MXPA01004779A

MXPA01004779A - Udp-galactosa: beta-n-acetil-glucosamina beta1, 3galactosiltransferasas, beta3gal-t5.

Info

Publication number: MXPA01004779A
Application number: MXPA01004779A
Authority: MX
Inventors: Margarida Amado
Original assignee: Clausen Henrick
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-11
Publication date: 2002-09-18
Also published as: US20060099699A1; AU1619700A; EP1129179A1; CA2350079A1; US7476527B2; DE69939549D1; WO2000029558A1; AU772112B2; EP1129179B1; ATE408006T1; JP2002530071A; EP1129179A4

Abstract

Se presenta un gen novedoso que define una enzima novedosa en la familia de UDP-D- galactosa: ?-N-acetilglucosamina/?-N-acetilgalactosamina ?1, 3galactosiltransferasa, ?3Gal-T5, con propiedades enzimaticas unicas. La actividad enzimatica de ?3Gal-T5 es distinta de la actividad enzimatica de enzimas previamente identificadas de esta familia de genes. La invencion divulga moleculas de ADN aisladas y constructos de ADN que codifican ?3Gal-T5 y derivados de la misma mediante remocion, sustitucion o insercion de aminoacidos que muestran una actividad ?3Gal-T5, asi como la clonacion y vectores de expresion que incluyen dicho ADN, celulas transfectadas con los vectores, y metodos recombinantes para proporcionar ?3Gal-T5. Se divulga la enzima ?3Gal-T5 y derivados activos de ?3Gal-T5, particularmente derivados solubles que comprenden el dominio cataliticamente activo de ?3Gal-T5. Ademas, la invencion divulga metodos para obtener sacaridos, glicopeptidos o glicoproteinas ?1,3galactosilglicosilados mediante el uso de una proteina ?3Gal-T5 enzimaticamente activas o proteina de fusion de la misma o bien mediante el uso de celulas transfectadas de manera estable con un vector que incluye ADN que codifica una proteina ?3Gal-T5 enzimaticamente activa como un sistema de expresion para la produccion recombinante de dichos glicopeptidos o glicoproteinas. Asi mismo se divulga un metodo para identificar variaciones de secuencias de ADN en el gen de ?3Gal- T5 mediante el aislamiento de ADN de un paciente, amplificacion de exonos que codifican ?3Gal-T5 por reaccionen cadena de polimerasa, y deteccion de la presencia de variacion de secuencia de ADN.

Description

UDP-GALACTOSA: ß-N-ACETIL-GLUCOSAMINA ßl, 3GALACTOSILTRANSFERASAS, B3GAL-T5 La invención reclama prioridad en los Estados Unidos de América de conformidad con 35 U.S.C. § 119 sobre la solicitud danesa No. PA 1998 01483 presentada el día 13 de Noviembre de 1998, dicha solicitud se incorpora por referencia aquí en su totalidad. 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a la biosíntesis de glicanos encontrados como oligosacáridos libres o bien unidos covalentemente a proteínas y glicoesfingolípidos . Esta invención se relaciona particularmente con una familia de ácidos nucleicos que codifican UDP-D-galactosa : ßN-acetilglucosa ina ßl,3-galactosiltransferasas (ß3Gal-transferasas) , que agregan galactosa al grupo hidroxi en el carbono 3 de 2-acetamido-2-desoxi-D-glucosa (GlcNAc, . Esta invención se refiere más particularmente a un gen que codifica el quinto miembro de la familia de ß3Gal-transferasas, que se conoce como ß3Gal-T5, sondas para el ADN que codifica ß3Gal-T5, constructos de ADN que comprenden ADN que codifica ß3Gal-T5, plásmidos recombinantes y métodos recombinantes para la producción de ß3Gal-T5, métodos recombinantes para transfectar de manera estable células para la expresión de ß3Gal-T5, y métodos para indicar polimorfismos de ADN en pacientes. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una familia de UDP-galactosa: ß-N-acetil-glucosamina ßl,3-galactosil-transferasas (ß3Gal-T' s) fue identificada recientemente (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosa--?ina ßl,3- Galactosiltransferasas) . J. Bi ol . Chem. 273:12770-12778, 1998; Kolbinger, F., Streiff, M.B. -_- Katopodis, A.G. Cloning of a human UDP-galactose: 2-acetara?¿o-2-deoxi-D-glucose 3ß-galactosyltransferase catalysing tr.e fomation of type i chains (Clonación de una UDP-galactcsa: 2-acetamida-2-deoxi-D-glucosa ß3-galactosiltransferasa humana que cataliza ia formación de cadenas de tipo 1) . J. Biol . Chem. 273:433-443, 1998; Hennett, T . , Dinter, A., Kuhnert, P., Mattu, T.S., Rudd, P.M. y Berger, E.G. Genomic cloning and expresión of three -murine UDP-galactose : ß-N-acetylglucosamine ßl,3-galactosiltransferasa genes (Clonación genómica y expresión de tres genes de UDP-galactosa: ßN^acetilglucosamina ßl,3-galactosiltransferasa de murino) . J. Bi ol . Chem. 273:58-65, 1998; Miyaki, H., Fukumoto, S., C ada, M., Hasegawa, T. y Furukawa, K. Expresión cloning of rat cDNA encoding UDP-galactose G(D2) ßl, 3-galactosyltransferase that determines the expresión of G(D1 b)/G(M 1)G(A1) (Clonación de expresión de ADNc de rata que codifica UDP-galactosa G(D2) 31,3-galactosiltransferasa que determina la expresión de G(Dlb)/G(M 1)G(A1)'). J. Bi ol . Chem. 272:24794-24799, 1997). Tres genes dentro de esta familia, ß3Gal-Tl, -T2 y -T3, codifican ß3-galactosiltransferasas que forman el enlace Galßl-3-GlcNAc. La secuencia de Galßl-3GlcNAc de cadena de tipo 1 se encuentra en ambcs oligosacáridos unidos a N y 0 de glicoproteínas y en lactoseries de glicosingolípidos en donde es la contraparte de estructuras de Galßl-4GlcNAc pcli-N-acetillactosamina de tipo 2 (Kobata, A. Structures and functions of the sugar chair.s of glycoproteins (Estructuras y funciones de cadenas de glicoproteínas de azucares) . ?' r J Biochem 209:483-501, 1992! . Las estructuras de cadena del tipo 1 se encuentran principalmente en epitelios derivados endodérmicamente mientras que las cadenas de tipo 2 se encuentran en células derivadas ectodér icamente y mesodérmicamente incluyen eritrocitos (Oriol, R., Le Pendu, J. y Mollicone, R. Genetics of ASO, H, Lewis, X and reíated antigens (Genética de ABO, H, Lewis, X y antígenos relacionados) . Vox Sang?ínis 51:161-171, 1986; Clausen, H. y Hakomori, S. ABH and reiated histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution (ABH y antígenos de grupo histo-sanguíneo relacionados; diferencias inmunoquímicas en isótipos portadores y su distribución). Vox Sanguinis 56:1-20, 1989).

Los epitelios gastro-intestinales normales expresan glicoconjugados de cadena de tipo 1 principalmente, mientras que las estructuras de cadena de tipo 2 predominan en tumores (Hakomori, S. Aberrant glycosylation ip tumors and tumor-associated carbohidrate antigens Tumor maiignancy defined by aberrant glycosylation and sphingo (glyco) lipid metabolism (Glicosilación aberrante en tumores y antígenos de carbohidrato asociados con tumores. Malignidad tumoral definida por glicosilación aberrante y metabolismo de esfingo (glico) lípido) . Advances in Cáncer Research 52:257-331,1989; Hakomori, S. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingc (glyco) lipid metabolism (Malignidad tumoral definida por glicosilacicr. y metabolismo sfingo (glico) lípido aberrante). Cáncer Res 56:5309-5318, 1996). Es de considerable interés definir el (ios) gen(es) responsable (s) de la formación de estas estructuras de núcleo en epitelios normales y malignos. Varias características de las tres ß3Gal-Ts previamente descritas y capaces de formar estructuras de cadena de tipo 1 sugieren que no son las enzimas principales involucradas en síntesis de cadena de tipo 1 en epitelio: (i) una análisis Northern indica que ß3Gal-Tl y -T2 se expresan exclusivamente en el cerebro (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasa) . J. Biol . Chem. 273:12770-12778, 1998; olbinger, F., Streiff, M.B. y Ktopodis, A.G. Cloning of a human UDP-galactose : 2-acetamido-2-deoxi-D-glucose 3ß-galactosyltransferase catalysing the formation of type 1 chains (Clonación de una UDP-galactosa: 2-acetamida-2-decxi-D-glucosa 3ß-galactosiltransferasa humana que cataliza la formación de cadenas de tipo 1) . J". Biol . Chem . 273:433-441, 1998; Hennett, T., Dinter, A., Kuhnert, P., Mattu, T.S., Rudd, P.M. y Berger, E.G. Genomic cloning and expresión cf three murine UDP-galactose : -N-acetylglucosamine 31,3-galactosiltransferasa genes (Clonación genómica y expresión de tres genes de UDP-galactosa : ßN-acetilglucosamina ßl,3-galactosiltransferasa de murino). J. Bi ol . Chem. 273:58-65, 1998; (ii) aún cuando ß3Gal-T3 tiene un patrón de expresión más amplio no es detectado en varios tejidos incluyendo el colon y es expresado de manera débil en la mucosa gástrica (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasa: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosaminá/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa) . J. Biol . Chem. 273:12770-12778, 1998; Kolbinger, F., Streiff, M.B. y Ktopodis, A.G. Cloning of a human UDP-galactose : 2-acetamido-2-deoxi-D-glucose 3ß-galactosyltransferase catalysing the formation of type 1 chains (Clonación de una UDP-galactosa: 2-acetamida-2-deoxi-D-glucosa ß3-galactosiltransferasa humana que cataliza ia formación de cadenas de tipo 1) . ". Biol . Chem. 273:433-440, 1998); (iii) las propiedad cinéticas de enzimas recombinantes no son consistentes con las propiedades reportadas para las actividades ß3Gal-T en epitelios (Sheares, B.T., Lau, J.T. y Carlson, D.M. Biosyntesis of galactosyl-beta 1,3-N-acetylglucosamine (Biosíntesis de galactosil-beta 1,3-N-acetilglucosamina) . J. Biol . Chem . 257:599-602, 1982; Holmes, E.H. Characterization and membrane organization of beta 1 3- and beta 1 4- galatosyltransferases from human colonic adenocarcinoma cel lines Cob 205 and S 403: basis for preferential syntesis of type 1 chain lacto-series carbohydrate structures (Caracterización y organización de membrana de beta 1 3- y beta 1 4- galactosiltransferasas a partir de líneas de células de adenocarcinoma humano Cob 205 y S 403: base de síntesis preferente de estructuras de carbohidrato de serie lacto de cadena de tipo 1) . Arch . Biochem Biophys 270:630-646, 1989); y (iv) las especificidades de sustrato de aceptador de ß3Gal-Tl, -T2, o -T3 no incluyen la estructura 3 de núcleo de tipo ucino (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasa) . J. Bi ol . Chem. 2"3 : 12770-12778, 1998; Hennett, 7., Dinter, A.., Kuhnert, P., Matu, T.S., Rudd, P.M. y Berger, E.G. Genomic cloning and expresión of three murine UDP-galactose: ß-N-acetylglucosamine ßl,3-galactosiltransferasa genes (Clonación senómica y expresión de tres genes de UDP-galactosa: ß-N-acetilglucosamina ßl,3-galactosiitransferasa de murino). J. Biol . Chem . 273:58-65, 1998) , que se considero previamente como un sustrato muy eficiente para la actividad de ß3Gal-T aislado de la traquea del cerdo (Sheares, B.T. y Carlson, D.M. Characterization of UDP-galactose: 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose 3 beta-galatosyitransferase from pig trachea (Caracterización de UDP-D-galactosa: 2-acetamido-2-deoxi-D-glucosa 3 beta-galactosiltransferasas a partir de traquea de cerdo) . J.

