞、末梢血管障害、腎動脈障害又は脳卒中などのような疾患を被る患者の細胞機能／生存を守ることができる。
FGF―21治療が有効な他疾患としては、心臓で起こる心筋細胞や支持細胞の機能損失や死で特徴づけられ心筋症、例えば、鬱血性心不全、心筋炎及び、例えば、骨格筋細胞、骨細胞或いは支持細胞の機能損失、機能不十分又は死で特徴づけられる筋骨格疾患、例えば、骨格筋障害、骨疾患及び関節炎が挙げられる。更に例えばFGF―21やその機能の損失で起こる肝臓、心臓、脳、肢、腎臓などでの先天的欠陥はFGF―21で治療できる。
FGF―21ポリペプチド及びポリヌクレオチドは又外傷、疾患、医学療法や外科治療で起こる創傷治癒を促進し、上記環境で必要な細胞組織の再生を助けることができる。例えばFGF―21は肝再生、手術創治癒、損傷血管の再内皮化,、外傷性創傷治癒、血管障害や代謝障害などによる潰瘍の治癒、骨折、炎症性疾患などによる細胞損失に効果がある。
本発明は治療目的で用いる組換え型FGFの効果を改善するために修飾基とのFGFペプチド複合物を提供する。これらFGFペプチド複合物中のペプチドのあるものは、野生型FGFと同じアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する一方、他は変異体である。
該修飾基は例えばPEG（ｍ−PEG）、PPG（ｍ−PPG）等、のようなポリマー型修飾基、治療成分、診断成分、標的成分及び類似体から選べる。FGFペプチド複合物の創生、例えば水溶性ポリマー型修飾基の付加により、患者でのFGF循環の安定性と保持時間が改善でき、且つ／又はFGFの抗原性を減少できる。
該発明のペプチド複合物は修飾基をグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドに酵素的に付着形成できる。アミノ酸グリコシル化部位及び／又はグリコシル基により、修飾基を持つ修飾糖のペプチドと複合化、例えば、複合糖質化する座位が提供される。
本発明により又天然発生の線維芽細胞成長因子に存在しないＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む線維芽細胞成長因子の遺伝子操作変異体が提供される。これらFGF変異体は実質的に野生型ホルモンの生物活性を保持するが、新規導入のグリコシル化部位により組換え型産生FGF変異体は種々のパターンでグリコシル化できる。
該発明法により実質的に均一な誘導体化パターンを持つペプチド複合物と糖ペプチド複合物が構築できる。該発明に用いる酵素は通常特定アミノ酸残基、アミノ酸残基の組み合わせ、特定グリコシル残基又は該ペプチドのグリコシル残基の組み合わせに選択的である。この方法は又ペプチド複合物の大規模産生にも実用的である。従って該発明法により事前選択の均一誘導体化パターンをもつペプチド複合物の大規模産生の実用的手段が提供される。この方法は限定はされないが、細胞培養物で細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母菌細胞又は原核細胞）産生時に不完全にグリコシル化された糖ペプチド、遺伝子導入植物又は遺伝子導入動物を含む治療用ペプチドの修飾に特に良く適する。
このFGFペプチド複合物としてFGFペプチド複合物と同様に薬剤容認担体からなる薬剤処方が含まれる。
本発明は又例えば、クリアランス速度の減少又は免疫系又は細網内皮系（RES）による取り込み速度の減少により治療半減期の増加したFGFペプチド複合物を提供する。更に該発明法によりペプチドの抗原決定基遮蔽手段が提供され、その結果該ペプチドに対する宿主免疫応答を減ずるか又は除去する。標的試薬の選択的付着を用いて、ペプチドは特定標的試薬に特異的な特定組織や細胞表面受容体を標的とする。
（変異体）
本発明は野生型ペプチドには見られない一つ以上のO−連結かＮ−連結グルコシル化部位を含むFGF変異体を提供する。該変異体は野生型ペプチドでは通常はグルコシル化されないか、殆どグリコシル化されない一つ以上の部位で酵素的グリコシル化する基質である。従って該変異体ではグリコシル残基又はグリコシル連結基の位置を操作して、選択の所望物性を有するペプチドが得られる。グリコシル残基又はグリコシル連結基の位置と数以外に、該発明の変異体と方法を用いて変化できる他物性としては、薬物動態力学、薬力学、タンパク質分解耐性、免疫原性、細網内皮系による認識、組織分配及び類似体が挙げられる。
その結果一様態では、本発明は変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。変異線維芽細胞成長因子は対応野生型線維芽細胞成長因子には存在しないO−連結又はＮ−連結グルコシル化部位を含む。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む。幾つかの好ましい実施形態では、変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１４６のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。代表的実施形態では、線維芽細胞成長因子活性をもつペプチドは、ここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％相同なアミノ酸配列を有する。好ましくはアミノ酸配列はここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
他様態では本発明により核酸、例えば、変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列を含む単離核酸からなる発現カセットや細胞が提供される。変異線維芽細胞成長因子としては相応野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位が挙げられる。
他様態では本発明により対応野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子が提供される。幾つかの実施形態では対応野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を含む。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１４６のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。代表的実施形態では線維芽細胞成長因子活性をもつペプチドは、ここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％相同なアミノ酸配列を有する。好ましくはアミノ酸配列はここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
他様態では本発明により対応野生型線維芽細胞成長因子に存在しないN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子作成法が提供される。本方法は変異線維芽細胞成長因子を組み換え的に産生する段階と、新規グリコシル化部位で変異線維芽細胞成長因子をグリコシル化する段階を含む。幾つかの実施形態では対応野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９及び１１２−１４５から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:１４６のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:１６１−２１４、２２０−３２０及び３２３−３６０から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含み。代表的実施形態では、線維芽細胞成長因子活性をもつペプチドは、ここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％相同なアミノ酸配列を有する。好ましくはアミノ酸配列はここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％相同である。
（FGFコード配列の獲得）
一般的組み換え技術
本発明は組み換え遺伝学分野での定型法に依存する。本発明で使用の一般法を開示した基礎的書籍としては、サンブルック（Sambrook）及びラッセル（Russell）、分子クローニング、ラボマニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、（３版、２００１年）；クリーグラー（Kriegler）、遺伝子導入と発現：ラボマニュアル（Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual）、（１９９０年）及びオウスベル等編（Ausubel, et al. eds.）、分子生物学での現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、（１９９４年）が挙げられる。
核酸の大きさはキロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらはアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、配列核酸又は公表DNA配列に基づく評価である。タンパク質の大きさはキロダルトン（ｋDa）又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質の大きさはゲル電気泳動、配列タンパク質、誘導アミノ酸配列又は公表タンパク質配列により評価する。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、ビューケージ（Beaucage）及びカルーザス（Caruthers）、テトラヘドロンレター（Tetrahedron Lett.）、２２巻、１８５９−１８６２頁（１９８１年）に最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法により、バンデバンター等（Van Devanter et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Res.）、１２巻、６１５１−６１６８頁（１９８４年）に記載の自動シンセサイザーを用いて化学的に合成できる。オリゴヌクレオチドの精製は任意の技術的に認知の方法、例えば、ピアーソン（Pearson）及びレニアー（Reanier）、ジャーナルオブクロマトグラフィ（J. Chrom.）、２５５巻、１３７−１４９頁（１９８３年）に記載の未変性アクリアミドゲル電気泳動か陰イオン交換HPLCを用いて行う。
クローン化野生型線維芽細胞成長因子遺伝子配列、変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列及び合成オリゴヌクレオチド配列は、例えばウオレス等（Wallace et al.）、ジーン（Gene）、16巻２１−２６頁（１９８１年）の配列決定二本鎖鋳型に関するチェーンターミネーション法を用いてクローン化後検証できる。
野生型FGFコード配列のクローン化とサブクローニング
多数の野生型線維芽細胞成長因子―２０コード化ポリヌクレオチド、例えばジェンバンクアクセス番号NM_０１９８５１、NM_０１９１１３が決定され業者から入手できる。
ヒトゲノム研究の急速な進歩により、ヒトDNA配列データベースが以前に同定された線維芽細胞成長因子をコード化したモノのように、既知ヌクレオチド配列に対して一定パーセントの配列相同性を有する任意遺伝子断片が調べられる場合、クローン化アプローチが可能になった。同定した任意DNA配列は、次いで化学合成及び／又は重複伸長法のようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により得られる。短鎖配列では完全にデノボ合成で十分である一方、大きな遺伝子を得るには更にヒト相補DNAからの全長コード配列単離、或いは合成プローブで用いるゲノムライブラリが必要となる。
代わりに線維芽細胞成長因子コード化核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような標準的クローン化法を用いてヒト相補DNAかゲノムDNAライブラリから単離でき、相同性ベースのプライマーがしばしば線維芽細胞成長因子コード化既知核酸配列から誘導される。この目的に最も良く用いる技法は標準テキスト、例えば上出のサンブルック（Sambrook）及びラッセル（Russell）に記載されている。
野生型線維芽細胞成長因子用コード配列を得るのに適した相補DNAライブラリーは市販されており又構築できる。伝令RNAの単離、逆転写による相補DNAの作成、相補DNAの組換え型ベクターへの連結、伝播、スクリーニング及びクローン化のための組み換え宿主への形質移入の一般法はよく知られている（例えば、ガブラー（Gubler）及びホフマン（Hoffman）、ジーン（Gene）、２５巻、２６３−２６９頁（１９８３年）；オースベル等（Ausubel, et al.）、上出）。PCRによりヌクレオチド配列の増幅セグメントが得られると、該セグメントを更にプローブとして用いて該相補DNAライブラリーから野生型線維芽細胞成長因子コード化完全長ポリヌクレオチド配列が単離できる。適切た手順の一般的記述は上述のサンブルック（Sambrook）及びラッセル（Russell）に見られる。
類似法に従って野生型線維芽細胞成長因子コード化完全長配列、例えば上述のジェンバンクアクセス番号の任意の一つがヒトゲノムライブラリから得られる。ヒトゲノムライブラリは市販されており種々の技術的に認知された方法により構築できる。通常ゲノムライブラリを構築するには、該DNAを先ず線維芽細胞成長因子が見つけられやすい組織から抽出する。次いで該DNAを機械的に剪断するか、又は酵素的に消化して長さが約１２−２０ｋｂの断片を得る。次いで該断片を好ましくない大きさのポリヌクレオチド断片から勾配遠心分離により分離し、バクテリオファージλベクターに挿入する。これらベクターとファージを試験管内でパッケジする。組み換えファージをベントン（Benton）及びデイビス（Davis）、サイエンス（Science）、１９６巻、１８０−１８２頁（１９７７年）に記載のようにプラークハイブリッド形成法により分析する。コロニーハイブリッド形成法をグルンスタイン等（Grunstein, et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７２巻、３９６１−３９６５頁（１９７５年）に記載のように行う。
配列相同性に基づいて縮重オリゴヌクレオチドをプライマー組みとしてデザインし、PCRを適切条件下で行い（例えばホワイト等（White, et al.）、PCRプロトコル：最新の方法と応用（PCR Protocols: Current Methods and Applications）、１９９３年；グリフィン（Griffin）及びグリフィン（Griffin）、PCR技術（PCR Technology）、シーアールシー出版社（CRC Press Inc.）、１９９４年参照）、ヌクレオチド配列セグメントを相補DNAかゲノムライブラリから増幅できる。該増幅セグメントをプローブとして用いて、野生型線維芽細胞成長因子コード化完全長核酸が得られる。
野生型線維芽細胞成長因子コード化核酸配列が得られると、該コード配列をベクター、例えば発現ベクターにサブクローンし、組み換え野生型線維芽細胞成長因子が生成作成物から産生できる。次いで野生型線維芽細胞成長因子コード配列への更なる修飾、例えばヌクレオチド置換が行われ該分子の特性が変えられる。
FGF配列への変異導入
コード化ポリヌクレオチド配列から野生型線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列、例えばSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:146が決定できる。次いでこのアミノ酸配列を一つ又は複数の追加グリコシル化部位を該アミノ酸配列の種々の位置に導入して修飾し、タンパク質のグリコシル化パターンを変えても良い。
幾つかの形のタンパク質グリコシル化部位が技術的に良く知られている。例えば、真核動物ではＮ−連結グリコシル化がXaaがプロリン以外の任意のアミノ酸である共通配列Asn−Xaa−Ser/Thrのアスパラギンで起こる（コーンフェルト等（Kornfeld et al.）、アニュアルレビュオブバイオケミストリ（Ann. Rev. Biochem.）、５４巻、６３１−６６４頁（１９８５年）；ククルジンスカ等（Kukuruzinska, et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８４巻、２１４５−２１４９頁（１９８７年）；ヘルスコビック等（Herscovics, et al.）、エフエイエスイービー（FASEB）、７巻、５４０−５５０頁（１９９３年）；及びオルリン（Orlean）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、３巻、（１９９６年））。O−連結グリコシル化はセリン残基かスレオニン残基で起こる（タンナー等（Tanner et al.）、バイオキミバイオフィジクアクタ（Biochim. Biophysl Acta）、９０６巻、８１−９１頁（１９８７年）及びハウンセル等（Hounsell, et al.）、グリココンジュゲートジャーナル（Glycoconj. J.）、１３巻、１９−２６頁、（１９９６年））。他グリコシル化パターンはグリコシルホスファチジルイノシトールをタンパク質のカルボキシル末端カルボキシル基に連結して形成する（武田等（Takeda, et al.）、トレンドインバイオケミストリサイエンス（Trends Biochem. Sci.）、２０巻、３６７−３７１頁（１９９５年）及びウデンフレンド等（Udenfriend, et al.）、アニュアルレビュオブバイオケミストリ（Ann. Rev. Biochem.）、６４巻、５９３−５９１頁（１９９５年））。この知見に基づいて適切な変異を野生型線維芽細胞成長因子配列に導入して新規グリコシル化部位が形成できる。
線維芽細胞成長因子ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の直接修飾入は、新規のＮ−連結又はO−連結グリコシル化部位導入には適するが、線維芽細胞成長因子配列コード化ポリヌクレオチドの変異により新規グリコシル化部位導入がよりしばしば完遂される。これは既知の変異誘発法のいずれかを用いて達成でき、その幾つかを以下に検討する。線維芽細胞成長因子への代表的修飾としてはSEQ ID NO:９又はSEQ ID NO:８７が挙げられる。
種々の変異発生プロトコルが技術的に確立され記載されている。例えばザング等（Zhang, et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sic. USA）、９４巻、４５０４−４５０９頁（１９９７年）；ステマー（Stemmer）ネーチャー（Nature）、３７０巻、３８９−３９１頁（１９９４年）参照。その方法を独立又は組み合わして用いて、核酸組みの変異体の産生とそれによるコード化ポリペプチド変異体が産生できる。変異誘発キット、ライブラリ構築及び他の多様性産生法は市販されている。
多様生産性の変異方法としては、例えば部位特異的変異誘発（ボットステイン（Botstein）、ショートル（Shortle）、サイエンス（Science）、２２９巻、１１９３−１２０１頁（１９８５年））、ウラシル含有鋳型使用の変異誘発（クンケル（Kunkel）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sic. USA）、８２巻、４８８−４９２頁（１９８５年））、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（ゾッラー（Zoller）、スミス（Smith）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucl. Acids Res.）、１０巻、６４８７−６５００頁（１９８２年））、ホスホロチオエート修飾DNA変異誘発（テーラー等（Taylor, et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucl. Acids Res.）、１３巻、８７４９−８７６４頁及び８７６５−８７８７頁（１９８５年）及びギャップ付き二重鎖DNA使用の変異誘発（クレーマー等（Kramer et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucl. Acids Res.）、１２巻、９４４１−９４５６頁（１９８４年））が挙げられる。
変異発生の他方法としては、点ミスマッチ修復（クレーマー等（Kramer et al.）、セル（Cell）、３８巻、８７９−８８７頁（１９８４年））、修復欠損宿主株使用の変異誘発（カーター等（Carter, et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucl. Acids Res.）、１３巻、４４３１―４４４３頁（１９８５年））、欠失変異誘発（エグテダルザデー（Eghtecarzadeh）、ヘニコフ（Henikoff）、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucl. Acids Res.）、１４巻、５１１５頁（１９８６年））、制限選択及び制限精製（ウエルズ等（Wells et al.）、フィロソフィカルトランザクションオブロイヤルソサエティオブロンドンA（Phil. Trans. R. Soc. Lond. A）、３１７巻、４１５−４２３頁（１９８６年））、遺伝子全合成による変異誘発（ナンビア等（Nambier et al.）、サイエンス（Science）、２２３巻、１２９９―１３０１頁（１９８４年））、二本鎖切断修復（マンデッキ（Mandecki）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sic. USA）、８３巻、７１７７−７１８１頁（１９８６年））、ポリヌクレオチド連鎖停止法による変異誘発（米国特許５，９６５，４０８）及び誤りがちなPCR（リュング等（Leung, et al.）、バイオテクニック（Biotechniques）、１巻、１１−１５頁（１９８９年））が挙げられる。
宿主生物での好ましいコドン使用用核酸の修飾
変異線維芽細胞成長因子コード化ポリペプチド配列は、更に特定宿主で使用に好ましいコドンと一致するように変化できる。例えば、細菌性細胞の一株での使用に好ましいコドンを用いて該発明の変異線維芽細胞成長因子をコードし、本株で好まれるコドンを含むポリヌクレオチドを誘導できる。宿主細胞が示す好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞発現の多数の遺伝子での好ましいコドン使用の平均頻度で計算できる（例えば計算サービスは上総DNA研究所（Kazusa DNA Research Institute）、日本（Japan）のホームページが利用できる）。この分析は好ましくは該宿主細胞により高度に発現する遺伝子に限られる。例えば、米国特許５，８２４，８６４では、双子葉植物と単子葉植物が示す高度発現遺伝子によるコドン使用頻度が与えられる。
修飾が完結すると変異線維芽細胞成長因子コード配列が配列決定により確認され、次いで野生型線維芽細胞成長因子と同様に組み換え産生用の適切発現ベクターにサブクローンする。
変異FGFの発現と精製
配列確認に続いて本発明の変異線維芽細胞成長因子が、ここに開示の該ポリペプチドコード化ポリヌクレオチド配列により、組み換え遺伝学分野での常法を用いて産生できる。
発現系
本発明の高レベルの変異線維芽細胞成長因子コード化核酸の発現を得るには、通常変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチドを転写を指示する強力プロモーター、転写／翻訳ターミネーター及び翻訳開始用リボソーム結合部位含有の発現ベクターにサブクローンする。適切な細菌性プロモーターは技術的によく知られ、例えば上出のサンブルック（Sambrook）とラッセル（Russell）とアウスベル等（Ausubel, et al.）に記載されている。野生型又は変異線維芽細胞成長因子発現用の細菌性発現系は、例えば大腸菌、バチルスｓｐ、サルモネラ菌、及びカウロバクターとして入手できる。この発現系用キットが市販されている。哺乳類細胞、酵母菌及び昆虫細胞用の真核生物発現系は、技術的によく知られており又市販されている。一実施形態では該真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター又はレトロウイルスベクターである。
異種核酸の直接発現に用いるプロモーターは特定用途に依存する。該プロモーターはその天然設定での転写開始部位とほぼ同じ距離の異種転写開始部位に位置しても良い。しかし技術的に知られているように、この距離はプロモーター機能を失うこと無しにいくらかの変化に適応できる。
プロモータ以外に該発現ベクターとしては、通常宿主細胞の変異線維芽細胞成長因子発現に必要な追加エレメント全てを含む転写ユニット又は発現カセットが挙げられる。従って典型的な発現カセットは、変異線維芽細胞成長因子コード化核酸配列と機能的に連結したプロモーターと、転写物の効果的なポリアデニル化、リボソーム結合部位及び翻訳終結に必要なシグナルを含む。線維芽細胞成長因子コード化核酸配列は。通常切断可能シグナルペプチド配列と連結して形質転換細胞による線維芽細胞成長因子分泌を促進する。このシグナルペプチドとしては、特に組織プラスミノーゲン活性因子、インスリン及びニューロン成長因子のシグナルペプチド及びオオタバニコガの幼若ホルモンエステル分解酵素が挙げられる。該カセットの追加エレメントとしてはエンハンサーを含んでも良く、ゲノムDNAが構造遺伝子として用いた場合には、機能性スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を有するイントロンを含んでも良い。
プロモーター配列以外に該発現カセットは、又効果的終結するために構造遺伝子下流に転写終結領域を含む必要がある。該終結領域はプロモーター配列と同一遺伝子から得ても良く又異なる遺伝子から得ても良い。
遺伝子情報の細胞への輸送に用いる特定発現ベクターは特に決定的ではない。真核細胞や原核細胞での発現に用いる在来ベクターのいずれかが使用できる。標準的細菌性発現ベクターとしては、ｐBR332ベースのプラスミドのようなプラスミド、ｐSKF、ｐET23D及びGST及びLacZのような融合発現系が挙げられる。エピトープ標識も又在来の単離法を提供するために組み換えタンパク質、例えばｃ−ｍｙｃに付加される。
真核ウイルスの調節エレメント含有発現ベクターは、通常真核発現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター及びEBウイルス由来ベクターで用いられる。他の代表的真核ベクターとしては、ｐMSG、ｐAV009/A+、ｐMTO10/A+、ｐMAMneo―５、バキュロウイルスｐDSVE及びSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター又は真核細胞での発現に有効性が示された他プローモーターの指示でタンパク質発現が可能な他ベクターが挙げられる。
幾つかの発現系はチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBリン酸転移酵素及びジヒドロ葉酸還元酵素のような遺伝子増幅を与えるマーカーを有する。代わりに遺伝子増幅を含まない高収率発現系は、昆虫細胞のバキュロウイルスベクターのようにポリヘドリンプロモーター、又は他の強力なバキュロウイルスプロモーター指示のもとに変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列に適する。
発現ベクターに通常含まれるエレメントとしては、又大腸菌で機能するレプリコンと組み換えプラスミドを持つ細菌選択が可能な抗生物質耐性コード化遺伝子と、真核生物配列挿入が可能な該プラスミドの非必須領域での特異的制限部位が挙げられる。選んだ特定の抗生物質耐性遺伝子は特に決定的ではなく、技術的に既知の多くの耐性遺伝子のいずれかが適する。原核生物配列は必要な場合には真核細胞のDNA複製を妨げないように選択しても良い。抗生物質耐性選択マーカーと同様に、既知代謝経路に基づく代謝選択マーカーも又形質転換宿主細胞選択手段として用いても良い。
組み換えタンパク質（例えば本発明のFGF変異体）のペリプラズム発現を望む場合、該発現ベクターは更に大腸菌OppA（ペリプラズムオリゴペプチド結合タンパク質）のように発現すべきタンパク質コード配列の５’位と直接結合する分泌シグナルコード化配列又はその修飾バージョンを含む。このシグナル配列により細胞膜を通して細胞質に産生の該組み換えタンパク質をペリプラズム空間に向かわす。発現ベクターは更に該組み換えタンパク質がペリプラズム空間に入る時にシグナル配列を酵素切断できるシグナルペプチダーゼ１用コード配列を含む。組み換えタンパク質のペリプラズム産生に関するより詳細な説明は、例えばグレイ等（Gray, et al.）、ジーン（Gene）３９巻、２４７−２５４頁（１９８５年）、米国特許６，１６０，０８９及び米国特許６，４３６，６７４に見いだせる。
上に検討したように技術の熟知者は、種々の同類置換が線維芽細胞成長因子の生物活性を今なお保持しながら、任意の野生型又は変異線維芽細胞成長因子又はそのコード配列に行えることが分かる。更にポリヌクレオチドコード配列修飾も又生成アミノ酸配列を変えることなしに特定発現宿主に好ましいコドンの使用が適応できる。
形質移入法
標準形質移入法を用いて大量の変異線維芽細胞成長因子を発現する細菌性株細胞、哺乳類株細胞、酵母菌株細胞、昆虫株細胞又は植物株細胞を産生し、次いで標準法を用いて精製する（例えば、コーリー等（Colley, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６４巻、１７６１９−１７６２２頁（１９８９年）；タンパク質精製ガイド（Guide to Protein Purification）、メソッドインエンザイモロジー（Methods in Enzymology）、１８２巻（ドイチャー等編（Deutscher, ed.）、１９９０年）参照）。真核細胞と原核細胞の形質転換は標準法により行う（例えば、モリソン（Morrison）、ジャーナルオブバクテリオロジー（J. Bact.）、１３２巻、３４９−３５１頁（１９７７年）；クラークーカーティス（Clark−Curtiss）、カーティス（Curtiss）、メソッドインエンザイモロジー（Methods in Enzymology）、１０１巻、３４７―３６２頁（ウー等編（Wu, et al., eds）、１９８３年）参照）。
異種ヌクレオチドを宿主細胞に導入する既知法のいずれかが使用できる。これらとしてはリン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム、微量注入、血漿ベクター、ウイルスベクター及びクローン化ゲノムDNA、相補DNA、合成DNA又は他異種遺伝的材料を宿主細胞に導入する他の既知方法の使用が挙げられる（例えば、サンブルック（Sambrook）及びラッセル（Russel）、上出参照）。用いる特定遺伝子工学法は、少なくとも一つの遺伝子を変異線維芽細胞成長因発現可能な宿主細胞に成功裏に導入できることだけが必要である。
宿主細胞中の変異FGF発現の検出
発現ベクターを適切宿主細胞に導入後、形質移入細胞を変異線維芽細胞成長因子発現が好のまれる条件下で培養する。次いで該細胞を組み換えポリペプチド発現のために選別し、次いで標準法を用いて該培養物から回収する（スコープス（Scopes）、タンパク質精製：原理と実施（Protein Purification: Principles and Practice）、（１９８２年）；米国特許４，６７３，６４１；アウスベル等（Ausubel, et al.）、上出；サンブルック（Sambrook）、ラッセル（Russel）、上出参照）。
技術の熟知者には遺伝子発現選別に関する幾つかの標準法がよく知られている。先ず遺伝子発現が核酸レベルで検出できる。核酸ハイブリッド化法を用いる種々の特異的DNA及びRNA 測定法が通常用いられる（例えばサンブルック（Sambrook）及びラッセル（Russel）、上出）。幾つかの方法は電気泳動分離（例えばDNA検出用のサザンプロット法及びRNA検出用のノーザンブロット法）が含まれるが、DNA又はRAN検出は同様に電気泳動無しで実施できる（ドットブロットのような）。形質移入細胞の変異線維芽細胞成長因子コード化核酸の存在も又配列特異的プライマーを用いてPCR又はRT−PCRにより検出できる。
次いで遺伝子発現はポリペプチドレベルで検出できる。技術の熟知者により種々の免疫アッセイを日常的に用いて、特にSEQ ID NO:３、４又は５のアミノ酸配列を有するポリペプチドのように、本発明の変異線維芽細胞成長因と特異的に反応するポリクロナール抗体又はモノクロナル抗体を用いて遺伝子産物レベルを測定する（例えばハーロウ（Harlow）、レーン（Lane）、抗体、ラボマニュアル（Antibodies, A laboratory Manual）、１４章、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８８年；コーラー（Kohler）、ミルステイン（Milstein）、ネーチャー（Nature）、２５６巻、４９５―４９７頁（１９７５年））。この技法は変異線維芽細胞成長因子に対して高特異性を持つ抗体又はその抗原部分の選択により抗体産生する必要がある。ポリクロナール抗体及びモノクロナル抗体産生法はよく確立されており、その説明は文献に見られ、例えばハーロウ（Harlow）、レーン（Lane）、上出；コーラー（Kohler）、ミルステイン（Milstein）、ヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー（Eur. J. Immunol）、６巻、５１１−５１９頁（１９７６年）参照。本発明の変異線維芽細胞成長因子に対する抗体の産生と、変異線維芽細胞成長因子検出の免疫アッセイ実施に関する説明は後章に提供する。
組み換え産生変異FGFの精製
形質移入宿主細胞の組み換え変異線維芽細胞成長因子発現が一旦確認されると、次いで該宿主細胞は該組み換えポリペプチド精製目的のため適切規模で培養する。
細菌からの組み換え産生変異FGFの精製
本発明の変異線維芽細胞成長因子が、通常プロモーター誘導後大量に形質移入細菌により組み換え産生されると、発現は恒常的であるが該タンパク質は不溶性凝集物を形成する。タンパク質封入体の精製に適する幾つかのプロトコルがある。例えば凝集タンパク質（以後封入体と呼ぶ）精製については、細菌性細胞破壊、例えば約１００―１５０μｇ／ｍｌリゾチームと非イオン界面活性剤の０．１％ノニデット（Nonidet）P４０緩衝液中でインキュベートして封入体を抽出、分離及び／又は精製することが挙げられる。該細胞懸濁物はポリトロン（Polytron）グラインダー（ブリンクマンインストルメント（Brinkman Instruments）、ウエストバリー（Westbury）、ニューヨーク（NY））を用いて粉砕する。代わりに該細胞を氷上で超音波処理できる。細菌溶解の代替え法はアウスベル等（Ausubel, et al.）及びサンブルック（Sambrook）、ラッセル（Russel）、両者上出で説明され、技術の熟知者には明白である。
該細胞懸濁物は通常遠心分離し、該封入体含有ペレットを溶解はしないが封入体を洗浄する緩衝液、例えば２０ｍMトリス塩酸塩（ｐH７．２）、１ｍM EDTA、１５０ｍM食塩及び非イオン界面活性剤の２％トリトン（Triton）X１００に再懸濁する。細胞性残骸をできるだけ除去するために洗浄工程を繰り返す必要があるかもしれない。封入体残留ペレットを適当な緩衝液（例えば２０ｍMリン酸ナトリウム、ｐH６．８、１５０ｍM食塩）に再懸濁しても良い。技術の熟知者には他の適切緩衝液が明らかである。
洗浄工程に続いて強水素受容体と強水素供与体両者（又はこれら物性の一つを持つ各溶剤の組み合わせ）である溶剤を添加して、該封入体を可溶化する。次いで該封入体形成タンパク質は適合緩衝液で希釈又は透析して変性する。適切溶剤としては限定はされないが、尿素（約４M乃至約８M）、ホルムアミド（少なくとも体積／体積基準で８０％）及びグアニジン塩酸塩（約４M乃至約８M）が挙げられる。SDS（ナトリウムドデシル硫酸塩）と７０％ギ酸のように凝集物形成タンパク質を可溶化できる幾つかの溶剤は、該タンパク質の不可逆変性の可能性のため免疫原性及び／又は活性欠如を伴いこの方法での使用に不適切である。グアニジン塩酸塩及び類似薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆ではなく該変性剤除去（例えば透析により）又は希釈により再変性が起こり、興味の免疫活性タンパク質及び／又は生物活性タンパク質を再形成できる。可溶化後該タンパク質は一般的分離法により他細菌性タンパク質から分離できる。細菌性封入体からの組み換え線維芽細胞成長因子精製の更なる説明に関しては、例えばパトラ等（Patra, et al.）、プロテインエクスプレッションアンドピュリフィケーション（Protein Expression and Purification）、１８巻、１８２−１９０頁（２０００年）参照。
代わりに組み換えポリペプチド、例えば変異線維芽細胞成長因子を細菌性ペリプラズムから精製できる。該組み換えタンパク質が該細菌ペリプラズムに搬出された場合、該細菌のペリプラズム画分は技術の熟知者に既知の他法以外に冷浸透圧衝撃により単離できる（例えばアウスベル等（Ausubel, et al.）、上出参照）。該ペリプラズムから組み換えタンパク質を単離するために該細菌精細胞を遠心分離してペレットを形成する。該ペレットを２０％蔗糖含有緩衝液に再懸濁する。該細胞溶解のために該細菌を遠心分離にかけ、ペレットを氷冷５ｍM硫酸マグネシウム中に再懸濁し、氷浴に約１０分間保持する。該細胞懸濁物を遠心分離にかけ上澄み液をデカントし取っておく。上澄みに存在する該組み換えタンパク質を技術の熟知者には良く知られた一般的分離法で宿主タンパク質から分離できる。
精製のための一般的タンパク質分離法
組み換えポリペプチド、例えば本発明の変異線維芽細胞成長因子が宿主細胞に可溶形で発現されると、その精製は以下に記載の標準的タンパク質精製法に従う。
溶解度分画
しばしば第一段階で且つタンパク質混合物が複雑な場合、最初の塩分画により無用の宿主細胞タンパク質(又は細胞培地由来のタンパク質)の多くを興味の組み換えタンパク質、例えば本発明の変異線維芽細胞成長因子から除去できる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムによりタンパク質混合物中の水量を効果的に減少してタンパク質が沈殿する。次いでタンパク質がその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質がより疎水性であればあるほど、低硫酸アンモニウム濃度で沈殿しやすい。典型的プロトコルは生成硫酸アンモニウム濃度が２０乃至３０％の間になるように飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に加える。これにより大部分の疎水性タンパク質は沈殿する。沈殿を捨て（興味のタンパク質が疎水性でなければ）、興味のタンパク質が沈殿すると考えられる濃度に硫酸アンモニウムを上澄みに加える。次いで該沈殿を緩衝液に可溶化し、必要なら透析又はダイアフィルトレーションのいずれかにより過剰塩を除去する。冷エタノール沈殿のよなタンパク質の溶解度に依存する他法は技術の熟知者には良く知られており、複合タンパク質混合物分画に使用できる。
サイズ分画濾過
計算分子量に基づいて異なる細孔径膜（例えばアミコン（Amicon）膜又はミリポア（Millipore）膜）による限外濾過を用いて、より大きいサイズとより小さいサイズのタンパク質が単離できる。第一段階で該タンパク質混合物を興味のタンパク質、例えば変異線維芽細胞成長因子の分子量より低い分子量カットオフを持つ細孔サイズを有する膜により限外濾過する。次いで限外濾過保持物を興味のタンパク質の分子量より大きな分子カットオフを持つ膜で限外濾過する。組み換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入る。次いで濾液を以下に説明するようにクロマトグラフにかける。
カラムクロマトグラフィ
興味のタンパク質（本発明の変異線維芽細胞成長因子のような）も又その大きさ、正味表面電荷、疎水性又は配位子親和性を基に他タンパク質から分離できる。更に線維芽細胞成長因子に対して産生の抗体をカラム担体と複合化し、線維芽細胞成長因子に免疫精製できる。これらの方法の全ては技術的に良く知られている。
クロマトグラフ法は任意の規模で且つ多くの異なる製造会社（例えばファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））の機器を用いて実施できことは一熟知者には明白である。
変異FGF発現検出用イムノアッセイ
組み換え変異線維芽細胞成長因子産生を確認するために、免疫学的アッセイは試料中の該ペプチドの発現検出に有用である。又免疫学的アッセイは該組み換えホルモンの発現レベルの定量に有用である。変異線維芽細胞成長因子に対する抗体がこれら免疫学的アッセイ実施に必要である。
変異FGFに対する抗体の産生
興味の免疫原と特異的の反応するポリクロナール抗体とモノクロナル抗体の産生法は技術の熟知者には既知である（例えば、コリガン（Coligan）、免疫学における最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）、ワイリー／グリーン（Wiley/Greene）、ニューヨーク（NY）、１９９１年；ハーロウ（Harlow）、レーン（Lane）、抗体：ラボマニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバーブレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク（New York）、１９８９年；スタイテス等編（Stites, et al. eds.）、基礎及び臨床免疫学（Basic and Clinical Immunology）（４版）、ラングメディカルパブリケーション（Lange Medical Publications）、ロスアルトス（Los Altos）、カルフォルニア（CA）及びそこに記載の文献；ゴディング（Goding）、モノクロナル抗体：原理と実施（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）（２版）、アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨーク（New York）、ニューヨーク（NY）、１９８６年及びコーラー（Kohler）、ミルステイン（Milstein）、ネーチャー（Nature）、２５６巻、４９５−４９７頁、１９７５年参照）。この方法としてはファージ又は類似ベクターの組み換え抗体ライブラリでの抗体選択による抗体産生が挙げられる（ヒューズ等（Huse, et al.）、サイエンス（Science）、２４６巻、１２７５−１２８１、（１９８９年）及びワード等（Ward, et al.）、ネーチャー（Nature）、５４４−５４６頁（１９８９年））。
所望特異性性を持つ抗体含有抗血清を産生するために、興味のポリペプチド（例えば、本発明の変異線維芽細胞成長因子）又はその抗原断片を用いて適切な動物、例えばマウス、ウサギ又は霊長類を免疫できる。標準的免疫化プロトコルによりフロイントアジュバントのような標準アジュバントを用いることができる。代わりにその特定ポリペプチド由来の合成抗原ペプチドを担体タンパク質に複合化し、次いで抗原として使用できる。
抗原製剤に対する動物の免疫応答は、試験出血を取り興味抗原に対する反応性力価を決定することでモニターする。抗原に対する抗体の適切な高力価が得らると、動物から血液を採取し抗血清を産生する。次いで該抗原に対し特異反応性の抗体を濃縮するために該抗血清の更なる分画と該抗体の精製を行うが、ハーロー（Harlow）、レーン（Lane）、上出と上記のタンパク質精製の一般的説明を参照する。
技術の熟知者には良く知られた種々の技法を用いてモノクロナル抗体が得られる。通常所望抗原で免役した動物の脾細胞を通常骨髄腫と融合して不死化する（コーラー（Kohler）、ミルステイン（Milstein）、ヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー（Eur. J. Immunol）、６巻、５１１−５１９頁（１９７６年）参照）。不死化の代替え法としては、例えばEBウイルスとの形質転換、発癌遺伝子又はレトロウイルス、又技術的に良く知られた他法が挙げられる。該抗原に対して所望特異性と親和性のある抗体産生のために単独不死化細胞で産生のコロニーを選別し、この細胞により産生したモノクロナル抗体収率は脊椎動物宿主腹腔への注入を含む種々技法で増加できる。
更にモノクロナル抗体は又所望特異性を有する抗体コード化核酸配列、又は上出のヒューズ等（Huse, et al.）に概説した一般的プロトコルによりヒトB細胞相補DNAライブラリを選別し、この抗体の結合断片を同定して組み換え産生できる。上に検討の組み換えポリプチド産生の一般的原理と方法は組み換え法による抗体産生に適用できる。
望ましい場合には本発明の変異線維芽細胞成長因子を特異的に認識できる抗体で、野生型線維芽細胞成長因子との交差反応性を試験でき、野生型タンパク質に対する抗体と区別できる。例えば変異線維芽細胞成長因子で免疫した動物から得た抗血清を、野生型線維芽細胞成長因子を固定化したカラムに流す。カラムを通過した該抗血清部分が変異線維芽細胞成長因子だけを認識し、野生型線維芽細胞成長因子は認識しない。同様に変異線維芽細胞成長因子に対するモノクロナル抗体も又野生型線維芽細胞成長因子ではなく、変異線維芽細胞成長因子のみを認識する排他性で選別できる。
野生型線維芽細胞成長因子ではなく、変異線維芽細胞成長因子のみを特異的に認識するポリクロナール抗体又はモノクロナル抗体は、例えば固体担体に固定の変異線維芽細胞成長因子特異的ポリクロナール抗体又はモノクロナル抗体で試料をインキュベートして、該野生型タンパク質からの変異タンパク質の単離に有用である。
変異FGF発現検出用イムノアッセイ
一旦本発明の変異線維芽細胞成長因子に特異な抗体が入手できると、試料、例えば細胞溶解物中の該ポリペプチド量は、熟練職人が定性的、定量的結果を得る種々のイムノアッセイ法で測定できる。一般的免疫学的方法とイムノアッセイ法の総説に関しては、スティテス（Stites）、上出；米国特許４、３６６，２４１；米国特許４，３７６，１１０；米国特許４，５１７，２８８及び米国特許４，８３７，１６８参照。
変異FGFによるグリコシル化と複合糖質化
酵素法によるグリコシル化と複合糖質化
ペプチドの発現後試験管内修飾は、グリカン構造修飾と新規部位へのグリカン導入両者を含む発現系操作によるグリコシル化調節に依存する方法での欠陥を改善するのに魅力的な戦略である。糖類供与体成分を転移する酵素の包括的武器が入手できるようになり、特注グリコシル化パターンとグリコシル構造をもつ複合糖質の試験管内酵素合成が可能である。例えば、米国特許５，８７６，９８０；米国特許６，０３０，８１５；米国特許５，７２８，５５４；米国特許５，９２２，５７７及び公開特許出願WO９８／３１８２６； WO０１／８８１１７；WO０３／０３１４６４；WO０３／０４６１５０；WO０３／０４５９８０；WO０３／０９３４４８；WO０４／００９８３８；US２００２／１４２３７０；US２００３／０４００３７；US２００３／１８０８３５；US２００４／０６３９１１；US２００３／２０７４０６及びUS２００３／１２４６４５を参照し、それぞれをここに文献として取り入れる。
該発明は対応野生型FGFには存在しないグリコシル化部位を有するグルコシル化又は非グリコシル化変異線維芽細胞成長因子の複合物産生法を提供する。この複合化はグリコシル化変異FGFの適切糖ユニットで直接起こるか、又は任意の好ましくない糖ユニットの除去（即ち“戻りトリミング”）が続く。該複合物はペプチドと水溶性ポリマー、治療成分、診断成分、標的成分及び類似体のような多様種の間で形成される。リンカーアームにより一緒に連結した二つ以上のペプチドを含む複合物、即ち多機能性複合物も又提供される。該発明の多機能性複合物は同一ペプチドの二つ以上のコピー、又は異なる構造及び／又は物性を持つ多様なペプチド収集物を含んでも良い。
該発明の複合物はグリコシル化又は非グリコシル化ペプチドへの修飾糖の酵素付着により形成する。修飾糖がペプチドと該糖の修飾基間に配置すると、ここで“グリコシル連結基”と呼ばれるものになる。糖転移酵素のような酵素の精巧な選択性を用いて、本発明は所望基を一つ以上の特異位置に持つペプチドを提供する。その結果本発明により、修飾糖がペプチド鎖上の選択座位に直接付着するか、代わりに修飾糖が糖ペプチドの炭水化物成分に付加する。修飾糖が糖ペプチド炭水化物とペプチドバックボーンのアミノ酸残基と直接結合したペプチドも又本発明の範囲内である。
既知の化学的、酵素的ペプチド生成戦略と対比すると、該発明法は実質的に均一な誘導体化パターンを持つペプチドと糖ペプチドが構築できる。該発明の用いる酵素は通常特定アミノ酸残基か又は該ペプチドのアミノ酸残基の組み合わせに選択的である。該法は又修飾ペプチド及び糖ペプチドの大規模産生に又実用的である。従って該発明法は事前選択の均一誘導体化パターンを有する糖ペプチドの大規模産生に対する実用手段を提供する。該法は制限はされないが、細胞培養細胞（例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母菌細胞又は原核細胞）、遺伝子導入植物又は遺伝子導入動物で産生中に不完全にグルコシル化した糖ペプチドも含む治療用ペプチドの修飾に非常に良く適する。
該発明の方法は又例えば、クリアランス速度の減少、免疫系又は網膜内皮系（ＲＥＳ）による取り込み速度の減少による治療半減期が増加したグリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドを提供する。更に該発明の方法はペプチドの抗原決定基の遮蔽手段を提供し、その結果該ペプチドに対する宿主免疫応答を減少するか除去する。標的薬剤の選択的付着を用いて又ペプチドは特定標的薬剤に特異的な特定組織か又は細胞表面受容体を標的にできる。
ペプチド複合物
他様態では本発明は修飾糖とＦＧＦペプチド間の複合物を提供する。この場合のＦＧＦペプチドは野生型ペプチドと同一配列を有するか又は変異ペプチドでも良い。ペプチド複合物は幾つかの形の一つを有する。典型的実施例ではペプチド複合物はＦＧＦペプチドとグリコシル連結基により該ペプチドのアミノ酸と連結した修飾基からなる。
他の典型的実施形態では線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ペプチド複合物は、ＦＧＦペプチドとＦＧＦペプチドアミノ酸残基に付着したグリコシル基からなる。他の典型的実施形態では該ＦＧＦペプチドはFGF―１、FGF―２、FGF―９、FGF―１８、FGF―２０及びFGF―２１から選んだ構成員である。他の典型的実施形態では該ＦＧＦペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１，９−１４、１８−４５、４８−６５、６９−１０９、１１２−１４５及び１４６から選んだ構成員である少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。
典型的実施形態では該グリコシル基は無傷グリコシル連結基である。他の典型的実施形態では該グリコシル基は更に修飾基を含む。他の典型的実施形態では該修飾基は非グリコシド修飾基である。典型的実施形態では該修飾基は天然発生糖成分を含まない。
他の典型的実施形態では該ペプチド複合物はＦＧＦペプチドと糖ペプチド炭水化物と
ぺプチドバックボーンのアミノ酸残基と直接結合したグリコシル連結基を含むことができる。更に他の典型的実施形態ではペプチド複合物はＦＧＦペプチドと該ペプチドのアミノ酸残基に直接連結した修飾基を含むことができる。本実施形態では該ペプチド複合物はグリコシル基を含まない。これら実施形態にいずれでも該ＦＧＦペプチドはグリコシル化されてもされなくても良い。本発明は又ＦＧＦ上でのグリカン構造修飾法も含み、ＦＧＦと修飾基間の複合物を提供する。
該発明の複合物は通常以下の一般構造に対応し、