Biol . Chem. 258:9893-9898, 1983). El acceso a genes existentes adicionales de ßGlcNAc ß3Gal-transferasa que codifican ß3Gal-transferasas con mejores propiedades cinéticas que ß3Gal-Tl, -T2, y -T3 permitiría la producción de enzimas más eficientes para su uso en la galactosilación de oligosacáridcs, glicoproteínas, y glicoesfinolípidos . Tales enzimas podrían emplearse, por ejemplo, en aplicaciones farmacéuticas o bien otras aplicaciones comerciales que requieren de la galactosilación sintética de estos u otros sustratos que sobre los cuales ß3Gal-Tl, -T2, y -T3 no actúa o bien solamente actúa de manera insatisfactoria, con ei cbjeto de producir gliconjugados apropiadamente glicosilados que tienen propiedades enzimáticas, inmunogénica= y otras propiedades biológicas y/o físicas particulares. Por consiguiente existe la necesidad er_ la técnica de UDP-galactosa:ß-N-acetil-glucosamina ßl, 3-galactosiltransferasas aisladas adicionales que tienen propiedades específicas únicas y la estructura primaria de los genes que codifican dichas enzimas. La presente invención cumple con esta necesidad y presenta además otras ventajas relacionadas, como se describe con detalles a continuación. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece ácidos nucleicos aislados que codifican UDP-galactosa:ß3-N-acetilglucosamina ßl,3-galactosiltransferasa (ß3Gal-T5) humana, incluyendo ADNc y ADN genómico. ß3Gal-T5 tiene mejores propiedades cinéticas que ß3Gal-Tl, -T2 y -T3, como se puede mostrar a través de los ejemplos de su mejor actividad con derivados de sacéridos y sustratos de tipo proteína así como su actividad con glicolípido de globosido. De hecho, ß3Gal-T5 es la primera glicosiltransferasa disponible para transferir Gal ßl-3 a globosido (GalNAcßl-4Galßl-4Glcßl-Cer) . La secuencia de nucleótidos completa de 53Gal-T5 se presenta en la Figura i. En un aspecto, la invención abarca ácidos nucleicos aislados que comprenden o consisten de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1-933 de conformidad con lo presentado en la Figura 1, o bien variar.oes que conservan ia secuencia c que conservan la función de la misma. Se proporcionan también ácidos nucleicos que pueden hibridarse con ácidos nucleicos que tienen la secuencia presentada en la Figura 1 o" fragmentos de la misma o bien variantes de la misma que conservan la secuencia o la función. En varias modalidades los ácidos nucleicos de la invención pueden hibridarse con secuencias de ß3Gal-T5 en condiciones poco estrictas, con un nivel de estrictez intermedio o altamente estrictas o bien con condiciones de estrictez preferidas específicas definidas aquí. En una modalidad, las secuencias de ADN codificar- las secuencias de aminoácidos de conformidad con .lo establecido en la Figura 1, de metionina (aminoácido no. 1) a valina (aminoácido no. 310) . En otra modalidad, la secuencia de ADN codifica una secuencia de aminoácidos que comprenden una secuencia desde metionina (no. 25) hasta valina (no. 310) de conformidad con lo presentado en la Figura 1. En un aspecto relacionado, la invención ofrece vectores de ácido nucleico que comprenden secuencias de ADN de ß3Gal-T5, incluyendo sin limitación, los vectores en los cuales la secuencia de ADN de ß3Gal-T5 está enlazada de manera operativa con un elemento de regulación de trascripción (por ejemplo, un promotor, un realzador, o ambos), con o sin una secuencia de poliadenilación. Células que comprenden estos vectores se producirán también, incluyendo, sin limitación, células que expresan de manera transiente y estable. Virus, incluyendo bacteriófagos, que comprenden una secuencia de ADN derivadas de ß3Gal-T5 se proporcionan también. La invención abarca también métodos para producir polipéptidos de ß3Gal-T5. Métodos basados en células incluyen, sin limitación los métodos que comprende: la introducción er- una célula huésped de una molécula de ADN aislada que codifica ß3Gal-T5, o bien un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica ß3Gal-T5; el cultivo de la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de ß3Gal-T5; y el aislamiento de ß3Gal-T5 producido por la célula huésped. Además, esta invención ofrece un método para generar una célula huésped con una expresión estable de novo de ß3Gal-T5 que comprende: la introducción en una célula huésped de una molécula de ADN aislada que codifica ß3Gal-T5 o bien un fragmento enzimáticamente activo de la misma (por ejemplo, un polipéptido que comprende los aminoácidos 25-310 presentados en la Figura 1) , o bien un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica ß3Gal-T5 o bien un fragmento enzimáticamente activo de la misma; la selección y el cultivo de células huéspedes en un medio apropiado; y la identificación de células transfectadas de manera estable que expresan ß3Gal-T5. Las células trasfectadas de manera estable pueden emplearse para la producción de enzima ß33Gal-T5 para su uso como catalizador y para la producción recombinante de péptidos o proteínas con galactosilación apropiada. Por ejemplo, células eucarióticas, ya sea células normales o enfermas, cuyo patrón de glicosilación es modificado por una transfección estable como arriba, o bien componentes de tales células, pueden emplearse para proporcionar glicofcrmas específicas de glicopéptidos y glicoproteína, por ejemplo, inmunogenos para vacuna. En otro aspecto, la invención ofrece polipéptidos de ß3Gal-T5 aislados incluyendo, sin limitación, polipéptidos que tienen la secuencia presentada en la Figura 1, polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos 25-310 de conformidad con lo establecido en la Figura 1, y un polipéptido de fusión que consiste de por lo menos los aminoácidos 25-311 de conformidad con lo establecido en la Figura 1 fusionados en cuadro con una segunda secuencia, que puede ser cualquier secuencia compatible con la retención de la actividad enzimática de ß3Gal-T5 en el polipéptido de fusión. Según las secuencias adecuadas incluyen, sin limitación, las secuencias que comprenden un ligando de afinidad, un grupo reactivo, y/o un dominio funcional de otra proteína. En otro aspecto de la presente invención, se divulgan métodos para tamizar para determinar la presencia de mutaciones en la región codificadora (exón Z > del gen de ß3Gal-T5 empleando ADN genómico aislado, por ejemplo, de células sanguíneas de sujetos normales y/o sujetes enfermos. En una modalidad, el método comprende: aislar ACN de un sujeto normal o enfermo; amplificar por reacción en cadena de polimeraza el exón codificador I; secuenciar ei ADN de los fragmentos de ADN de exón amplificado y establecer a partir de ahí defectos estructurales potenciales del gen de ß3Gal-T5 asociado con la enfermedad. Estos y otros aspectos de ia presente invención serán evidentes al ser referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos anexos. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de ADN del gen de 53Gal-T5 (SEQ ID NO: 8) y la secuencia predicha de aminoácidos de ß3Gal-T5 (SEQ ID NO: 9) . La secuencia de aminoácidos se muestra en el código de aminoácidos de una sola letra. El segmento hidrofóbico que representa el dominio de transmembrana putativo es subrayado con una doble raya (Kyte & Doolittle, ventana de 8 (Kite, J. y Doolittle, R.F. A simple meted for displaying the hydropathic character of a protein (Un método sencillo para presentar el carácter hidropático de una proteína) . Journal of Molecular Biology 157:105-132,1982)). Tres motivos de consenso para N-glicosilación son indicados por asteriscos. La ubicación de los iniciadores empleados para la preparación de los constructos de expresión se indica mediante subrayado simple. El código de aminoácidos de una sola letra corresponde al código de aminoácidos de tres letras de la Lista de Secuencias presentada a continuación: A, Ala; R, Arg; N, Asn; D, Asp; B, Asx; C, Cys; Q, Gln; E, Glu; Z, Glx; G, Gly; H, His; I, lie; L, Leu; K, Lys; M, Met; F, Phe; P, Pro; S, Ser; T, Thr; W, Trp; Y, Tyr; y V, Val. La Figura 2 es una ilustración de análisis de varias secuencias (ClustalW) de cinco ß3Gal-transferasas humanas. Las transferasas se presentan en la lista de conformidad con el orden de similitud con ß3Gal-Tl. La SEQ ID Nos para las transferasas mostradas son las siguientes: ß3Gal-Tl (SEQ ID NO: 11), ß3Gal-T2 (SEQ ID NO: 10), ß3Gal-T3 (SEQ ID NO: 12), ß3Gal-T4 (SEQ ID NO: 13) y ß3Gal-T5 (SEQ ID NO: 9) . Los huecos -introducidos se muestran como guiones, los residuos idénticos alineados están en cuadros , (negros para todas las secuencias, gris oscuro para cuatro secuencias y gris claro para tres secuencias) . Les dominios de transmembrana putativos son subrayados con una sola raya , las posiciones de cisteínas conservadas se indican mediante asteriscos . Un sitio de N-glicosilación conservado es indicado a través de un circulo abierto . El motive de DxD es indicado por medio de flecha. La Figura 3 es una representación esquemática de 13Gal-transferasas alineadas para los residuos de cisteína conservados. Sitios potenciales de N-glicosilación se indican mediante árboles . Residuos ie cisteína se indican por la letra C, y la conservación de cisteínas se indica por medio de líneas punteadas entre genes. La posición de motivos de secuencia conservados como se muestra en la Figura 2 son indicados por líneas de puntos y secuencias de aminoácidos. La señal putativa de transmembrana es indicada por meoio de lineas gruesas . La Figura 4 muestra secciones de un espectro 1-D H-2\:-íR del producto ß3Gal-T5 con Core3-pNPh, Galßl-»3GlcNAcßl?3GalNAcal->lpNPh, mostrando todas las resonancias no intercambiables de etipa de anillo de monosacárido y metileno exocíolico. Designaciones de residuos para Galßl-3 (Galñ3) , GlcNAc1-l-3 (GlcN?cS3), GalNAcal?l (a) son seguidas por designacicr.es de protones (Braunsch?"eiler, L. y Ernst, R.R. Coherence transfer by isotropic mixing: Application to protón correlation spectroscopy (Transferencia de coherencia por mezclado isotrópico: Aplicación a la espectroscopia de correlación de protones) . J. Magn . Reson . 53:521-528, 1983; Bax, A. y Davis, D.G. MLEV-1 7 based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy (Espectroscopia de transferencia de magnetización homonuclear bidimensional basada en MLEV-1 7). J. Magn . Reson . 65:355-360, 1985a; Bothner-By, A. ., Stephens, R.L., Lee, J.M., arren, C.D. y Jeanloz, R. . Structure determination of a tetrasaccharide: Transient nuclear Overhauser effects in the rotating frame (Determinación de estructura de una tetrasacárido : efectos Overhauser nucleares transientes en el cuadro de rotación). J. Am. Chem. Soc . 106:811-813, 1984; Bax, A. y Davis, D.G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy (Aspectos prácticos de espectroscopia de NOE transversal bidimensional) . J. Magn . Reson . 63:207-213, 1985b; Keeler, J., Laue, E.D. y Moskau, D. Experiments for recording pure-absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field . gradients (Experimentos para registrar espectros de correlación heteronuclear de absorción pura empleando gradientes de-campos impulsados). J. Magn . Reson . 98:207-216, 1992; Bodenhausen, G. y Rubén, D.J. Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy (Nitrógeno de abundancia natural-15 NMR por espectroscopia heteronuclear incrementada). Chem. Phys . Lett . 69:185-189,1980). La Figura 5 es una ilustración fotográfica de análisis Northern blot de líneas de células tumorales humanas. Líneas de células de adenocarcinoma pancreático de ser humano AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Colo357, HPAF, PANC-1, Suit2, S2-013, y la línea de células de adenocarcinoma de colon HT29 fueron sondeadas con ADNc marcado con "? de ß3Gal-T5 que corresponde al constructo de expresión soluble. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las solicitudes de patente, patentes y referencias de literatura mencionadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones, tendrá preferencia. 5.1 DEFINICIONES 1. "Ácido nucleico" o "polinucleótido" cerno se emplean aquí se refiere a polímeros que contienen purina y pirimidir.a de cualquier longitud, ya sea poliribonucleótidoe o polidesoxiribonucleótidos o una poliribo-polidesoxiribonucleótidos mixtos. Esta definición incluye moléculas de cadena única y moléculas de cadena doble, es decir, híbridos -ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN, así como "ácidos nucleicos de proteína" (PNA) formados por la conjugación de bases con una estructura de aminoácidos. Esto incluye también ácidos nucleicos que contienen bases modificadas (véase a continuación) . 2. La expresión "ADN complementario o ADNc" como se emplea aquí se refiere a una molécula de ADN o secuencia que ha sido enzimáticamente sintetizada a partir de las secuencias presentes en un templado ARNm, o un clon de dicha molécula de AD?. Un "constructo de AD?" es una molécula de AD? o un oion de dicha molécula, ya sea de cadena única o de cadena doble, que ha sido modificada para obtener segmentos de AD? que son combinados y yuxtapuestos de una manera que no existiría de otra forma en la naturaleza. A título de ejemplo no limitativo, un AD?c o AD? que no tiene intrones es insertado adyacente a secuencias de AD? exógenas o dentro de dichas secuencias . 3. Un plásmido, o, más generalmente, un vector es un constructo de AD? que contiene información genética "que puede proporcionar su replicación cuando es insertado en una célula huésped. Un plásmido contiene generalmente por io mence una secuencia de gen a expresar en la célula huésped así como secuencias que facilitan dicha expresión de gen incluyendo promotores y sitios de inicio de trascripción. Puede ser una molécula lineal o circular cerrada. 4. Ácidos nucleicos pueden "hibridarse" entre ellos cuando por lo menos una cadena de un ácido nucleico puede fusionarse sobre otro ácido nucleico en condiciones de estrictez li definidas. El carácter estricto de la hibridación es determinado, por ejemplo, por a) la temperatura a la cual se efectúa la hibridación y/o el lavado y b) la fuerza iónica y polaridad (por ejemplo, formamida) de las soluciones de 'hibridación y lavado, así como ocros parámetros. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias sustancialmente complementarias; según el nivel de estrictez de la hibridación, sin embargo, se pueden tolerar faltas de correspondencia. Típicamente, la hibridación de dos secuencias con alto nivel de estrictez (como por ejemplo, en una solución acuosa de 0.5X SSC, a una temperatura de 65°C) requiere que las secuencias presenten un alto grado de complementariedad sobre todas sus secuencias. Condiciones de nivel de estrictez intermedio (como per ejemplo, una solución acuosa 2X SSC a una temperatura de 65°C) y de bajo nivel de estrictez (como por ejemplo, una solución acuosa 2X SSC a una temperatura de 55°C) , requieren correspondientemente una menor complementariedad global entre más secuencias de hibridación. (IX SSC es 0.15 M NaCl, citrato de Na 0.015 M) . En una modalidad, esta invención proporciona ácidos nucleicos que pueden hibridarse con un ácido nucleico ß3Gal-T5 en las siguientes condiciones de hibridación: un constructo de expresión de ß3Gal-T5 soluble o de longitud completa (véase Ejemplo) se emplea como sonda (por ejemplo, mediante marcado iniciado aleatoriamente) contra una mancha de ADN o ARN, la mancha es sondeada durante la noche a una temperatura de 42°C de conformidad con lo previamente descrito (Bennett et al., 1996, cDNA cloning and expresión of a novel human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine, Polypeptido N-acetyl-galactosa inyl-transferase, GalNAc-T3 (Clonación de ADNc y expresión de una UDP-N-acetil-alpha-D-galactosamina, Polipéptido N-acetil-galactosaminil-transferasa humana novedosa, GalNAc-T3) , J. Biol . Chem. 271, 17006-17012), lavada 2 x 10 minutos a temperatura ambiente (RT; de 18 a 23°C) con 2 x SSc, 1% NA4P;0. , 2 x 20 minutes a 65°C con 1.2 x SSC, 1% SD?, 1% NA'P;0: y una vez durante 10 minutos ccn 0.2 x SSC a temperatura ambiente ("condicicnes preferidas de hibridación") . En estas condiciones de hibridación preferidas, no hay hibridación cruzada entre ß3Gal-T5 y las ß3Gal-Ts previamente identificadas (es decir, ß3Gal-Tl, -T2, -T3, y -T4; véase también Amado et al., 1998, A. Family of human ß3-galactosyltransferases : characteri?atisn of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasa) . J. Biol . Chem. 273:12770-12778) . 5. Un ácido nucleico "aislado" o polipéptido "aislado", como se emplea aquí se refiere a un componente removido de su entorno original (por ejemplo, su entorno natural si ocurre naturalmente) . Un ácido nucleico aislado o un polipéptido aislado contiene menos que aproximadamente 50%, de preferencia menos que aproximadamente 75o y con mayor preferencia menos que aproximadamente 90%, de los componentes celulares con los cuales estaba originalmente asociado. 6. Una "sonda" se refiere a un ácido nucleico que forma una estructura híbrida con una secuencia en una región objetivo debido a la complementariedad de por lo menos una secuencia en la sonda con una secuencia en la región objetivo. 7. Un ácido nucleico que "se deriva de" una secuencia designada se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que corresponden a una región de la secuencia designadas. Esto abarca secuencias que son homologas o complementarias de la secuencia, así como "variantes conservadoras de la secuencia" y "variantes conservadoras de la función". Variantes conservadoras de la función son las variantes en las cuales un cambio de uno o varios nucleótidos en una posición de codon dada resulta en la ausencia de alteración en el aminoácido codificado en esta posición. Variantes conservadoras de función de ß3Gal-T5 son las variantes en las cuales un residuo de aminoácido dado en el polipéptido ha sido cambiado sin alterar la conformación general y la actividad enzimática (incluyendo especificidad de sustrato) del polipéptido nativo; estos cambios incluyen, sin limitarse a ellos, el reemplazo de aminoácido con otro que tiene propiedades fisicoquímicas similares (come per ejemplo, ácido básico, hidrofóbico, y similares) . 8. Un "sustrato donador" es una molécula reconocida, por ejemplo, por una galatosiltransferasa y que contribuye una porción galactosilo para la reacción de transferaza. Para ß3Gal-T5, un sustrato donador es una UDP-galactosa. Un "sustrato aceptador" es una molécula, de preferencia un sacárido o bien oligosacarido, reconocido por ejemplo por una galactosiltransferasa y que es el objetive de la modificación catalizada por la transferaza, es decir, recibe la porción galactosilo. Para ß3Gal-T5, sustratos aceptadores incluyen sin limitación oligosacáridos, gliceproteínas, GicNAc-glicopéptidos enlazados en 0, GalNAc-gliccpéptidos enlazados en 0, así como glicoesfingolípides que contienen las secuencias GlcNAcßl-6Gal, GlcNAcßl-6GaINAc, GlcNA-cßl-3 GalNaccßl-2Mal, GlcNAcßl-4Man, GlcNAcSl-4Mal, GlcNAcßl-oMap, GlcNAcßl-3Man, Glcßl-ceramida, y GalNAc31-3Gal . La presente invención ofrece las moléculas de ADN aisladas incluyendo ADN genómico y ADNc, que codifican la UDP— galactosa :ß-N-acetilglucosamina ßl, 3-galactosiltransferasa (ß3Gal-T5) . ß3Gal-T5 fue identificada mediante análisis de información de secuencias de base de datos EST y elenada con base en EST y clones de ADNc 5' RACE. La estrategia de clonación puede ser resumida brevemente a continuación: 1) la síntesis de oligonucleótidos derivados de información de secuencia de EST, designados EBER1301 y EBER 1302; 2) tamizado por reacción en cadena de polimerasa y aislamiento de un fago de ADN genómico Pl que contiene la región codificadora entera de ß3Gal-T5; 3) secuenciamiento de ADN de Pl; 4) identificación de una secuencia de ADN novedosa que corresponde a ß3Gal-T5; 5) construcción de constructos de expresión mediante reacción en cadena de polimerasa de trascripción reversa (RT-PCR) empleando ADN de Pl de ser humano; 6) Expresión de la ADNc que codifica ß3Gal-T5 en células de Sf9 (Spodoptera frugiperda) . Más específicamente, el aislamiento de una molécula de ADN representativa que codifica un quinto miembro novedoso de la familia de UDP-galactosa: ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl,3-galactcsiltransferasa de mamífero que participa en los siguientes procedimientos descritos a continuación. 5.2 IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE ß3C-ai-T5 DE SER HUMANO Un gen novedoso, con una similaridad de secuencias significativa con la familia de genes de ß3Gal-transferasa fue identificado (Figura 1) , empleando la estrategia descrita previamente (Almeida, R., Amado, M., David, L., et al. A Family of Human ß4-Galactosiltransferases : Cloning and espression of two novel UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine ßl,4-Galactosyl-transferases, ß4Gal-T2 and ß4Gal-T3. (Una familia de ß4-galactosiltransferasas de ser humano: clonación y expresión de dos UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina ßl,4-galactosil-transferasas, ß4Gal-T2 y ß4Gal-T3) . J. Biol . Chem. 272:31979-31992, 1997). La región codificadora predicha de ß3Gal-T5 incluyo dos codones de inicio potenciales, precediendo una secuencia hidrofóbica, el segundo correspondiendo a la regla de Kozac (Kozac, M. Regulation of traslation in eukariotic systems '.Regulación de traslación en sistemas eucarióticos). Ann Rev Cell Biol 8:197-225, 1992) (Figura 1) . La secuencia codificadora predicha indica que ß3Gal-T5 es una glicoproteina de tranemembrana de tipo II con un dominio citoplásmico de terminal N de 2 o 7 residuos, un segmento de trasme brana de 19 residuos flanqueado con residuos . cargados y una región precursora y dominio catalítico de 284 residuos con tres sitios de N-glicosilación potenciales (Figura 1) . Una gráfica de -hidropatía de Kyte y Doolittle (Kite, J. y Doolittle, R.F. A simple meted for displaying the hidropathic character of -a protein. (Un método sencillo para presentar el carácter hidropático de una proteína). Journal of Molecular Biology 157:105-132,1982) indicó que la región precursora putativa era hidrofílica de manera similar a ß3Gal-Tl, -T2 y -T3 (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterization of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa) . J. Biol . Chem. 273:12770-12778, 1998} En contraste, ß3Gal-T4, con especificidad exclusiva para glicolípidos tiene una región precursora hidrofóbica (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterization of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiitransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa). J. Biol . Chem. 213 : 12110-12118 , 1998; Miyaki, H., Fukumoto, S., Okada, M., Hasegawa, T. y Furukawa, K. Expresión cloning of rat cdna encoding UDP-galactcse G(C2; ßl, 3-galactosyltransferase that determines the expresión ef G(D1 b)/G(M 1)G(A1) (Clonación de expresión de ADNc de rata que codifica UDP-galactosa G(D2) ßl, 3-galactosiltransferasa que determina la expresión de G(Dlb)/G(M 1)G(A1). J. Bici . Chem . 272:24794-24799, 1997). Una alineación de secuencias múltiples de cinco ß3Gal-transferasas aparece en la Figura 2. El gen de ß3Gal-T5 tiene la similaridad más alta con ß3Gal-T2. Similaridades entre les cinco genes humanos se encuentran predominantemente en las regiones centrales; no existen similaridades importantes en las regiones de terminal NH-. Varios motivos en los dominios catalíticos putativos se conservan entre todas las secuencias. Es importante observar que tres residuos de cisteína están alineados con todos los genes humanos, y tres adicionales están alineados dentro ß3Gal-Tl, -T2, -T3 y -T5 (Figura 2, Figura 3) . Un sitio de glicosilación enlazado a N potencial ocurre en la región central de los dominios catalíticos putativos, y es conservado en todas las secuencias. De manera similar, un sitio de glicosilación enlazado a N único fue conservado entre todos los miembros de la familia de genes de ß4Gal-T (Schwientek, T.y Almeida, R., Levery, S.B., Holmes, E., Bennett, E.P. y Clausen, H. Cloning of a novel member of the UDP-galactose: ß-N-acetylglucosamine ßl, 4-Galactosyltransferase family, ß4Gal-T4, involved in glicosphingolipid biosyntesis (Clonación de un miembro novedoso de la familia de UDP-galactosa: ß-N-acetilglucosa ina ßl, 4-Galactosiltransferasa, ß4Gal-T4, involucrado en la biosíntesis de glicoesfingolípidos . J. Biol . Chem. 273:29295-29305, 1998 Schwientek et al., 1998). El motivo DXD, del cual se mostró recientemente que era conservado entre varias familias de genes de glicolsiltransferasas (Wiggins, C.A.R. y Munro, S. Activity of the yeast MNNlalfa-1, 3-mannosyltransferase requires a motif conserved in many other families of glycosyltransferases (La actividad de MN lalfa-1, 3-manosiltranferasa de levadura requiere de un motivo conservado en muchas otras familias de glicosiltransferasas) . Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 95:7945-7950, 1998; Bretón, C, Bettler, E., Joziasse, D.H., Geremia, R.A. e Imberty, A. Sequence-function relationships of prokaryotic and eukaryotic galactosyltrasferases (Relaciones secuencias-funciones de galactosiltransferasas procarioticas y eucarioticas) . J. Biochem 123:1000-1009, 1998), se encuentran en presente en todas las ß3Gal-transferasas de ser humano. 5.3 ORGANIZACIÓN GENÓMICA Y LOCALIZACIÓN EN CROMOSOMA DE ß3Gal-T5, BGALT5 La región codificadora de ß3Gal-T5 fue determinada mediante el secuenciamiento de clones de Pl como localizada en un exón único, similar a ßGal-Tl, -T2, -T3 y -T4 (Amado, M., Al eida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterization of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasa) . J. Biol . Chem. 273:12770-12778, 1998) . Se confirmó en una secuencia genómica de 164 kb recientemente divulgada (Número de Acceso GenBank AF064860) . BGALT5 se localiza en el cromosoma 21q22.3. Los demás transgenes en la familia se localizan en cromosomas diferentes BGALT2 (lq31) , -T3 (3q25), y -T4 (6p21.3) (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasa) . J. Bi ol . Chem . 273:12770-12778, 1998) . 5.4 EXPRESIÓN DE ß3GAL-T5 EN CÉLULAS DE INSECTO La expresión de un constructo soluble de ß3Gal-T5 en células Sf9 resultó en un incremento notable (de 20 a 30 veces) de la actividad galactosiltransferasa empleando sustratos de aceptador que contenían ßGlcNAc terminal, en comparación con células no infectadas o bien con células infectadas con constructos irrelevantes (no se muestra) . Un análisis de la especificidad de sustrato de actividad ß3Gal-T5 parcialmente purificada mostró que todos los sustratos efectivos contenían ßGlcNAc en un extremo no reductor (Tabla I) . Tabla I Especificidad de sustrato de ß3Gal -T5 con aceptadores de sacáridos ß3Gal- -T5'3 Concentración de sustrato 1 5mM D-GIcNAc 0. 5 1.2 ß-D-GicNAc-Bzl'' 1. 5 3.9 ß-D-GlcNAc-1-p-Nph /__ 1 6.9 ß-D-GlcNAc-1-thio-p-Nph 1 - 3.4 ß-D-G1cNAc-Me-umb . c 7.5 ß-D-GalNAc-Me-umb 0 0 0.0 a-D-GlcNAc-Bzl c o 0.0 a-D-GalNAc-Bzl a-D-Gal-1-o-Nph 0.0 ß-D-Gal-1-o-Nph r, n ß-D-Glc-Me-umb ß-Gal- (1-4) -ß-D-Xyl-1-Me-umb" ß-D-GlcNAc-(l-3)-ß-D-Gal-l-Me S~.4 -1.4 ß-D-GlcNAc- (1-3) -a-D-GalNAc-p-Nph 11. 34.4 ß-D-GlcNAc- (1-6) -a-D-Man-1-Me 4.0 13.0 ß-D-GlcNAc- (1-2) -a-D-Man 0.0 ß-D-GlcNAc- (1-2) -a-D-Man- (1-3) - [ß-D-GlcNAc- (1-2) -a-D-Man- (l-6)-]D-Man c.o .0 3 Enzima parcialmente purificada de conformidad on lo descrito en otra parte en este documento. D Bzl, bencilo; Me, metilo; Me-Umb, 4-metilo-umbeliferilo; Nph, nitrofenilo. preparado enzimáticamente empleando -3-D-Xyl-l-Me- mb y UPD-Gal como sustratos (R. Almeida, H. Clausen, no publicados) . Entre los derivados de sacáridos simples probados el disacárido ß-D-GlcNAc- (1-3) -ß-D-Gan-1-Me fue mejor que todos los demás derivados de sacáridos. Esto en contraste con ß3Gal-Tl y -T2 que presentaron actividades relativa muy bajas con disacáridos empleados como sustratos (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N- cetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de iDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa). J. Biol . Chem. 273:12770-12778, 1998; Kolbinger, F., Streiff, M.B. y Ktopodis, A.G. Cloning of a human UDP-galactose : 2-acetamido-2-deox?-D-glucose 3ß-galactosyltransferase catalysing the formatien of type 1 chains (Clonación de una UDP-galactosa: 2-acetamida-2-deoxi-D-glucosa ß3-galactosiltransferasa de ser humano que cataliza la formación de cadenas de tipo 1) . J. Biol . Chem. 273:433-440, 1998; Hennett, T., Dinter, A., Kuhnert, P., Mattu, T.S., Rudd, P.M. y Berger, E.G. Genomic cloning and expresión of three murine UDP-galactose: ß-N-acetylsiucosamine ßl,3-galactosiltransferasa genes (Clonación genómica y expresión de tres genes de UDP-galactosa: ß-N-acetilglucosamina ßl,3- galactosiltransferasa de murino). J. Biol . Chem . 273:58-65, 1998) . ß3Gal-T5 mostró una actividad limitada con derivado de sacárido que representan estructuras de núcleo enlazadas con N a saber ß-D-GlcNAc- ( 1-6) -a-Man-1-Me, pentasacárido biantenario y ß-D-GlcNAc- (1-2) -a-D-Mau. Es especialmente sorprendente observar que una actividad relativamente elevada hacia ß-D-GlcNAc- (1-3) -a-D-GalNAc-1-p-Nph, que representa la estructura enlazada con O de núcleo 3. Una comparación de actividades relativas de varias ß3- y 4Gal-transferasae con estructuras enlazadas con O de núcleo 3 y núcleo 2 se presenta en la Tabla II. TABLA II Actividades con aceptadores de núcleo 2 y 3 de zipo mucina ßGlcNAc-Bzlc ßGlcNAc (1, 3) aGAlNAC-p-Nph 0.2 mM 2 mM nmol/min n ol/min ß3Gal-Tla 0.03 0.0 (0.0) 0.0 (0.0) ß3Gal-T2 0.04 0.0 (0.0) 0.0 (0.0) ß3Gal-T5 0.1 0.3 (0.3) 0.2 (2.0) ß4Gal-T2 0.03 0.2 (0.6) 0.01 (0.3) -ß4Gal-T3 0.03 0.1 (0.3) 0.03 (1.0) ßGlcNAc- (1, 6) [ßGal (1, 3) aGAlNAC-p-Nph 0.2 mM 2 mM nmol/min nmol/min ß3Gal-Tl3 0.0 (0.0) 0.0 (0.0-ß3Gal-T2 0.0 (0.0) 0.0 (0.0) ß3Gal-T5 0.0 (0.0) 0.01 (0.1) ß4Gal-T2 0.03 (1.0) NA ß4Gal-T3 ND ND a Enzima parcialmente purificada de conformidad con lo descrito en otra parte en este documento. b ß-D-GlcNAc-Bzl fue empleada a 80mM con ß3Gal-Tl y ß3Gal-T2; a 20mM con ß3Gal-T5; a 0.25mM con ß4Gal-T2 y a 2mM con ß4Gal-T3. ND, no determinado. NA, no aplicable debido a inhibición, (), proporción entre valores obtenidos ccn núcleo 2 o 3 y los obtenidos con ßGlcNAc-Bzl. Ninguna de las ß3Gal-Ts emplea el sustrato de núcleo 2 y solamente ß3Gal-T5 catalizó la glicosilación de sustratos de núcleo 3. Las dos ß4Gal-Ts probadas presentaron una actividad menor que ß3Gal-T5 con el sustrato de núcleo 3, sin embargo, una comparación directa no es posible. Sin embargo, se encontraron estructuras de cadena de tipo 1 en el núcleo 3 (van Halbeek, H., Dorland, L., Vliegenthart, J.F.G., et al. Primary-structure determination of fourteen neutral oligosaccharides derived from bronchial-mucus glycoproteins of patients suffering from cystic fibrosis employing 500-MHz 1H-NMR spectroscopy, (Determinación de estructura primaria de catorce oligosacáridos neutros derivados de glicoproteínas de bronquios-mucosa de pacientes que padecen de fibrosis quística empleando 1H-NMR espectroscopia a 500-MHz) . Eur J Biochem 7-20, 1982), pero a nuestro leal saber y entender las estructuras de núcleo 2 están siempre extendidas por cadenas de N-acetilactosamina de cadena de tipo 2. El análisis de ß3Gal-Ts con aceptadores de glicoproteína (Tabla III) mostró que ß3Gal-T5 empleó solamente mucina submaxilar bovina que lleva aproximadamente 10% de glicanos enlazados con O de núcleo 3 de terminal de GlcNAc (Mártensson, S., Levery, S.B., Fang, T. y 3er.aiak, B. Neutral core oligosaccharides of bovine submaxiliary mucin. Use of lead tetraacetate in the cold for establishing branch positions (Oligosacáridos de núcleo neutrales de mucina submaxilar bovina. Uso de tetraacetate de plomo en frío para establecer posiciones de ramificación) . Eur J Biochem 258, 603-622, 1998) . TABLA III Especif idad de sustrato de ß3galaczcsil t,ransf erasas con aceptadores de gli coprozeínas Sustrato ß3Gal-Tl3 ß3Gal-T2 ß3Gal-T5 aceptador3 mmol/min mmol/min mmol/min ß-D-GlcNAc-Bzl 0.3 0.4 0.1 Albúmina de 0.0 (0.0) 0.02 Í0.5) 0.0 (o.o; gallina Asíalo- 0.01 (0.31 O . O'i (1.8) 0.0 (0.0) agalacto-fetuina Mucina 0.0 (0.0) 0.0 (0.0) 0.04 ; o . 4 ) submaxilar bovina Orosomucoide 0.0 (0.0) 0.0 (0.0) 0.0 (1.0) ß-o-GlcNac-Bzl se empleó a 80 mM para ß3Gal-Tl y ß3Gal- 2 y a 20mM para ß3Gal-T5; ( ) , proporción entre valores obtenidos con glicoproteínas y los obtenidos con ß-D-GlcNAc-Bzl . Como se reporte previamente y en el presente estudio, ß3Gal-T2 utilizo glicoproteínas con glicanos enlazados con N mientras que ß3Gal-Tl no mostró ninguna actividad con aceptadores de glicoprcteína o bien solamente mostró una actividad muy baja (Amado, M., Almeida, R. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactcsyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetyiglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine 31, 3- Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina 31,3- Galactosiltransferasa) . J. Bi ol . Chem. 2".3 : 12770-12778, 1998) (Tabla III) . Una especifidad diferencial similar para glicoproteínas se encontró entre ß4Gal-transferasas, en donde ß4Gal-Tl, -T2 y -T3 catalizan la glicosilacicn de glicoproteínas enlazadas con N, pero un miembro novedoso, ß4Gal-T4, parece ser inactivo con estos sustratos (Schwientek, T., Almeida, R., Levery, S.B., Holmes, E., Bennett, E.P. y Clausen, H. Cloning of a novel member ef the UDP-galactose: ß-N-acetylglucosamine ßl.4-galactosyltransferase family, ß4Gal-T4, involved in glicosphingolipid biosyntesis (Clonación de un miembro novedoso de la familia de U P-galactosa: ß-N-acetilglucosamina ßl, 4-galactosiltransferasa, ß4Gal-T4, involucrado en la biosíntesis de gliceesfingolípidos . J. Biol . Chem. 273:29295-29305, 1998). El análisis de las actividades catalíticas con un panel de sustratos de glicolípidos mostró que ß3Gal-T5 tiene una alta actividad con GlcNAcßl-3Galßl-4Glcßa-Cer Í c3) , ya sea en taurodesoxicolato o bien Tritón CF-54 (Tabla IV) . TABLA IV Especificidades de sustra to cor. aceptadores de glicolípidos ß3G ul-T55 Sustrato de aceptado:. Cc Tritón CF- -54 µmo 1/h/mg GlcCer (Glcßl-Cer) 14 ND LacCer (Galßl-4Glcßl-Cer) ND ND Gb3 (Galal-4Galßl-4Glcßl-Cer) ND ND Gß, (GalNAcßl-3Galal-4Galßl- . 6 0 . 09 4GlCßl-Cer) Gg3 (GalNAcßl-4Galßl-4Glcßl-Cer) . 9 0.005 GM- (GalNAcßl- (NeuAca2-3) Galßl- XD ND 4GlCßl-Cer) GM- (Galßl-3GalNAcßl-4 (NeuAca2-3) XD ND -Galßl-4Glcßl-Cer) Le3 (GlcNAcßl-3Galßl-Cer) 4.4 3.6 nLc.; (Galßl-4GlcNAcßl-3Galßl- ND ND 4Glcßl-Cer) nLC (GlcNAcßl-3Galßl-4GlcNAcßl- 1.6 0.4 4Glcßl-Cer) a Enzima parcialmente purificada de conformidad con lo descrito en otra parte en este documento y la concentración específica de proteína se estimo mediante SDS-PAGE. en 300µg/ml. fc Se efectuaron ensayos empleando IQOµg de taurodesoxicciato (TDOC) o bien Tritón CF-54/100µg de mezcla de reacción. ND, no detectable. Se encontró también actividad con nLc=, pero esta actividad fue 3 veces menor que con Lc3, y la actividad fue significativamente menor en Tritón CF-54. De manera interesante, se observó una actividad considerable con Gb_ y se observó una incorporación detectabie en GlcCer y Gg_ . El producto formado con Gb4 fue caracterizado y se encontré que representaba primariamente la estructura Galßl-3Gb.; esperada. El Km aparente de ß3Gal-T5 para Lc;Cer en presencia de taurodesoxicolato fue de aproximadamente 2µM, pero debido a la inhibición de sustrato, este resultado se basó solamente en puntos de datos a bajas concentraciones. La especificidad de sustrato de aceptador y las propiedades cinéticas de ß3Gal-T5 son similares a una acfividad ß3Gal-transferasa traqueal porcina previamente reportada (Sheares, B.T. y Carlson, D.M. Characterization of UI?-galactose: 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose 3 beta-galatosyltransferase from pig trachea (Caracterización de UDP-D-galactosa: 2-aceta?tido-2-deoxi-D-glucosa 3 beta-galactosiltransferasas a partir de traquea de cerdo). J. Biol . Chem. 258:9893-9898, 1983) y actividad ß3Gal-tansferasa de colon de ser humano (Seko, A., Ohkura, T., Kitamura, H., Yonezawa, S., Sato, ?. y Yamashita, K. Quantitative differences in GIcNAc:betal -->3 and GlcNAc:betal-->4 galactosyltransferase activities between human colonic adenocarcinomas and normal oelonic mucosa (Diferencias cuantitativas en actividades GlcNA.e : betal -->3 y GlcNAc:beta 1—>4 galactosiltransferasa entre ader-ecarcinoma de colon de ser humano y mucosa de colon normal. Cáncer Res 56:3468-3473, 1996). Tanto las actividades ß33al-transferasa de cerdo como de ser humano tienen Kms aparentes para UD?-Gal de 200-220 µM empleando sustratos de aceptadores 3GlcNAcßl-3Gal (GalNAc) , y la ß3Gal-T5 recombinante secretada tenía un Km aparente de 169 µM (Tabla V) . TABLA V Propiedades cinéticas de ß3Ca.l -T5 ß33al-T5a Sustratoc Km Vmax mM pmol/min UDP-Gal 0 . 169 1422 . 2 ß-D-GlcNAc-Bzl 20.4 873.4 ß-D-GlcNAc- (1-3) -a-D-GalNAc-p-Nph 2.8 931.1 ß-D-GlcNAc- (1-3) -a-D-Gal-Me 1.8 972.9 a Enzima parcialmente purificada de conformidad con io descrito en otra parte en este documento. fc Las concentraciones empleadas fueron 25-400 µM para UE?-Gal, 3.75-60 mM para ß-D-GlcNAc-Bzl y 0.3125-5 iriM para ß-I-GlcNAc- (l-3)-a-D-GalNAc-p-Nph y ß-D-GlcNAc (1-3) -a-D-Gal-Me . Estos Kms relativamente elevados de sustrato de donadores son significativamente diferentes de los reportados para ß3Gal-Tl y -T2 (90 y 37µM, respectivamente) (Amado, M., Almeida, ?. Carneiro, F., et al. A Family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamir.e ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas de ser humano: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-X-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasas) . J. Biol . Chem. 273 : 12770-127"ó, 1998) . De manera interesante, la actividad del constructo codificador de longitud completa de ß3Gal-T5 analizado en Tritón CF-54 de homogenados de células de insectos infectadas, mostró un Km aparente más bajo de 33µM para el sustrato donador (no se muestra) . La actividad ß3Gal-transferasa purificada analizada por Sheares, et al .