ここでa、ｂ、ｃ、ｄ及びｓはゼロではない正の整数を表し、ｔはゼロか正の整数のいずれかである。“薬剤”は治療薬、生物活性薬剤、検出可能標識、水溶性成分（例えばＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ及びｍ−ＰＰＧ）又は類似体である。“薬剤”はペプチド、例えば酵素、抗体、抗原などでも良い。リンカーは下記の広範囲の連結基のいずれかである。代わりにリンカーは単結合又は“ゼロ次リンカー”でも良い。
以下の検討で該発明はFGF―２０及びFGF―２１のような選ばれたＦＧＦペプチドの使用を参照して示す。技術の熟知者にはこの検討の中心は説明を明快にするためであり、任意のＦＧＦペプチドは野生型も変異型もこれら複合物形成に使用できることが分かる。
修飾糖
典型的実施形態では該発明のペプチドは修飾糖と反応してペプチド複合物を形成する。修飾糖は“糖供与体成分”と同様に“糖転移成分”を含む。該糖供与体成分は該発明の複合物としてグリコシル成分か又はアミノ酸成分のいずれかにより該ペプチドと付着する修飾糖の任意部分である。該糖供与体成分は修飾糖からペプチド複合物のグリコシル連結基への転換時に化学的に変化するそれら原子を含む。該糖転移成分は該発明の複合物としてペプチドに付着しない修飾糖の任意部分である。例えば該発明の修飾糖はペグ化糖ヌクレオチドであるシチジン一リン酸―糖―ＰＥＧ（ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）である。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧでは糖供与体成分又はＰＥＧ―シアル酸供与体成分はＰＥＧ―シアル酸を含むが、、糖転移成分又はシアル酸基転移成分はＣＭＰを含む。
該発明で用いる修飾糖で糖成分としては、好ましくは糖、デオキシ糖、アミノ糖又はＮ−アシル糖である。“糖類”及びその相当語句の“糖の”、“糖”及び“グリコシル”という用語は単量体、二量体、オリゴマー及びポリマーを意味する。該糖成分は又修飾基で機能化される。該修飾基は通常糖のアミン、スルフヒドリル又は水酸基成分、例えば一級水酸基により糖成分と複合化する。典型的実施形態では該修飾基は糖のアミン成分により、例えばアミンと修飾基の反応性誘導体との反応により形成されるアミド、ウレタン又は尿素により付着する。
任意の糖成分は修飾糖の糖供与体成分として使用できる。糖成分はマンノース、ガラクトース又はブドウ糖のような既知糖、或いは既知糖の立体化学を有する種でも良い。これら修飾糖の一般式は以下の通りである。


該発明成分の形成に有用な他糖成分としては限定されないが、フコース及びシアル酸、更にはグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５アミン類似物及び類似体が挙げられる。該糖成分は天然に見出される構造でも良く、又該修飾基を複合化する部位を提供するように修飾しても良い。例えば一実施形態では該修飾糖は９―水酸基成分がアミンで置換されたシアル酸誘導体を提供する。該アミンは選択修飾基の活性化類似物で容易に誘導化される。
該発明で用いる修飾糖の例はPCT特許出願PCT／US０５／００２５２２に記載され、ここに文献として取り入れる。
更なる典型的実施形態では該発明は６―水酸基位置が上に示したもののように、リンカー修飾基を持つ対応アミン成分に変換した修飾糖を利用する。これら修飾糖のコアとして使用できる典型的グリコシル基としてはＧａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ，Ｘｙｌ，Ｍａｎ及び類似体が挙げられる。本実施形態による代表的修飾糖は以下の式を有し、


ここでR11―R14はH, OH, C(O)CH3, NH及び NHC(O)CH3から独立に選んだ構成員である。 R10は他のグリコシル残基（―O―グリコシル）又は第ＶＩＩ因子及び／又は活性化第ＶＩＩ因子ペプチド（―NH―（第ＶＩＩ因子及び／又は活性化第ＶＩＩ因子）のアミノ酸とのリンクである。R14はOR1、NHR1又は NH―L―R1である。R1とNH―L―R1は上記した。
グリコシル連結基
典型的実施形態では該発明は該発明の修飾糖とＦＧＦペプチド間で形成するペプチド複合物を提供する。本実施形態では修飾糖の糖供与体成分（糖成分及び修飾基のような）は“グリコシル連結基”となる。“グリコシル連結基”は代わりに該ペプチドと該修飾基間に位置するグリコシル成分を意味する。
ペプチドへのグリコシル残基付加及び／又は修飾に利用できる方法の汎用性により、該グリコシル連結基は実質的に任意構造が取り得る。以下の検討で該発明がフラノースとピラノースの選択的誘導体使用を参考にして説明する。技術の熟知者は検討の中心は説明を明快にするためで、示した構造と組成は通常グリコシル連結基と修飾糖の属全体に適応できることが分かる。グリコシル連結基は実質的に任意の単糖でもオリゴ糖を含むことができる。グリコシル連結基は側鎖かペプチドバックボーンを通してアミノ酸に付着する。代わりにグリコシル連結基は糖成分を通してペプチドに付着できる。この糖成分はペプチドのO−連結又はＮ−連結グリカン構造の一部でも良い。
典型的実施形態では該発明は以下の式を有するグリコシル連結基を利用し、


ここでＪはグリコシル成分、Ｌは結合又はリンカー、R1は修飾基、例えばポリマー型修飾基である。代表的結合はグリコシル成分のアミノ成分と修飾基の相補的反応性基間で形成されるものである。例えばR1がカルボン酸成分を含む場合、この成分は活性化されグリコシル残基のアミノ成分と結合してNHC(O)R1構造を有する結合を与える。Ｊは好ましくはピラノース構造やフラノース構造を切断する条件、例えば酸化条件、例えば過ヨウ素酸ナトリウムに暴露しても分解していない“無傷な”グリコシル成分である。
典型的リンカーとしてはアルキル成分又はヘテロアルキル成分が挙げられる。リンカーとしては連結基、例えばアシルベースの連結基、例えばーC(O)NH―、―OC(O)NH―及び類似体が挙げられる。該連結基は該発明種の成分間、例えばグリコシル成分とリンカー（Ｌ）間、又はリンカーと修飾基（R1）間で形成した結合である。他の典型的連結基はエーテル類、チオエーテル類及びアミン類である。例えば一実施形態ではリンカーはグリシン残基のようなアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸成分はグリコシル残基のアミンと反応して対応アミドに変換し、グリシンのアミンは修飾基の活性化カルボン酸又は炭酸塩と反応して対応アミド又はウレタンに変換する。
NH―L―R1の典型種としては以下の式を有する。
―NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1で、ここで指数ｓとｔは独立にゼロか１である。指数a、ｂ及びｄは独立に０から２０の整数であり、ｃは１から２５００の整数である。他の類似リンカーは―ＮＨ成分が他の基、例えば―S、―O又は―CH2で置換された種に基づく。技術の熟知者には指標ｓとｔに対応する一つ以上の括弧内成分が、置換又は非置換アルキル成分又はヘテロアルキル成分で置換できることが分かる。
より特定的には該発明はNH−L−R1が以下の化合物を利用する。
NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1及びNHR1。これらの式で指標a、ｂ及びｄは整数０から２０、好ましくは１から５から独立に選ぶ。指標ｃは１から約２５００の整数である。
典型的実施形態ではｃはＰＥＧ成分が約１キロダルトン、５キロダルトン、１０キロダルトン、１５キロダルトン、２０キロダルトン、２５キロダルトン、３０キロダルトン、３５キロダルトン、４０キロダルトン、４５キロダルトン、５０キロダルトン、５５キロダルトン、６０キロダルトン又は６５キロダルトンであるように選択する。
便宜的な目的で本節の残分でのグリコシル残基はシアリル成分に基づく。しかし技術の熟知者にはマンノシル、ガラクトシル、グルコシル又はフコシルのような他のグルコシル成分がシアリル成分の代わりに使用できることが分かる。
典型的実施形態では該グリコシル連結基は連結基を形成する一つ又は複数のグリコシル成分が化学的（例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウム）工程や酵素的（例えば酸化酵素）工程で分解しない無傷のグリコシル連結基である。該発明の選択複合物としてはアミノ糖、例えばマンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミン成分と結合する修飾基が挙げられる。典型的実施形態では該発明は以下から選んだ式を有する無傷グリコシル連結基からなるペプチド複合物を提供する。


式ＩでR2は水素原子、CH2OR7、 COOR7 又はOR7であり、R7は水素原子、置換又は非置換アルキル又は置換又は非置換ヘテロアルキルである。COOR7がカルボン酸かカルボキシレートの場合には、両形は単一構造COO―またはCOOHの意味で表される。式Ｉと式ＩＩで記号R3、R4、R5、R6及びR6'は独立に水素原子、置換又は非置換アルキル、OR8、NHC(O)R9を表す。指数ｄはゼロか１である。R8及びR9は水素原子、置換又は非置換アルキル又は置換又は非置換ヘテロアルキル、シアル酸又はポリシアル酸から独立に選ぶ。R3、R4、R5、R6及びR6'の少なくとも一つは修飾基を含む。この修飾基はポリマー型修飾成分、例えばＰＥＧを一結合か一連結基を通して連結する。典型的実施形態ではR6及びR6'はこれらが付着した炭素原子と一緒にしたシアル酸のピルビル酸の側鎖成分である。更なる典型的実施形態では該ピルビル酸側鎖は該ポリマー型修飾基で機能化する。他の典型的実施形態ではR6及びR6'はこれらが付着した炭素原子と一緒にシアル酸の側鎖成分であり、該ポリマー型修飾基はR5の成分である。
このテーマによる典型的修飾基の無傷グリコシル連結基カセットは、以下の式を有するもののようにシアル酸構造に基づく。

上式でR1とＬは上記の通りである。典型的R1基の構造の更なる詳細は以下に提供する。
なお更なる典型的実施形態では該複合物はペプチドと該修飾基が修飾糖の６位炭素でリンカーにより付着した修飾糖の間で形成する。その結果本実施形態による具体的グリコシル連結基は以下の式を有し、


ここで置換基は上記の通りである。グリコシル連結基としては制限無しでブドウ糖、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及び類似体が挙げられる。
一実施形態では本発明は以下のグリコシル連結基からなるペプチド複合物を提供する。



ここでＤは水酸基及びR1−L−NH−から選んだ構成員である。Ｇは水素原子、R1−L−及び−C(O)(C1−C6)アルキルから選んだ構成員である。R1は直鎖又は分岐鎖ポリエチレングリコール残基からなる成分である。Ｌはリンカー、例えば結合（“ゼロ次”）、置換又は非置換アルキル又は置換及び非置換ヘテロアルキルである。典型的実施形態ではＤが水酸基の場合、ＧはR1−L−であり、Ｇが−C(O)(C1−C6)アルキルの場合、ＤはR1−L−NH−である。
該発明は以下の式を有するグリコシル連結基を含むペプチド複合物を提供する。

他実施形態ではグリコシル連結基は下式を有する。


ここで指数ｔはゼロか１である。
更なる他実施形態ではグリコシル連結基は下式を有する。


ここで指数ｔはゼロか１である。
また他の実施形態ではグリコシル連結基は下式を有する。


ここで指数ｐは１から１０の整数を表し、aはゼロか１である。
典型的実施形態では該発明の糖質ペグ化ペプチドは以下に示す式から選ばれる。

上式で指数ｔはゼロから１の整数であり、指数ｐは１から１０の整数である。記号R15''は水素原子、水酸基（例えばGal−OH）、シアリル成分、シアリル連結基（即ちシアリル連結基―ポリマー型修飾基（Sia−L−R1）又はポリマー修飾シアリル成分（例えばSia−Sia−L−R1）に結合したシアリル成分（“Sia−Siap”））を表す。典型的ポリマー修飾糖成分は式Ｉと式ＩＩに従う構造を有する。該発明の典型的ペプチド複合物としては式Ｉと式ＩＩに従う構造を含むR15''を有する少なくとも一つのグルカンが挙げられる。式１と式ＩＩの空き原子価を有する酸素原子は好ましくはグリコシド結合を通してＧａｌ又はＧａｌＮＡｃ成分の炭素原子に付着する。更なる典型的実施形態では酸素原子はガラクトース残基の3位の炭素原子に付着する。典型的実施形態では修飾シアル酸はα２，３位でガラクトース残基と結合する。他の典型的実施形態ではシアル酸はα２，６位でガラクトース残基と結合する。
典型的実施形態では該シアリル連結基はポリマー修飾シアリル成分（例えばSia−Sia−L−R1）に結合したシアリル成分（“Sia−Siap”）である。ここでグリコシル連結基はシアリル成分を通してガラクトシル成分と連結する。


このテーマによる典型種はＳｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、例えばＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ及びＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いてＳｉａ−Ｌ−Ｒ１をグリカンの末端シアル酸に複合化して産生する。
他典型的実施形態では該ペプチド複合物のグリカンは以下のグループ又はそれらの組み合わせから選んだ式を有する。

上式のR15'それぞれでは上記の通りである。更に該発明の典型的ペプチド複合物は式ＩかＩＩによる構造を持つR15を有する少なくとも一つのグルカンを含む。
他の典型的実施形態ではグリコシル連結基は以下の式を有するグリコシル連結基を少なくとも一つ含む。


ここでR15は該シリアル連結基であり、指数ｐは１から１０で選ぶ整数である。
典型的実施形態ではグリコシル連結成分は以下の式を有する。


ここでｂは０乃至１の整数である。指数ｓは１から１０の整数を表す。指数ｆは１から２５００の整数を表す。
典型的実施形態ではポリマー型修飾基はＰＥＧである。他典型的実施形態では該ＰＥＧ成分は分子量約２０キロダルトンを有する。他典型的実施形態では該ＰＥＧ成分は分子量約５キロダルトンを有する。他典型的実施形態では該ＰＥＧ成分は分子量約１０キロダルトンを有する。他典型的実施形態では該ＰＥＧ成分は分子量約４０キロダルトンを有する。
他の典型的実施形態では該グリコシル連結基は線形１０キロダルトンＰＥＧ―シアリルであり、且つ一つ又は二つのこれらグリコシル連結基はペプチドと共有結合により付着する。典型的実施形態では該グリコシル連結基は線形２０キロダルトンＰＥＧ―シアリルであり、且つ一つ又は二つのこれらグリコシル連結基はペプチドと共有結合により付着する。他の典型的実施形態では該グリコシル連結基は線形５キロダルトンＰＥＧ―シアリルであり、且つ一つ、二つ又は三つののこれらグリコシル連結基はペプチドと共有結合により付着する。他の典型的実施形態では該グリコシル連結基は線形４０キロダルトンＰＥＧ―シアリルであり、且つ一つ又は二つのこれらグリコシル連結基はペプチドと共有結合により付着する。
修飾基
該発明のペプチド複合物は修飾基を含む。この基はアミノ酸又はグリコシル連結基を通してＦＧＦペプチドと共有結合により付着する。“修飾基”は標的成分、治療成分、生体分子を含む種々の構造を含むことができる。更に“修飾基”は生体利用度や身体での半減期のようなペプチド物性を変えられるポリマーのポリマー型修飾成分を含む。
典型的実施形態では該修飾基は複合物成分として標的薬剤が存在することで特定組織に選択的に局在化した標的薬剤である。典型的実施形態では該標的薬剤はタンパク質である。典型的タンパク質としてはトランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、特異的抗原を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ−ＸＩＩ（損傷組織、血餅、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えばα―酸性糖タンパク質、フェチュイン、α―胎児性タンパク質（脳、血液プール）、β２―糖タンパク質（肝臓、アステローム斑、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球細胞過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期増加）及びリポ蛋白Ｅが挙げられる。
便宜的な目的で本節残部での該修飾基は大部分が水溶性ポリマーと非水溶性ポリマーのようなポリマー型修飾基に基づく。しかし技術の熟知者には標的成分、治療成分及び生体分子のような他の修飾基がポリマー型修飾基の代わりに使用できることが分かる。
修飾基のリンカー
修飾基のリンカーは修飾基（即ちポリマー型修飾基、標的成分、治療成分及び生体分子）をペプチドに付着する役割をする。典型的実施形態ではポリマー型修飾基は通常コア上のヘテロ原子、例えば窒素原子を通して例えば以下に示すようにリンカーＬによりグリコシル連結基と結合する。


R1はポリマー成分でありＬは結合と連結基から選ぶ。指数ｗは１乃至６、好ましくは１乃至３、より好ましくは１乃至２から選ぶ整数である。典型的連結基としては置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル成分及びシアル酸が挙げられる。リンカーの典型的成分はアシル成分である。
該発明による典型的化合物は上式Ｉ又はＩＩによる構造を有し、ここでR2、R3、R4、R5、R6又はR6'の少なくとも一つは下式を有する。

この実施形態による他例ではR2、R3、R4、R5、R6又はR6'の少なくとも一つは下式を有する。


ここでｓは０乃至２０の整数であり、R1は線形ポリマー型修飾成分である。
典型的実施形態ではポリマー型修飾基―リンカー作成物は中心成分に付着した二つ以上のポリマー鎖を含む分岐構造である。この実施形態では作成物は下式を有する。

ここでR1とＬは上に検討したものであり、ｗ’は２乃至６、好ましくは２乃至４、より好ましくは２乃至３の整数である。
Ｌが結合の場合、結合はR1前駆体上の反応性官能基と糖コアの補足的反応性を持つ反応性官能基の間で形成する。Ｌがゼロ次リンカーの場合、Ｌの前駆体はR1前駆体と反応する前にグリコシル成分に配置できる。代わりにR1とＬの前駆体を前もって形成したカセットに取り入れ、次いでグリコシル成分に付着できる。ここに示すように適切反応性官能基を有する前駆体の選択と産生は技術の熟知者能力範囲内である。更に該前駆体の結合は技術的によく理解された化学により進行する。
典型的実施形態ではＬはアミノ酸又はポリマー型修飾基が置換アルキルリンカーを通して付着した修飾糖を提供する小ペプチド（例えば１乃至４アミノ酸残基）で形成した連結基である。典型的リンカーとしてはグリシン、リシン、セリン及びシステインが挙げられる。ＰＥＧ成分はアミド又はウレタン結合により該リンカーのアミン成分に付着する。該ＰＥＧはそれぞれチオエーテル又はエーテル結合によりシステインとセリンの硫黄原子又は酸素原子と連結する。
典型的実施形態ではR5としてはポリマー型修飾基が挙げられる。他の典型的実施形態ではとしてR5はポリマー型修飾基と該修飾基を分子の残部と結合するリンカーＬの両者が挙げられる。上に検討したようにＬは線型構造か分岐構造であっても良い。同様にポリマー型修飾基は分岐か線型でも良い。
水溶性ポリマー
技術の熟知者には多くの水溶性ポリマーが知られており、本発明実施に利用できる。水溶性ポリマーという用語は、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、ヘパラン、ヘパリン等）、ポリアミノ酸、例えばポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸、核酸、合成ポリマー（例えばポリアクリル酸、ポリエーテル、例えばポリエチレングリコール）、ペプチド、タンパク質及び類似体のような種を含む。本発明はポリマーとして複合物残部に付着する点を含むことが必要な唯一の制限を持つ任意の水溶性ポリマーで実施できる。
ポリマー活性化法は又ＷＯ９９４／１７０３９、米国特許５，３２４，８４４、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許５，２１９，５６４、米国特許５，１２２，６１４、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許５，２８１，６９８及び更なるＷＯ９３／１５８１９に見出され、活性化ポリマーとペプチド間の複合化に関しては、例えば凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許４，４１２，９８９）、ＲＮＡ分解酵素及びスーパーオキシドディスムターゼ（ベロネッセ等（Veronese, et al.）、アプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（App. Biochem. Biotech.）、１１巻、１４１−１４５頁（１９８５年）がある。
典型的水溶性ポリマーはポリマー試料中ポリマー分子の大部分がほぼ同じ分子量であるものであり、このポリマーは“均一分散性”である。
更に本発明ではポリエチレングリコール複合物を参照して説明する。ＰＥＧの機能化と複合化に関する幾つかの総説とモノグラフが利用できる。例えば、ハリス（Harris）、マクロモレキュラーケミストリーアンドフィジック（Macromol Chem. Phys.）、Ｃ２５、３２５−３７３頁（１９８５年）；スコウーテン（Scouten）、メソッドインエンザイモロジー（Methods in Enzymology）、１３５巻、３０−６７頁（１９９５年）；ウオン等（Wong, et al.）、エンザイムミクロビアルテクノロジー（Enzyme Microb. Technol.）、１４巻、８６６−８７４頁（１９９２年）；デルガード等（Delgado, et al.）、クリティカルレビューインセラピューティックドラッグキャリヤーシステム（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems）、９巻、２４９−３０４頁（１９９２年）；ザリプスキー（Zalipsky）、バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconjugate Chem.）、６巻、１５０−１６５頁（１９９５年）及びバードラ等（Bhadra, et al.）、ファルマジー（Parmazie）、５７巻、５−２９頁（２００２年）参照。反応性ＰＥＧ分子を産生し該反応性分子を用いて複合物を形成する経路は技術的に既知である。例えば、米国特許５，６７２，６６２には線型又は分岐ポリアルキレンオキシド、ポリオキエチル化ポリオール、ポリオレフィンアルコール及びポリアクリロモルホリンから選んだ水溶性で単離可能なポリマー酸活性エステル複合物が開示されている。
米国特許６．３７６，６０４には有機溶剤中でポリマー末端水酸基をジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートと反応して、水溶性の非ペプチド性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾイル）炭酸エステル産生法が示されている。該活性エステルを用いてタンパク質やペプチドのような生物活性薬剤と複合物を形成する。
ＷＯ９９／４５９６４には生物活性薬剤と、ポリマーバックボーンと安定な結合で連結した少なくとも一つの末端を有するポリマーバックボーンを含む活性化水溶性ポリマーを含む複合物が記載され、少なくとも一末端でこの生物活性薬剤が少なくとも一つの近接反応性基と結合した分岐成分に連結した近接反応性基を有する分岐成分を含む。ＷＯ９６／２１４６９には他の分岐ポリエチレングリコールが記載され、米国特許５，９３２，４６２には反応性官能基含有分岐末端を含む分岐ＰＥＧ分子と形成した複合物が記載されている。遊離反応性基を用いてタンパク質やペプチドのような生物活性種と反応し、ポリエチレングリコールと生物活性種間複合物を形成する。米国特許５，４４６，０９０には二官能性ＰＥＧリンカーと、該ＰＥＧ各末端にペプチドを有する複合物形成での使用が記載されている。
分解可能なＰＥＧ結合含有の複合物がＷＯ９９／３４８３３，ＷＯ９９／１４２５９更には米国特許６，３４８，５５８に記載されている。この分解可能結合は本発明に利用できる。
上記の技術的に容認のポリマー活性化法は本発明本文でここに示した分岐ポリマー形成とこの分岐ポリマーの他種、例えば糖類、糖ヌクレオチド及び類似体との複合化で使用される。
典型的水溶性ポリマーはポリエチレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコールである。本発明に用いるポリエチレングリコールはいずれの特定形や分子量範囲に制限されない。非分岐ポリエチレングリコールではその分子量は好ましくは５００乃至１００，０００間である。分子量２０００乃至６０，０００が好ましく使用され、好ましくは約５，０００乃至約４０，０００である。
典型的実施形態では該発明のポリエチレングリコール分子は限定はされないが、以下に示す種が挙げられる。


ここでR2は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、OHC―、 H2N−CH2CH2−、 HS−CH2CH2− 、−(CH2)qC(Y1)Z2、―糖―ヌクレオチド又はタンパク質である。指数“ｎ”は１乃至２５００の整数を表す。指数ｍ、o及びｑは０乃至２０の整数を独立に表す。記号Ｚは水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、S−R3、活性エステルのアルコール部分、−(CH2)pC(Y2)V、−(CH2)pU(CH2)sC(Y2)v、糖―ヌクレオチド、タンパク質及び離脱基、例えばイミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハロゲン化物を表す。記号Ｘ，Ｙ１、Ｙ２、Ｗ，Ｕは独立に酸素原子、硫黄原子、Ｎ−Ｒ４を表す。記号Ｖは水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、S−R5、活性エステルのアルコール部分、活性化アミドのアミン部分、糖―ヌクレオチド及びタンパク質を表す。指数ｐ、ｓ及びｖは整数０乃至２０から独立に選んだ構成員である。記号R3 、R4及びR5は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換複素アリールを独立に表す。
他の典型的実施形態ではポリエチレングリコール分子は以下から選ぶ。

他実施形態では該ポリエチレングリコールは一つより多い付着ＰＥＧ成分を有する分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例は、米国特許５，９３２，４６２、米国特許５，３４２，９４０、米国特許５，６４３，５７５、米国特許５，９１９，４５５、米国特許６，１１３，９０６、米国特許５，１８３，６６０、ＷＯ０２／０９７６６、小寺、ワイ（Kodera Y.）、バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconjugate Chemistry）、５巻、２８３−２８８頁（１９９４年）及び山崎等（Yamasaki, et al.）、アグリカルチャルアンドバイオロジカルケミストリー（Agric. Biol. Chem.）、５２巻、２１２５−２１２７頁（１９９８年）に記載されている。好ましい実施形態では分岐ＰＥＧの各ポリエチレングリコールの分子量は４０，００ダルトン以下である。
代表的ポリマー型修飾成分としては側鎖含有アミノ酸、例えばセリン、システイン、リシン及び小ペプチド、例えばｌｙｓ−ｌｙｓに基づく構造が挙げられる。典型的構造としては以下が挙げられる。




技術者にはジリシン構造での遊離アミンが又アミド又はウレタン結合によりＰＥＧ成分とペグ化できることが分かる。
更に他実施形態ではこのポリマー型修飾成分はトリリシンペプチドに基づく分岐ＰＥＧ成分である。該トリリシンはモノペグ化、ジペグ化、トリペグ化又はテトラペグ化できる。本実施形態による典型種は以下の式を有する。


ここで指数e、ｆ及びｆ‘は１乃至２５００の整数から独立に選ばれ、指数ｑ、ｑ’及びｑ”は１乃至２０の整数から独立に選ばれる。
技術者には明らかなように該発明で用いる分岐ポリマーとしては、上記テーマの変形が挙げられる。例えば、上に示したジリシン−ＰＥＧ複合物では三つのポリマーサブユニットを含み、第三サブユニットは上の構造で非修飾として示したαアミンと結合する。同様に所望ポリマー型修飾成分で標識化した三つ又は四つのポリマーサブユニットで機能化したトリリシンの使用は該発明の範囲内である。
ここで検討するように該発明の複合物に用いるＰＥＧは線型でも分岐形でも良い。該発明の本実施形態による分岐ＰＥＧ含有ペプチド複合物形成に用いる典型的前駆体は以下の式を有する。

該発明の本実施形態による分岐ＰＥＧ含有ペプチド複合物形成に用いる他の典型的前駆体は以下の式を有する。


ここで指数ｍとｎは０乃至５０００から独立に選んだ整数である。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10及びA11は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、−NA12A13, −OA12 及び−SiA12A13から独立に選んだ構成員である。A12及びA13は置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選んだ構成員である。
本式による分岐ポリマー種は本質的に正真正銘の水溶性ポリマーである。X3'はイオン化可能基（例えば水酸基、カルボン酸基、リン酸二水素基、亜硫酸水素基、アミノ基及びそれらの塩等）又は他の反応性官能基、例えば以下の基を含む成分である。Cは炭素原子である。X5 、R16及びR17は非反応性基（例えば、水素原子、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）及びポリマー型アーム（例えば、PEG）から独立に選ぶ。X2及びX4は好ましくは生理的条件下で実質的に非反応性で、同一でも異なっても良い結合断片である。典型的リンカーでは芳香族成分もエステル成分も含まない。代わりにこれらの結合は生理関連条件下で分解するようにデザインした一つ以上の成分、例えばエステル、ジスルフィドなどを含んでも良い。X2及びX4はポリマーアームR16及びR17を炭素原子に結合する。X3'がリンカー−糖又はリンカー−糖カセットのような補足反応性を持つ反応性官能基と反応する場合、X3'は結合断片成分X3に変換する。
X2 、X3及びX4に関する典型的結合断片としては、硫黄原子、SC(O)NH、 HNC(O)S、 SC(O)O、 酸素原子、NH、NHC(O)、(O)CNH、NHC(O)O、OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS又は(CH2)oY'−PEGが独立に選ばれ、ここでY'は硫黄原子、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH又は酸素原子であり、oは１乃至５０の整数である。典型的実施形態では結合断片X2及びX4は異なる結合断片である。
典型的実施形態では前駆体（式ＩＩＩ）又はその活性化誘導体はX3'と糖成分の補足的反応基、例えばアミン間の反応により糖、活性化糖又は糖ヌクレオドと反応し、その結果これらとと結合する。代わりにX3'はリンカーＬに対する前駆体上の反応性官能基と反応する。式Ｉ及び式ＩＩの一つ以上のR2 、R3 、R4 、R5 、R6又はR6'としては分岐ポリマー型修飾成分又はＬにより結合した本成分が挙げられる。
典型的実施形態では該成分は下記リンカーアームＬである。


この実施形態では典型的リンカーは天然アミノ酸又は非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸擬態者又はこれら一種以上で形成の小ペプチドから誘導される。例えば、該発明化合物で見出されるある分岐ポリマーは下式を有する。

Xaは分岐ポリマー型修飾成分前駆体上の反応性官能基、例えばX3'と糖成分上の反応性官能基、又はリンカーに対する前駆体と反応して形成される結合断片である。例えばX3'がカルボン酸の場合、活性化されアミノ糖（例えば、Sia、GalNH2、 GlcNH2、 ManNH2等）のアミン基ペンダントと直接結合してアミド基としてXaを形成する。更なる典型的反応性官能基と活性化前駆体は以下に記載する。指数ｃは１乃至１０の整数を表す。他記号は上で検討したものと同一単位を有する。
他の典型的実施形態ではXaは以下の他リンカーと形成した連結成分である。


ここでXbは第二の結合断片でありXaに示した基から独立に選び且つＬと同じであり,
L1は結合、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキルである。
Xa及びXbの典型種は硫黄原子、SC(O)NH、 HNC(O)S、 SC(O)O、 酸素原子、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O及びOC(O)NHである。
他の典型的実施形態ではX4は一つ又は複数のαアミン成分及び／又は一つ又は複数の側鎖ヘテロ原子をポリマー型修飾成分で修飾したアミノ酸、ジペプチド（例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ）又はトリペプチド（例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）であるR17とのペプチド結合である。
更なる典型的実施形態では該発明のペプチド複合物としては、例えば以下から選んだ式を有する成分R15である成分が挙げられる。



ここで種々の記号で表される官能基のアイデンティティは上で検討したものと同じである。Ｌaは上でＬとL1に関して検討した結合又はリンカー、例えば置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル成分である。典型的実施形態ではLaは示したようなポリマー型修飾成分で機能化したシアル酸側鎖成分である。典型的La成分としては一つ以上の水酸基又はアミノ基含有の置換又は非置換アルキル鎖が挙げられる。
更なる他の典型的実施形態では該発明は成分、例えば以下の式を持つR15成分を有するペプチド複合物を提供する。


種々の記号で表される官能基のアイデンティティは上で検討したものと同じである。熟知者には分かるように式ＶＩＩと式ＶＩＩＩのリンカーアームはここに示した他修飾糖に同様に適応できる。典型的実施形態では式ＶＩＩと式ＶＩＩＩ種はここに示したグルカン構造に付着したR15成分である。
更なる他の典型的実施形態では因子ＶＩＩペプチド複合物又は因子ＶＩＩａペプチド複合物としては以下から選んだ構成員の式を有するR15成分が挙げられる。



ここで官能基のアイデンティティは上に検討したものである。Laの典型種は−(CH2)jC(O)NH(CH2)hC(O)NH−であり、指数ｈとｊは０乃至１０から独立に選んだ整数である。更なる典型種は−C(O)NH−である。指数ｍとｎは０乃至５０００から独立に選んだ整数である。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10及びA11は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、−NA12A13, −OA12 及びSiA12A13から独立に選んだ構成員である。A12及びA13は置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選んだ構成員である。
典型的実施形態ではグリコシル連結基は下式に従う構造を有する。

更に上に示した該発明実施形態でポリマーが水溶性ポリマー、特にポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）、例えばメトキシポリエチレングリコールを参照して説明する。熟知者は以下の節での中心が説明を明快にするためであり、典型的ポリマーとしてＰＥＧを用いて示した種々テーマがＰＥＧ以外のポリマーを利用した種にも同様に適応できることが分かる。
本発明では任意の分子量、例えば１キロダルトン、２キロダルトン、５キロダルトン、
１０キロダルトン、１５キロダルトン、２０キロダルトン、２５キロダルトン、３０キロダルトン、３５キロダルトン、４０キロダルトン及び４５キロダルトンのＰＥＧが使用される。
典型的実施形態ではR15成分は以下の基から選んだ構成員式を有する。


上記の各構造でリンカー断片−NH(CH2)n−はあってもなくても良い。
他の典型的実施形態ではペプチド複合物として以下の基から選んだR15成分が挙げられる。

上の各式で指数eとｆは１乃至２５００から独立に選んだ整数である。更なる典型的実施形態ではeとｆは約１キロダルトン、２キロダルトン、５キロダルトン、１０キロダルトン、１５キロダルトン、２０キロダルトン、２５キロダルトン、３０キロダルトン、３５キロダルトン、４０キロダルトン及び４５キロダルトンのＰＥＧ成分を与えるように選ぶ。記号Ｑは、置換又は非置換アルキル（例えば、C1−C6アルキル、例えばメチル）、置換又は非置換ヘテロアルキ又は水素原子を表す。
他の分岐ポリマーはジリシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば


とトリリシンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ―Ｌｙｓ）、例えば


を基にした構造を有する。
上の各図で指数e、ｆ、ｆ‘及びｆ“は１乃至２５００から独立に選んだ整数である。指数ｑ、ｑ’及びｑ”は１乃至２０から独立に選んだ整数である。
他の典型的実施形態では修飾基は

以下から選んだ構成員式を有する。


ここでＱは水素原子及び置換又は非置換C1−C6アルキルから選んだ構成員である。指数e及びｆは１乃至２５００から独立に選んだ整数であり、指数ｑは０乃至２０から選んだ整数である。
他の典型的実施形態では修飾基は


以下から選んだ構成員式を有する。


ここでＱは水素原子及び置換又は非置換C1−C6アルキルである。指数e、ｆ及びｆ‘は１乃至２５００から独立に選んだ整数であり、指数ｑとｑ’は１乃至２０から独立に選んだ整数である。
他の典型的実施形態では分岐ポリマーは下式に従う構造を有する。


ここで指数ｍ及びｎは０乃至５０００から独立に選んだ整数である。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10及びA11は水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、−NA12A13, −OA12 及びSiA12A13から独立に選んだ構成員である。A12及びA13は置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選んだ構成員である。
式ＩＩＩaは式ＩＩＩのサブセットである。式ＩＩＩaで記載される構造は又式ＩＩＩで包含される。
上式による他の典型的実施形態では分岐ポリマーは下式による構造を有する。


典型的実施形態ではA1とA2はそれぞれメトキシ基または水素原子である。
具体例では修飾糖はシアル酸であり該発明に用いる選択修飾糖化合物は下式を有する。

指数a、ｂ及びｄは０乃至２０の整数である。指数ｃは１乃至２５００の整数である。上に示した構造はR15の成分でも良い。
他の具体例では糖の一級水酸基は修飾基で機能化される。例えばシアル酸の９位水酸基は相応アミンに変換し機能化して該発明による化合物を与える。本実施形態による式としては以下が挙げられる。


上に示した構造はR15の成分でも良い。
本発明はＰＥＧを参照して前節で説明したが、技術者には分かるように多くのポリマー型修飾成分がここに示した化合物と方法で使用できる。
選択した実施形態ではR1又はL−R1分岐ＰＥＧ、例えば上に示した種の一つである。典型的実施形態では分岐ＰＥＧ構造はシステインペプチドに基づく。本実施形態による具体的修飾糖としては以下が挙げられる。


ここでX4は結合又は酸素原子である。上記の各構造でアルキルアミンリンカー−(CH2)aNH−はあってもなくても良い。上に示した構造はR15／R15'の成分でも良い。
ここで検討したように該発明に用いるポリマー修飾シアル酸は又線形構造でも良い。従って該発明は以下のような構造に基づくシアル酸成分含有の複合物を提供する。