(Sheares, B.T. y Carlson, D.M. Characterization of UDP-galactose: 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose 3 beta-galatosyltransferase from pig trachea (Caracterización de UDP-D-galactosa: 2-acetamido-2-deoxi-D-glucosa 3 beta-galactosiltransferasas a partir de traquea de cerdo) . J. Biol . Chem. 258:9893-9898, 1983; sin embargo, representa probablemente una forma truncada proteolíticamente disociado que se encuentra frecuentemente con preparaciones de glicosiltransferasa purificadas per afinidad (Clausen, H., White, T., Takio, K., et al. Isoiation to homogeneity and partial characterization of a histo-blood group A defined Fue alpha 1 2Gal alpha 1 3-N-acetylgalactosaminyltransferase from humanlung tissue (Aislamiento a homogeneidad y caracterización parcial del grupo A de histo definió Fue alpha 1 2Gal alpha 1 3-N-acetilgalatosaminiltransferasa a partir de tejido pulmonar humano). J. Bi ol . Chem. 265:1139-1145, 1990). Además, Holmes (Holmes, E.H. Characterization and -membrane organization of beta 1 3- and beta 1 4- galatosyltransferases from human colonic adenocarcinoma cel lines Cob 205 and S 403: basis for preferential syntesis of type 1 chain lacto-series carbohydrate structures (Caracterización y organización de membrana de beta 1 3- y beta 1 4- galactosiltransferasas de líneas de células de adenocarcinomas de colon de ser humano Cob 205 y S 403: base para ia síntesis preferencial de estructuras de carbohidratos de serie lacto de cadena de tipo 1). Arch. Bi ochem Bi ophys 270:630-646, 1989) reportaron que una actividad de ß3Gal-T no codificada a partir de células Colo205 tenia un Km aparente para UDP-Gal de 43µM empleando glicolípidos como sustrato de aceptador. Esta preparación puede contener tanto formas enteras como formas secretadas de transferasas. La forma de longitud completa recombinante de ß3Gal-T5 se pareció a la forma secretada recombinante en todos los demás aspectos probados. La actividad ß3Gai-transferasa porcina tenía un Km aparente para núcleo 3 de 2.4 mM y ß3Gal-T5 presentó un Km aparente para núcleo 3 de 2.8 mM. Holmes (Holmes, E.H. Characterization and membrane organization of beta 1 3- and beta 1 4-galatosyltransferases from human colonic adenecarcinoma cei lines Cob 205 and S 403: basis for preferential syntesis of type 1 chain lacta-series carbohydrate structures (Caracterización y organización de membrana de beta 1 3- y beta 1 4- galactosiltransferasas de líneas de células de adenocarcinomas de colon de ser humano Cob 205 y S 403: base para la síntesis preferencial de estructuras de carbohidratos de serie lacto de cadena de tipo 1) . Arc?. Bi ochem Biophys 270:630-646, 1989) reportó un Km para Lc.Cer de 13µM para la actividad ß3Gal-T a partir de células Colo205. El mejor sustrato identificado para ß3Gal-T5 fue ß-D-GlcNAc (1-3) -D-ß-Gal-1-MetKm aparente de 1.8 mM (Tabla V) ] . Esto es similar al Km aparente de 2.9 mM para la actividad 33Gal-T de colon de ser humano para ß-D-GlcNAc (1-3) -D-ß-Gal (1-4) -D-ß-Glc (Seko, A., Ohkura, T., Kitamura, H., Yonezawa, S., Sato, E. y Yamashita, K. Quantitative differences in GlcNAc:betal —>3 and GlcNAc:betal—>4 galactosyltransferase activities between human colonic adenocarcino as and normal colonic mucosa (Diferencias cuantitativas en actividades GIcNAc:betal -->3 y GIcNAc:beta l-->4 galactosiltransferasa enfre adenocarcinoma de colon de ser humano y mucosa de colon normal. Cáncer Res 56:3468-3473, 1996). ß3Gal-T5 mostró una especificidad estricta de sustrato de donador para UD?-Gal y no utilizó UDP-GalNAc ni UDPGlcNAc con los sustratos de aceptador probados (datos no ilustrados) . La expresión del constructo de codificación entera de 33Gal-T? en células Sf9 60 horas después de la infección resultó en la conservación de virtualmente la totalidad de la actividad ß3Gal-transferasa en célula (Tabla VI) . TABLA VI Expresión de constructos de codificación enteres de ß3Gal-Tl y ß3Gal -T5 ß3Gal-Tlb ß3Gal-T5 Células Medio Células Medio nmol/min/ml nmol/min/ml ß-D-GlcNAc- 7.2 0.2 1.5 1.1 3 Se empleó ß-D-GlcNAcBzl a 20mM. r Las fuentes de enzimas fueron el medio o bien homogenados de células Tritón CF54 al 1% a partir de células SfS transfectadas con ß3Gal-Tl y -T5, cosechadas 60 horas después de la infección. Esto se encontró también para ß3Gal-Tl (Tabla VI) y lo mismo ha sido encontrado para las demás ß3Gal-Ts así como para varias ß4Gal-Ts y GalNAc-transferasas de polipéptido (no se muestra) . En contraste, más del 50% de la actividad enzimática se encuentra en el medio después de 60 horas de transfección cuando se emplearon constructos truncados secretados. 5.5 ESPECTROSCOPIA ~H- Y 13C~NMR DE PRODUCTO FORMADO POR GLICOSILACIÓN DE NÚCLEO 3-P-NPh CON ß3Gal-T5 El producto derivado de la reacción de 33Gal-T5 con GlcNAcßl -> 3GalNAcal -* IpNp fue caracterizado per espectroscopia NMR para confirmar que la unión apropiada estaba formada entre el azúcar donador y el sustrato aceptador. La comparación de un espectro de 1H-NMR de 1-D del producto (Figura 4) con el espectro del sustrato (no ilustrado) mostró claramente una resonancia de H-l adicional (4.467 ppm) a partir de un residuo de azúcar enlazado en la configuración ß (JJi._ = 7-9 Hz) . Esto fue acompañado por un desplazamiento tanto debajo de la resonancia H-l de ß-GlcNAc a 4.719 ppm (?d 0.065), de conformidad con lo esperado en efectuarse la glicosilación de este residuo. Sin embargo, criterios de desplazamiento químico anomérico solos son insuficientes para determinar la identidad y posición de enlace del residuo recién agregado. Puesto que no pudimos encontrar datos NMR para los glicosidos para-nitrofenilo de sustrato de núcleo C o bien del producto de núcleo 3 de Galß3 esperado en la literatura o bien en las bases de datos de NMR glicoconjugado, y puesto que los efectos anisotrópicos sustanciales del grupo paranitrofenilo impiden una comparación directa de los datos de cambio químico con los datos de benzilglicosidos (Pollex-Kruger, A., Meyer, B., Stuike-Pill, R., Sinnwell, V., Matta, K.L. y Brockhausen, I. Preferred conformations and dynamics of five core structures of mucin type O-glicans determined by NMR spectroscopy and forcé field calculations (Conformaciones y dinámicas preferidas de cinco estructuras de núcleo de O-glicanos de tipo mucina determinadas por espectroscopia NMR y cálculos de campo de fuerza). Glyco conj gate J 10:365-380,1993) . TABLA VII Cambios químicos según *H, ~~C (ppm) y constantes de acoplamiento ?-? (HZ) para sustrato de núcleo 3-p-Nph y producto biosíntetico Galß3-núcleo 3-p-Nph en D:0 a una temperatura de 25° C. Núcleo 3 Galßl-3-Núcleo3 GlcNacB GalNAca Galß3 GlcNAcß3 GalNAca 3 H-la 4.654 5.785 4.467 4.719 5.787 H-2 3.734 4.502 3.525 3.866 4.505 H-3 3.584 4.237 3.651 3.854 4.253 H-4 3.488 4.291 3.919 3.589 4.303 H-5 3.453 4.002 3.721 3.498 4.002 H-6R 3.780 3.732 3.764 3.800 3.731 H-6S 3.918 3.679 3.764 3.918 3.681 H-8 2.033 2.036 N.A.fc 2.C26 2.037 (Me) J?,? 8.2 3.6 8.0 8.0 3.7 Ji,"- 10.2 11.3 10.3 N.F.0.: 10.9 Jj.i 8.2 3.1. 3.6 8.0 3.0 J*,? 9.8 <1.5 <1.5 10.1 <1.5 Jc.,f>K 5.1 7.7 N . D . 5.1 8.0 J3.6? 2.1 4.6 N.D. 2.2 4.4 JR, ? -12.3 -11.8 N.F.O. -12.4 -11.7 C-1 102.33 95.51 103.24 101.99 95.48 C-2 55.38 47.80 70.41 54.45 47.76 C-3 73.17 75.88 72.31 81.86 76.01 C-4 69.53 68.36 68.29 68.25 68.27 C-5 75.48 71.63 75.10 74.94 71.61 C-6 60.25 60.69 60.75 60.21 60.63 C-7 174.28 173.61 N.A. N.D. N.D. (C=0) C-8 21.99 21.76 N.A. 21.90 21.79 (Me) 3 los cambios químicos son con referencia a la acetona interna (2.225 y 30.00 ppm para 'H y iJC, respectivamente). c N.A., no aplicable. " N.F.O., no de primer orden. d N.D., no determinado. El análisis de datos de constante de acoplamiento confirmó que el residuo adicional era un ß-Gal ( ~ J¿> _ < 1.5 Hz) . El enlace 1 —> 3 fue confirmado por los siguientes criterios: (i) el cambio químico inducido por glicosilación más importante entre los protones de núcleo 3 fue observado para ß-GlcNAc H-3 (?d = 0.270); (ii) de manera consistente con esto, en un espectro "H-1H ROESY del producto (no ilustrado) , el incremento de cuadro Overhauser giratorio más fuerte observado a partir de ß-Gal H-l fue para ß-GlcNAc H-3; (iii) no se observaron otras correlaciones interresiduos originándose a partir ß-Gal H-l, y no se introdujo ninguna ambigüedad en la interpretación del espectro ROESY por la casi degeneración de ß-GlcNAc H-2 y H-3 en el producto, puesto que no existe ningún sitio de glicosilación potencial en C-2; (iv) la comparación de los datos de espectro ~~C para el sustrato y producto mostró solamente un desplazamiento campo abajo significativo inducido por glicosilación, para ß-GlcNAc C-3 (?d 8.69). La magnitud del cambio de desplazamiento de 13C es esencialmente de diagnóstico para la glicosilación en ese sitio. El producto formado con Gb4 fue caracterizado por espectroscopia de "H-NMR de 1-D (no ilustrada) ; aún cuando se detecto más que un componente, cinco resonancias ano éricas fueron claramente observadas para el componente mayor, con desplazamientos químicos y constantes de acoplamiento ~J:,: virtualmente idénticas a las obtenidas previamente para Galßl — > 3Gb (Kannagi, R., Levery, S.B., Ishigami, F. , et al. New globosides Glycosphingolipids in huma teratocarcino a reactive with the monoclonal antibody directed to a developmentally regulated antigen, stage-specific embryonic antigen 3 (Nuevos globosidos en gliceesfingolípidos en teratocarcinoma humano reaccionan con el anticuerpo monoclonal dirigido aun antígeno regulado por desarrollo, el antígeno embrionico 3 específico de etapa; . J. Bi ol . Chem . 258:8934-8942, 1983). Fueron 4.810 ppm (~Z-_, = 3.6 Hz) , 4.620 ppm (3J?,; = 7.7 Hz) , 4.267 ppm (?J:, = 7.4 Hz) , 4.198 ppm ("J:,: = 7.9 Hz) t 4.173 ppm ( J;.,; = 7.9 Kz) , correspondiendo a H-l de Gala4, GalINAcß3, Galß4, Galß4, y Glcñl, respectivamente, de la secuencia Galßl - 3Gb4. Resonancias anoméricas de Gb sin reaccionar fueron también detectadas en el producto. La identidad de un tercer componente menor, separable por HPTLC de preparación, se encuentra actualmente bajo investigación. 5.6 ANÁLISIS NORTHERN DE ß3GAL-T5 Un análisis Northern de múltiples manchas Northern (MTN) de Clontech no produjo señales en varios intentos. Un análisis de secuencia sugirió que el transcripto pudiera rebasar 10 kilobases (kb) , con base en el hallazgo de la primera señal de consenso de poliadenilación corriente arriba. Por consiguiente, una ausencia de señal en las manchas comerciales pudiera explicarse por una transferencia limitada de ARNm grandes. Una mancha fue preparada ccn ARN total de líneas de células de carcinoma humano, y se tomó el cuidado de asegurar una transferencia eficiente de especies de ARNm largas . Esto proporcionó bandas hibridantes en 12 kb c más para tres líneas de células: AsPc-1, HPAF, Suit2, y S2-013. Es interesente observar que aparte del EST único identificado para la región codificadora de ß3Gal-T5, no ESTs derivados de cualquier parte del 3'UTR de la región de aproximadamente 10 kb ha sido incluido en las bases de datos de EST. No resulta claro ahora porque esta proteína de masa promedio es codificada por un transcrito de ARNm de 12 kb. 5.7 AD?, VECTORES Y CÉLULAS HUÉSPEDES PARA ß3GAL-T? En la práctica de la presente invención, muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, AD? recombinante, e inmunología, se emplean. Tales técnicas son bien conocidas y se explican totalmente, por ejemplo, en Sa brook, et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual , Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ?ew York; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II, 1985 (D.?. Glover ed. ) ; Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed. ) ; Nucleic Acid Hybridi za tion, 1985, (Hames and Higgins) ; Transcription and Transla tion , 1984 (Hames and Higgins eds.); animal Cell Cul ture, 1986 (R.I. Fresney ed.); Immcbilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; la serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M.P. Carlos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology Vol. 154 y Vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds., respectivamente); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1937 (Mayer and Waler, eds; Academic Press, London); Scopes, 1987, Protein Purification : Principies and Practice, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.) y Handbook of Experimental Immunology, 1986, Volúmenes I-IV (Weir and Blackwell eds.); Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Bioiogy series of laboratory technique manuals (en los protocolos actuales en la serle de Biología Molecular de manuales técnicos de laboratorio) , O 1987-1997 Current Protocols, © 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.); y Dyson, N.J., 1991, Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis (Inmovilización de ácidos nucleicos y análisis de hibridación) , En: Essential Molecular Biology: A practical Approach, Vol. 2, T.A. Brown, ed., pp . 111-156, Press at Oxford University Press, Oxford, Reino Unido; cada uno de los cuales se incorpora por referencia aquí en su totalidad) .