ここで指数ｑとeは上に検討したものである。
典型的修飾糖類は水溶性ポリマーか非水溶性ポリマーで修飾する。更に有用ポリマー例を以下に示す。
他の典型的実施形態では昆虫細胞から、ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌをマンノースコアに付加して再構築し、線型ＰＥＧ成分を有するシアル酸を用いて糖質ペグ化してペプチドを誘導し、下式を有する少なくとも一成分を含む第ＶＩＩ因子ペプチド又は活性型第因子ＶＩＩペプチドを与えた。


ここで指数ｔは０乃至１の整数である。指数ｓは１乃至１０の整数を表し、指数ｆは１乃至２５００の整数を表す。
非水溶性ポリマー
他実施形態では上に検討のものと類似して、修飾糖として水溶性ポリマーよりむしろ非水溶性ポリマーが挙げられる。該発明の複合物は又一つ以上の非水溶性ポリマーを含んでも良い。該発明の本実施形態は治療用ペプチドを制御下に送達する媒体としての複合物使用で示される。ポリマー型ドラッグデリバリーシステムは技術的に既知である。例えばダン等編（Dunn, et al., Eds.）、ポリマー型薬剤とドラッグデリバリーシステム（Polymeric Drugs and Drug Delivery）、エイシーエスシンポジウムシリーズ（ACS Symposium Series）、 ４６９巻、アメリカ化学会（American Chemical Society）、ワシントン（Washington）、ディスクリクトオブコロンビア（D.C.）、１９９１年を参照。技術の熟知者には実質的にはいずれの既知ドラッグデリバリーシステムが本発明の複合物に適用できることが分かる。
R1、L−R1、R15、R15'及び他官能基で上に示したテーマが、技術の熟知者が容易にアクセスできる化学を用いて無制限に線型構造か分岐構造に組み入れられる非水溶性ポリマーに同様に適用できる。同様にこれらの種をここで検討の修飾糖類のいずれかに組み込むのは本発明の範囲内である。従って該発明は非水溶性線型又は分岐ポリマーで修飾複合物のシアル酸及び他糖成分及び修飾シアル酸種の活性化類似物（例えばＣＭＰ−Ｓｉａ−（非水溶性ポリマー）含有複合物）と、この複合物産生に用いる複合物を提供する。
代表的非水溶性ポリマーとしては限定はされないが、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリメチルメタアクリレート、ポリエチルメタアクリレート、ポリブチルメタアクリレート、ポリイソブチルメタアクリレート、ポリヘキシルメタアクリレート、ポリイソデシルメタアクリレート、ポリラウリルメタアクリレート、ポリフェニルメタアクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリイソプロピルアクリレート、ポリイソブチルアクリレート、ポリオクタデシルアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロライド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プロニック及びポリビニルフェノール及びそれらのコポリマーが挙げられる。
該発明複合物で用いる合成的修飾天然ポリマーとしては限定はされないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル及びニトロセルロースが挙げられる。幅広い種類の合成的修飾天然ポリマーの特に好ましい構成員としては限定されないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタール酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩及びアクリル酸エステル、メタアクリ酸エステル及びアルギン酸のポリマーが挙げられる。
ここに検討したこれらポリマーや他ポリマーはシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（MO））、ポリサイエンス（Polysciences）（ウオレントン（Warrenton）、ペンシルバニア（PA））、アルドリッチ（Aldrich）（ミルウォキー（Milwaukee）、ウイスコンシン（WI））、フルカ（Fluka）（ロンコンコーマ（Ronkonkoma）、ニューヨーク（NY））及びバイオラド（BioRad）（リッチモンド（Richmond）、カルフォルニア（CA））から容易に入手でき、又これは供給業者から得られるモノマーから標準法を用いて別に合成もできる。
該発明複合物で用いる代表的生分解性ポリマーとしては限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコライド及びその共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ラクチド／カプロラクトン共重合体、ラクチド／グリコライド共重合体、ポリ酸無水物、ポリオルソエステル、そのブレンド及び共重合体が挙げられる。コラーゲン、プロニック及び類似体のようなゲル形成組成は特に有用である。
該発明で用いるポリマーは少なくともその構造の一部内に非水溶性材料である生体再吸収性分子含有の“ハイブリッド”ポリマーを含む。このポリマー例は生体再吸収性領域、親水性領域、及びポリマー鎖当たり複数の架橋性官能基を有する非水溶性共重合体を含むポリマーである。
本発明の目的のための“非水溶性材料”は水又は水含有環境で実質的に不溶な材料を含む。従って共重合体のある領域や断片は親水性か又は水溶性であっても、ポリマー分子全体では水に実質量溶解しない。
本発明の目的のための“生体再吸収性分子”という用語は身体の正常排泄経路を通して代謝又は崩壊し且つ再吸収及び／又は除去できる領域を含む。この代謝物又は崩壊生成物は好ましくは実質的に身体に無毒である。
生体再吸収性領域は共重合体組成が全体で水溶性にならない限り疎水性でも親水性でも良い。従って該生体再吸収性領域はこのポリマーが全体として非水溶性のままであることを優先して選択する。その結果相対的物性、即ち生体再吸収性領域に含有の官能基の種類とその相対的割合及び親水性領域は、有効生体再吸収性組成が確実に非水溶性のままであるように選択する。
典型的再吸収性ポリマーとしては、例えば合成産生の再吸収性ポリ（α―ヒドロキシカルボン酸）／ポリオキシアルキレンブロックコポリマーが挙げられる（コーン等（Cohn, et al.）、米国特許４，８２６，９４５参照）。これらの共重合体は架橋して無く水溶性であるので、身体は分解したブロックコポリマー成分を排泄できる。ヨウネス等（Younes, et al.）、ジャーナルオブバイオメディカルマテリアルリサーチ（J. Biomed. Materia. Res.）、２１巻、１３０１−１３１６頁（１９８７年）及びコーン等（Cohn, et al.）、ジャーナルオブバイオメディカルマテリアルリサーチ（J. Biomed. Materia. Res.）、２２巻、９９３−１００９頁（１９８８年）参照。
現在の好ましい生体再吸収性ポリマーとしては、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリラクトン、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリアミノ酸、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリホスファゼン、ポリリン酸エステル、ポリチオエステル、多糖類及びそれらの混合物から選んだ一つ以上の成分が挙げられる。より好ましくは該生体再吸収性ポリマーとしてはポリヒドロキシ酸が挙げられる。ポリヒドロキシ酸の中ではポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸及びその共重合体と混合物が好ましい。
体内吸収（“生体再吸収される”）断片を形成する以外に、該発明法で用いる好ましいポリマー型コーティング剤は又は排泄可能及び／又は代謝可能断片を形成できる。
より高次のポリマーも又本発明で使用できる。例えば、ケーシー等（Casey, et al.）は１９８４年、３月２０日に公開された米国特許４，４３８，２５３に、ポリグリコール酸と水酸基末端のポリアルキレングリコールとのエステル交換で産生したトリブロック共重合体を開示している。この組成では再吸収性モノフィラメント縫合糸としての使用が開示されている。この組成の柔軟性がテトラーｐ−トリルオルト炭酸エステルのような芳香族オルト炭酸エステルを共重合体構造に組み込んで調節する。
乳酸及び／又はグリコール酸に基づく他ポリマーも又利用できる。例えばスピヌ（Spinu）は１９９３年、４月１３日に公開された米国特許５，２０２，４１３に、オリゴマー型ジオール又はジアミン残基へのラクチド及び／又グリコライド開環重合に続くジイソシアネート、ジ塩化アシル又はジクロロシランのような二官能性化合物による鎖延長により産生した逐次配列ブロックのポリラクチド及び／又はポリグリコライドを有する生分解性マルチブロックコポリマーを開示している。
本発明に有用なコーティング剤の生体再吸収性領域は加水分解切断及び／又は酵素切断可能なようにデザインできる。本発明の目的の“加水分解切断可能な”とは、共重合体、特に生体再吸収性領域の水又は水含有環境での加水分解敏感性を意味する。同様にここで用いた“酵素切断可能な”とは共重合体、特に生体再吸収性領域の内因性酵素又は外因性酵素による切断敏感性を意味する。
体内に配置すると、該親水性領域は排泄可能断片及び／又は代謝可能断片に進む。その結果該親水性領域としては、例えばポリエーテル、ポリアルキレンオキサイド、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアルキルオキサゾリン、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質及びその共重合体と混合物が挙げられる。更に親水性領域としては又、例えばポリアルキレンオキサイドが挙げられる、このポリアルキレンオキサイドとしては、例えばポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド及びその混合物と共重合体が挙げられる。
ヒドロゲル成分であるポリマーも又本発明に有用である。ヒドロゲルは比較的大量の水を吸収できるポリマー材である。化合物形成ヒドロゲルの例としては限定はされないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カラギーナン及び他の多糖類、ヒドロキエチレンメタアクリル酸（ＨＥＭＡ）、更にはその誘導体及び類似体が挙げられる。安定で生分解性で且つ生体再吸収性のヒドロゲルが産生できる。更にヒドロゲル組成は一つ以上のこれら物性を示すサブユニットが含まれる。
完全性が架橋により調節できる生体整合性ヒドロゲル組成は既知であり、現在該発明法で好んで使用される。例えば、ハッベル等（Hubbel, et al.）は１９９５年、４月２５日に公開の米国特許５，４１０，０１６及び１９９６年、６月２５日に公開の米国特許５，５２９，９１４に、二つの易加水分解性延長部に挟まれた水溶性中央ブロックセグメントを有する架橋ブロックコポリマーの水溶性システムを開示している。この共重合体は更に光重合可能なアクリルエステル官能性部で末端封止されている。架橋によりこのシステムはヒドロゲルになる。この共重合体の水溶性中央ブロックはポリエチレングリコールを含有できる。一方易加水分解性延長部はポリグコール酸やポリ乳酸のようなポリα―ヒドロキシ酸でも良い。ソーニー等（Sawhney, et al.）、マクロモリキュール（Macromolecules）、２６巻、５８１―５８７頁（１９９３年）参照。
他の好ましい実施形態ではこのゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲル及びそれらの組み合わせのような成分を含む熱可逆性ヒドロゲルが現在好ましい。
更に典型的実施形態では該発明の複合物はリポソーム成分を含む。リポソームは例えばエプスタイン等（Epstein, et al.）の米国特許４，５２２，８１１に記載のように、技術の熟知者には既知の方法で産生できる。例えば、リポソーム処方は適切な一つ又は複数の脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン及びコレステロールのような）を無機溶剤に溶解し、次いで濃縮し容器表面に乾燥脂質薄膜を残すことで産生できる。次いで活性化合物又はそお製薬的容認の塩水溶液を容器に導入する。次いで容器を手でぐるぐる回し脂質材を容器面から遊離し、脂質凝集体を分散し、その結果リポソーム懸濁物を形成する。
上に列挙の微粒子とこの微粒子産生法は実施例により提供されるが、本発明で使用の微粒子の範囲を定義する意図はない。技術の熟知者には異なる方法で加工した多くの微粒子が本発明の使用できることが分かる。
上の本文で検討した水溶性ポリマーの構造形式は、直鎖と分岐共に非水溶性ポリマーにも同様に通常応用できる。従って例えば、システイン、セリン、ジリシン及びトリリシン分岐コアは二つの非水溶性ポリマー成分で官能化できる。この種産生に用いる方法は通常水溶性ポリマー産生に用いるものと非常に類似している。
生体分子
他の好ましい実施形態では該修飾糖は生体分子を有する。更なる好ましい実施形態では該生体分子は機能性タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば一ヌクレオチド又は一ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び一本鎖核酸及び多重鎖核酸）、レクチン、受容体又はそれらの組み合わせである。
好ましい生体分子は実施的に非蛍光性か、又はアッセイでの蛍光マーカー使用に不適切な最低量の蛍光を放射する。更に通常糖類でない生体分子の使用が好ましい。この選択の例外となるのは他存在物（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療成分、診断成分等）と共有結合付着により修飾した別天然発生糖の使用である。典型的実施形態では生体分子の糖成分分はリンカーアームと複合化し、次いで該糖―リンカーアームカセットは該発明法によりペプチドと複合化する。
本発明実施に有用な生体分子は任意の供給源から誘導する。該生体分子は天然源から単離できるし、又合成法で産生できる。ペプチドは天然ペプチドでも変異ペプチドでも良い。変異は化学的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又は技術の熟知者に既知の他変異誘発手段で生ずる。本発明実施に有用なペプチドは、例えば酵素、抗原、抗体及び受容体が挙げられる。抗体はポリクロナール又はモノクロナルのいずれでも良いし、無傷でも断片でも良い。該ペプチドは定方向進化プログラム産生物でも良い。
天然誘導及び合成ペプチドと核酸が本発明の複合化に使用される。これらの分子は任意の利用可能な反応性基により糖残基成分又は架橋剤に付着する。例えばペプチドは反応性アミン基、カルボキシル基、スルフヒドリル基又は水酸基により付着できる。反応性基はペプチド末端かペプチド鎖内部位に存在できる。核酸は塩基の反応性基（例えば環外アミン）又は糖成分の利用可能な水酸基（例えば３’位又は５’位水酸基）により付着できる。更にペプチド鎖と核酸鎖は適切反応性基を鎖に付着できるように一つ以上の部位で誘導化できる。クリシー等（Chrisey, et al.）、ヌクレイックアシッドリサーチ（）、２４巻、３０３１−３０３９頁（１９９６年）参照。
更に好ましい実施形態では生体分子を選択して該発明法で修飾したペプチドを特定組織に方向づけ、その結果該組織に送達される非誘導体化ペプチド量に比べ該組織への該ペプチドの送達を増強する。更なる好ましい実施形態では選択期間内での特定組織への誘導体化ペプチド送達量は、誘導体化により少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更により好ましくは少なくとも約１００％だけ増強される。現在適応標的に好ましい生体分子としては、抗体、ホルモン及び細胞表面受容体用リガンドが挙げられる。
更なる典型的実施形態ではビオチンとの複合物が提供される。従って例えば、選択的ビオチン化ペプチドが一つ以上の修飾基を有するアビジン又はストレプトアビジンに付着して産生される。
方法
上に検討の複合物以外に本発明はこれら複合物と他複合物の産生法を提供する。従って更なる様態では該発明は選択成分とペプチド間で共有結合の複合物形成法を提供する。更に該発明は該発明複合物を身体の特定組織又は領域を標的にする方法を提供する。更に本発明は、該発明複合物を疾患発生の危険性がある被験者又は疾患にかかった被験者に投与して、病状を防止、治癒又は回復する方法を提供する。
典型的実施形態では該複合物は水溶性ポリマー、治療成分、標的成分又は生体分子及びグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチド間で形成する。該ポリマー、治療成分又は生体分子は、ペプチドと修飾基（例えば、水溶性ポリマー）両者の間に位置し且つ共有結合した無傷グリコシル連結基によりペプチドと複合化する。
典型的実施形態では該複合物は時々化学的ペグ化と云われる化学的方法で形成する。化学的ペグ化ペプチド複合物合成の更なる検討は、２００２年１０月９日に出願のＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６と２００２年１１月５日に出願の米国特許出願１０／２８７，９９４に提供され、それぞれ全てが文献としてここに組み入れてある。
該方法は修飾糖と該修飾糖が基質であるグリコシル基転移酵素含有混合物とペプチドの接触を含む。この反応は修飾糖とペプチド間での共有結合形成に十分な条件下に行う。修飾糖の糖成分は好ましくは糖ヌクレオチド、活性化糖及びヌクレオチドでも活性化のいずれでもない糖から選ぶ。
受容体ペプチド（グリコシル化又は非グリコシル化された）は通常新規に合成されるか、又は原核細胞（例えば、大腸菌のような細菌性細胞）又は哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、酵母菌（例えば、サッカロミセス）、昆虫又は植物細胞のような真核細胞で組み換え発現される。該ペプチドは完全長タンパク質でも断片のいずれでも良い。更に該ペプチドは野生型ペプチドでも変異ペプチドでも良い。典型的実施形態では該ペプチドは一つ以上のコンセンサスグリコシル化部位を該ペプチド配列に付加する変異を含む。
該発明法は又組み換え産生の不完全グリコシル化ペプチドの修飾を提供する。多くの組み換え産生糖タンパク質は不完全にグリコシル化され、好ましくない物性、例えば免疫原性のＲＥＳ認識を持つ炭水化物残基を暴露する。該発明法による修飾糖を用いて、該ペプチドは更に例えば、水溶性ポリマー、治療薬剤又は類似体で同時にグリコシル化と誘導体化ができる。修飾糖の糖成分は完全グリコシル化ペプチドの受容体又は所望物性を持つ他糖成分と適切に複合化した残基でも良い。
該発明法での修飾糖は合成ペプチドでも野生型ペプチドでも良く、部位特異的突然変異誘発のような技術的既知法で産生の変異ペプチドでも良い。ペプチドのグリコシル化は通常Ｎ−連結かO−連結のいずれかである。典型的Ｎ−連結は修飾糖のアスパラギン酸残基側鎖との付着である。Ｘがプロリン以外の任意アミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン―Ｘ−セリン及びアスパラギン―Ｘ−スレオニンは、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素付着での認識配列である。従ってポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより潜在的グリコシル化部位が創生される。O−連結グリコシル化は一つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、ブドウ糖、フコース又はキシロース）と、５−ヒドロキシプロリンや５−ヒドロキシリシンも又使用できるが、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリン又はスレオニンのヒドロキシ側鎖との付着を意味する。
ペプチドや他構造へのグリコシル化部位付加は、該アミノ酸配列が一つ以上のグリコシル化部位を含有するように変ることで容易に達成される。又水酸基を与える一つ以上の種、好ましくはセリン残基かスレオニン残基を該ペプチド配列（O−連結グリコシル化部位のための）内に組み込むことでこの付加が起こる。該ペプチドの変異か化学的全合成によりこの付加が起こる。このペプチドアミノ酸配列は好ましくはＤＮＡレベルでの変化、特にコドンが産生し所望アミノ酸に翻訳されるよう前もって選んだ塩基のペプチドをコードするＤＮＡを変異して変える。一つ又は複数のＤＮＡ変異は好ましくは技術的既知法を用いて起こす。
典型的実施形態ではポリヌクレオチドをシャッフルしてこのグリコシル化部位を付加する。候補ペプチドコード化ポリヌクレオチドはＤＮＡシャッフリングプロトコルで調節できる。ＤＮＡシャッフリングは関連遺伝子プールを無作為に断片化し、次いでポリメラーゼ連鎖反応類似法でその断片を再構築する帰納的組み換え変異プロセスである。
例えば、ステマー（Stemmer）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、９１巻、１０７４７−１０７５１頁（１９９４年）；ステマー（Stemmer）、ネーチャー（Nature）、３７０巻、３８９−３９１頁（１９９４年）及び米国特許５，６０５，７９３、米国特許５，８３７，４５８、米国特許５，８３０，７２１及び米国特許５，８１１，２３８参照。
本発明は又一つ以上の選択グリコシル残基をペプチドに付加（又は除去）し、その後で修飾糖をそのペプチドの選択グリコシル残基の少なくとも一つと複合化する方法を提供する。本実施形態は例えば、修飾糖をペプチド上に存在しないか又は所望量存在しない選択グリコシル残基に複合化したい場合に有用である。従って修飾糖をペプチドと結合する前に、選択グリコシル残基を酵素結合又は化学結合により該ペプチドと複合化する。他の実施形態では糖ペプチドのグリコシル化パターンは、修飾糖複合化前に炭水化物残基を該糖ペプチドから除去して変える。例えばＷＯ９８／３１８２６参照。
該糖ペプチドに存在する任意炭水化物成分の付加又は除去は化学的又は酵素的のいずれかで達成される。化学的脱グリコシル化は好ましくは該ポリペプチド変形物をトリフルオロメタンスルホン酸化合物又は同等化合物に暴露して引き起こす。この処理により連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分又は全糖類の切断が起こるが、該ペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコシル化はハキマッディン等（Hakimuddin, et al.）、アーカイブバイオケミバイオフィジク（Arch. Biochem. Biophys.）、２５９巻、５２頁（１９８７年）及びエッジ等（Edge, et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１１８巻、１３１頁（１９８１年）参照。ポリペプチド変形物上の炭水化物成分の酵素切断はトータクラ等（Thotakura, et al.）、メソッドインエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、１３８巻、３５０頁（１９８７年）に記載のように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを用いて達成できる。
グリコシル成分の化学付加は任意の技術容認の方法で実施する。糖成分の酵素付加は好ましくは該発明で用いる修飾糖用未変性グリコシルユニットを置換するここに示した方法の修正を用いて達成する。糖成分付加の他法は米国特許５，８７６，９８０、米国特許６，０３０，８１５、米国特許５，７２８，５４４及び米国特許５，９２２，５７７に開示されている。
選択グリコシル残基用の典型的付着点としては限定されないが、（a）Ｎ−連結グリコシル化及びＯ−連結グリコシル化用コンセンサス部位、（ｂ）糖転移酵素用受容体である末端グリコシル成分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン及びヒスチジン、（ｄ）遊離カルボン酸基、（e）システインのスルフヒドリル基のような遊離スルフヒドリル基、（ｆ）セリン、スレオニン又はトリプトファンの水酸基のような遊離水酸基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンの芳香族残基のような芳香族残基又は（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明で用いる典型的方法は１９８７年９月１１日発行のＷＯ８７／０５３３０及びアプリン（Aplin）、ウリストン（Wriston）、シーアールシークリティカルレビューオブバイオケミストリー（CRC Crit. Rev. Biochem.）、２５９−３０６頁（１９８１年）に記載されている。
一実施形態では該発明はFGF―２１と一つ以上のペプチドとのを連結基による結合法を提供する。この連結基は任意の有用な構造であり、直鎖構造か分岐鎖構造から選択できる。好ましくはペプチドに付着するリンカーの各末端は修飾糖（即ち新生無傷グリコシル連結基）を含む。
該発明の典型的方法では二つのペプチドをＰＥＧリンカー含有リンカー成分により一緒に連結する。この作成物は上記カートーンで示した一般構造に従う。ここに記載のように該発明作成物は二つの無傷グリコシル連結基（即ちｓ＋ｔ＝１）を含む。二つのグリコシル基含有ＰＥＧリンカーに焦点をあてるのは明快するためで、該発明の本実施形態で用いるリンカーアームのアイデンティティを制限するものと説明してはならない。
従ってＰＥＧ成分は第一端末で第一グリコシルユニットで機能化され、第二端末で第二グリコシルユニットで機能化される。第一グリコシルユニットと第二グリコシルユニットは好ましくは異なる転移酵素用基質であり、第一ペプチドと第二ペプチドをそれぞれ第一グリコシルユニットと第二グリコシルユニットに直交結合ができる。実際には（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２リンカーが、第一ペプチドと第一グリコシルユニットが基質である第一転移酵素と接触し、その結果（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２を形成する。次いで糖転移酵素及び／又は未反応ペプチドを反応混合物から任意に除去しても良い。第二ペプチドと第二グリコシルユニットが基質である第二転移酵素を（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２複合物に付加し、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２―（ペプチド）２を形成する。技術の熟知者には上に概説した方法が又、例えば分岐ＰＥＧ、デンドリマー、ポリアミノ酸、多糖類又は類似体を用いて、二つより多いペプチド間の複合物形成に適応できることが分かる。
他の典型的実施形態をスキーム３に示す。スキーム３はポリマー含有複合物の産生法を示す。このポリマーはＦＧＦタンパク質の循環半減期を増加する。





スキーム３

ここでＳＡはシアル酸、ポリマーはＰＥＧ、ｍＰＥＧ，ポリシアル酸、水溶性ポリマー又は非水溶性ポリマーである。該方法はFGF―２０とFGF―２１を参照して例示するが、技術者には他ＦＧＦペプチド、例えばFGF―９及びFGF―１８にも同様に適応できることが分かる。
一つ以上のペプチド成分をリンカーに付着するためにＰＥＧ（又は他リンカー）の反応性誘導体を用いることは本発明の範囲内である。該発明は反応性ＰＥＧ類似体のアイデンティティにより制限されれない。ポリエチレングリコールの多くの活性化誘導体が市販され文献で利用できる。本発明に有用な基質産生に適する活性化ＰＥＧ誘導体を選択し、必要であれば合成することは十分に一技術者の能力内である。アブチョブスキー等（Abuchowski, et al.）、キャンサーバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Cancer Biochem. Biophsy.）、７巻、１７５−１８６頁（１９８４年）；アブチョブスキー等（Abuchowski, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５２巻、３５８２−３５８６頁（１９７７年）；ジャクソン等（Jackson, et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１６５巻、１１４−１２７頁（１９８７年）；小出等（Koide, et al.）、バイオケミストリーバイオフィジックリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１１１巻、６５９−６６７頁（１９８３年）、トリフルオロメタンスルホン酸エステル（ニルソン等（Nilsson et al.）、メソッドインエンザイモロジー（Methods Enzymol.）、１０４巻、５９−６９頁（１９８４年）；デルガード等（Delgado, et al.）、バイオテクノロジーアンドアプライドバイオケミストリー（Biotechnol. Appl. Biochem.）、１２巻、１１９−１２８頁（１９９０年））；Ｎ−ヒドロキシスクシニミド誘導活性エステル（バックマン等（Buckmann, et al.）、マクロモレキュラーケミストリー（Makromol. Chem.）、１８２巻、１３７９−１３８４頁（１９８１年）；ジョピッチ等（Joppich, et al.）、マクロモレキュラーケミストリー（Makromol. Chem.）、１８０巻、１３８１−１３８４頁（１９７９年）；アブチョブスキー等（Abuchowski, et al.）、キャンサーバイオケミストリーアンドバイオフィジック（Cancer Biochem. Biophsy.）、７巻、１７５−１８６頁（１９８４年）；カトレ等（Katre, et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８４巻、１４８７−１４９１頁（１９８７年）；北村等（Kitamura, et al.）、キャンサーリサーチ（Cancer Res.）、５１巻、４３１０−４３１５頁（１９９１年）；ボック等（Boccu, et al.）、ツアイトシュリフトフュアナトゥールホルシュング（Z. Naturforsch.）、３８Ｃ、９４−９９頁（１９８３年）；炭酸塩（ザリプスキー等（Zalipsky et al.）、ポリエチレングリコール化学：バイオ技術と生物医学への応用（Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications）、ハリス編（Harris, Ed.）、プレナムプレス（Plenum Press）、ニューヨーク（New York）、１９９２年、３４７−３７０頁；ザリプスキー等（Zalipsky et al.）、バイオテクノロジーアンドアプライドバイオケミストリー（Biotechnol. Appl. Biochem.）、１５巻、１００−１１４頁（１９９２年）：ベロネッセ等（Veronese, et al.）、アプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（Appl. Biochem. Biotech.）、１１巻、１４１―１５２頁（１９８５年））、ギ酸イミダゾールエステル（ビューチャンプ等（Beauchamp, et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１３１巻、２５−３３頁（１９８３年）；バーガー等（Berger）、ブラッド（Blood）、７１巻、１６４１−１６４７頁（１９８８年））。４−ジチオピリジン（ウオーギレン等（Woghiren, et al.）、バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconjugate Chem.）、４巻、３１４−３１８頁（１９９３年））、イソシアネート（ビュン等（Byun, et al.）、エイエスエイアイオージャーナル（ASAIO Journal）、Ｍ６４９−Ｍ６５３（１９９２年））及びエポキシド（ノイシキー等（Noishiki, et al.）に発行の米国特許４，８０６，５９５（１９８９年）参照。他の連結基としてはアミノ基と活性化ＰＥＧ間のウレタン結合が含まれる。ベロネッセ等（Veronese, et al.）、アプライドバイオケミストリーアンドバイオテクノロジー（Appl. Biochem. Biotech.）、１１巻、１４１―１５２頁（１９８５年）参照。
修飾糖類の産生
通常糖成分と修飾基は反応性基を用いて一緒に連結し、この連結工程により通常生理関連条件下で非反応性の新規有機官能基又は種へ変換する。一つ又は複数の反応性官能基は糖成分の任意位に位置する。本発明実施に有用な反応性基と反応種は複合生物化学技術で良く知られたものである。現在反応性糖成分に利用できる好ましい種類の反応は比較的穏和な条件で進むものである。これらとして限定はされないが、求核置換（例えばアミンやアルコールとハロゲン化アシルや活性エステルとの反応）、求電子置換（例えばエナミン反応）及び炭素―炭素多重結合や炭素―ヘテロ原子多重結合への付加（例えばマイケル反応、ディールス―アルダー付加）が挙げられる。これら反応と他の有用な反応は例えば、マーチ（March）、最新有機化学（Advanced Organic Chemistry）、３版、ジョンワイリーアンドサン（John Wiley & Sons）、ニューヨーク（New York）、１９８５年：ハーマンソン（Hermanson）、複合生物技法（Bioconjugate Techniques）、アカデミックプレス（Academic Press）、サンジエゴ（San Diego）、１９９６年及びフィーニー等（Feeney, et al.）、タンパク質修飾（Modification of Proteins）、化学における進歩シリーズ（Advances in Chemistry Series）、１９８巻、アメリカ化学会（American Chemical Society）、ワシントン（Washington）、ディスクリクトオブコロンビア（D.C.）、１９８２年に検討されている。
糖核又は修飾基の有用な反応性官能基ペンダントとしては限定はされないが、
（a）限定はされないが、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステル及び芳香族エステルを含むカルボキシル基と種々のその誘導体、
（ｂ）例えばエステル、エーテル、アルデヒドなどに変換できる水酸基、
（ｃ）ハロゲン化物で、例えばアミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン又はアルコキシドイオンのような求核基で後に置換でき、その結果該ハロゲン原子の官能基に新しい基が共有結合付着するハロアルキル基、
（ｄ）例えばマレイミド基のようにディールス―アルダー反応に加われられるジエノフィル、
（e）例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン又はオキシムのようなカルボニル誘導体形成によるか、又はグリニャール付加又はアルキルリチウム付加のような機構により後続誘導体化が可能なようなアルデヒド基又はケトン基、
（ｆ）アミンとの後続反応で、例えばスルホアミドを形成するハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）例えばジスルフィドへの変換やハロゲン化アシルとの反応が可能なチオール基、
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化又は酸化が可能なアミン基又はスルホヒドリル基、
（ｉ）例えば付加環化、アシル化、マイケル付加などが起こるアルケン及び
（ｊ）例えばアミン及びヒドロキシル化合物と反応できるエポキシド
が挙げられる。
反応性官能基は反応性糖核又は修飾基構築に必要な反応に預からないか、又は妨害しないように選ぶ。代わりに反応性官能基は保護基の存在でその反応に加わるのを防ぐこともできる。技術の熟知者には選択した組み合わせの反応条件で妨害しないように、如何に特定官能基を保護するかは理解できる。有用な保護基の例については、例えばグリーン等（Greene, et al.）、有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）、ジョンワイリーアンドサン（John Ｗiley & Sons）、ニューヨーク（New York）、１９９１年参照。
以下の検討で本発明実施に有用な多数の修飾糖の特定例を示す。典型的実施例では修飾基を付着するシアル酸を糖核として利用する。シアル酸誘導体に関する論考中心は説明を明快にするためだけで、該発明の範囲を制限しようとすべきではない。技術の熟知者には多種の他糖成分が、シアル酸を例に用いて示したのと類似の形で活性化及び誘導体化できることが分かる。例えば技術的に容認された方法で容易に修飾できる小数の糖基質の名前を挙げると、ガラクトース、ブドウ糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン修飾に多くの方法が利用できる。例えば、エルハラビ等（Elhalabi, et al.）、カレントメジシナルケミストリー（Curr. Med. Chem.）、６巻、９３頁（１９９９年）及びシェーファー等（Schafer, et al.）、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（J. Org. Chem.）、６５巻、２４頁（２０００年）。
典型的実施形態では該発明法で修飾のペプチドは原核細胞（例えば大腸菌）、酵母菌及び哺乳類細胞を含む真核細胞（例えばＣＨＯ細胞）又は遺伝子導入動物で産生の糖ペプチドであり、従って不完全にシアル酸付加したＮ及び／又はO−連結オリゴ糖鎖を含有する。シアル酸に欠け且つ端末ガラクトース残基含有糖ペプチドのオリゴ糖鎖はペグ化、ＰＰＧ化又は別の修飾シアル酸で修飾できる。
典型的ＰＥＧ―シアル酸誘導体としては、


が挙げられ、ここでＬはシアル酸成分とＰＥＧ成分を連結する置換又は非置換アルキルリンカー成分又は置換又は非置換ヘテロアルキルリンカー成分であり、“ｎ”は１以上であり、且つ


において、指数“ｓ”は０乃至２０の整数を表し且つ“ｎ”は１以上である。
スキーム４ではアミノグリコシド１を保護アミノ酸（例えばグリシン）誘導体の活性エステルで処理し、糖アミン残基を対応保護アミノ酸アミド付加物に変換する。この付加物をアルドラーゼで処理してα―ヒドロキシカルボン酸塩２を形成する。化合物２をシチジン一リン酸（ＣＭＰ）―シアル酸（ＳＡ）合成酵素により対応ＣＭＰ誘導体に変換し、次いでＣＭＰ誘導体の接触水素化により化合物３を産生する。グリシン付加物形成による導入アミンを化合物３の活性化ＰＥＧ誘導体又はＰＰＧ誘導体（例えば、PEG−C(O)NHS、 PEG−OC(O)―p−ニトロフェニル）との反応によるＰＥＧ付着坐位として用い、それぞれ４又は５のような種を産生する。
スキーム４

表１にＰＥＧ成分やＰＰＧ成分のような修飾基で誘導体化した糖一リン酸塩の代表例を示す。線維芽細胞成長因子ペプチドはスキーム１の方法で修飾できる。他誘導体は技術的容認の方法で産生する。例えばケップラー等（Keppler, et al.）、グリコバイオロジー（Glycobiology）、１１巻１１Ｒ（２００１年）及びチャーター等（Charter, et al.）、グリコバイオロジー（Glycobiology）、１０巻１０４９頁（２０００年）参照。他のアミン反応性ＰＥＧとＰＰＧ類似体は市販されており、又技術の熟知者が容易にアクセスできる方法で産生できる。
表１



ここでＲは修飾基、例えば線型又は分岐ＰＥＧを又は−Lx−Rxを表し、Ｌｘは結合（ゼロ次）、置換又は非置換アルキル又は置換又は非置換ヘテロアルキルから選んだリンカーであり、Ｒｘは修飾基である。
本発明実施に用いる修飾糖リン酸塩は他の位置と同様に上に示した位置で置換できる。シアル酸の現在の好ましい置換を式Ｉに示す。


ここでＸは好ましくは−O−, −N(H)−, −S, CH2−及びN(R)2から選んだ連結基であり、各ＲはR1−R5から独立に選んだ構成員である。記号Ｙ、Ｚ、Ａ及びＢはそれぞれＸのアイデンティティで上で示した基から選ぶ基を表す。Ｘ，Ｙ、Ｚ、Ａ及びＢはそれぞれ独立選択され、それ故同じでも異なっても良い。記号R1 、R2 、R3 、R4及びR5は水素原子、水溶性ポリマー、治療成分、生体分子又は他成分を表す。代わりにこれら記号は水溶性ポリマー、治療成分、生体分子又は他成分と結合したリンカーを表す。
ここで開示の複合物に結合した典型的成分としては限定はされないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキルＰＥＧ，アシルＰＥＧ，アシルアルキルＰＥＧ、アルキルアシルＰＥＧ、カルバモイルＰＥＧ、アリールＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキルＰＰＧ，アシルＰＰＧ，アシルアルキルＰＰＧ、アルキルアシルＰＰＧ、カルバモイルＰＰＧ、アリールＰＰＧ）、治療成分、診断成分、マンノース−６−リン酸、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬex、マンノース、マンノース−６−リン酸、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、触角型オリゴ糖、ペプチド及び類似体が挙げられる。種々の修飾基と糖類成分との複合化法は技術の熟知者には容易にアクセスできる（ポリエチレングリコール化学：バイオ技術と生物医学への応用（Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications）、ジェイミルトン、ハリス編（J. Milton Harris, Ed.）、プレナムプレス（Plenum Press）、ニューヨーク（New York）、１９９２年；ポリエチレングリコール化学：化学と生物への応用（Poly(ethylene glycol) Chemical and Biological Applications）、ジェイミルトン、ハリス編（J. Milton Harris, Ed.）、アメリカ化学会シンポジウムシリーズ（ACS Symposium Series）、６８０号、アメリカ化学会（American Chemical Society）、１９９７年； ハーマンソン（Hermanson）、複合生物技法（Bioconjugate Techniques）、アカデミックプレス（Academic Press）、サンジエゴ（San Diego）、１９９６年及びダン等編（Dunn, et al. Eds）、ポリマー薬剤とドラッグデリバリーシステム（Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems）、アメリカ化学会シンポジウムシリーズ（ACS Symposium Series）、４６９号、アメリカ化学会（American Chemical Society）、１９９７年、ワシントン（Washington）、ディストリクトオブコロンビア（D.C.）、１９９１年）。
架橋基
本発明法で用いる修飾糖産生は修飾基を糖残基に付着し糖転移酵素用の基質となる安定な付加物形成を含む。糖と修飾基はゼロ次か高次架橋薬剤で結合できる。修飾基を炭水化物成分に付着するのに使用できる典型的二官能性化合物としては限定はされないが、二官能性ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステル及び類似体が挙げられる。例えば、リー等（Lee, et al.）、バイオケミストリー（Biochemistry）、２８巻、１８５６頁（１９８９年）；バチア等、（Bhatia, et al.）、アナリティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.）、１７８巻、４０８頁（１９８９年）；ヤンダ等（Janda, et al.）、ジャーナルオブアメリカケミカルソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）、１１２巻、８８８６頁（１９９０年）；ベッドナルスキ等（Bednarski, et al.）、ＷＯ９２／１８３１５参照。以下の検討で該反応基は新生修飾糖の糖成分上で穏和に処理する。議論の中心は説明を明快にするためである。技術の熟知者にはこの議論が修飾基の反応性基にも同様に関連することが分かる。
種々の試薬を用いて分子内化学架橋により修飾糖成分を修飾する（架橋剤と架橋法に関しては、ウオルド、エフ（Wold, F）、メソッドインエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、２５巻、６２３−６５１頁、１９７２年；ウイートール、エッチエッチ（Weetall, H.H.）、クーニー、ディエイ（Cooney, D. A.）、薬剤としての酵素（Enzymes as Drugs）、（ホルセンベルグ、ロバート編（Holcenberg, Roberts, eds.））、３９５−４４２頁、ワイリー（Wiley）、ニューヨーク（New York）、１９８１年；ジーティエッチ（Ji, T.H）.、メソッドインエンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、９１巻、５８０−６０９頁、１９８３年；マットソン等（Mattson, et al.）、モレキュラーバイオロジカルレポート（Mol. Biol. Rep.）、１７巻、１６７−１８３頁、１９９３年を参照し、これら全てが文献としてここに取り入れてある）。好ましい架橋剤は種々のゼロ長架橋試薬、ホモ二官能性架橋試薬及びヘテロ二官能性架橋試薬から誘導される。ゼロ長架橋試薬は外来材の導入無しで二つの固有化学基の直接複合化を含む。ジスルフィド結合形成を触媒する薬剤はこの種類に属する。他例はカルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５フェニルイソオキサゾリウムー３’―スルホネート）及びカルボニルジイミダゾールのようなカルボキシル基と第一級アミノ基の縮合を誘導し、アミド結合を形成する試薬である。これら化学試薬以外に酵素のグルタミン転移酵素（グルタミル−ペプチドγ―グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）をゼロ長架橋剤として用いても良い。この酵素は通常基質としての第一級アミノ基と、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でのアシル基転位反応を触媒する。好ましいホモ二官能性試薬とヘテロ二官能性試薬は、それぞれアミノ基、スルフォヒドリル基、グアニジノ、インドール又は非特定基と反応できる二つの同じ部位か二つの異なる部位を含有する。
更なる他実施形態では光活性化可能基をジアゾピルビン酸塩から選ぶ。例えばｐ−ニトロフェニルジアゾピルビン酸エステルのｐ−ニトロフェニルエステルを脂肪族アミンと反応してジアゾピルビン酸アミドを得、紫外線光分解を行ってアルデヒドを形成する。光分解ジアゾピルビン酸修飾親和性成分はフォルムアルデヒドやグルタルアルデヒドのように反応して架橋物を形成する。
切断可能リンカー基
更なる実施形態でリンカー基は切断して修飾基を糖残基から放出する基を備えている。多くの切断可能基が技術的に知られている。例えばユング等（Jung, et al.）、バイオケミストリーバイオフィジックアクタ（Biochem. Biophys. Acta）、７６１巻、１５２−１６２頁（１９８３年）；ジョッシ等（Joshi, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、１４５１８−１４５２５頁（１９９０年）；ザーリング等（Zarling, et al.）、ジャーナルオブイムノロジー（J. Innunol.）、１２４巻、９１３−９２０頁（１９８０年）；ブーザー等、（Bouizar, et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eru. J. Biochem.）、１５５巻、１４１−１４７頁（１９８６年）；パーク等（Park, et al.）ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６１巻、２０５−２１０頁（１９８６年）；ブラウニング等（Browning, et al.）、ジャーナルオブイムノロジー（J. Innunol.）、１４３巻、１８５９−１８６７頁（１９８９年）参照。更に広範囲の切断可能な二官能性（ホモ二官能性とヘテロ二官能性）リンカー基がピアース（Pierce）のような供給業者から市販されている。
典型的な切断可能成分は光、熱或いはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩及び類似体のような試薬を用いて切断できる。更にある好ましい基がエンドサイトーシス（例えばシス−アコニチル、シェン等（Shen, et al.）、バイオケミストリーバイオフィジックリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophys.Res. Commun）、１０２巻、１０４８頁（１９９１年）参照）に応答して体内で切断する。好ましい切断可能基はジスルフィド、エステル、イミド、炭酸塩、ニトロベンジル、フェナシル及びベンゾイン基からなる一群から選んだ構成員の切断可能成分を含む。
修飾糖のペプチドとの複合化
修飾糖は複合化を仲介する適切な酵素を用いてグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドに複合化する。好ましくは一つ又は複数の修飾供与体糖、一つ又は複数の酵素及び一つ又は複数の受容体ペプチド濃度は該受容体が消費されるまでグルコシル化が進行するように選ぶ。以下で検討する考察はシアリル酸転移酵素との関連で示すが、通常他糖転移酵素反応に適応できる。
所望オリゴ糖構造の合成に多くの糖転移酵素使用法が知られており、通常本発明に利用できる。典型的方法は例えば、ＷＯ９６／３２４９１、伊藤等（Ito, et al.）、ピュアーアンドアプライドケミストリ（Pure Appl. Chem.）、６５巻、７５３頁（１９９３年）及び米国特許５，３５２，６７０、米国特許５，３７４，５４１及び米国特許５，５４５，５５３参照。
本発明は単一糖転移酵素又は組み合わせの糖転移酵素を用いて実施する。例えばシアリル酸転移酵素とガラクトシル基転移酵素の組み合わせを使用できる。一つより多い酵素を用いるこれらの実施形態では、好ましくは該酵素と基質を最初の反応混合物で一緒にするか、又は該酵素と第二酵素反応用試薬を一旦第一酵素反応が完了又はほぼ完了した反応媒体に加える。単一容器中で二つの酵素反応を連続して実施することで、中間体種を単離する方法以上に全収率が改善される。更に余分の溶剤や副産物の浄化や廃棄が減少する。
好ましい実施形態では第一酵素と第二酵素のそれぞれが糖転移酵素である。他の好ましい実施形態では一酵素はエンドグリコシダーゼである。更なる好ましい実施形態では二つより多い酵素を用いて該発明の修飾糖タンパク質を構築する。酵素を用いて修飾糖のペプチドへの付加前又は後のいずれかの任意の点でペプチドの糖類構造を変える。
他実施形態では該法は一つ以上のエキソグリコシダーゼ又はエンドグリコシダーゼを利用する。該グリコシダーゼは通常グリコシル結合を切断するよりむしろ形成するように操作する変異体である。変異体グリカナーゼは通常アミノ酸残基の活性部位酸性アミノ酸残基への置換を含む。例えばエンドカナーゼがエンド−Ｈの場合、置換活性部位残基は通常１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕ又はそれらの組み合わせである。アミノ酸は通常セリン、アラニン、アスパラギン又はグルタミンで置換される。
変異体酵素はエンドカナーゼ加水分解段階の逆反応と類似の合成段階により反応を触媒する。これらの実施形態ではグリコシル供与体分子（例えば所望オリゴ糖構造又は単糖構造）は脱離基を含み、その反応はタンパク質のＧｌｃＮＡｃ残基に供与体分子を付加して進行する。例えば脱離基はフッ化物のようなハロゲン原子である。他実施形態では脱離基はＡｓｎ又はＡｓｎ―ペプチド成分である。更なる実施形態ではグリコシル供与体分子のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えばＧｌｃＮＡｃ残基は１，２―オキサゾリン成分を含んでも良い。
好ましい実施形態では該発明の複合物産生に利用する各酵素は触媒量存在する。特定酵素の触媒量は酵素基質濃度と同様に温度、時間及びｐＨ値により変わる。前もって選んだ基質濃度と反応条件での所定酵素触媒量の決定法は、技術の熟知者には良く知られている。
上記工程を実施する温度は氷結温度の直ぐ上から最も敏感な酵素が変性する温度範囲である。好ましい温度範囲は約０℃から約５５℃、より好ましくは約２０℃から約３０℃である。他の典型的実施形態では本法成分の一つ以上が好熱性酵素を用いて高温で実施する。
反応混合物を受容体がグリコシル化するのに十分な時間保持し、その結果所望複合物を形成する。複合物のあるものはしばしば数時間後に検出でき、通常２４時間以内に回収可能量が得られる。技術の熟知者には反応速度は選択系で最適化する多くの変動要因（例えば酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶剤量）に依存することが分かる。
本発明は又修飾ペプチドの工業規模産生を提供する。ここで用いる工業規模は単一反応サイクル後に、即ち該複合物が同一の連続反復合成サイクルでの反応生成物の組み合わせでなしに、通常少なくと約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｇの純粋な最終複合物を産生する。
以下の議論では該発明をグリコシル化ペプチドとの修飾シアル酸成分複合化で例示する。典型的修飾シアル酸はｍ−ＰＥＧで標識化する。ＰＥＧ修飾シアル酸とグリコシル化ペプチド使用に関する以下の議論の中心は説明の明快にするためで、該発明がこれら二つのパートナー複合化に限定する意図はない。一熟知者にはこの議論が通常シアル酸以外の修飾グルコシル化成分の付加に適応できることが分かる。更にこの議論は同様に他水溶性ポリマー、治療成分及び生体分子を含むｍ−ＰＥＧ以外の薬剤でのグルコシルユニット修飾に適用できる。
酵素手段を用いてペグ化炭水化物又はＰＰＧ化炭水化物をペプチド又は糖ペプチドに選択導入できる。この方法はＰＥＧ、ＰＰＧ又は遮蔽反応性官能基含有の修飾糖を利用し、適切な糖転移酵素又は糖合成酵素と組み合わす。所望炭水化物結合を作る糖転移酵素を選び、且つ修飾糖を供与体基質として用いて、該ＰＥＧ又はＰＰＧがペプチドバックボーン、糖ペプチドの存在糖残基又はペプチドと付加した糖残基に直接導入できる。
糖転移酵素用受容体は天然発生構造か組み換え的か酵素的か又は化学的に配置の構造として本発明の方法により修飾されるペプチドに存在する。適切な受容体としては、例えばＧｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧaｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｓＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（乳糖）及び技術の熟知者に知られた他受容体のようなガラクトシル受容体が挙げられる（例えば、ポールソン等（Paulson, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５３巻、５６１６−５６２４頁（１９７８年））。
一実施形態ではシアル酸転移酵素用受容体が糖ペプチドの体内合成時に修飾される糖ペプチド上に存在する。この糖ペプチドは糖ペプチドのグリコシル化パターンを前もって修飾する事なしに請求項の方法を用いてシアル酸付加できる。代わりに該発明法を用いて適切な受容体を含有しないペプチドをシアル酸付加できる。先ず技術の熟知者に既知の方法で受容体を含むように該ペプチドを修飾できる。典型的実施形態ではＧａｌＮＡｃ残基がＧａｌＮＡｃ転移酵素作用により付加する。
典型的実施形態ではガラクトシル受容体はガラクトース残基をペプチドに連結した適切受容体、例えばＧａｌＮＡｃに付着して構築する。該法は修飾すべきペプチドを適切量のガラクトシル基転移酵素（例えば、Ｇａｌβ１，３又はＧａｌβ１，４）と適切ガラクトシル供与体（例えば、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−ガラクトース）含有の反応混合物とインキュベートすることを含む。この反応は実質的に完了まで進行させるか、又は代わりに前もって選んだ量のガラクトースを加えてこの反応を終結する。選んだ糖類受容体構築の他法は技術の熟知者には明白である。
更に他実施形態では糖ペプチド連結オリゴ糖の全体又は一部を先ず“トリム”し、シアル酸転移酵素用受容体か一つ以上の適切残基が付加して適切受容体が得られる成分のいずれかを暴露する。糖転移酵素及びエンドグリコシダーゼのような酵素（例えば、米国特許５，７１６，８１２参照）は付着反応及びトリミング反応に有用である。
以下の議論で該発明法が糖に結合した水溶性ポリマーを有する修飾糖を用いて例示する。議論の中心は説明を明白にするためである。熟知者にはこの議論が修飾糖が治療成分、生体分子又は類似体を持つ実施形態に同様に適切であることが分かる。
典型的実施形態ではO−連結炭水化物残基を修飾糖の付加前に“トリム”する。例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ残基をトリムしてＧａｌＮＡｃに戻す。水溶性ポリマーを有する修飾糖は“トリミング”により一つ以上が露出した糖残基と複合化する。一例では糖ペプチドを“トリム”し、水溶性ポリマーを生成Ｏ側鎖アミノ酸又は糖ペプチドグリカンに、水溶性ポリマーと複合化した、たとえば例えばＳｉａ、Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃ成分のような糖成分により付加する。その修飾糖成分はこの“トリムした”糖ペプチドの受容体部位に付着する。代わりに非修飾糖成分、例えばＧａｌはO−連結グリカン末端に付加できる。
他の典型的実施形態では水溶性ポリマーはガラクトース残基を有する修飾糖によりＧａｌＮＡｃ残基に付加する。代わりに非修飾ＧａｌはＧａｌＮＡｃ残基末端に付加できる。
更なる例では水溶性ポリマーは修飾シアル酸を用いてＧａｌ残基に付加する。
他の典型的実施形態ではＯ−連結グリコシル残基はアミノ酸に付着したＧａｌＮＡｃに“トリム戻し”する。一例では水溶性ポリマーはこのポリマーで修飾したＧａｌにより付加する。代わりに非修飾ＧａｌをＧａｌＮＡｃに付加し、次いで付加水溶性ポリマーを有するＧａｌで付加する。更なる他実施形態では一つ以上の非修飾Ｇａｌ残基をＧａｌＮＡｃに付加し、次いで水溶性ポリマーで修飾したシアル酸成分で付加する。
該発明法を用いて実質的に任意の所望構造の炭水化物成分を“トリム戻し”や構築できる。修飾糖は上に示したように炭水化物成分末端に付加でき、又はペプチドコアと炭水化物末端の中間にもおける。
典型的実施形態では水溶性ポリマーはポリマー修飾シアル酸を用いてＧａｌ残基末端に付加できる。適切なシアル酸転移酵素を用いて修飾シアル酸を付加する。その方法をスキーム５に要約する。
スキーム５







スキーム６に要約した更なる方法では、シアル酸に遮蔽反応機能性が存在する。遮蔽反応性基は好ましくは修飾シアル酸のペプチド付着に用いる条件に影響されない。ペプチドへの修飾シアル酸共有結合付着後遮蔽物を除き、このペプチドをＰＥＧ、ＰＰＧ、治療成分、生体分子又は他薬剤のような薬剤と複合化する。この薬剤は修飾糖残基上の非遮蔽反応性基と反応して特異的にこのペプチドと複合化する。
スキーム６

任意の修飾糖が糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖により適切糖転移酵素と共に用いられる（表２）。上に検討したようにペグ化構造又はＰＰＧ化構造導入に必要な糖ペプチドの末端糖は発現中に自然に導入できるか、又は適切な一つ又は複数のグリコシダーゼ、一つ又は複数の糖転移酵素又は一つ又は複数のグリコシダーゼと一つ又は複数の糖転移酵素の混合を用いて発現後に産生できる。
表２


Ｘ＝酸素原子、ＮＨ、硫黄原子、CH2, N−(R1−5)2
Y＝Ｘ，Ｚ＝Ｘ；Ａ＝Ｘ；Ｂ＝Ｘ
Ｑ＝H2、酸素原子、硫黄原子、ＮＨ、N−R
Ｒ，Ｒ1−4＝水素原子、リンカー−Ｍ、Ｍ
Ｍ＝興味の配位子
興味の配位子＝アシルＰＥＧ、アシルＰＰＧ、アルキルＰＥＧ、アシルアルキルＰＥＧ、アシルアルキルＰＥＧ、カルバモイルＰＥＧ、カルバモイルＰＰＧ、ＰＥＧ、ＰＰＧアシルアリールＰＥＧ、アシルアリールＰＰＧ、アリールＰＥＧ、アリールＰＰＧ、マンノース６リン酸、ヘパリン、ヘパラン、SＬex、マンノース、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、ペプチドなど。
更なる典型的実施形態ではＵＰＤ−ガラクトース−ＰＥＧがウシ乳β１，４−ガラクトシル転移酵素と反応して、修飾ガラクトースを適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造に転移する。哺乳類、昆虫、植物又は真菌のような発現系で起こるように、糖ペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基が発現時に産生しても良く、或いは糖ペプチドを必要ならしシアリダーゼ及び／又はグリコシダーゼ及び／又は糖転移酵素で処理して産生できる。
他の典型的実施形態ではＧＮＴ１−５のようなＧｌｃＮＡｃ転移酵素を用いてペグ化ＧｌｃＮＡｃを糖ペプチド上の末端マンノース残基に転移する。更なる典型的実施形態ではＮ−連結及び／又はＯ−連結グリカン構造を糖ペプチドから酵素的に除去し、アミノ酸又は端末グリコシル残基を暴露し、次いで修飾糖と複合化する。例えばエンドグリカナーゼを用いて糖ペプチドのＮ−連結構造を除去し、糖ペプチド上のＧｌｃＮＡｃ−連結―Ａｓｎのような末端ＧｌｃＮＡｃを暴露する。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ及び適切なガラクトシル転移酵素を用いてＰＥＧ−ガラクトース機能性又はＰＰＧ−ガラクトース機能性を暴露ＧｌｃＮＡｃに導入する。
代わりの実施形態では糖残基をペプチドバックボーンに転移することが知られている糖転移酵素を用いて、直接ペプチドバックボーンに付加する。この典型的実施形態はスキーム７に示す。本発明実施に有用な典型的糖転移酵素は限定はされないが、ＧａｌＮＡｃ転移酵素（ＧａｌＮＡｃＴ１−２０）、ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、フコシル基転移酵素、グルコシル基転移酵素、キシロシル基転移酵素、マンノシル基転移酵素及び類似体が挙げられる。この方法を用いていずれかの炭水化物が欠如したペプチド、又は代わりに既存糖ペプチドに修飾糖を直接付加できる。両者の場合修飾糖の付加は、化学法を用いたタンパク質ペプチドバックボーン修飾で起こるような無作為的ではなく、糖転移酵素の基質特異性で規定されるようにペプチドバックボーンの特定位で起こる。数々の薬剤が適切アミノ酸配列をポリペプチド鎖に操作して、糖転移酵素基質ペプチド配列に欠けたタンパク質又は糖ペプチドに導入できる。
スキーム７