La invención abarca fragmentos aislados de ácido nucleico que comprenden la totalidad o una parte de la secuencia de ácido nucleico divulgada aquí como se muestra en la figura 1. Los fragmentos tienen por lo menos aproximadamente 8 nucleótidos de longitud, de preferencia por lo menos aproximadamente 12 nucleótidos de longitud, y de preferencia por lo menos aproximadamente 15-20 nucleótidos de longitud. Además tales fragmentos pueden tener por lo menos aproximadamente 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5001 o bien 10,000 nucleótidos de longitud. La invención abarca además ácidos nucleicos aislados que comprenden secuencias que pueden hibridarse en condiciones estrictas de 2X SSC, 55°C, con la cuarta secuencia en la Figura 1; de preferencia, los ácidos nucleicos pueden hibridarse a 2X SSC, 65°C; y con mayor preferencia pueden hibridarse a 0.5X SSC, 65°C. Los ácidos nucleicos pueden aislarse directamente de las células. Alternativamente, se puede emplear en métodos de reacción en cadena de polimeraza (PCR) para producir los ácidos nucleicos de la invención, empleando ya sea hebras sintetizadas químicamente o bien material genómico como templados . Los iniciadores empleados para reacción en cadena de polimerasa pueden ser sintetizados empleando la información de secuencia proporcionada aquí y pueden además ser diseñados para introducir nuevos sitios de restricción apropiados, si se desea, para facilitar la incorporación en un vector dado para expresión recombinante. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar planteados por secuencias regulatorias humanas naturales, o bien pueden estar asociados con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, realzadores, elementos de respuesta, secuencias de señales, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificadoras 5'- y 3'-, y similares. Los ácidos nucleicos pueden también estar modificados por cualquier medio conocido en la técnica. Ejemplos no limitativos de tales modificaciones incluyen metilación, "capas", sustitución de uno o varios de los nucleótidos que ocurren naturalmente con un análogo, modificaciones internucleótidos, por ejemplo, las modificaciones con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfanatos, fosfotriesteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Ácidos nucleicos pueden contener una o varias porciones enlazadas covalentemente adicionales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señales, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelatores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidantes, etc.), y alquilatores . El ácido nucleico puede ser derivado mediante la formación de un enlace de alquilfosforanlidato o metil o etil fosfotriester . Además, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden también ser modificadas con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea directa o indirectamente. Marcadores ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, y similares. De conformidad con la presente invención, sondas útiles comprenden una secuencia de sonda de por lo menos ocho nucleótidos de largo que consiste de la totalidad o una parte de la secuencia seleccionada entre las secuencias presentadas en la Figura 1 o variantes conservadoras de secuencia o conservadoras de función de la misma, o bien un complemento de la misma, y que ha sido marcada de conformidad con lo descrito arriba. La invención ofrece también vectores de ácido nucleieo que comprenden la secuencia divulgada o derivados o fragmentos de la misma. Un gran número de vectores, incluyendo vectores de plásmido y fúngales, han sido descritos para la replicación y/o expresión en varios huéspedes eucarióticos y procarióticos, y pueden emplearse para terapia génica así como para simple clonación o expresión de proteína. Vectores de clonación recombinantes incluyen frecuentemente uno o varios sistemas de replicación para clonación o expresión, uno o varios marcadores para selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a los antibióticos y uno o varios cassettes de expresión. Las secuencias codificadoras insertadas pueden ser sintetizadas por métodos estándares, aisladas de fuentes naturales, o bien preparadas como híbridos, etc. La ligación de las secuencias codificadoras con elementos regulatorios transcripcionales y/o otras secuencias de codificación de aminoácidos puede lograrse por métodos conocidos. Células huéspedes adecuadas pueden ser transformadas/transfectadas/infectadas según lo apropiado por cualquier método adecuado incluyendo electroporación, absorción de ADN mediada por CaCl2, infección fungal, microinyección, microproyectil, y otros métodos establecidos. Células huéspedes apropiadas incluyen bacterias, arquebacterias, hongos, especialmente levadura, y células de plantas y animales, especialmente células de mamífero. Son especialmente interesantes Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombi , células SF9, células C129, células 293, Neurospora , y células CHO, células COS, células HeLa, así como líneas de células de mieloides y linfoides de mamífero inmortalizadas. Sistemas de replicación preferidos incluyen M13, ColEl, SV40, báculovirus, lambda, adenovirus, y similares. Un gran número de regiones que regulan el inicio y la terminación de transcripción han sido aisladas y son efectivas en la transcripción y traslación de proteínas heterólogas en los varios huéspedes. Ejemplos de estas regiones, métodos de aislamiento, forma de manipulación, etc. se conocen en la técnica. En condiciones de expresión apropiadas, células huéspedes pueden ser empleadas como fuente de péptidos y polipéptidos derivados de ß3Gal-T5 producidos recombinantemente . De manera provechosa, los vectores pueden también incluir un elemento de regulación de transcripción (es decir, un promotor) enlazado operativamente sobre una porción codificadora de ß3Gal-T5. El promotor puede contener opcionalmente porciones de operador y/o sitios de enlace de ribosoma. Ejemplos no limitativos de promotores bacterianos compatibles con E. coli incluyen: promotor de ß-lactamasa (penicilinasa) ; promotor de lactosa; promotor de triptofano (trp) ; promotor de operon BAD arabinosa; promotor Pi derivado de lambda así como sitio de enlace de ribosoma de gen N; y el promotor híbrido tac derivado de secuencia de promotores de UV5 trp y lac. Ejemplos no limitativos de promotores de levadura incluyen promotor de 3-fosfogliceratquinasa, promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) ; promotor de galactoquinasa (GALI) , promotor de galactoepimerasa, así como promotor de alcohol deshidrogenasa (ADH) . Promotores adecuados para células de mamífero incluyen sin limitación, promotores virales tales como promotores del virus 40 del Simio (SV40) , virus de sarcoma de Rous (RSV) , adenovirus (ADV) , así como virus de papiloma bovino (BPV) . Células de mamíferos pueden requerir también de secuencias de terminador y secuencias de poli A adición y secuencias de realzador que incrementan la expresión pueden también incluirse; secuencias que provocan la amplificación del gen pueden también ser deseables. Además secuencias que facilitan la secreción del producto recombinante a partir de células, incluyen sin limitarse a ellos bacterias, levadura, células de animales, tales como secuencias de señales de secreción y/o secuencias proregión prohormona, pueden también incluirse. Estas secuencias son conocidas en la técnica. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tipo silvestre o variantes pueden también introducirse en células por eventos de recombinación. Por ejemplo, dicha secuencia puede ser introducida en una célula, y lograr de esta forma recombinación homologa en el sitio de un gen endógeno o una secuencia con una identidad sustancial con el gen. Otros métodos basados en recombinación tales como recombinaciones no homologas o bien remoción de genes endógenos por recombinación homologa pueden también emplearse. Los ácidos nucleicos de la presente invención son útiles, como por ejemplo, como sondas para remover organismos relacionados y como templados para la producción recombinante de péptidos o polipéptidos. Estas y otras modalidades de la presente invención se describen con mayores detalles a continuación. 5.8 POLIPÉPTIDOS DE ß3GAL-T5 La presente invención abarca péptidos aislados (generalmente definidos como polipéptido que tiene menos que 50 residuos de aminoácidos) y polipéptidos codificados por la secuencia de ácido nucleico divulgada. Los péptidos tienen de preferencia por lo menos 5 residuos de longitud. Los péptidos o polipéptidos pueden tener, por ejemplo, 6, 10, 15, 30, 50, 100, 200 o 300 residuos de longitud. Ácidos nucleicos que comprenden secuencias codificadoras de proteína pueden emplearse para dirigir la expresión recombinante de polipéptidos en células intactas o bien en sistemas de traslación sin células. El código genético conocido, adaptado si se desea para una expresión más eficiente en un organismo huésped dado, puede emplearse para sintetizar oligonucleótidos que codifican las secuencias deseadas de aminoácidos. El método de soporte sólido de fosforamidita de Matteucci et al . , 1981, J. Am. Chem . Soc . 1_03:3185, el método de Yoo et ai., 1989, J. Bid. Chem. 764 : 17078, o bien otros métodos bien conocidos pueden emplearse para dicha síntesis. Los oligonucleótidos resultantes pueden ser insertados en un vector apropiado y expresados en un organismo huésped compatible. Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo variantes que conservan la función de la secuencia divulgada, puede ser aislados a partir de organismos o células nativos o bien a partir de organismos de células heterólogos (incluyen, sin limitarse a ellos, bacterias, hongos, células de insectos, plantas y mamíferos) en donde una secuencia codificadora de proteína ha sido introducida y expresada.

Además, los polipéptidos pueden ser parte de proteínas de fusión reco binantes. Métodos para purificación de polipéptidos son bien conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitación, electroforesis en gel de disco de preparación, enfoque isoeléctrico, HPLC, HPLC de fase reversa, filtración en gel, intercambio de iones y cromatografía de partición, así como distribución a contracorriente. Para ciertos propósitos, es preferible producir el polipéptido en un sistema recombinante en el cual la proteína contiene un marcador de secuencia adicional que facilita la purificación, como por ejemplo, pero sin limitación, una secuencia de polihistidina. El polipéptido puede ser después purificado a partir de un lisado crudo de la célula huésped por cromatografía en una matriz de fase sólida apropiada. Alternativamente, anticuerpos producidos contra una proteína o bien contra péptidos derivados de la misma pueden emplearse como reactivos de purificación. Otros métodos de purificación son posibles. La presente invención abarca también derivados y homólogos de polipéptidos. Para ciertos propósitos, secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos pueden ser alterados por sustituciones, adiciona, o remociones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalente, es decir, variantes que conservan la función. Por ejemplo, uno o varios residuos de aminoácidos dentro de la frecuencia puede (n) ser sustituido (s) por otro aminoácido de propiedades similares, por ejemplo aminoácidos cargados positivamente (arginina, lisina e histidina) ; aminoácidos cargados negativamente (aspartato y glutamato) ; aminoácidos neutros polares; así como aminoácidos no polares. Los polipéptidos aislados pueden ser modificados, por ejemplo, mediante fosforilación, sulfatación, acilación, o bien otras modificaciones de proteína. Pueden también ser modificados con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea indirecta o indirectamente, incluyendo, sin limitación radioisotipos y compuestos fluorescentes. 5.9. ANTICUERPOS DE ß3GAL-T5 La presente invención abarca varios anticuerpos que reconocen específicamente componentes inmunogénicos derivados de ß3Gal-T5. Tales anticuerpos pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos para detectar y purificar ß3Gal-T5. Anticuerpos específicos para ß3Gal-T5 de conformidad con la presente invención incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales y humanizados, así como fragmentos y derivados de los mismos. Los anticuerpos de la invención pueden ser expresados en huéspedes animales por inmunización con componentes de ß3Gal-T5 o bien pueden formarse mediante inmunización in vitro de células inmunes. Los componentes inmunogénicos empleados para la expresión de los anticuerpos pueden ser aislados de células humanas o bien producidos en sistemas recombinantes. Los anticuerpos pueden ser también producidos en sistemas recombinantes programados con el ADN que codifica anticuerpo apropiado. Alternativamente, anticuerpos pueden ser construidos por reconstitución bioquímica de cadenas purificadas pesadas y ligeras. Anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos híbridos (es decir, que contienen dos conjuntos de combinaciones cadena pesada/cadena ligera, cada uno reconoce un antígeno diferente) , anticuerpos quiméricos (es decir, en donde ya sea las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, o bien ambas, son proteínas de fusión) , y anticuerpos univalentes (es decir, que consisten de un complejo de cadena pesada/cadena ligera unido a la región constante de una segunda cadena pesada) . Se incluyen también fragmentos Fab' , incluyendo fragmentos y F(ab)2 de anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) , así como fragmentos de anticuerpo de enlace de epítopo. Métodos para la producción de la totalidad- de los tipos antes mencionados de anticuerpos y derivados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, técnicas para producir y procesar antisueros policlonales se presentan en Mayer and Walker, 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Métodos Inmunoquímicos en Biología Celular y Molecular) , (Academic Press, Londres) . Una descripción adicional de los anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, quiméricos y humanizados de la invención se presenta a continuación. Anticuerpos policlonales de la invención son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados. Varios procedimientos bien conocidos en la técnica pueden emplearse para la producción de anticuerpos monoclonales para ß3Gal-T5 y fragmentos de los mismos. Para la producción de anticuerpos monoclonales, varios animales huéspedes pueden ser inmunizados por inyección con ß3Gal-T5 o un fragmento o derivado del mismo, incluyendo, sin limitarse a ellos, ratones, conejos, ratas, etc. varios adyuvantes pueden emplearse para incrementar la respuesta inmunológica, según la especie huésped, e incluyendo sin limitación, adyuvante de Freud (completo e incomplete) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa, dinitrofenol, así como adyuvantes humanos potenciaimente útiles tales como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum. Tales adyuvantes son también conocidos en la técnica. Anticuerpos monoclonales de la invención son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular. Un anticuerpo monoclonal (mAb) para ß3Gal-T5 o un fragmento derivado del mismo puede prepararse mediante el uso de cualquier técnica conocida que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas de células continuas en cultivo. Incluyen, sin limitarse a ellas, la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495-497), y la técnica de hibridoma de células B de ser humano más reciente (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72) y técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. páginas 77-96) . Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los mAbs de uso en esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. Anticuerpos monoclonales de la invención incluyen, sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales de ser humano. Anticuerpos monoclonales de ser humano pueden elaborarse a través de cualesquiera de varias técnicas conocidas (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 80, 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16). Esta invención ofrece anticuerpos quiméricos específicos para ß3Gal-T5 o bien un fragmento derivado de la misma. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones son derivadas de diferentes especies animales tales como las que tienen una región variable derivada de un mAb de murino y una región constante de inmunoglobulina de ser humano. Varias técnicas están disponibles para la producción de tales anticuerpos quiméricos (véase, por ejemplo, Morrison et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312, 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314, 452-454) mediante el empalme de los genes provenientes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo de ser humano de actividad biológica apropiada. La invención ofrece anticuerpos humanizados específicos para ß3Gal-T5 o un fragmento derivada de la misma. En resumen, anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo a partir de especies no humanas que tienen una o varias regiones de determinación complementaria (CDRs) a partir de las especies no humanas y una región de estructura a partir de una molécula de inmunoglobulina humana. Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, Queen, Patente Norteamericana No. 5,585,089, que se incorpora por referencia aquí en su totalidad) . Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste de una región de "estructuras" interrumpida por tres regiones hipervariables) , que se conocen como regiones complementariamente determinantes (CDRs) . Se ha definido con precisión la magnitud de la región de estructura y de CDRs (véase, Kabat et al., 1983, Sequences of Proteins of immunological interest (Secuencias de Proteínas de interés inmunológico) , Departamento Norteamericano de Salud y Servicios humanos) . Además, técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente Norteamericana No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242, 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 85, 5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature, 334, 544-546) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena única específicos para ß3Gal-T5 o un fragmento derivado de la misma. Anticuerpos de cadena única se forman mediante el enlace de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv a través de un puente de aminoácidos, lo que resulta en un polipéptido de cadena única. Fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos de ß3Gal-T5 o un fragmento derivado del mismo pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, sin limitarse a ellos: el fragmento F(ab'); que puede ser producido por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden ser generados por medio de la reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, bibliotecas de expresión de Fab pueden ser construidas (Huse et al., 1989, Science, 246, 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Además, métodos generales de producción de anticuerpos y uso son adecuados para los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, véase, Harlow y Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los anticuerpos de la invención pueden ser purificados por métodos estándares, incluyendo, sin limitarse a ellos, la electroforesis en gel en disco de preparación, enfoque isoeléctrico, HPLC, HPLC de fase reversa, filtración en gel, cromatografía de partición e intercambio de iones así como distribución a cortacorriente. Métodos de purificación de anticuerpos se divulgan, por ejemplo, en The Art of Antibody Purification (La técnica de Purificación de Anticuerpo) , 1989, Amicon División, W.R. Grace & Co . Métodos generales de purificación de proteína se describen en Protein Purification : Principies and Practice (Purificación de Proteínas: Principios y Prácticas) , R.K. Scopes, Ed., 1987, Springer-Verlag, Nueva York, Nueva York. Anticuerpos anti-ß3Gal-T5, ya sea no marcados o bien marcados por métodos estándares, pueden emplearse como la base de inmunoensayos. El marcador particular empleado dependerá del tipo de inmunoensayo empleado. Ejemplos de marcadores que pueden emplearse incluyen, sin limitarse a ellos, radio arcadores tales como 32P, ?:"I, 3H y 14C; marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo y umbeliferona; quimioluminiscentes tales como luciferia y 2, 3-dihidroftal-azindionas; y enzimas tales como peroxidasa de rábano agrio, fosfatasa alcalina, lisozima y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa . Los anticuerpos pueden ser marcados por estos marcadores a través de métodos conocidos. Por ejemplo, agentes de acoplamiento como por ejemplo aldehidos carbodiimidas, dimaleimida, imidatos, succinimidas, benzadina bisdiazotizada y similares pueden emplearse para marcar los anticuerpos con marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes o enzimas. Los métodos generales involucrados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Chan (Ed) , 1987, Immunoassay: A practical Guide (Inmunoensayo: Una Guía Práctica), Academic Press, Inc., Orlando, FL. La invención descrita y reclamada aquí puede ser apreciada adicionalmente por un experto en la materia a través de la referencia a los ejemplos siguientes. Estos ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar varios aspectos de la invención y no deben considerarse como limitativos de la invención de ninguna manera. 6. EJEMPLOS Empleando un análisis BLAST de una base de datos EST, identificamos un total de diez miembros homólogos humanos candidatos de la familia de gen de ß3Gal-T incluyendo los cuatro miembros previamente reportados (Amado, M., Almeida, R., Carneiro, F., et al. A family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa. J. Biol. Chem. 273: 12770-12778, 1998) . El análisis de similaridad de secuencias de los cuatro primeros miembros mencionó características indicativas de funciones de enzimas codificadas, incluyendo conservación de residuo de cisteína, espaciado de motivos conservados y perfiles de hidropatía (Amado, M., Almeida, R., Carneiro, F., et al. A family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3- Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3- Galactosiltransferasa. J. Biol. Chem 273:12770-12778, 1998). ß3Gal-T4 presentó diferencias significativas con relación a ß3Gal-Tl, -T2, y -T3 en este aspecto, y la función de esta enzima fue diferente en la medida en que el sacárido de aceptador fue ß3GalNAc en los glicolípidos de ganglioseries (Miyaki, H., Fukumoto, S., Okada, M., Hasegawa, T. y Furukawa K. Expression Cloning of rat cDNA encoding UDP-galactose (Clonación de expresión de ADNc de rata que codifica UDP-galactosa G(D2), ßl,3 galactosiltransferasa que determina la expresión de G(D1 b)G(M 1)G(A 1). J. Biol. Chem. 272: 24794-24799, 1997; (Amado, M., Almeida, R., Carneiro, F., et al. A family of human ß3-galactosyltransferases : characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de "JDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa. J. Biol. Chem 273: 12770-12778, 1998). Se predijo que una secuencia derivada de un clon de EST (No. de acceso GenBank AJ003597) representaba un nuevo gen que codifica una ß3Gal-T que forma los enlaces Galßl-3GlcNAc. Este reporte describe la clonación y expresión de este gen, designado ß3Gal-T5, y demuestra que la enzima codificada tenía mejores propiedades cinéticas que las enzimas de las ß3Gal-Ts previamente clonadas. ß3Gal-T5 es candidato para la actividad ß3Gal-T encontrada en el epitelio. 6.1 IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE ß3Gal-T5 Los programas BLASTn y tBLASTn fueron empleados con la secuencia codificadora de ß3Gal-T2 de ser humano para investigar la base de datos de dbEST en el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI, USA) de conformidad con lo previamente descrito (Almeida, R., Amado, M., David, L., et al. A family of human ß4-galactosyltransferases: Cloning and expression of two novel UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine ßl, 4-Galactosyltransferases (Una familia de ß4-galactosiltransferasas humanas: clonación y expresión de dos UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina ßl/4-Galactosiltransferasas novedosas, ß4Gal-T2 y ß4Gal-T3. J. Biol. Chem 272: 31979-31992,1997). Un EST (No. de acceso GenBank AJ003597) fue identificado como representando un gen novedoso putativo de ß4Gal-T. Puesto que las regiones codificadoras de todos los demás miembros clonados de la familia de gen de ß4Gal-T de ser humano estaban codificados en un solo exón, empleamos la información de secuencia de EST para diseñar iniciadores para le tamizado por reacción en cadena de polimerasa de una biblioteca genómica de Pl . Una biblioteca de Pl de prepucio de ser humano (DuPont Merck Pharmaceutical Company Human Foreskin Fibroblast Pl Library) fue tamizada empleando los pares de iniciadores EBER 1301 (5'-CTTCCTTAAGCTCCCAGATAC3' ) (SEQ ID NO: 1) y EBER 1302 (5'-GTTTCCGCTGCACTGCTGGTG 3') (SEQ ID NO: 2). Un clon, de Pl para ß4Gal-T5 (DMPC-HFF#l-119h3) , así como de AND de fagos de Pl fueron obtenidos de Genome Systems Inc. El secuenciamiento de este ADN de Pl reveló un cuadro de lectura abierto de 933 pares de bases que codifica una proteína putativa con una estructura de dominio de tipo II (figura 1) . La secuencia codificadora entera de ß4Gal-T5 fue totalmente secuenciada empleando secuenciamiento automatizado (ABI377, Perkin Elmer) con química de terminador de colorante. El clon de EST AJ003597 fue derivado de la biblioteca de cromosomas 21, y subsecuentemente se enlazó una secuencia PAC de 165 pares de kilobases que contenía la secuencia entera de ß4Gal-T5 con 21 g22.3 (número de acceso GenBank AF064860) . La secuencia de EST no pareció ser derivada del inicio de oligo-dT correcto, y el análisis de la secuencia PAC genómica mostró que el primer consenso corriente debajo de la señal de poliadenilación (AATAAA) estaba a 9568 pares de bases del primer cordón de inicio. La secuencia de UTR 3' putativa contenía repeticiones y regiones codificadoras cortas potenciales, pero ninguna de las regiones codificadoras mostró similaridad con genes conocidos. No ESTs a partir de 3' UTR ha sido depositado en la base de datos de GenBank. Una segunda señal de poliadenilación de consenso se encuentra 2991 pares de bases corriente abajo de la primera, y algunos 3' ESTs han sido identificados a partir del sitio y mapeados (STS-N41029) , pero ninguna proteína codificadora de secuencia con simílaridad con genes conocidos ha sido asignada a partir de esta región.

La secuencia EST (AJ003597) tiene 338 nucleótidos de largo. Los nucleótidos 1-312 de AJ003597 codifican el complemento de los nucleótidos 38-349 de la región codificadora de ß4Gal-T5 (figura 1) (nucleótidos 116-427 de SEQ ID NO: 8) . 6.2. EXPRESIÓN DE ß3Gal-T5 Lo que sigue son ejemplos de expresión de ß3Gal-T5 en células de insecto, y un producto de gen de longitud total o longitud parcial (soluble) en células CHO. 6.2.1 EXPRESIÓN DE ß3Gal-T5 EN CÉLULAS DE INSECTO Un constructo de expresión (pAcGP67-ß3Gal-T5-sol) diseñado para excluir el segmento de transmembrana hidrofóbico y para codificar residuos de aminoácidos 25-310, fue preparado por reacción encadena de polimerasa empleando ADN genómico de Pl, y el par de iniciadores EBER1300 sol (5'-ATGTACAGTCTAAATCCTTTC) (SEQ ID NO: 3) y EBER1310sol (5' -TCAGACAGGCGGACAATCTTC) (SEQ ID NO: 4) (figura 1), incluyendo sitios de restricción BamHl. Un producto de reacción en cadena de polimerasa fue clonado en el sitio BamHI de pAcGP67B (Pharmigen) . Un constructo de expresión pVL-ß3Gal-T5-full diseñado para codificar la secuencia codificadora entera (a partir del primer ATG, figura 1) fue preparado por reacción en cadena de polimerasa con ADN genómico de Pl, empleando el par de iniciadores EBER1309 (5'-ATGGCTTCCCGAAGATGAG) SEQ IS NO: 5) y EBER1310. Este producto de reacción en cadena de polimerasa fue clonado en el sitio BamHl de pVL1193 (Pharmigen) . Tanto los constructos solubles como de longitud total fueron totalmente secuenciados para confirmar la fidelidad. Los plásmidos pAcGP67-ß3Gal-T5-sol y pVL-ß3Gal-T5-full fueron co-transfectados con ADN Baculo-Gold™ (Pharmigen) de conformidad con lo descrito previamente (Bennett, E.P. Hassan, H. y Clausen, H. cDNA cloning and expression of a novel human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine. Polypeptide N-acetyl-galactosaminyl-transferase (Clonación de ADNc y expresión de una UDP-N-acetil-alfa-D—galactosamina humana novedosa. N-acetil-galactosa inil-transferasa de péptido, GaINAc-T3) . J. 3iol. Chem. 271:17006-17012, 1996). Baculovirus recombinantes fueron obtenidos después de dos amplificaciones sucesivas en células Sf9 cultivadas en medio que contiene suero y los títulos de virus fueron estimados por titulación en placas de 24 pozos con monitoreo de actividades enzimáticas. Los controles incluyeron pAcGP67-ß3Gal-Tl (Amado, M. , Almeida, R., Carneiro, F., et al. A family of human ß3-galactosyltransferases: characterisation of four members of a UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine/ß-N-acetylgalactosamine ßl, 3-Galactosyltransferase family (Una familia de ß3-galactosiltransferasas humanas: caracterización de cuatro miembros de una familia de UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3-Galactosiltransferasa). J. Biol. Chem 273: 12770-12778, 1998), pAcGP67-ß3Gal-T2 (Id), pAcGP67-ß4Gal-T2 (Id) (Almeida, R., Amado, M., David, L., et al. A family of human ß4-galactosyltransferases : Cloning and expression of two novel UDP-Galactose ß-N-Acetylglucosamine ßl,4-Galactosyltransferases (Una familia de ß4-galactosiltransferasas humanas: clonación y expresión de dos UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina ßl/4- Galactosyltransferasas novedosas, ß4Gal-T2 y ß4Gal-T3) . J. Biol. Chem 272: 31979-31992,1997), pAcGP67-ß4Gal-T3 (Id), y pAcGP67-GalNAc-T3-sol (Bennett, E.P. Hassan, H. y Clausen, H. cDNA cloning and expression of a novel human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine. Polypeptide N-acetyl-galactosaminyl-transferase (Clonación de ADNc y expresión de una UDP-N-acetil-alfa-D—galactosa ina humana novedosa. N-acetil-galactosa inil-transferasa de polipéptido, GaINAc-T3). J. Biol. Chem. 271:17006-17012, 1996). Para la expresión a gran escala, se empleó un virus amplificado para infectar células High Five™ cultivadas en medio exento de suero (Invitrogen) en botellas de rodillos verticales agitando a 140 revoluciones por minuto y a una temperatura de 27° C. las propiedades cinéticas fueron determinadas con formas secretadas, parcialmente purificadas de las enzimas. La semipurificación de las enzimas a partir de medio exento de suero de células High Five™ infectadas fue efectuada por cromatografía secuencial Amberlite, DEAE-Sephacel y 5-Sepharosa de conformidad con lo previamente descrito (Wandall, H.H., Hassan, H., Mirgorodskaya, E., et al. Substrate specificities of three members of the human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine; Polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase family (especificidades de sustrato de tres miembros de la familia de UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina; Nacetilgalactosaminiltransferasa humana, GalNAc-Tl, -T2, y -T3) . J. Biol. Chem. 272:23503-23514, 1997) . Comparaciones de enzimas fueron efectuadas con relación a la actividad obtenida por ßGlcNAc-Bzl (Tablas XI y III) . Enzimas de longitud completa fueron ensayadas con homogenados de células lavadas Tritón CF54 al 1%. Ensayos de enzimáticos fueron efectuados en 50 µl de mezclas de reacción totales que contenían 25 mM de Cacodilato (pH 7.5), 10 mM MnCl2, 0.25% Tritón X-100 µM UDP -[14C]-Gal (2,600 cpm/nmol) (Amersham) , y varias concentraciones de sustratos de aceptador (Sigma) (véase tabla I para estructuras) . Productos de reacción fueron cuantificados por cromatografía Dowex-1. Ensayos con glicoproteínas fueron efectuados con la mezcla de reacción estándar modificada para contener 150 µM de UDP-Gal, 54 Mde NaCl, y 0.5 mg de ovalbu ina, asialo-agalacto-fetuina, orosomucoide, o bien sustratos aceptadores de mucina submaxilar bovina obtenidos de conformidad con lo descrito previamente (Schwientek, T., Almeida, T., Levery, S.B., Holmes, E., Bennett, E.P. y Clausen, H. Cloning a novel member of the UDP-galactose: ß-N-acetylglucosamine ßl, 4-galactosyltransferase family, ß4Gal-T4, involved in glycosphingolipid biosynthesis (clonación de un nuevo miembro de la familia de UDP-galactosa: ß-N-acetilglucosamina ßl, 4-galactosiltransferasa, ß4Gal-T4, involucrado en la biosíntesis de los glicoesfingolípidos) . J. Bio. Chem. 273: 29295-29305, 1998) . La transferencia de Gal fue evaluada después de precipitación acida por filtración a través de filtros de fibra de vidrio Whatman GF/C. Ensayos para determinar Km de sustratos de aceptador y sustratos donadores fueron modificados para incluir 200 µM de UDP [14C] Gal (2, 600 cpm/nmol) o 30 mM GIcNAcß-bencilo . Ensayos con aceptadores de glicolípidos fueron efectuados de conformidad con lo previamente descrito (Holmes, E.H. Characterization and membrane organization of beta 1 3 and beta 1 4-galactosyltransferases from human colonic adenocarcinoma cell lines Cob 205 and SW403: basic for preferential syntesis of type 1 chain lacto-series carbohydrate structures (Caracterización y organización de membrana de beta 1 3 y beta 1 4-galactosiltransferasas a partir de líneas de células de adenocarcinoma de colón humanas Cob 205 y SW403: base para la síntesis preferencial de estructuras de carbohidratos de la serie lacto de cadena de tipo i; . Arch Biochem Biophys 270:630-646, 1989) en mezclas de reacción que contenía 2.5 µmol HEPES buffer, pH 7.2, 1 µmol MnCl:, 100 µg taurodesoxicolato o Tritón CF-54, 20 µg de glicolípido de aceptador, 15 µmol de UDP- [14C] -galactosa (13,000 cpm/nmol) y enzima en volumen total de 100 µl . Las condiciones para la incubación y aislamiento de producto fueron de conformidad con lo descrito previamente (Id) . 6.2.2. EXPRESIÓN ESTABLE DE SECUENCIA CODIFICADORA COMPLETA DE ß3Gal-T5 EN CÉLULAS CHQ Una secuencia de ADNc que codifica la secuencia codificadora entera del gen de ß3Gal-T5 fue derivada por RT-PCR empleando iniciadores EBER1309 y EBER1310 con sitios de restricción BamHl introducidos. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue diseñado para proporcionar una proteína ß3Gal-T5 con una señal de retención de transmembrana hidrofóbica con el objeto que la enzima sea expresada y colocada en el compartimiento de Golgi apropiado de la célula transfectada.