上に示した各典型的実施形態ではペプチドとの修飾糖複合化後に、一つ以上の追加の化学的修飾法又は酵素的修飾法が利用できる。典型的実施形態では酵素（例えばフコシル基転移酵素）を用いてグルコシルユニット（例えばフコース）をこのペプチドに付着した末端修飾糖に付加する。他例では酵素反応を用いて修飾糖が複合化できなかった部位を“キャップ”する（例えば、シアル酸付加する）。代わりに化学反応を用いて複合化修飾糖構造を変える。例えば該複合化修飾糖を修飾糖が結合したペプチド成分との結合を安定化又は不安定化する薬剤と反応する。他例では修飾糖成分をペプチドとの複合化後に脱保護する。一熟練者には修飾糖をペプチドと複合化後の段階で、該発明に利用できる数々の酵素法及び化学法があることが分かる。修飾糖―ペプチド複合物の更なる推敲は該発明範囲内である。
酵素種
本発明の様態は活性化アシル成分と糖核に見られるヘテロ原子間の結合を形成する酵素を利用する。本発明実施に有用な酵素は限定はされないが、野生型及び変異タンパク質分解酵素、リパーゼ、エステラーゼ、アシラーゼ、アシル基転移酵素、糖転移酵素、サフォ転移酵素、グリコシダーゼ及び類似体が挙げられる。典型的変異体は活性部位の一つ以上のアミノ酸残基が変化して、対応野生型酵素活性に比して合成活性が改善された酵素を提供するものである。
アシル転移
幾つかの酵素が有機溶剤中で触媒活性であるという発見により、生体触媒としての使用が多いに拡大された。この媒体ではこれら酵素は新規の触媒挙動を示す。例えばリパーゼは有機媒体中でエステル化反応とエステル交換反応を触媒する。これらの物性により化学法を用いて得るのが困難な化合物の産生が可能になる。
タンパク質分解酵素
タンパク質分解酵素は該発明の幾つかの実施形態で用いる。タンパク質分解酵素はエステル化によるアミノ酸の糖への付着を触媒することは技術的に知られている（デービス（Davis）、ＷＯ０３／０１４３７１、２００３年２月２０日公開）。この公開ではビニルエステルアミノ酸基がバシラスレンタス（Bacillus lentus）誘導のセリンプロテアーゼサブチリシン存在下で炭水化物アシル受容体と反応する。野生型タンパク質分解酵素は更にバシリスアミロリクエファシエン（Bacillus amyloliquefaciens）から単離できる。変異タンパク質分解酵素は例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１０６１５及びＷＯ９１／０６６３７に教示により産生でき、ここに文献として取り入れる。本発明で使用の他タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ（キモトリプシン、プラスミン及びトロンビンのような）、システインプロテアーゼ（カテプシンＢ及びパパインのような）及びアスパラギン酸エンドペプチダーゼ（ペプシンＡ、キモシン、カテプシンＤ、アスパラゲナーゼのような）が挙げられる。
典型的実施形態ではタンパク質分解酵素を用いて、糖成分と修飾基間の結合は修飾基で誘導体化したアミノ酸である。この糖とアミノ酸がタンパク質分解酵素により形成したアミド成分により連結する。
リパーゼ
該発明の幾つかの実施形態でリパーゼを使用する。糖類アシル化でのリパーゼの使用は以前に報告された。例えば有機溶剤中でリパーゼＰＳを用いてアルキルβ―Ｄ−キシロプラノシドの位置選択的アシル化がロペズ（Lopez）により報告された（ロペズ等（Lopez, et al.）、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（J. Org. Chem.）、５９巻、７０２７−７０３２（１９９４年）。又他グループは酢酸ビニル中でアセチル基のシアル酸への転移を触媒
するためにリパーゼＰＳを用いる（ロー等（Lo, et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、９巻、７０９−７１２頁（１９９９年））。カンジダアンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼで触媒される三級ブチルアルコール中での位置選択的二糖類アシル化が報告された（ウーデンベルグバンオーステローム等（Woudenberg van−Oosterom, et al.）、バイオテクノロジーアンドバイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioeng.）、４９巻、３２８−３３３頁（１９９６年））。カンジダアンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼの固定化版が又三級ブタノール中でのヒドロキシプロピルセルロースのアシル化に用いられた（セレッティ等（Sereti, et al.）、バイオテクノロジーアンドバイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioeng.）、７２（４）巻、４９５−５００頁（２００１年））。本発明で用いる他リパーゼとしては、リポタンパク質リパーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ジグリセライドリパーゼ及びポストヘパリンリパーゼが挙げられる。
エステラーゼ
エステラーゼも又該発明の幾つかの実施形態で使用できる。セロビオース及びセルロースのアセチル化は、酢酸イソプロペニル存在下の水性媒体中でアルスロバクタービスコサス（Arthrobacter viscosus）の細胞内カルボキシルエステラーゼにより触媒されることが示された（キュイ等（Cui, et al.）、エンザイムミクロバイオロジカルテクノロジー（Enzyme Microb. Technol.）、２４巻、２００−２０８頁（１９９９年））。他グループはコレトトリチャムリンデムチアナム（Colletotrichum lindemuthianum）のキチン脱アセチル化酵素を用いて、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液中でキトビオーズとキトテトラオースのアミノ基をアセチル化した（徳安等（Tokuyaksu, et al.）、カーボハイドレートリサーチ（Carbohydr. Res.）、３２２巻、２６−３１頁（１９９９年））。第三のグループはシゾフィラムコンミューン（Schizophyllum commune）のアセチルキシランエステラーゼ（ＡｃＸＥ）を用いて、メチルβ―Ｄ−キシロピラノシド、メチルβ―Ｄ−セロビシド、メチルβ―Ｄ−グルコピラノシド、セロテトラオース、２−デオキシーＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、β―１，４―マンノビオース、β―１，４−マンノペントース、β―１，４−マンノヘキソース、β―１，４−キシロビオース及びβ―１，４−キシロペンタオースへのアセチル基転移を触媒した（ビーリー等（Biely, et al.）、バイオキミカエトバイオフィジカアクタ（Biochimica et Biophysica Acta）、１６２３巻、６２−７１頁（２００３年））。又二級アルコールのアセチル化がフミコラインソレンス（Humicola insolens）のフェルロイルエステラーゼにより、酢酸ビニルのエステル交換により達成された（ハッツァキス等（Hatzakis, et al.）、ジャーナルオブモレキュラーキャタリスト、Ｂエンザイム（J. Mol. Catal., B Enzym）、２１巻、３０９−３１１頁（２００３年））。該発明で用いる他のエステラーゼとしては、コリンエステラーゼ、ステロールエステラーゼ、ヒドロキシシンナモイルエステラーゼ、アセチルサリチル酸エステラーゼ及び多発神経炎性エステラーゼが挙げられる。
アシラーゼ
該発明の幾つかの実施形態では又アシラーゼが用いられる。該発明で用いる典型的なアシラーゼとしては、アミノアシラーゼＩ、Ｌ−アミノ酸アシラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、アセチル補酵素Ａアシラーゼ、アシルリシンデアシラーゼ、アクレアシンＡアシラーゼ、サクシニル補酵素Ａアシラーゼ及びアセチルアスパラギン酸デアミナーゼが挙げられる。
アセチル基転移酵素
該発明の他実施形態でアシル転移はアセチル基転移酵素で実現される。多糖類アシル化でのアセチル基転移酵素の使用は以前に報告されている。シアル酸の９位でのＯ―アセチル化はＣＯＳ細胞系の幾つかの遺伝子産物で起こることが示された（シー等（Shi, et al.）、グリコバイオロジー（Glycohiology）、８（２）巻、１９９−２０５頁（１９９８年））。大腸菌のマルトース−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）は、ブドウ糖とマルトースのＣ６位へのアセチル基転移を触媒することが知られている（レッジオ等（Leggio, et al.）、バイオケミストリー（Biochemistry）、４２巻、５２２５−５２３５頁（２００３年））。この同じグループが又ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）を用いてガラクトシルユニットへのアセチル基転移を触媒した。該発明に用いる他のアセチル基転移酵素としてはスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ、ジアミンーＮ−アセチルトランスフェラーゼ及びシアル酸―Ｏ−アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。
糖転移
アシル結合複合物形成に関する状況を上で検討した酵素以外に、該複合物及び出発物質（例えばペプチド、脂質）のグリコシル化パターンは産生、トリム戻し又は他酵素を用いる方法で別に修飾できる。糖供与体を受容体に転移する酵素を用いるペプチドと脂質再構築法は、２００３年４月１７日に発行のドゥフリース（DeFrees）のWO０３／０３１４６４A2に詳細に検討されている。本法に用いる選択酵素について如何に簡単な概括を示す。
糖転移酵素
糖転移酵素は活性化糖（供与体ヌクレオシド二リン酸（NDP）―糖）のタンパク質、糖ペプチド、脂質又は糖脂質或いは成長オリゴ糖の非還元性末端への段階的付加を触媒する。N―連結糖ペプチドは転移酵素及び糖質連結オリゴ糖供与体のDol―PP―NAG２Gｌｃ３Man9の一括転移に続きコアのトリミングにより合成する。この場合“コア”糖の性質は続く付着物とやや異なる。技術的に非常に多数の糖転移酵素が知られている。
糖転移酵素反応が関与する酵素糖合成はクローン化できるし、又任意の出所から単離できる。多くのクローン化糖転移酵素がそのポリヌクレオチド配列のように知られている。例えば“クローン化糖転移酵素に関するワールドワイドウエブガイド”（http:/www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm）参照。アミノ酸配列が推定できる糖転移酵素コード化糖転移酵素アミノ酸配列及びヌクレオシド配列は又ジェンバンク（GenBank）、スイスプロット（Swiss−Prot）、EMBL及びその他を含む種々の公的利用可能なデータベースに見いだせる。
該発明法で使用できる糖転移酵素は限定はされないが、ガラクトシル基転移酵素、フコシル基転移酵素、グルコシル基転移酵素、N―アセチルガラクトサミニル基転移酵素、N―アセチルグルコサミニル基転移酵素、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアル酸転移酵素、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸転移酵素、ガラクツロン酸転移酵素及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられる。適切な糖転移酵素は真核生物と同様に原核生物から得た酵素を含む。
フコシル基転移酵素
幾つかの実施形態では該発明法で使用できる糖転移酵素はフコシル基転移酵素である。フコシル基転移酵素は技術の熟知者には知られている。典型的フコシル基転移酵素としてはL―フコースをGDP―フコースから受容体糖の水酸基位に転移する酵素が挙げられる。非ヌクレオチド糖を受容体に転移するフコシル基転移酵素は又本発明で使用される。
幾つかの実施形態では受容体糖は例えば、オリゴ糖グリコシドのGalβ（１→３，４）GlcNAｃβ基のGlcNAｃである。この反応での適切なフコシル基転移酵素としては、最初に人乳で特定されたGalβ（１→３，４）GlcNAｃβ１―α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（TRIIIE.C.No.２．３．１．６５）（パリシック等（Palcic, et al.）、カーボハイドレートリサーチ（Carbohydrate Res.）、１９０巻、１−１１頁（１９８１年）；プリールズ等（Prieels, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chemi.）、２５６巻、１０４５６−１０４６３頁（１９８１年）及びヌーネッツ等（Nunez, et al.）、カナディアンジャーナルオブケミストリー（Can. J. Chem）、５９巻、２０８６−２０９５頁（１９８１年）参照）とヒト血清に見出されるGalβ（１→４）GlcNAｃβ―αフコシルトランスフェラーゼ（FTIV、FTV、FTVI）が挙げられる。シアリルα（２→３）Galβ（（１→３）GlcNAｃβフコシルトランスフェラーゼであるFTVII（E.C.No.２．４．１．６５）も又特定された。組換え型のGalβ（１→３，４）GlcNAｃβ１―α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼも又特定された（デュマス等（Dumas, et al.）、バイオオルガニックメディシンレター（Bioorg. Med. Letters）、１巻、４２５−４２８頁（１９９１年）及びクコースカーラタヨ等（Kukowska−Latallo, et al.）、ジーンアンドデベロプメント（Genes and Development）、４巻、１２８８−１３０２頁（１９９０年）参照）。他の典型的フコシル基転移酵素としては、例えばα１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。酵素フコシル化はモリコーン等（Mollicone, et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Bioochem.）、１９１巻、１６９−１７６頁（１９９０年）又は米国特許５，３７４，６５５に記載の方法で実施できる。フコシル基転移酵素産生に用いる細胞としては又GDP―フコース合成用酵素系が挙げられる。
ガラクトシルトランスフェラーゼ
他グループの実施形態では糖転移酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。典型的ガラクトシルトランスフェラーゼとしてα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（E.C.No.2.4.1.151、例えばダブコウスキー等（Dabkowski, et al.）、トランスプラントプロシーディング（Transplant Proc.）、２５巻、２９２１頁（１９９３年）及び山本等（Yamamoto, et al.）、ネーチャー（Nature）、３４５巻、２２９−２３３頁（１９９０年）、ウシ（ジェンバンクｊ０４９８９、ジョジアッセ等（Joziasse, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６４巻、１４２９０−１３２９７頁（１９８９年））、マウス（ジェンバンクｍ２６９２５、ラーセン等（Larsen, et al.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc.. Nat'l. Acad. Sci. USA）、８６巻、８２２７−８２３１頁（１９８９年））、ブタ（ジェンバンクL３６１５２、ストラハン等（Strahan, et al.）、イムノジェネティック（Immunogenetics）、４１巻、１０１−１０５頁（１９９５年））が挙げられる。他の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは血液型B抗原合成に関与するものである（EC2.4.1.37、山本等（Yamamoto, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６５巻、１１４６−１１５１頁（１９９０年）（ヒト））。更なる典型的ガラクトシルトランスフェラーゼはコアGal―T1である。
該発明法での使用に適するものとしてはβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼがあり、例えばEC2.4.1.90（LacNAｃ合成酵素）及びEC2.4.1.22（乳糖合成酵素）（ウシ（ドゥアゴスタロ等（D'Agostaro, et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Bioochem.）、１８３巻、２１１―２１７頁（１９８９年））、ヒト（マッスリ等（Masri, et al.）、バイオキミバイオフィジクリサーチコミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１５７巻、６５７−６６３頁（１９８８年））、ブタ（中沢等（Nakazawa, et al.）、ジャーナルオブバイオケミストリー（J. Biochemi.）、１０４巻、１６５―１６８頁（１９８８年））、更にはE.C.2.4.1.38やセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（E.C.2.4.1.45、スタール等（Stahl, et al.）、ジャーナルオブニューロサイエンスリサーチ（J. Neurosci. Res.）、３８巻、２３４−２４２頁（１９９４年））が挙げられる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる（例えばシゾサッカロミセスポンベから、チャペル等（Chapell, et al.）、モレキュラーバイオロジーアンドセル（Mol. Biol. Cell.）、５巻、５１９−５２８頁（１９９４年））。
シアル酸転移酵素
シアル酸転移酵素は組み換え細胞と該発明の反応混合物に使用できる他形の糖転移酵素である。組み換えシアル酸転移酵素を産生する細胞は、又シアル酸転移酵素用のシアル酸供与体であるCMP―シアル酸を産生する。本発明での使用に適するシアル酸転移酵素の例としてはST3Gal III（例えばラット又はヒトのST3Gal III）、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST６Gal I、ST3Gal V、ST６Gal II、ST６GalNAｃI、 ST６GalNAｃII及びST６GalNAｃIIIが挙げられる（ここで用いたシアル酸転移酵素命名法は辻等（Tsuji, et al.）、グリコバイオロジー（Glycobiology）、６巻、ｖ−xiv（１９９６年）記載による）。α（２，３）シアル酸転移酵素（E.C.2.4.99.6）として引用の典型的α（２，３）シアル酸転移酵素は、シアル酸をGalβ１→３Glcジサッカロイド又はグリコシドの非還元性末端Galに転移する。バンデンアインデン等（Van den Eijnden, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５６巻、３１５９頁（１９８１年）；ワインシュタイン等（Weinstein, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５７巻、１３８４５頁（１９８２年）及びウエン等（Wen, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、２１０１１頁（１９９２年）参照。他の典型的α２，３―シアル酸転移酵素（E.C.2.4.99.4）はシアル酸を該ジサッカロイド又はグリコシドの非還元性末端Galに転移する。レアリック等（Rearick, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５４巻、４４４４頁（１９７９年）及びギレスピー等（Gillespie, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、２１００４頁（１９９２年）参照。更なる典型的酵素としてはGal−β―１，４−GlcNAｃα―２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（黒沢等（Kurosawa, et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、２１９巻、３７５−３８１頁（１９９４年））参照）。
好ましくは糖ペプチド炭水化物の糖修飾において、該シアル酸転移酵素は完全シアル酸付加水化物構造上の末端シアル酸の基礎である最も通常の最後から二番目の配列であるGalβ１，４GalcNAｃ配列にシアル酸を転移できる（表３参照）。
表３ 受容体基質としてGalβ１，４GalcNAｃ配列使用のシアル酸転移酵素
グーチー等（Goochee, et al.）、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、９巻、１３４７―１３５５頁（１９９１年）
山本等（Yamamoto, et al.）、ジャーナルオブバイオケミストリー（J. Biochem.）、１２０巻、１０４―１１０頁（１９９６年）。
ギルバート等（Gilbert, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻、２８２７１−２８２７６頁（１９９６年）
特許請求法で使用できるシアル酸転移酵素の例はＳＴ３ＧａｌＩＩであり、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ2.4.99.6）と呼ぶ。この酵素はシアル酸のＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃのＧａｌへの転移を触媒し、（例えばウエン等（Wen, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、２１０１１頁（１９９２年）；バンデンアインデン等（Van den Eijnden, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５６巻、３１５９頁（１９８１年）参照）、且つ糖ペプチドのアスパラギン連結オリゴ糖のシアル酸付加に関与する。該シアル酸は二つの糖間でα結合を形成してＧａｌと連結する。該糖類間の結合（連結）はＮｅｕＡｃの2位とＧａｌの3位間である。この特定酵素はラット肝臓（ワインシュタイン等（Weinstein, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５７巻、１３８４５頁（１９８２年））；ヒト相補ＤＮＡ（佐々木等（Sasaki, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６８巻、２２７８２−２２７８７頁（１９９３年））；北川及びポールソン（Kitagawa and Paulson）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、１３９４―１４０１頁（１９９４年））から単離でき、ゲノムＤＮＡ配列も知られており（北川等（Kitagawa, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻、９３１−９３８頁（１９９６年））、組み替え発現による本酵素産生を容易にする。好ましい実施形態では特許請求のシアリル酸付加法はラットＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩを用いる。
本発明で使用の他の典型的シアル酸転移酵素としては、該α（２，３）体を含むカンピロバクタージェジュニから単離したものが挙げられる。ＷＯ９９／４９０５１参照。
表３に挙げたもの以外のシアル酸転移酵素は、商業的に重要な糖ペプチドのシアル酸付加のための経済的且つ効率的な大規模プロセスで又使用できる。これら他酵素の有用性を知る簡単な試験として、種々量の各酵素（１−１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）をアシアロ−α１ＡＧＰ（１−１０ｍｇ／ｍｌ量で）と反応し、興味のシアル酸転移酵素の糖ペプチドのシアル酸付加能を、ウシＳＴ６Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩ又は両シアル酸転移酵素のそれと比較する。代わりにこの評価のためにペプチドバックボーンから酵素的に放出された他糖ペプチド、糖ペプチド又はＮ−連結オリゴ糖をアシアロ−α１ＡＧＰの代わりの用いても良い。ＳＴ６Ｇａｌ Ｉよりもより有効に糖ペプチドＮ−連結オリゴ糖にシアル酸付加できる能力を有するシアル酸転移酵素はペプチドのシアル酸付加の実際的な大量プロセスに有用である。
図２に本発明に使用の典型的シアル酸転移酵素のリストを提供する。
ＧａｌＮＡｃ転移酵素
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明の実施で特にＧａｌＮＡｃ成分をペプチドＯ−連結グリコシル化部位アミノ酸と結合するのに有用である。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは限定されないが、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（長田等（Nagata, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６７巻、１２０８２−１２０８９（１９９２年）及びスミス等（Smith, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、１５１６２（１９９４年））及びポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ホマ等（Homa, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６８巻、１２６０９（１９９３年））が挙げられる。
クローン化遺伝子の遺伝子操作による酵素ＧａｌＮＡｃＴＩ−ＸＸのようなタンパク質産生は知られている。例えば米国特許４，７６１，３７１参照。その一方法は十分量の試料収集に次いで、Ｎ−末端配列決定による該酵素アミノ酸配列の決定が含まれる。次いでこの情報を用いて全長（膜結合の）転移酵素のコード化相補ＤＮＡクローンを単離し、昆虫株細胞Ｓｆ９での発現により完全活性酵素合成をもたらす。次いで１６個の異なるタンパク質で既知グリコシル化部位を囲むアミノ酸の半定量的分析を用い、次いで合成ペプチドの試験管内グリコシル化を調べて該酵素の受容体特異性を決定する。この研究により特定アミノ酸残基がグリコシル化ペプチドセグメントで大きな比率を占め、且つグリコシル化セリン残基とスレオニン残基を囲む特定位の残基が、受容体効率に他アミノ酸成分よりより顕著に影響することが示された。
細胞結合糖転移酵素
他実施形態では該発明法に用いる酵素は細胞結合糖転移酵素である。多くの可溶性糖転移酵素が知られているが（例えば米国特許５，０３２，５１９参照）、糖転移酵素は通常細胞に付随した場合通常膜結合型となる。今まで研究された膜結合酵素の多くは、固有タンパク質と考えられている。即ち超音波処理により膜から放出されず、可溶化には界面活性剤が必要である。表面糖転移酵素が脊椎動物細胞と無脊椎動物細胞表面で同定され、これら表面転移酵素が生理条件下で触媒活性を維持することが認められた。しかし細胞表面糖転移酵素のより良く認知された機能は細胞間認識である（ロース（Roth）、超細胞レベル現象への分子的取り扱い法（Molecular Approaches to Supracellular Phenomena）、１９９０年）。
細胞発現による該糖転移酵素変形法が開発された。例えばラーセン等（Larsen, et al.）はプロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８６巻、８２２７−８２３１頁（１９８９年）に、細胞表面オリゴ糖構造とその同族糖転移酵素発現を決定するクローン化相補ＤＮＡ配列単離するための遺伝子的取り扱い法を報告している。ＵＤＰ―ガラクトースを発現することが知られているマウス株細胞で単離の伝令ＲＮＡ産生の相補ＤＮＡライブラリーにあるβ―Ｄ―ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチルーＤ−グルコサミニドα―１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼがＣＯＳ−１細胞に形質移入された。次いで該形質移入細胞を培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が定量された。
フランシスコ等（Francisco, et al.）はプロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８９巻、２７１３−２７１７頁（１９９２年）に大腸菌外面へのβ―ラクタム分解酵素固定法を開示している。（i）外膜タンパク質のシグナル配列、（ii）外膜タンパク質の膜貫通部分及び（iii）完全成熟β―ラクタム分解酵素配列からなる三者間融合を産生して、活性表面結合β―ラクタム分解酵素分子を生成した。しかしフランシスコ（Francisco）の方法は原核細胞系だけに限られ、著者が認めているように適切な機能化には完全な三者間融合が必要である。
スルホトラスフェラーゼ
又該発明により例えばヘパリン、硫酸ヘパラン、カラギーナン及び関連化合物のような硫酸化多糖類を含む硫酸化分子を含むペプチド産生法が提供される。適切なスルホトラスフェラーゼとしては、例えば、コンドロイチンー６―スルホトラスフェラーゼ（福田等（Fukuda, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７０巻、１８５７５―１８５８０頁（１９９５年）記載のニワトリ相補ＤＮＡ、ジェンバンク受入番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグリコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（ディクソン等（Dixon, et al.）、ジェノミックス（Genoics）、２６巻、２３９−２４１頁（１９９５年）；ＵＬ１８９１８）及びグリコサミノグリカンＮ−アセチルグリコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（オレヤーナ等（Oellana, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、２２７０−２２７６頁（１９９４年）及びエリクッソン等（Eriksson, et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、２６９巻、１０４３８―１０４４３頁（１９９４年）記載のマウス相補ＤＮＡ、ジェンバンク受入番号Ｕ２３０４記載のヒト相補ＤＮＡ）が挙げられる。
グリコシダーゼ
本発明は又野生型変異グリコシダーゼの使用を含む。変異β―ガラクトシダーゼ酵素がα―フッ化グリコシルとガラクトシル受容体分子との結合による二糖形成を触媒することが示された。（ウイザース（Withers）、米国特許６，２８４，４９４、２００１年９月４日公報）。本発明で用いる他のグリコシダーゼとしては例えば、β―グリコシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、β―マンノシダーゼ、β―アセチルグルコサミニダーゼ、β―Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β―キシロシダーゼ、β―フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α―グリコシダーゼ、α―ガラクトシダーゼ、α―マンノシダーゼ、α―Ｎ―アセチルグルコサミニダーゼ、α―Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α―キシロシダーゼ、α―フコシダーゼ及びノイラミニダーゼ／シアリダーゼが挙げられる。
固定化酵素
又本発明は固体及び／又は可溶担体に固定化した酵素の使用も提供する。典型的実施形態では該発明法に従い無傷グリコシルリンカーによりＰＥＧと複合化した糖転移酵素が提供される。該ＰＥＧ―リンカー−酵素複合物は任意に固体担体に付着しても良い。該発明法の固体サポート酵素を用いることで反応混合物処理と反応生成物精製は簡単化され、又該酵素回収を容易にする。該糖転移酵素複合物が該発明法に用いられる。酵素と担体の他の組み合わせは技術の熟知者には明らかである。
組み換え法によるグリコシル化
ＦＧＦペプチド複合物は又組み換え法により細胞内で産生しても良い。少なくとも一つの新規導入Ｎ―連結又はＯ―連結グリコシル化部位を含むＦＧＦコード化ポリヌクレオチド配列は、適切な宿主株細胞、例えば酵母菌、昆虫又は哺乳類起源由来の真核生物株化細胞に形質移入しても良い。このような株細胞で産生した線維芽細胞成長因子は該宿主細胞グリコシル化機構によりグリコシル化される。
ＦＧＦペプチド複合物の精製
上記プロセスで産生のＦＧＦペプチド複合物は好ましくは使用前に精製する。薄層クロマトグラフィや厚層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ又は膜濾過のような標準的既知技法が使用できる。膜濾過使用が好ましく、より好ましくは逆浸透膜又は、以下に検討し文献としてここに記載する一つ以上の回収用カラムクロマトグラフ法の使用である。
該ＦＧＦペプチド複合物が細胞内で産生する場合、第一段階で宿主細胞か溶解断片のいずれかの微粒子細片を、例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。任意に該タンパク質を市販のタンパク質濃縮用フィルターで濃縮し、次いで免疫親和性クロマトグラフィ、イオン交換カラム分別法（例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）上又はカルボキシメチル基又はスルホプロピル基含有充填材上で）、ブルーセファロース、ＣＭブルーセファロース、モノ−Ｑ（MONO−Q）、モノ−Ｓ（MONO−S）、レンチルレクチンセファロース、ＷＧＡセファロース、ＣｏｎＡセファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、ＳＰセファロース又はタンパク質Ａセファロース上のクロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィ、シリカクロマトグラフィ、等電点電気泳動逆相ＨＰＬＣ（例えば追加脂肪族を有するシリカゲル）、例えばセファデックス分子ふるいクロマトグラフィ又はサイズ排除クロマトグラフィを用いたゲル濾過法、該ポリペプチドと選択的に結合したカラムでのクロマトグラフィ及びエタノール又は硫安沈殿から選んだ一つ以上の方法により該ポリペプチド変異体を他不純物から分離する。
培養物中で産生のＦＧＦペプチド複合物は、通常細胞、細胞溶解物、培地などから初期抽出し、次いで１回以上の濃縮、塩析、水溶性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィ法で単離する。更に該糖タンパク質はアフィニティークロマトグラフィで精製しても良い。最後にＨＰＬＣを最終精製法に用いても良い。
プロテアーゼ阻害剤、例えばフッ化メチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）をタンパク質分解を阻害するために前述の方法の任意段階に含めても良く、抗生物質を外来混入物の成長を防ぐために含めても良い。
ある場合には該発明のＦＧＦペプチド複合物産生系の上澄みを、先ず市販の濃縮フィルター、例えばアミコン（Amicon）又はミリポアペリコン（Millipore Pellicon）限外濾過器を用いて濃縮する。濃縮段階に続いて該濃縮物を適切な精製充填材に添加しても良い。例えば適切な親和性充填材としては、該ペプチド用配位子、レクチン又は適切支持材に結合した抗体分子を含んでも良い。代わりに陰イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥペンダント基を有する充填材か基質を用いても良い。適切な充填材としては、例えばアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に通常用いられる他形式が挙げられる。又陽イオン交換法を用いても良い。適切な陽イオン交換体としてはスルホプロピル基やカルボキシメチル基含有の種々の不溶性充填材が挙げられる。スルホプロピル基が特に好ましい。
最後に疎水性逆相ＨＰＬＣ媒体、例えばメチル基ペンダント又はその他の脂肪族基ペンダントを有するシリカゲルを用いる一つ以上の逆相ＨＰＬＣを用いて、更にＦＧＦペプチド複合物を精製しても良い。前述の精製法の幾つか又は全てを種々組み合わして用いて糖タンパク質が得られる。
大規模発酵法で生成の該発明ＦＧＦペプチド複合物は、アーダル等（Urdal, et al.）、ジャーナルオブクロマトグラフィ（J. Chromatog.）、２９６巻、１７１頁（１９８４年）に開示の方法の類似法で精製できる。この文献では分取ＨＰＬＣカラム上での組み換えヒトインターロイキン（ＩＬ）−２精製のために、二つの逐次逆相ＨＰＬＣ法を記載している。代わりにアフィニテイークロマトグラフィのような技法を用いて該糖タンパク質を精製しても良い。
グルコシル化変異線維芽細胞成長因子の産生と、好ましくは精製に続いて、幾つかの技術的に知られた方法を用いて該糖タンパク質の生物学的機能を試験する。機能分析は線維芽細胞成長因子の種々の特性に基づく。
薬剤組成と投与
上記の所望オリゴ糖決定要因を有する該ＦＧＦペプチド複合物は、成長ホルモン欠如関連の種々の疾患及び状態治療用の治療剤として使用できる。本発明の該ＦＧＦペプチド複合物で治療可能な成長関連状態としては、小人症、小児及び成人の低身長、悪液質／筋肉疲労、一般的筋萎縮症及び性染色体異常（例えばターナー症候群）が挙げられる。本発明の該ＦＧＦペプチド複合物を用いて治療できる他状態としては、短腸症候群、脂肪萎縮症、骨粗鬆、尿毒症、やけど、女性不妊症、骨再生、一般的糖尿病、ＩＩ型糖尿病、変形性関節炎、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び不眠症が挙げられる。又該発明ＦＧＦペプチド複合物を用いて種々の治癒過程、例えば一般的組織再生、骨再生及び傷治癒を促進するのに用いるか、又はワクチン補助剤として用いる。従って本発明により又上記法により産生のＦＧＦペプチド複合物を有効量含有する薬剤組成が提供される。
該発明の薬剤組成は種々のドラッグデリバリーシステムでの使用に適する。本発明で用いる適切処方は、レミントン薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、マック出版社（Mack Publishing Company）、フィラデルフィア（Philadelphia）、ペンシルバニア（PA）、１７版（１９８５年）に見出される。ドラッグデリバリー法に関する簡単な概説に付いては、ランガー（Langer）、サイエンス（Science）、２４９巻、１５２７−１５３３頁（１９９０年）参照。
該薬剤組成は予防治療及び／又は治療処置のために、非経口投与、経鼻投与、局所投与、経口投与又は皮下注射のような局所投与、エアロゾル吸入又は経皮吸収を意図する。通常該薬剤組成は非経口的に、例えば皮下的又は静脈内に投与する。従って該発明により容認担体、好ましくは水溶性担体、例えば水、緩衝水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び類似物に溶解又は懸濁した該ＦＧＦペプチド複合物含有の非経口投与用組成が提供される。又該組成はツィーン（Tween）２０やツィーン８０のような界面活性剤、マニトール、ソルビトール、スクロース及びトレハロースのような安定剤及びＥＤＴＡやｍ−クレゾールのような防腐剤を含んでも良い。該組成は生理条件に近似するに必要なようにｐＨ調整剤と緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤及び類似物のような薬剤的容認助剤を含有しても良い。
これら組成は在来の減菌法により減菌するか無菌濾過しても良い。生成水溶液をそのまま使用するようにパッケージするか凍結乾燥しても良く、該凍結乾燥製剤は投与前に減菌水溶性担体と組み合わす。該製剤のｐＨは通常３乃至１１の間、より好ましくは５乃至９、最も好ましくは７乃至８である。
該ＦＧＦペプチド複合物含有組成は予防治療及び／又は治療処置のために投与できる。治療用途では既に成長ホルモン欠如関連疾患又は状態を被る患者で該疾患症状及びその合併症が治癒するか、少なくとも一部抑止するに十分な量を投与する。これを実現するに十分な量は“治療有効用量”と定義する。この使用に有効な量は該疾患又は状態の重症度及び該患者の体重と全身状態によるが、通常７０ｋｇ患者に対して一日に約０．１ｍｇ乃至２０００ｍｇのＦＧＦペプチド複合物範囲であり、より一般的にはその投与量は一日に該化合物約５ｍｇ乃至２００ｍｇである。
予防的用途では該発明のＦＧＦペプチド複合物含有組成は、特定疾患にかかりやすい患者、或いはさもなければ特定疾患のリスクのある患者に投与する。この量は“予防有効用量”と定義する。この用途では正確な量は再度患者の健康状態と体重に依存するが、通常７０ｋｇ患者につき約０．１ｍｇ乃至１０００ｍｇの範囲、より一般的には体重７０ｋｇ当たり約５ｍｇ乃至約２００ｍｇの範囲である。
該組成の１回又は複数回投与が診療医師が選択した用量とパターンで実施される。いずれにしても薬剤処方により患者を効果的に治療するに十分量の本発明ＦＧＦペプチド複合物を提供する必要がある。
実施例
以下の実施例は説明目的のためだけに提供され、限界目的のためではない。技術の熟知者には実質的に同一結果が得られるよう変形したり修正できる種々の重要でいないパラメーターが容易に認識できる。該法はFGF―２０とFGF―２１を参考にして例示するが、熟知者にはグリコシル化部位が他ＦＧＦ、例えばFGF―９とFGF―１８のペプチド配列に以下に示す方法で組み込めることが分かる。
線維芽細胞成長因子―２０配列情報
タンパク質の異なる領域を示す線維芽細胞成長因子―２０配列を表５に示す。該野生型FGF―２０はグリコシル化されていないと考えられ、治療剤として大腸菌で産生できる。該アミノ酸配列を以下の表４に示す。
表４ ヒト線維芽細胞成長因子―２０（SEQ ID NO:1）
MAPLAEVGGF LGGLEGLGQQ VGSHFLLPPA GERPPLLGER RSAAERSARG
GPGAAQLAHL HGILRRRQLY CRTGFHLQIL PDGSVQGTRQ DHSLFGILEF
ISVAVGLVSI RGVDSGLYLG MNDKGEL YGS EKLTSECIFR EQFEENWYNT
YSSNIYKHGD TGRRYFVALN KDGTPRDGAR SKRHQKFTHF LPRPVDPERV
PELYKDLLMY T
グリコシル化部位創生目的のための変異に適するFGF―２０領域を表５に示す。これらの領域は一領域が他領域に近接する場合には、ボールド体かイタリック体のいずれかで示す。
表５ 異なるタンパク質領域を示す野生型ヒトFGF―２０配列
線維芽細胞成長因子―２１配列情報
タンパク質の異なる領域を示す線維芽細胞成長因子―２１配列を表７に示す。該野生型FGF―２１はグリコシル化されていないと考えられ、治療剤として大腸菌で産生できる。該アミノ酸配列を以下の表６に示す。
表６ ヒト線維芽細胞成長因子―２１（SEQ ID NO:146）
MHP IPDSSPLLQF GGQVRQRYLY TDDAQQTEAH LEIREDGTVG
GAADQSPESL LQLKALKPGV IQILGVKTSR FLCQRPDGAL YGSLHFDPEA
CSFRELLLED GYNVYQSEAH GLPLHLPGNK SPHRDPAPRG PARFLPLPGL
PPALPEPPGI LAPQPPDVGS SDPLSMVGPS QGRASPSYAS
グリコシル化部位創生目的のための変異に適するFGF―２１領域を表７に示す。これらの領域は一領域が他領域に近接する場合にはボールド体かイタリック体のいずれかで示す。
表７ 異なるタンパク質領域を示す野生型ヒトFGF―２１配列
ＦＧＦ又は変異ＦＧＦがグリコシル化されるか又は複合糖質化される（ここに文献として組み入れたＷＯ０３／３１４６４参照）。好ましくは変異ＦＧＦは糖ペグ化され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分はグリコシル結合により該変異ＦＧＦポリペプチドと複合化する（ここに文献として組み入れたＷＯ０３／３１４６４参照）。該ＦＧＦの糖ペグ化により期待されるように限定はされないが、改良半減期、改良曲線下面積（ＡＵＣ）値、クリアランスの低減及び免疫原性の低減を含む生物物理的物性の改善をもたらす。
実施例１
変異によるグリコシル化部位導入に適したFGF―２０の典型的領域を上記の表５に示す。全ての場合でＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ）は任意の変異体に存在しても不在でも良い。該アミノ酸残基の番号付けは最初の非修飾配列に基づき、一番左の残基であるメチオニンを１位と番号付けする。該変異配列が非修飾配列に比して如何に異なるかを強調するために、該配列下に表される非修飾アミノ酸の番号付けは修飾後も変わらないままである。本発明のＦＧＦ変異体は一つより多い記載配列で修飾される。具体的には野生型ペプチドに存在しない一つ又は複数のグリコシル化部位創生で変異を導入するための好ましい領域は、コード化ヌクレオチド配列で、野生型ＦＧＦアミノ酸配列（表５参照）のアミノ酸１−７（領域1；SEQ ID NO:2）、アミノ酸２０−４２（領域２；SEQ ID NO:3）、アミノ酸４３−６０（領域３；SEQ ID NO:4）、アミノ酸７３−９０（領域４；SEQ ID NO:5）、アミノ酸１５９−１７４（領域５；SEQ ID NO:6）、アミノ酸１７７−１９８（領域６；SEQ ID NO:7）又はアミノ酸１９９−２０１（領域７；SEQ ID NO:8）は変異でき、その結果Ｎ−連結又はO−連結グリコシル化部位のいずれかが生成変異FGF―２０ポリペプチドに導入される。
以下の例でＮ−連結グリコシル化部位、例えばアスパラギン残基及びO−連結グリコシル化部位、例えばセリン又はスレオニン残基を、野生型線維芽細胞成長因子―２０配列又はその任意の修飾バージョンの好ましくはプロリン含有部位に導入するアミノ酸配列変異について記載する。
１．領域１
領域１変異体では、野生型FGF―２０のMAP3LAEV；SEQ ID NO:2のＮ端末がMXYaZbP3BJO1234で置換され、ここで１，２，３，４，Ｘ，Ｙ、Ｚ，Ｂ，Ｊ及びＯは任意の非荷電アミノ酸かグルタミン酸（Ｅ）から独立に選び、少なくとも一つはスレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ用基質であり、ＧａｌＮＡｃはＯ−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。記号aとｂは独立に０又は１を表す。明確のためにSEQ ID NO:12−14、338−344と指定した配列は、未変性FGF―２０配列のＰ３とＬ４間のアミノ酸挿入物を含有する。好ましい例としては以下が挙げられる。
MAPTP3LAEV; SEQ ID NO:9
MVTP3LAEV; SEQ ID NO:10
MAP3TTEV; SEQ ID NO:11
MAP3TQGAMPL4AEV; SEQ ID NO:12
MAP3 TSSL4AEV; SEQ ID NO:13
MAP3 TALPL4AEV; SEQ ID NO:14
MAP3 TQAPL4AEV; SEQ ID NO:338
MAP3 TEIPL4AEV; SEQ ID NO:339
MAP3 TINTPL4AEV; SEQ ID NO:340
MAP3 TINTL4AEV; SEQ ID NO:341
MAP3 TTVSL4AEV; SEQ ID NO:342
MAP3 TQEVL4AEV; SEQ ID NO:343
MAP3 TQAVL4AEV; SEQ ID NO:344
２．領域２
これらの変異体では野生型QVGSHFLLP28P29A30GERPPLLGERRS; SEQ ID NO:3は領域２（a）VGSHFLLP28P29A30GERPP, SEQ ID NO:15、領域２（ｂ） P28P29AGERPP, SEQ ID NO:16及び領域２（ｃ） P34P35PLLGERRS, SEQ ID NO: 17の三領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域２（a）：これら変異体では野生型VGSHFLLP28P29A30GERPP（SEQ ID NO:15）は1234XYZP28P29A30で置換され、ここで１，２，３，４，Ｘ、Ｙ、Ｚは独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮａｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。記号a及びｂは独立に０又は１である。好ましい変異として以下が挙げられる。
TETP28P29A30GERPP; SEQ ID NO:18
GTETP28P29A30GERPP; SEQ ID NO:19
VGTETP28P29A30GERPP; SEQ ID NO:20
TGTP28P29AEERPP; SEQ ID NO:21
TATP28P29AEERPP; SEQ ID NO:22
領域２（ｂ）：これら変異体では野生型P28P29A30GERPP（SEQ ID NO:16）はP28P291234(5)aPPで置換され、ここで１，２，３，４，Ｘ、Ｙ、Ｚは領域２（a）で記載したとおりである。好ましい変異として以下が挙げられる。
P28P29TGEAPP; SEQ ID NO:23
P28P29TGEVPP; SEQ ID NO:24
P28P29TQGAPP; SEQ ID NO:25
P28P29ATVAPP; SEQ ID NO:26
P28P29ATILPP; SEQ ID NO:27
P28P29AGTAPP; SEQ ID NO:28
P28P29TQGAMPP; SEQ ID NO:29
P28P29GSTAPP; SEQ ID NO:30
P28P29AGTSPP; SEQ ID NO:31
P28P29AGETPP; SEQ ID NO:32
P28P29ATETPP; SEQ ID NO:33
P28P29GTETPP; SEQ ID NO:34
P28P29TGERPP; SEQ ID NO:35
P28P29TINTPP; SEQ ID NO:345
P28P29TTVSPP; SEQ ID NO:346
P28P29TQALPP; SEQ ID NO:347
領域２（ｃ）：これら変異体では野生型P34P3PLLGERRS（SEQ ID NO:17）はP34P35123456で置換され、ここで１，２，３，４，５，６は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮａｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
P34P35TQGAMP; SEQ ID NO:36
P34P35TQGAMRS; SEQ ID NO:37
P34P35TQGAMAS; SEQ ID NO:38
P34P35TQGAMFS; SEQ ID NO:39
P34P35TSSSTRS; SEQ ID NO:40
P34P35TSSSTKS; SEQ ID NO:41
P34P35TGERRS; SEQ ID NO:42
P34P35TTGVRRS; SEQ ID NO:43
P34P35TTGEARS; SEQ ID NO:44
P34P35TAGERRS; SEQ ID NO:45
P34P35TINTRRS; SEQ ID NO:348
P34P35TTVSRRS; SEQ ID NO:349
３．領域３
これら変異体ではP52前後のアミノ酸配列、 AAERSARGGP52GAAQLAHL; SEQ ID NO:4が領域３（a） RSARGGP52; SEQ ID NO:46 と領域３（ｂ）P52GAAQLA, SEQ ID NO:47の二領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域３（a）：これら変異体では野生型RSARGGP52（SEQ ID NO:46）は123456P52で置換され、ここで１，２，３，４，５，６は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮAｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
RSATETP52; SEQ ID NO:48
RSGTETP52; SEQ ID NO:49
RSGTETP52; SEQ ID NO:50
RVGTETP52; SEQ ID NO:51
GVGTETP52; SEQ ID NO:52
GSATETP52; SEQ ID NO:53
GVGVTETP52; SEQ ID NO:54
GVTETP52; SEQ ID NO:55
QTELP52; SEQ ID NO:56
GVTSAP52; SEQ ID NO:57
SVVTP52; SEQ ID NO:58
領域３（ｂ）：これら変異体では野生型P52GAAQLA（SEQ ID NO:47）はP52123456で置換され、ここで１，２，３，４，５，６は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮＡｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
P52TGAQLA; SEQ ID NO:59
P52TQGAMP; SEQ ID NO:60
P52TQGAMA; SEQ ID NO:61
P52TTAQLA; SEQ ID NO:62
P52GATQLA; SEQ ID NO:63
P52TSSSTA; SEQ ID NO:64
P52TSSSLA; SEQ ID NO:65
P52TINTLA; SEQ ID NO:350
P52TTVSLA; SEQ ID NO:351
P52TQAQLA; SEQ ID NO:352
４．領域４
これらの変異体では野生型TGFHLQILP81DGSVQGTRQ; SEQ ID NO:5は領域4（a）HLQILP81, SEQ ID NO:66、領域４（ｂ） P81DGSVQGT, SEQ ID NO:67及び領域４（ｃ） P81NGS, SEQ ID NO: 68の三領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域４（a）：これら変異体では野生型HLQILP81（SEQ ID NO:66）は12345P81で置換され、ここで１，２，３，４，５は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮＡｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
QTELP81; SEQ ID NO:69
LIVTP81; SEQ ID NO:70
LTELP81; SEQ ID NO:71
LTELP81; SEQ ID NO:72
GVTSAP81; SEQ ID NO:73
HLTETP81; SEQ ID NO:74
VLTETP81; SEQ ID NO:75
VGTETP81; SEQ ID NO:76
VGVGTETP81; SEQ ID NO:77
VTSAP81; SEQ ID NO:78
VSTP81; SEQ ID NO:79
EATP81; SEQ ID NO:80
領域４（ｂ）：これら変異体では野生型P81DGSVQGT（SEQ ID NO:67）はP8112345GTで置換され、ここで１，２，３，４，５は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮＡｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
P81TGSVGT; SEQ ID NO:81
P81TQGVQGT; SEQ ID NO:82
P81TGSVGPGT; SEQ ID NO:83
P81TQGAMPGT; SEQ ID NO:84
P81TTSVQGT; SEQ ID NO:85
P81TTAVQGT; SEQ ID NO:86
P81TINTQGT; SEQ ID NO:353
P81TTVSQGT; SEQ ID NO:354
領域４（ｃ）：これら変異体では野生型P81DGS（SEQ ID NO:68）は変異されてＮ−連結グリコシル化部位を創生する。好ましい例としては以下が挙げられる。
IL P81NGSVH; SEQ ID NO:87
IF P81NGSV; SEQ ID NO:88
P81NGT; SEQ ID NO:89
L P81NGTVH; SEQ ID NO:90
P81NGTV; SEQ ID NO:91
IL P81NGT; SEQ ID NO:92
QIL P81NGT; SEQ ID NO:93
QIL P81NGTVH; SEQ ID NO:94
５．領域５
これら変異体では野生型LN KDGTP175RDGAR SKRH, SEQ ID NO:6は12345P17567891011で置換され、ここで１，２，３，４，５、６，７，８，９，１０，１１は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧＡｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮａｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
LNVTET P175RDGARSKRH; SEQ ID NO:95
LNVTET P175DDGARSKRH; SEQ ID NO:96
LNVTET P175LDGARSKRH; SEQ ID NO:97
LNAITT P175RDGARSKRH; SEQ ID NO:98
LNAITT P175LDGARSKRH; SEQ ID NO:99
LNQEAT P175LDGARSKRH; SEQ ID NO:100
LNQTEL P175LDGARSKRH; SEQ ID NO:101
LNQTEL P175ADGARSKRH; SEQ ID NO:102
LNKDGT P175TDGARSKRH; SEQ ID NO:103
LNKDGT P175TSGARSKRH; SEQ ID NO:104
LNKDGT P175TDGAASKRH; SEQ ID NO:105
LNKDGT P175TSGAASKRH; SEQ ID NO:106
LNKDGT P175TQGAMPKRH; SEQ ID NO:107
LNKDGT P175TQGAMSKRH; SEQ ID NO:108
LNKDGT P175TTTARSKRH; SEQ ID NO:109
LN KDGTP175TINTRSKRH; SEQ ID NO:355
LN KDGTP175TINTSSKRH; SEQ ID NO:356
LN KDGTP175TTVSRSKRH; SEQ ID NO:357
LN KDGTP175TTVSASKRH; SEQ ID NO:358
６．領域６
これらの変異体では野生型配列FTHFL P192RPVD P197ERVP201ELYKDLL; SEQ ID NO:7は領域６（a）LP192RPVD P197ERV P201ELYKD; SEQ ID NO:110及び領域６（ｂ） P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:111の二領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域６（a）：領域６（a）ではこれら野生型LP192RPVD P197ERVP201ELYKD（SEQ ID NO:110）はP1921P23P197で置換され、ここで１，２，３は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮＡｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
LP192APTD P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:112
LP192NPTA P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:113
LP192RPTA P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:114
LP192APTQ P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:115
LP192TPVD P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:116
LP192TPSD P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:117
LP192VPTD P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:118
LP192TPAD P197ERVP201ELYKD; SEQ ID NO:119
領域６（ｂ）：領域６（ｂ）ではこれら野生型P197ERVP201ELYKD（SEQ ID NO:111）はP197123P20145678で置換され、ここで１，２，３、４、５、６、７、８は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮａｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。好ましい変異として以下が挙げられる。
P197TAS P201ELYKD; SEQ ID NO:120
P197TAS P201ALYKD; SEQ ID NO:121
P197NTL P201ELYKD; SEQ ID NO:122
P197ETV P201ELYKD; SEQ ID NO:123
P197QET P201ELYKD; SEQ ID NO:124
P197TQG P201ELYKD; SEQ ID NO:125
P197TQG P201ALYKD; SEQ ID NO:126
P197QGT P201ALYKD; SEQ ID NO:127
P197ATE P201ELYKD; SEQ ID NO:128
P197TTQ P201ELYKD; SEQ ID NO:129
P197TTE P201ELYKD; SEQ ID NO:130
P197ERVP201TLYKD; SEQ ID NO:131
P197ERVP201TLYAD; SEQ ID NO:132
P197ERVP201TQGAD; SEQ ID NO:133
P197ERVP201TQGAMP; SEQ ID NO:134
P197ERVP201TQGA; SEQ ID NO:135
P197TQAP201ELYKD; SEQ ID NO:359
P197TEIP201ELYKD; SEQ ID NO:360
７．領域７
これら変異体では野生型L208MY T211（SEQ ID NO:8）は123(4)a(5)b(6)c(x)で置換され、ここで１，２，３，４，５は独立に任意の非荷電アミノ酸又はグルタミン酸（Ｅ）から選択し、少なくともその一つはスレオニン（Ｔ）かセリン（Ｓ）であり、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧａｌＮＡｃはO−連結グリコシル化部位創生のために少なくともスレオニン又はセリンに付加する。記号a、ｂ及びｃは独立に０又は１を表し、(x)は水酸基、アミノ基、グリシン、アラニン、ロイシン及びアスパラギンから選ぶ。好ましい変異として以下が挙げられる。
L208MY T211P(x); SEQ ID NO:136
L208TE T211P(x); SEQ ID NO:137
VTE T211P(x); SEQ ID NO:138
GVTE T211PL(x); SEQ ID NO:139
PELYVGVTC T211PL(x); SEQ ID NO:140
L208MY T211(x); SEQ ID NO:141
L208MY T211PTASP; SEQ ID NO:142
L208MY T211PATEP; SEQ ID NO:143
L208MY T211PTP(x); SEQ ID NO:144
L208MY T211PTAP(x); SEQ ID NO:145
アミノ酸残基の番号付けは初期非修飾配列に基づき、大部分のＮ末端残基が１番となる。非修飾アミノ酸の番号付けは修飾後も不変のままである。上述配列の一つより多くが本発明のＦＧＦ変異体に存在する。
実施例２
実施例１に開示の一つの見込みあるO−連結グリコシル化部位を有するFGF―２０ペプチドライブラリーは大腸菌で発現されるか、又は試験管内翻訳法を用いて発現される。タンパク質はヘパリン結合かＩＭＡＣ捕獲法のいずれかを用いて精製し、試験管内生物活性を試験する。試験管内活性を保持するこれらタンパク質配列を糖ペグ化用受容体として試験する。糖ペグ化FGF―２０（４０キロダルトン、分岐型）を上に概説したように更に生物学的評価のために精製する。
実施例３
変異によるグリコシル化部位導入に適したFGF―２１の典型的領域を上の表７に示す。全ての場合でＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ）は任意のＦＧＦ変異体に存在しても不在でも良い。該アミノ酸残基の番号付けは最初の非修飾配列に基づき、一番左の残基であるメチオニンが１位と番号付けする。該変異配列が非修飾配列に比して如何に異なるかを強調するために、該配列下に表される非修飾アミノ酸の番号付けが修飾後も変わらない。本発明のＦＧＦ変異体は一つより多い記載配列で修飾される。具体的には野生型ペプチドに存在しない一つ又は複数のグリコシル化部位創生で変異を導入すのに好ましい領域は、コード化ヌクレオチド配列で、野生型FGF―２１アミノ酸配列（表７参照）のアミノ酸１−８（領域1；SEQ ID NO:147）、アミノ酸９−１３（領域２；SEQ ID NO:148）、アミノ酸４６−５４（領域３；SEQ ID NO:149）、アミノ酸６０―６５（領域４；SEQ ID NO:150）、アミノ酸７８−８３（領域５；SEQ ID NO:151）、アミノ酸８６−９１（領域６；SEQ ID NO:152）又はアミノ酸１１２−１４１（領域７；SEQ ID NO:153）アミノ酸１４９−１５７（領域８；SEQ ID NO:154）アミノ酸１６０−１６６（領域９；SEQ ID NO:155）アミノ酸１６７−１７２（領域１０；SEQ ID NO:156）アミノ酸１７３−１８２（領域１１；SEQ ID NO:157）は変異でき、その結果Ｎ−連結又はO−連結グリコシル化部位のいずれかが生成変異FGF―２１ポリペプチドに導入される。
以下の例でＮ−連結グリコシル化部位、例えばアスパラギン残基及びO−連結グリコシル化部位、例えばセリン又はスレオニン残基を、野生型線維芽細胞成長因子―２１配列又はその任意の修飾バージョンの好ましくはプロリン含有部位に導入するアミノ酸配列変異について記載する。
１．領域１
領域１変異体では野生型FGF―２１のM1HPIPDSS（SEQ ID NO:147）のＮ末端は領域１（a）M1HP3（SEQ ID NO:158）、領域１（ｂ）M1HPIP（SEQ ID NO:159）及び領域１（ｃ） P5DSS（SEQ ID NO:160）の三領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域１（a）：これら変異体で野生型M1HP3（SEQ ID NO:158）はM1XnBoOrJqP3で置換され、ここでＢ，Ｏ、Ｊは独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｘは任意の非荷電アミノ酸又はヒスチジン（Ｈ）であり、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、o、ｐ、ｑ、ｒは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
M1VTP3 SEQ ID NO:161
M1QTP3 SEQ ID NO:162
M1ATTP3 SEQ ID NO:163
M1IATP3 SEQ ID NO:164
領域１（ｂ）：これら変異体で野生型M1HPIP（SEQ ID NO:159）はM1XnPBoPで置換され、ここでＢは独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｘは任意の非荷電アミノ酸又はヒスチジン（Ｈ）であり、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
M1FPTP SEQ ID NO:165
M1HPTPSEQ ID NO:166
M1APTPSEQ ID NO:167
M1FPSP SEQ ID NO:168
M1HPSPSEQ ID NO:169
M1APSPSEQ ID NO:170
M1SPTP SEQ ID NO:171
領域１（ｃ）：これら変異体で野生型P5DSS（SEQ ID NO:160）はP5BoOrJqで置換され、ここでＢ、Ｏ、Ｊは独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号o、ｑ、ｒは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
P5TSS; SEQ ID NO:172
P5TQA; SEQ ID NO:173
P5TAQ; SEQ ID NO:174
P5TIE; SEQ ID NO:175
P5SSS; SEQ ID NO:176
２．領域２
これら変異体で野生型P9L10LQF（SEQ ID NO:148）はP9JqXnOrUsで置換され、ここでＸ，Ｊ、Ｏ、Ｕは独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｑ、ｎ、ｒ、ｓは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
P9P10TQF; SEQ ID NO:177
P9P10INT; SEQ ID NO:178
P9P10QGA; SEQ ID NO:179
P9P10QGF; SEQ ID NO:180
P9P10TVS; SEQ ID NO:181
P9P10QAF; SEQ ID NO:182
３．領域３
これら変異体で野生型ADQSP50ESLL（SEQ ID NO:149）は1tφZmBo P50Jq XnOrUs
で置換され、ここでφ、Ｚ，Ｘ，Ｂ，Ｊ、Ｏ、Ｕ、１，２、３は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｚ又はＪは独立にグルタミン酸（Ｅ）から選び、２とＸは独立にリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）として選び、且つ少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｍ、ｎ、o、ｑ、ｒ、ｓ、ｔは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
ADQSP50TSLL; SEQ ID NO:183
ADQSP50TTVS; SEQ ID NO:184
ADQSP50TINT; SEQ ID NO:185
ADQSP50TQAL; SEQ ID NO:186
ADQSP50TQGA; SEQ ID NO:187
ADQSP50TQAL; SEQ ID NO:188
ATQSP50ESLL; SEQ ID NO:189
ATESP50ESLL; SEQ ID NO:190
ATETP50ESLL; SEQ ID NO:191
VTQSP50ESLL; SEQ ID NO:192
VTETP50ESLL; SEQ ID NO:193
ATESP50ASLL; SEQ ID NO:194
４．領域４
これら変異体で野生型KP61GVIQ（SEQ ID NO:150）はBoP61JqXnOrUsで置換され、ここでＢはリシン（Ｋ）又は任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｘ，Ｊ、Ｏ、Ｕは独立に任意の非荷電アミノ酸から選び、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、o、ｑ、ｒ、ｓは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
SP61TVIQ; SEQ ID NO:195
AP61TVIQ; SEQ ID NO:196
SP61TTVS; SEQ ID NO:197
SP61TINT; SEQ ID NO:198
SP61TQAQ; SEQ ID NO:199
SP61TQGA; SEQ ID NO:200
SP61TVIA; SEQ ID NO:201
SP61TTVS; SEQ ID NO:202
SP61TINT; SEQ ID NO:203
５．領域５
これら変異体で野生型RP79DGAL（SEQ ID NO:151）はBoP79Jq XnOrUsで置換され、ここでＸ、Ｂ、Ｊ、Ｏ、Ｕは独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｂは独立にリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選んでも良く、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、o、ｑ、ｒ、ｓは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
SP79TGAL; SEQ ID NO:204
AP79TGAL; SEQ ID NO:205
SP79TINT; SEQ ID NO:206
SP79TTVS; SEQ ID NO:207
SP79TQAL; SEQ ID NO:209
SP79TQGA; SEQ ID NO:210
SP79TQGAM; SEQ ID NO:211
６．領域６
これら変異体では野生型SLHFDP91（SEQ ID NO:152）は21φtZmBoP91で置換され、ここでφ、Ｚ、Ｂ、１，２は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｍ、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
SLTFTP91; SEQ ID NO:212
SLTETP91; SEQ ID NO:213
SVTETP91; SEQ ID NO:213
７．領域７
これら変異体では野生型A112HGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLP（SEQ ID NO:153）は領域７（a）AHGLP116LHLP120（SEQ ID NO:215）、領域7（ｂ）HLP120GNKSP125HR（SEQ ID NO:216）、領域７（ｃ）KSP125HRDP129APR（SEQ ID NO:217）、領域７（ｄ）RGP134ARFLP139LP（SEQ ID NO:218）及び領域７（e）RGP134ARFLP139LP（SEQ ID NO:219）の五領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域７（a）：これら変異体では野生型AHGLP116LHLP120（SEQ ID NO:215）は1tφZmBoP116 JqXnOrP120で置換され、ここで１，φ、Ｚ、Ｂ、Ｊ、Ｏは独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｍ、o、ｑ、ｎ、ｒは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
ATGTP116LHLP120 SEQ ID NO:220
ATETP116LHLP120 SEQ ID NO:221
VTETP116LHLP120 SEQ ID NO:222
VTGLP116LHLP120 SEQ ID NO:223
ATGLP116LHLP120 SEQ ID NO:224
AHGLP116TQAP120 SEQ ID NO:225
AHGLP116TAQP120 SEQ ID NO:226
AHGLP116TEIP120 SEQ ID NO:227
AHGL;P116TSSP120 SEQ ID NO:228
AHGLP116TALP120 SEQ ID NO:229
ASGLP116TQAP120 SEQ ID NO:230
ASGLP116TEIP120 SEQ ID NO:231
領域７（ｂ）：これら変異体では野生型HLP120GNKSP125HR（SEQ ID NO:216）は1tLP120XnOrUs2aP125BoJqで置換され、ここでＸ、Ｂ、Ｊ、Ｏ、Ｕ、１，２は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｂ，Ｊ、１は独立にヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選び、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｎ、ｒ、ｓ、a、o、ｑは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
HLP120TTAVP125HR; SEQ ID NO:232
HLP120TSGEP125HR; SEQ ID NO:233
HLP120GSTAP125HR; SEQ ID NO:234
HLP120GNTSP125HR; SEQ ID NO:235
HLP120GTESP125HR; SEQ ID NO:236
HLP120LTQTP125HR; SEQ ID NO:237
HLP120GTQTP125HR; SEQ ID NO:238
HLP120LTQTP125AR; SEQ ID NO:239
HLP120TNASP125HR; SEQ ID NO:240
HLP120TQGSP125HR; SEQ ID NO:241
HLP120VTSQP125HR; SEQ ID NO:242
HLP120TINTP125HR; SEQ ID NO:243
HLP120TSVSP125HR; SEQ ID NO:244
領域７（ｃ）：これら変異体では野生型KSP125HRDP129APR（SEQ ID NO:217）は1tSP 125XnOrUsP129BoP Jqで置換され、ここでＢ、Ｕ，１は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｘ、Ｏ、Ｊは独立に任意の非荷電アミノ酸、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選び、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｎ、ｒ、ｓ、o、ｑは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
KSP125TAQP129APR; SEQ ID NO:245
KSP125TADP129APR; SEQ ID NO:246
ASP125TAQP129APR; SEQ ID NO:247
SSP125TADP129APR; SEQ ID NO:248
KSP125TSDP129APR; SEQ ID NO:249
KSP125TEIP129APR; SEQ ID NO:250
KSP125TEIP129APR; SEQ ID NO:251
KSP125TEDP129APR; SEQ ID NO:252
ASP125TEDP129APR; SEQ ID NO:253
SSP125TADP129APR; SEQ ID NO:254
SSP125TAQP129APR; SEQ ID NO:255
KSP125TQAP129APR; SEQ ID NO:256
SSP125TQAP129APR; SEQ ID NO:257
ASP125TEIP129APR; SEQ ID NO:258
KSP125HRDP129TPR; SEQ ID NO:259
KSP125HRDP129SPR; SEQ ID NO:260
KSP125HRDP129TPA; SEQ ID NO:261
KSP125HRDP129TPS; SEQ ID NO:262
KSP125HSDP129TPA; SEQ ID NO:263
KSP125HADP129TPS; SEQ ID NO:264
KSP125HADP129TPA; SEQ ID NO:265
領域７（ｄ）：これら変異体では野生型RGP134ARFLP139LP（SEQ ID NO:218）は1tGP 134XnOrUs2aP139BoPで置換され、ここでＸ、Ｂ、Ｏ、Ｕ，１、２は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｏ、１は独立にリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選び、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｎ、ｒ、ｓ、a、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
RGP134TSFLP139LP; SEQ ID NO:266
RGP134TSGEP139LP; SEQ ID NO:267
RGP134GSTAP139LP; SEQ ID NO:268
RGP134ANTSP139LP; SEQ ID NO:269
RGP134ATESP139LP; SEQ ID NO:270
RGP134ATQTP139LP; SEQ ID NO:271
RGP134ATQTP139LP; SEQ ID NO:272
RGP134LTQTP139LP; SEQ ID NO:273
RGP134TQFLP139LP; SEQ ID NO:274
RGP134TSFLP139LP; SEQ ID NO:275
RGP134VTSQP139LP; SEQ ID NO:276
SGP134TSFLP139LP; SEQ ID NO:277
AGP134TSGEP139LP; SEQ ID NO:278
SGP134TSALP139LP; SEQ ID NO:279
領域７（e）：これら変異体では野生型RGP134ARFLP139LP（SEQ ID NO:219）は1tGP 134XnOrUs2aP139BoPで置換され、ここでＸ、Ｂ、Ｏ、Ｕ，１、２は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、Ｏ、１は独立にリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選び、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮAc
転移酵素用基質であり、ＧあｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｔ、ｎ、ｒ、ｓ、a、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
RGP134ARFLP139TP; SEQ ID NO:280
RGP134ARFLP139SP; SEQ ID NO:281
RGP134ASFLP139TP; SEQ ID NO:282
８．領域８
これら変異体では野生型EPP151GILAP156Q（SEQ ID NO:154）はBoPP151XnOrUs2aP1561tで置換され、ここでＢ，Ｘ．Ｏ、Ｕ，２，１は独立に任意の非荷電アミノ酸から選択し、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号o、ｎ、ｒ、ｓ、a、ｔは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
TPP151GILAP156Q; SEQ ID NO:283
SPP151GILAP156Q; SEQ ID NO:284
EPP151TILAP156Q; SEQ ID NO:285
EPP151TTLAP156Q; SEQ ID NO:286
EPP151TQLAP156Q; SEQ ID NO:287
EPP151TQGAP156Q; SEQ ID NO:288
EPP151TSGEP156Q; SEQ ID NO:289
EPP151GSTAP156Q; SEQ ID NO:290
EPP151TTAVP156Q; SEQ ID NO:291
EPP151GNTSP156Q; SEQ ID NO:292
EPP151GTESP156Q; SEQ ID NO:293
EPP151GTETP156Q; SEQ ID NO:294
EPP151VTSQP156Q; SEQ ID NO:295
EPP151AVQTP156Q; SEQ ID NO:296
EPP151LTQTP156Q; SEQ ID NO:297
EPP151VTSQP156Q; SEQ ID NO:298
EPP151SSGAP156Q; SEQ ID NO:299
EPP151TINTP156Q; SEQ ID NO:300
EPP151TTVSP156Q; SEQ ID NO:301
EPP151TQAAP156Q; SEQ ID NO:302
EPP151GILAP156T; SEQ ID NO:303
EPP151GILAP156S; SEQ ID NO:304
９．領域９
これら変異体では野生型DVGSSDP166（SEQ ID NO:155）はXnOrUs2aBoZmP166で置換され、ここでＺ，Ｘ、Ｂ、Ｏ、Ｕ，２は独立に任意の非荷電アミノ酸、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択し、少なくとも一つはＴ又はＳであり且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、ｒ、ｓ、a、o、ｍは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
TVGSSDP166; SEQ ID NO:305
DVGSSTP166; SEQ ID NO:306
DVGTETP166; SEQ ID NO:307
DAASAAP166; SEQ ID NO:308
DAATAAP166; SEQ ID NO:309
DVGTSDP166; SEQ ID NO:310
DVATSDP166; SEQ ID NO:311
TGDSSDP166; SEQ ID NO:312
TDASGAP166; SEQ ID NO:313
DVGTSGP166; SEQ ID NO:314
１０．領域１０
これら変異体では野生型LSMVGP172（SEQ ID NO:156）はXnOrUs2aBoP172で置換され、ここでＢ、Ｏ、Ｕ，２は独立に任意の非荷電アミノ酸、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択し、少なくともＸはＴ又はＳのいずれかを選び且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、ｒ、ｓ、a、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
TSMVGP; SEQ ID NO:315
TSGVGP; SEQ ID NO:316
TSGAMP; SEQ ID NO:317
TQGAMP; SEQ ID NO:318
TSMVGP; SEQ ID NO:319
TQGAMP; SEQ ID NO:320
１１．領域１１
これら変異体では野生型SQGRSP178SYAS（SEQ ID NO:157）は領域１１（a）SQGRSP178 （SEQ ID NO:321）とカルボキシル末端領域１１（ｂ）RSP178SYAS（SEQ ID NO:322）の二領域に再分割される。各領域での変異を以下に別々に考察する。
領域１１（a）：これら変異体では野生型SQGRSP178（SEQ ID NO:321）はXnOrUs2aBoP178で置換され、ここでＢ、Ｏ、Ｕ，２は独立に任意の非荷電アミノ酸、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択し、少なくともＸはＴ又はＳのいずれかを選び且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、ｒ、ｓ、a、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
SQGASP178; SEQ ID NO:323
TQGASP178; SEQ ID NO:324
TQGAMP178; SEQ ID NO:325
TQGAMp178; SEQ ID NO:326
領域１１（ｂ）：これら変異体では野生型カルボキシル末端RSP178SYAS（SEQ ID NO:322）はZSP178XnOrUs1Bo23で置換され、ここでＺ，Ｘ，Ｂ、Ｏ、Ｕ，１，２、３は独立に任意の非荷電アミノ酸、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択し、少なくともＸはＴ又はＳのいずれかを選び、Ｚは独立にアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）で選んでも良く、且つＧａｌＮＡｃ転移酵素用基質であり、ＧaｌＮＡｃは少なくともＴ又はＳに付加する。記号ｎ、ｒ、ｓ、oは独立に０−３を表す。好ましい変異は以下に挙げられる。
ASP178SYAS; SEQ ID NO:327
RSP178TSAVAA; SEQ ID NO:328
ASP178TSAVAA; SEQ ID NO:329
ASP178SSGAPPPS; SEQ ID NO:330
ASP178SSGAPP; SEQ ID NO:331
ASP178SSGAP; SEQ ID NO:332
RSP178SSGAPPPS; SEQ ID NO:333
ASP178TINT; SEQ ID NO:334
ASP178TSVS; SEQ ID NO:335
ASP178TQAF; SEQ ID NO:336
ASP178TINTP; SEQ ID NO:337
実施例４
大腸菌でのFGF―２０とFGF―２１の可溶性発現
治療用タンパク質は通常大腸菌中で不活性な不溶性封入体として発現する。封入体の精製後に可溶性治療剤がタンパク質の再折りたたみ反応により得られる。この再折りたたみプロセスは通常ジスルフィド結合の再シャッフルを促進する化合物の包含により増強される。
タンパク質発現と封入体形成部位である大腸菌原形質は、ジスルフィド結合形成を阻害する化学的還元性環境である。より低い還元性で、より高い酸化性の原形質を有する株は、理論的にはジスルフィド結合形成を可能にし、可溶形での治療用タンパク質発現を促進する。
実験
試験した治療用タンパク質はヒトFGF―２０とFGF―２１である。FGF―２１作成物はＮ末端シグナル配列に欠ける。これら治療用タンパク質のコード化遺伝子は表８に示すように４つの異なるベクターバックボーン（ベクター＃１、ベクター＃２、ベクター＃３及びｐＥＴ２４a）までクローンした。これら作成物は表８に示すように４つの異なる菌種（Ｗ３１３０、ＢＬ２１ＤＥ３、大腸菌（trxb, gor, supp）―２及び大腸菌（trxb, gor, supp）―２ＤＥ３）の一つ又は二つで試験した。
タンパク質発現のために一晩の小規模培養物を用いてカナマイシン５０μｇ／ｍＬ含有の予熱したマルトンＬＢ１００ｍＬ培養液に播種した。培養物を振盪しながら３７℃でインキュベートし、６２０ｍμでの光学密度（ＯＤ６２０）をモニターした。ＯＤ６２０が０．４−０．６に達したとき、該培養物を分割し、３７℃又は２０℃の振盪インキュベーションを１５−２０分間行った。次いでＩＰＴＧを最終濃度が０．１−１．０ｍＭになるように加え、振盪インキュベーションを１．５時間から一晩まで継続した。細胞をソルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ３Ｃ＋中で４℃、７０００ｘｇで１５分間遠心分離して回収した。
タンパク質発現の全細胞抽出物分析のために、該誘導培養物１５０μＬから遠心分離により細胞を収集し、１ｘＰＢＳ／０．１％ＳＤＳに溶解した。１００ｍＭＤＴＴと１ｘタンパク質試料緩衝液で加熱後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシー蛍光オレンジで染色した。
タンパク質溶解度分析のために、誘導培養物５０―１００ｍＬから溶解緩衝液（例えば１ｘＰＢＳ、５ｍＭＥＤＴＡ）約３０ｍＬを用いて細菌性細胞ペレットを再懸濁し、ミクロフルイダイザーに三回通して機械的破壊により溶解した。少量の試料を採取し不溶材をミクロ遠視分離機により４℃で最高速度で１０分間遠心分離してペレット化した。回転後上澄みをペレットから分離し、両者をＳＤＳ−ＰＡＧＥとタンパク質染色により分析した。該治療用タンパク質に特異な抗体によるウエスタンブロット分析を、該観測可溶性タンパク質の同一性を確認するため行った。
結果
FGF―２０
FGF―２０を有するベクターを表８に示すように異なる菌種に形質転換した。温度、通気（ｒｐｍ）、ＩＰＴＧ濃度及び時間を変えて誘導培養物５０−１００ｍＬを全細胞抽出物（ＷＣＥ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１aに示すように中程度の発現がベクター＃２、ベクター＃３及びｐＥＴ２４aベクターで観察されたが、ベクター＃１では観察されなかった。発現は誘導後１．５時間で直ちに観察され、より高いレベルの発現が２０℃より３７℃で観察された。
FGF―２０が可溶性タンパク質として発現されるか否かを決定するため、ｐＥＴ２４aFGF―２０を有するＢＬ２１ＤＥ３株と大腸菌（trxb, gor, supp）―２ＤＥ３株の誘導細胞ペレットを溶解、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１ｂに示すように大部分のFGF―２０は２０℃で成長すると、大腸菌（trxb, gor, supp）―２ＤＥ３に可溶であった。３７℃での成長によりＢＬ２１ＤＥ３細胞と大腸菌（trxb, gor, supp）―２ＤＥ３細胞の両者でほぼ同量の可溶性タンパク質と不溶性タンパク質が得られた。
FGF―２１
FGF―２１を有するベクターを表８に示すように異なる菌種に形質転換した。温度及び時間を変えて誘導培養物１００ｍＬをＷＣＥＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１ｃに示すように発現がベクター＃２、ベクター＃３及びｐＥＴ２４aベクターで観察されたが、ベクター＃１では観察されなかった。発現は誘導後１．５時間で直ちに観察された。FGF―２１はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で予測の約１９．６キロダルトンより約３−５キロダルトン大きく観察され、該誘導バンドの同一性がウエスタンブロット分析で確認された（図１ｃ）。
FGF―２１が可溶性タンパク質として発現されるか否かを決定するため、ベクター＃３FGF―２１を有するＷ３１１０３株と大腸菌（trxb, gor, supp）２株の誘導細胞ペレットを溶解、遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１ｄに示すように大部分のFGF―２１は２０℃で誘導すると、大腸菌（trxb, gor, supp）２細胞でのみ可溶であった。３７℃での大腸菌（trxb, gor, supp）２細胞での誘導又はいずれの温度でのＷ３１１０細胞での誘導により大部分が不溶性タンパク質が得られた。
本研究により細菌中の治療用タンパク質FGF―２０及びFGF―２１が可溶性タンパク質として発現する方法が示された。ここに記載の大腸菌（trxb, gor, supp）２を用いる発現法は、他の治療用タンパク質の可溶性発現に応用できるはずである。
本発明は特定実施形態を参考にして開示したが、本発明の他実施形態や変形が技術の他熟知者により該発明の真の精神と範囲を逸脱することなく考案できることは明白である。
本応用で記載の全特許、特許出願及び他出版物は多目的のためにその全体を文献として取り入れる。