Se insertó el producto de reacción en cadena de polimerasa en el sitio BamHl de un vector de expresión de mamífero pCDNA3 (Invitrogen), y el constructo pCDNA3-ß3Gal-T5, fue transfectado en células CHO y transfectantes estables fueron seleccionados. Detalles adicionales se proporcionan a continuación. La forma retenida de Golgi de longitud completa de ß3Gal-T5 fue expresada de manera estable en células de ovario de Hámster chino (CHO-K1) obtenidas en ATCC. El constructo codificador de longitud completa, diseñado para contener ios aminoácidos 1-310, fue preparado por reacción en cadena de polimerasa con ADN genómico de Pl, empleando el par de iniciadores EBER1309 y EBER1310 8figura 1) , que incluye sitio de restricción de BamHl. La inserción correcta del producto de reacción en cadena de polimerasa clonado en el sitio BamHl del vector pcDNA3 (Invitrogen) fue confirmada por secuenciamiento. La región codificadora fue dicha del constructo se muestra en la figura 1. Células CHO-Kl fueron transfectadas empleando 0.2 µg de ADN y 5 µg de lipofectamina (Invitrogen) y placas de 6 pozos subconfluentes de conformidad con el protocolo del fabricante. Después de 48 horas, el medio fue cambiado y se agregaron 400 µg/ml de G418. A las 72 horas, de 10 a 20% de los pozos fueron tripsinizados y el porcentaje de células que expresa ß3Gal-T5 fue evaluado por in unocitología empleando un anticuerpo monoclonal anti-ß3Gal-T5, " UH9. 6.2.3 EXPRESIÓN ESTABLE DE FORMA SOLUBLE DE ß3Gal-T5 EN CÉLULAS DE CHO ADNc de pAcGP67-ß3Gal-T5 que contiene la secuencia codificadora de una enzima ß3Gal-T5 secretada, soluble fue clonado en el sitio BamHl de un vector de expresión de mamífero modificado, pCD?A3 (Invitrogen) . pcD?A3 fue modificado por inserción de una secuencia de péptido de señal de interferon en el sitio Kpnl/BamEI para asegurar la secreción del producto expresado cuando es clonado en el vector. El constructo pcDNA3-?INF-ß3Gal-T5-sol fue transfectado en células CHO y se seleccionaron transfectantes estables. Detalles adicionales se proporcionan a continuación. Las formas secretables de ß3Gal-T5 fue expresada de manera estable en células de ovario de Hámster Chino (CHO-Kl) obtenidas en ATCC. Un constructo truncado, diseñado para contener los aminoácidos 25-310, fue preparado con reacción en cadena de polimeraza empleando Pl genómico de ADN y el par de iniciadores EBER1300 sol (SEQ ID NO: 3) y EBER1310 (SEQ ID NO: 4) (Figura 1), que incluía los sitios de restricción BamHl. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue clonado en el sitio BamHI de un vector de pcDNA3 (Invitrogen) . El vector pcDNA3 fue modificado para incluir 19 aminoácidos de la secuencia de señal gamma-interferon por inserción direccional de una secuencia sintética de 91 pares de bases que codifica la secuencia de interferon con sitios de flanqueo de .Kp.nl y BamHl. El vector pcDNA3 modificado fue construido de la siguiente manera. Cuatro oligonucleótidos sintéticos fueron sintetizados: INFFOR (5'-cggggtaccggaaacgatgaaatatacaag-3' ) (SEQ ID NO: 14); INFREVA (5'-ggcggatccaggcagatcacagccaagagaacccaaaacg-3' ) (SEQ ID NO: 15); INFREVB (5' -gcggatcccaggcagatcacagccaagagaacccaaaacg-3' ) (SEQ ID NO: 16); y INFREVC (5' gcggatccccaggcagatcacagccaagagaacccaaaacg3' ) (SEQ ID NO: 17) . Pares de iniciadores de oligonucleótidos INFFOR/INFREVA, INFFOR/INFREVB e INFFOR/INFREVC fueron empleados para amplificar por reacción en cadena de polimeraza un fragmento de este ADN que codifica interferon a partir del ADN genómico humano en las siguientes condiciones: 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 5 segundos, 72°C durante 15 segundos, empleando Ampli-Taq (Perkin-Elmer Cetus) y un termociclador modelo 480 (Perkin-Elmer) . El uso de tres iniciadores 3' espaciados por una base proporciona tres vectores con un sitio BamHl posesionado para cualesquiera de tres cuadros de lectura con relación a la secuencia diseñada. Células CHO-Kl (ATCC) fueron transfectadas empleando 0.2 µg de ADN y 5 µg de lipofectamina (Invitrogen) en platos de 6 pozos con subconfluentes de conformidad con el protocolo del fabricante. Después de 48 horas, el medio fue cambiado y se agregaron 400 µg/ml G418. A las 72 horas, de 10-20% de pozos fueron tripsinisados y el porcentaje de células que expresan ß3Gal-T5 fue evaluado por inmunocitología empleando un anticuerpo monoclonal anti-ß3Gal-T5, UH9. 6.3 CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO FORMADO CON C0RE3-p-Nph POR ß3Gal-T5 La glicosilación completa de core3-p-Nph fue efectuada en una mezcla de reacción que consistía de 1 mU de ß3Gal-T5 (actividad especifica determinada por ßGlcNAc-Umb) , 2mg de core3-p-Nph, 50mM de Tris (pH 7.0), ImM de MnCl^, 0.01% de Tritón X-100, y 4.6 µmol de UDP-Gal en un volumen final de 500 µl. La glicosilación fue monitoreada por HPTLC y terminó después de 3 horas de incubación. El producto de reacción fue aislado de conformidad con lo descrito previamente en cartuchos de octadecilo-silice ("Bakerbond; " J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) (Almeida, R., Amado, M., David, L., et al. A Family of Human ß4-Galactosiltransferases : Cloning and espression of two novel UDP-galactose ß-N-acetylglucosamine ßl, 4-Galactosyl-transferases, ß4Gal-T2 and ß4Gal-T3. (Una familia de ß4-galactosiltransferasas humanas: clonación y expresión de dos UDP-galactosa ß-N-acetilglucosamina ßl,4-galactosil-transferasas, ß4Gal-T2 y ß4Gal-T3) . J. Biol . Chem. 272:31979-31992, 1997) empleando elusiones escalonadas sucesivas con MeOH. La solución de MeOH fue evaporada hasta sequedad y sometida a análisis ~H-NMR de conformidad con lo descrito a continuación. 6.3.1 ESPECTROSCOPIA 1-D ^-NMR DE PRODUCTOS DE REACCIÓN CON CORE3-p-Nph Y Gb El producto purificado a partir de la reacción core3-p-NPh fue deuterio intercambiado por sonicación repetida y liofilización a partir de D20. Una solución saturada en D20 fue empleada para análisis NMR. Experimentos de 1-D "H-NMR, 2-D 1H-1H-TOCSY (Braunschweiler, L. y Ernst, R.R. Coherence transfer by isotropic mixing: Application to protón correlation spectroscopy (Transferencia de coherencia por mezclado isotrópico: Aplicación a espectroscopia de correlación de protones). J. Magn . Reson . 53:521-528, 1983; Bax, A. y Davis, D.G. MLEV-1 7-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy (Espectroscopia de transferencia de magnetización homonuclear bidimensional basada en MLEV-1 7). J. Magn . Reson. 65:355-360, 1985a) y -ROESY (Bothner-By, A.A. , Stephens, R.L., Lee, J.M., Warren, C.D. y Jeanloz, R.W. Structure determination of a tetrasaccharide: Transient nuclear Overhauser effects in the rotating frame (Determinación de estructura de una tetrasacárido : efectos de Overhauser nucleares transientes en un cuadro giratorio). J. Am . Chem. Soc . 106:811-813, 1984; Bax, A. y Davis, D.G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy (Aspectos prácticos de una espectroscopia de NOE transversal bidimensional) . J. Magn . Reson . 63:207-213, 1985b) fueron realizados a una temperatura de 298°C en un espectrómetro Varian Unity Inova 600 MEz (0.5 mL en un tubo de 5 mm) empleando una programática de adquisición estándar disponible en el paquete de programática Varian VNMR. SE efectuó un experimento de gradiente, sensible a fase, desacoplado con "L3C, detectado por 1H (Davis, A.L., Keeler, J., Laue, E.D. y Moskau, D. Experiments for recording pure-absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients (Experimentos para registrar espectros de correlación heteronucleares de absorción pura empleando gradientes de campos impulsados). J. Magn . Reson. 98:207-216, 1992) "C^H-HSQC (Bodenhausen, G. y Rubén, D.J. Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy (Abundancia natural de nitrógeno-15 NMR por espectroscopia heteronuclear realzada) . Chem. Phys . Lett . 69:185-139,1980) a una temperatura de 298°C en un espectrómetro de orificio ancho Varian Unify Inova 500 MHz (2 mL en un tubo de 8 mm) . Una muestra de 2 mg de core3-pNph fue preparada de manera similar y analizada en condiciones idénticas para comparación. Desplazamientos químicos se proporcionan por referencia a la acetona interna (2.225 y 29.92 ppm para 1H y 13C, respectivamente) . Los productos de glicoesfingolípidos purificados a partir de la reacción con Gb4 fueron intercambiados con deuterio mediante disolución en CDCI3-CD, OD 2:1, evaporando totalmente en nitrógeno seco (repetición 2x) , y después disueltos en 0.5 mL DMSO-d6/2% D_0 (Dabrcwski, J., Hanfland, P. y Egge, H. Structural analysis of glycosphingolipids by high resolution 1H nuclear magnetic reeonance spectroscopy (Análisis estructural de glicoeefingelípidos por espectroscopia de resonancia magnética nuclear 1H de alta resolución). Biochemistry 19:5652-5658, 1980) para análisis NMR. Espectros 1-D XH-NMR fueron adquiridos a 600 MHz (temperatura 308°K) ; 10,000 FIDs fueren acumulados con supresión con solvente por impulso de presaturación durante el retardo de relajación. Los espectros fueron interpretados por comparación de los espectros de estándares de glicoesfingolípidos relevantes adquiridos previamente en condiciones comparables (Dabrowski, J., Hanfland, P. y Egge, H. Structural analysis of glycosphingolipids by high resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy (Análisis estructural de glicoesfingolípidos por espectroscopia de resonancia magnética nuclear 1H de alta resolución). Biochemistry 19:5652-5658, 1980; Kannagi, R., Levery, S.B., Ishigami, F., et al. New globosides Glycosphingolipids in human teratocarcinoma reactive with the monoclonal antibody directed to a developmentally regulated antigen, stage-specific embryonic antigen 3 (Nuevos globosidos glicoesfingolípidos en teratocarcinoma humano reactivo con el anticuerpo monoclonal dirigido hacia un antígeno regulado por desarrollo, el antígeno 3 embrionico especifico de etapa). J. Biol . Chem. 258:8934-8942, 1983). 6.4. PATRÓN DE EXPRESIÓN DE ÓRGANO RESTRINGIDO DE ß3Gal-T5 El ARN total fue aislado a partir de líneas de células de adenocarcinoma humano AsPc-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Colo357, HPAF, HT-29, PA?C-1, Suit2, y S2-013 de conformidad con lo descrito previamente (Sutherlin, M-E . , ?ishimori, I., Caffrey, T., et al. Expression of three UDP-?-acetyl-alpha-D galactosamine: polypeptide Gal?Ac ?-acetylgalactosaminyl-transferases in adenocarcinoma cell lines (Expresión de tres UDP-N-acetil-alpha-D galactosamina: polipéptido GalNAc N-acetilgalactosaminil-transferasas en líneas de células de adenocarcinoma). Cáncer Res 57:4744-4748, 1997). Veinticinco µg de ARN total fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa desnaturalizante al 1% y transferidos a nitrocelulosa de conformidad con los descrito previamente (Sutherlin, M-E . , ?ishimori, I., Caffrey, T., et al. Expression of three UDP-?-acetyl-alpha-D galactosamine: polypeptide Gal?Ac ?-acetylgalactosaminyl-transferases in adenocarcinoma cell lines (Expresión de tres UDP-?-aoetil-alpha-D galactosamina: polipéptido Gal?Ac ?-acetilgalactosaminil-transferasas en líneas de células de adenocarcinoma). Cáncer Res 57:4744-4748, 1997). Manchas northern de múltiples tejidos humanos, MT?I y MTNII , fueron obtenidas de Clontech. El constructo de expresión soluble fue empleado como sonda. La sonda fue marcada por preparación aleatoria empleando aP^dCTP (Amersham) y un conjunto de elementos de oligo marcado (Pharmacia) . Las manchas fueron probadas durante la noche a una temperatura de 42°C de conformidad con lo descrito previamente (Bennett- E.P., Hassan, H. y Clausen, H. cD?A cloning and expression of a novel human UDP-?-acetyl-alpha-D-galactosamine. Polypeptide ?-acetyl-galactosaminyl-transferase, GaI?Ac-T3 (Clonación de AD?c y expresión de una UDP-?-acetii-alfa-D—galactosamina humana novedosa. Polipéptido ?-acetil-galactosaminil-transferasa GaINAc-T3) . J. Biol . Chem. 271:17006-17012, 1996) , se lavó 2 x 10 minutos a temperatura ambiente con 2 x SSC, NaP;0; al 1%, 2 x 20 minutos a una temperatura de 65°C con 0.2 x SSC, SDS al 1%, Na.jP;0; al 1%, y una vez 10 minutos con 0.2 x SSC a temperatura ambiente ("condiciones de hibridación preferidas") . 6.5 ANÁLISIS DE POLIMORFISMO DE ADN DEL GEN DE ß3Gal-T5 Pares de iniciadores EBER 1320 (5' -CAGCGAGGTTCTAGAGTTTCC-3' ) (SEQ ID NO: 6) y EBER 1321 (5' -GAAATCCACGCCAGAATGTCG-3' ) (SEQ ID NO: 7) para amplificación de la secuencia codificadora entera han sido empleados para amplificación por reacción en cadena de polimerasa de exón 1. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue subclonada y la secuencia de 10 clones que contiene el inserto apropiado fue determinada asegurando que ambos alelos de cada individuo fueran caracterizados . 