Claims (16)

  1. 線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）複合物が
    変異ＦＧＦ−２１ペプチド及び修飾基を含み、
    該変異ＦＧＦ−２１ペプチドは、対応する野生型ＦＧＦ−２１には存在しない新規導入のＯ連結グリコシル化部位を含み、該対応する野生型ＦＧＦ−２１は、SEQ ID NO.１４６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、該変異ＦＧＦ−２１ペプチドはSEQ ID NO.３２４と同一のアミノ酸配列を含み、
    該修飾基は、無傷グリコシル結合基により該ペプチドのアミノ酸残基位で該ペプチドと共有結合し、該修飾基はポリマー型修飾基である、
    ＦＧＦ複合物。
  2. 該グリコシル結合基が以下の式による構造を有する請求項１のＦＧＦ複合物で、
    ここでR2は水素原子、CH2OR7、COOR7又はOR7であり、ここで
    R7は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル又は置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキルを表し、
    R3及びR4及びは水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、OR8、NHC(O)R9から独立に選ぶ構成員であり、
    ここでR8及びR9は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル又はシアリル酸から独立に選び、
    Laは結合、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキルから選ぶリンカーであり、
    R16及びR17は独立に選択したポリマー型アームであり、
    X2及びX4はポリマー成分R16及びR17を炭素原子に連結する独立に選んだ結合断片であり且つ
    X5は非反応性基であるＦＧＦ複合物。
  3. 該グリコシル結合基が以下の式による構造を有する請求項２のＦＧＦ複合物。
  4. 該グリコシル結合基が以下の式による構造を有する請求項１から３のいずれか一項記載のＦＧＦ複合物。
    ここで、式中、ｂは０及び１より選択される整数、ｓは、１から１０より選択される指数、ｆは１から２５００より選択される指数である。
  5. 対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１に存在しない新規導入のＯ連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子−２１であって、
    該対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１は、SEQ ID NO.１４６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、該変異線維芽細胞成長因子−２１はSEQ ID NO.３２４と同一のアミノ酸配列を含む、
    変異線維芽細胞成長因子−２１。
  6. 変異線維芽細胞成長因子−２１が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項５の変異線維芽細胞成長因子−２１。
  7. グリコシルリンカーによりグリコシル化部位と結合した水溶性ポリマーを含む請求項５の変異線維芽細胞成長因子−２１。
  8. 該グリコシルリンカーが無傷グリコシルリンカーである請求項７の変異線維芽細胞成長因子−２１。
  9. 対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１に存在しない新規導入のＯ連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子−２１の作成方法で、
    （ａ）該変異線維芽細胞成長因子−２１を組み換え産生する段階と、
    （ｂ）該変異線維芽細胞成長因子−２１を新規導入グリコシル化部位でグリコシル化する段階を含み、
    該グリコシル化が無細胞試験管内プロセスである変異線維芽細胞成長因子−２１の作成方法であって、
    該対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１は、SEQ ID NO:１４６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、該変異線維芽細胞成長因子−２１はSEQ ID NO.３２４と同一のアミノ酸配列を含む、
    方法。
  10. 変異線維芽細胞成長因子−２１が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項９の方法。
  11. 変異線維芽細胞成長因子−２１の有効量と薬学的に許容可能な補助物質を含有する薬剤組成物であって、
    該変異線維芽細胞成長因子−２１は、該対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１に存在しない新規導入のＯ連結グリコシル化部位を含み、
    該対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１は、SEQ ID NO:１４６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、該変異線維芽細胞成長因子−２１はSEQ ID NO.３２４と同一のアミノ酸配列を含む、
    薬剤組成物。
  12. 該変異線維芽細胞成長因子−２１が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項１１の組成物。
  13. 対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１に存在しない新規導入のＯ連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子−２１の複合糖質の作成方法で、
    （ａ）該変異線維芽細胞成長因子−２１を組み換え産生する段階と、
    （ｂ）該変異線維芽細胞成長因子−２１を新規導入グリコシル化部位で修飾糖により酵素的にグリコシル化する段階を含み、
    該グリコシル化が無細胞試験管内プロセスである複合糖質作成法であって、
    該対応する野生型線維芽細胞成長因子−２１は、SEQ ID NO:１４６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、該変異線維芽細胞成長因子−２１はSEQ ID NO.３２４と同一のアミノ酸配列を含む、
    方法。
  14. 該修飾糖が水溶性ポリマーで修飾する請求項１３の方法。
  15. 該修飾糖がポリエチレングリコール及びｍ−ポリエチレングリコールからなる一群から選んだ水溶性ポリマーで修飾する請求項１４の方法。
  16. 変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項１５の方法。
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