6.6. ANTICUERPOS PARA ß3Gal-T5 Un anticuerpo monoclenal anti-ß3Gal-T5, UH9, fue preparado por inmunización de ratón con una preparación de ß3Gal-T5 purificada que proporcionó una banda única de aproximadamente 35,000 en gel teñido con Coomassie en SDS-PAGE. Ratones Balb/c fueron inmunizados con una inyección subcutánea o intraperitoneal de 10 µl de proteína subnaturalizada en adyuvante completo de Freund, seguido por dos inyecciones con adyuvante incompleto de Freund, y finalmente con un refuerzo intravenoso sin adyuvante. Sangrados oculares fueron tomados siete días después de la tercera inmunización y se evaluaron el título y la especificidad de los anticuerpos anti-ß3Gal-T5. Fusión con NS-1 y el procedimiento de clonación fueron de conformidad con lo descrito en White et al., Biochemistry (Bioquímica) 29:2740 (1990) . El anticuerpo monoclonal UH9 fue seleccionado por reactividad con células y/o tejidos no fijados, así como por su capacidad de inmunoprecipitar la actividad de ß3Gal-T5. Hibridomas fueron seleccionados de conformidad con tres criterios: (i) reactividad diferencial en ensayos ELISA con enzimas recombinantes purificadas; (ii) inmunocitología en células Sf9 dos días después de la infección con báculovirus que contenía ß3Gal-transferasas, ß3Gal-Tl, -T2, -T3, -T4 y -T5; y (iii) inmuniprecipitación diferencial de enzimas recombinantes activas. Un análisis ELISA fue efectuado de conformidad con lo descrito por White et al. (Id), empleando ß3Gal-Tl, -T2 y -T5 recombinantes purificados empleando una concentración de antígeno inicial de 10 µg/ml. El ensayo de inmunocitología fue efectuado mediante el lavado de células tripsinizadas dos veces en PBS y secado al aire de las células lavadas en platinas. Las platinas secadas fueron fijadas en acetona fría en hielo al 100% durante 10 minutos, secadas e incubadas con anticuerpo anti-ß3Gal-T5 monoclonal durante 1 hora. Después del lavado con PBS, las platinas fueron incubadas con IG de anti-ratón de conejo conjugado con FITC durante 30 minutos, lavadas con PBS y montadas en glicerol y analizadas por microscopia. La inmunoprecipitación de ß3Gal-transferasas humanas recombinantes fue efectuada de la siguiente manera. Unas formas secretadas de ß3Gal-transferasas humanas fueron expresadas en células Sf9 y medios fueron concentrados tres días después de la infección y empleado como fuente de enzimas. Se saturó secuencialmente Protein G Sepharose con anticuerpos monoclonales IgG de anti-ratón de conejo como sobrenadantes de cultivo. Una suspensión al 5% de perlas de Protein G fue agregada a medio Sf9 que contenía cualesquiera de GalNAc-Tl, -T2, -T3 o bien -T4. Después de incubación durante 1 hora a una temperatura de 4°C, las perlas fueron lavadas en PBS, y resuspendidas en 25 mM de Tris (pH 7.4), 0.25% de Tritón X-100. Las actividades ß3Gal-transferasa fueron medidas en los sobrenadantes y las pellas fueron lavadas. UH9 inmunoprecipitó selectivamente la actividad ß3Gal-T5 pero no la actividad de ß3Gal-Tl o -T2. Un análisis Western blot con enzimas recombinantes purificadas fue también efectuado. Comprobó ser difícil seleccionar anticuerpos que reaccionan tanto con la enzima ß3Gal-GMG nativa como desnaturalizada. El anticuerpo UH9 por consiguiente es probablemente dirigido hacia un epitopo conformacional, y para detectar ia conformación nativa de ß3Gal-T5. Otro anticuerpo, designado UH10, reaccionó solamente con ß3Gal-T5 desnaturalizada como se evidenció por su capacidad de ser sometido a western blot. Este anticuerpo sí tiñó células de insecto infectadas con pVL-ß3Gal-T5-full y pAcGP67-ß3Gal-T5-sol, pero no tiñó células CHO transfectadas establemente con los constructos de expresión de ß3Gal-T5 o varias líneas de tejido de células epiteliales. Además, UH10 no inmunoprecipitó la actividad de enzima ß3Gal-T5. Para correlacionar la inmunoreactividad con la actividad enzimática, células transfectadas que expresan ß3Gal-T5 soluble fueron tripsinizadas y colocadas en platos de 96 pozos. Dos rondas de tamizado y clonación por dilución limitante empleando inmunoreactividad con UH9 fueron efectuadas y los clones que lograron más del 50% de células positivas fueron seleccionados y probados para determinar el nivel de enzima secretada en sobrenadante de cultivos confluentes. La intensidad de la inmunoreactividad por ensayo de citología se correlacionó en todos los casos con el nivel de actividad de enzima ß3Gal-T5 encontrada en medios gastados a partir de clones . La invención descrita y reclamada aquí no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades específicas divulgadas aquí puesto que estas modalidades tienen el propósito de ilustrar varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente se encuentra dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones a la invención, además de las mostradas y descritas aquí, serán aparentes a los expertos en la materia a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones caen también dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En toda esta solicitud, se citan varias referencias, el contenido de cada una de ellas se incorpora aquí por referencia en la presente solicitud en su totalidad.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Clausen, Henrik Amado, Margarita <120> UDP-GALACTOSA: ß-N-ACETIL-GLUCOSAMINA ßl,3GALACTOSILTRANSFERASAS, BGAL-T5 <130> 7188-157 <140> <141> <160> 17 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción' de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 1 21 cttccttaag ctcccagata c <210> 2 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 2 gtttccgctg cactgcactg ceggt 26 <210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 3 21 atgtacagtc taaatccttt c <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 4 21 tcagacaggc ggacaatctt c <210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 5 atggctcccg aagatgag <210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 6 cagcgaggtt ctagagtttc c 21 <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: INICIADOR <400> 7 gaaatccacg ccagaatgtc g 21 <210> 8 <211> 1011 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> ( 79) . . ( 100Í <400> 8 tgc ctt ctg gtt ctg ggg gct ctt tgt ttg tat ttt age atg tac agt 159 Cys Leu Leu Val Leu Gly Ala Leu Cys Leu Tyr Phe Ser Met Tyr Ser 15 20 25 cta aat cct ttc aaa gaa cag tcc ttt gtt tac aag aaa gac ggg aac 207 Leu Asn Pro Phe Lys Glu Gln Ser Phe Val Tyr Lys Lys Asp Gly Asn 30 35 40 ttc ctt aag ctc cea gat ac gac tgc agg cag acá cct ecc ttc ctc 255 Phe Leu Lys Leu Pro Asp Thr Asp Cys Arg Gln Thr Pro Pro Phe Leu 45 50 55 gtc ctg ctg gtg acc tea tcc cac aaa cag ttg gct gag cgc atg gcc 303 Val Leu Leu Val Thr Ser Ser His Lys Gln Leu Ala Glu Arg Met Ala 60 65 70 75 ate cgg cag acg tgg ggg aaa gag agg acg gtg aag gga aag cag ctg 351 lie Arg Gln Thr Trp Gly Lys Glu Arg Thr Val Lys Gly Lys Gln Leu 80 85 90 aag acá ttc ttc ctc ctg ggg acc acc age agt gca gcg gaa acá aaa 399 Lys Thr Phe Phe Leu Leu Gly Thr Thr Ser Ser Ala Ala Glu Thr Lys 95 100 105 gag gtg gac cag gag age cag cga cac ggg gac att ate cag aag gat 447 Glu Val Asp Gln Glu Ser Gln Arg His Gly Asp lie lie Gln Lys Asp 110 115 120 ttc cta gac gtc tat' ac aat ctg acc ctg aag acc atg atg ggc acá 495 Phe Leu Asp Val Tyr Tyr Asn Leu Thr Leu Lys Thr Met Met Gly He 125 130 135 gaa tgg gtc cat cgc ttt tgt cct cag gcg gcg ttt gtg atg aaa acá 543 Glu Trp Val His Arg Phe Cys Pro Gln Ala Ala Phe Val Met Lys Thr 140 145 150 155 gac tea gac atg ttc ate aat gtt gac tat ctg act gaa ctg ctt ctg 591 Asp Ser Asp Met Phe He Asn Val Asp Tyr Leu Thr Glu Leu Leu Leu 160 165 170 aag aaa aac aga acá acc agg ttt ttc act ggc ttc ttg aaa ctc aat 639 Lys Lys Asn Arg Thr Thr Arg Phe Phe Thr Gly Phe Leu Lys Leu Asn 175 180 185 gag ttt ecc ate agg cag cea ttc age aag tgg ttt gtc agt aaa tet 687 Glu Phe Pro He Arg Gln Pro Phe Ser Lys Trp Phe Val Ser Lys Ser 190 195 200 gaa tat ceg tgg gac agg tac cea cea ttc tgc tcc ggc acc ggc tac 735 Glu Tyr Pro Trp Asp Arg Tyr Pro Pro Phe Cys Ser Gly Thr Gly Tyr 205 210 215 9C9 ttc tct 99c 9ac 9t 9C9 a9t ca9 fc tac aat 9tc tcc aa9 a9c 783 Val Phe Ser Gly Asp Val Ala Ser Gln Val Tyr Asn Val Ser Lys Ser 220 225 230 235 gtc cea tac att aaa ctg gaa gac gtg ttt gtg ggg ctc tgc ctc gaa 831 Val Pro Tyr He Lys Leu Glu Asp Val Phe Val Gly Leu Cys Leu Glu 240 245 250 agg ctg aac ate aga ttg gag gag ctc cac tcc cag ceg acc ttt ttt 879 Arg Leu Asn He Arg Leu Glu Glu Leu His Ser Gln Pro Thr Phe Phe 255 260 265 cea ggg ggc tta cgc ttc tcc gta tgc ctc ttc agg agg ate gtg gcc 927 Pro Gly Gly Leu Arg Phe Ser Val Cye Leu Phe Arg Arg He Val Ala 270 275 280 tgc cac ttc ate aag cct cgg act ctc ttg gac tac tgg cag gct cta 975 Cys His Phe He Lys Pro Arg Thr Leu Leu Asp Tyr Trp Gln Ala Leu 285 290 295 gag aat tcc cgg ggg gaa gat tgt ceg cct gtc tga 1011 Glu Asn Ser Arg Gly Glu Asp Cys Pro Pro Val 300 305 310 <210> 9 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Phe Pro Lys Met Arg Leu Met Tyr He Cys Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Cys Leu Tyr Phe Ser Met Tyr Ser Leu Asn Pro Phe Lys 20 25 30 Glu Gln Ser Phe Val Tyr Lys Lys Asp Gly Asn Phe Leu Lys Leu Pro 35 40 45 Asp Thr Asp Cys Arg Gln Thr Pro Pro Phe Leu Val Leu Leu Val Thr 50 55 60 Ser Ser His Lys Oln Leu Ala Glu Arg Met Ala He Arg Gln Thr Trp 65 70 75 80 Gly Lys Glu Arg Thr Val Lys Gly Lys Gln Leu Lys Thr Phe Phe Leu 85 90 95 Leu Gly Thr Thr Ser Ser Ala Ala Glu Thr Lys Glu Val Asp Gln Glu 100 105 110 Ser Gln Arg His Gly Asp He He Gln Lys Asp Phe Leu Asp Val Tyr 115 120 125 He Asn Val Asp Tyr Leu Thr Glu Leu Leu Leu Lys Lys Asn Arg Thr 165 170 175 Thr Arg Phe Phe Thr Gly Phe Leu Lys Leu Asn Glu Phe Pro He Arg 180 185 190 Gln Pro Phe Ser Lys Trp Phe Val Ser Lys Ser Glu Tyr Pro Trp Asp 195 200 205 Arg Tyr Pro Pro Phe Cye áer Gly Thr Gly Tyr Val Phe Ser Gly Asp 210 215 220 Val Ala Ser Gln Val Tyr Asn Val Ser Lys Ser Val Pro Tyr He Lys 225 230 235 240 Leu Glu Asp Val Phe Val Gly Leu Cys Leu Glu Arg Leu Asn He Arg 245 250 255 Leu Glu Glu Leu His Ser Gln.Pro Thr Phe Phe Pro Gly Gly Leu Arg 260 ' 265 270 Phe Ser Val Cys Leu Phe Arg Arg He Val Ala Cys His Phe He Lys 275 280 285 Pro Arg Thr Leu Leu Asp Tyr Trp Gln Ala Leu Glu Asn Ser Arg Gly 290 295 300 Glu Asp Cys Pro Pro Val 305 310 <210> 10 <211> 422 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Leu Gln Trp Arg Arg Arg His Cys Cys Phe Ala Lys Met Thr Trp 1 5 10 15 Asn Ala Lys Arg Ser Leu Phe Arg Thr His Leu He Gly Val Leu Ser 20 25 30 Leu Val Phe Leu Phe Ala Met Phe Leu Phe Phe Asn His His Asp Trp 35 40 45 Leu Pro Gly Arg Ala Gly Phe Lys Glu Asn Pro Val Thr Tyr Thr Phe 50 55 60 Arg Gly Phe Arg Ser Thr Lys Ser Glu Thr Asn His Ser Ser Leu Arg 65 70 75 80 Asn He Trp Lys Glu Thr Val Pro Gln Thr Leu Arg Pro Gln Thr Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asn Asn Thr Asp Leu Ser Pro Gln Gly Val Thr Gly Leu 100 105 110 Glu Asn Thr Leu Ser Ala Asn Gly Ser He Tyr Asn Glu Lys Gly Thr 115 120 125 Gly His Pro Asn Ser Tyr His Phe Lys Tyr He He Asn Glu Pro Glu 130 135 140 Lys Cys Gln Glu Lys Ser Pro Phe Leu He Leu Leu He Ala Ala Glu 145 150 155 160 Pro Gly Gln He Glu Ala Arg Arg Ala He Arg Gln Thr Trp Gly Asn 165 170 175 Glu Ser Leu Ala Pro Gly He Gln He Thr Arg He Phe Leu Leu Gly 180 185 190 Leu Ser He Lys Leu Asn Gly Tyr Leu Gln Arg Ala He Leu Glu Glu 195 200 205 Ser Arg Gln Tyr His Asp He He Gln Gln Glu Tyr Leu Asp Thr Tyr 210 215 220 Tyr Asn Leu Thr He Lys Thr Leu Met Gly Met Asn Trp Val Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Cys Pro His He Pro Tyr Val Met Lys Thr Asp Ser Asp Met Phe 245 250 255 Val Asn Thr Glu Tyr Leu He Asn Lys Leu Leu Lys Pro Asp Leu Pro 260 265 270 Pro Arg His Asn Tyr Phe Thr Gly Tyr Leu Met Arg Gly Tyr Ala Pro 275 280 285 Asn Arg Asn Lys Asp Ser Lys Trp Tyr Met Pro Pro Asp Leu Tyr Pro 290 295 300 Ser Glu Arg Tyr Pro Val Phe Cys Ser Gly Thr Gly Tyr Val Phe Ser 305 310 315 320 Gly Asp Leu Ala Glu Lys He Phe Lys Val Ser Leu Gly He Arg Arg 325 - 33,3?0 335 Leu His Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly He Cys Leu Ala Lys Leu Arg 340 345 350 He Asp Pro vV»all PPrroo Ptrroo P*•r-.o-- Asn Glu Phe Val Phe A3s6n5 His Trp Arg 355 36° e r- rvs Lve Tyr Ser His Leu He Thr Ser His Gln Val Ser Tyr Ser Ser Cys Lys ryr ^ 375 370 Gln Pro Ser Glu Leu - Hp e t L„y«s= T Tyr T Trrop A Assnn H «iie Leu Gln Gln A ^sn Phe 390 385 „. AU cy " ». »» «* 3-. y ? -Iy «, Ty Lys His 410 405 Arg His Arg Lys Leu Hie 420 <210> 11 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Ser Lys Val Ser Cys Leu Tyr Val Leu Thr Val Val Cys Trp 1 5 10 15 Ala Ser Ala Leu Trp Tyr Leu Ser He Thr Arg Pro Thr Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Gly Ser Lys Pro Phe Ser His Leu Thr Val Ala Arg Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Phe Gly Asn He Arg Thr Arg Pro He Asn Pro His Ser Phe Glu 50 55 60 Phe Leu He Asn Glu Pro Asn Lys Cys Glu Lys Asn He Pro Phe Leu 65 70 75 80 Val He Leu He Ser Thr Thr His Lye Glu Phe Asp Ala Arg Gln Ala 85 90 95 He Arg Glu Thr Trp Gly Asp Glu Asn Asn Phe Lys Gly He Lys He 100 105 110 Ala Thr Leu Phe Leu Leu Gly Lys Asn Ala Asp Pro Val Leu Asn Gln 115 120 125 Met Val Glu Gln Glu Ser Gln He Phe His Asp He He Val Glu Asp 130 135 140 Phe He Asp Ser Tyr His Asn Leu Thr Leu Lys Thr Leu Met Gly Met 145 150 155 160 Arg Trp Val Ala Thr Phe Cys Ser Lys Ala Lys Tyr Val Met Lys Thr 165 170 175 Asp Ser Asp He Phe Val Asn Met Asp Asn Leu He Tyr Lys Leu Leu 180 185 190 Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Arg Arg Tyr Phe Thr Gly Tyr Val He 195 200 205 Asn Gly Gly Pro He Arg Asp Val Arg Ser Lys Trp Tyr Met Pro Arg 210 215 220 Asp Leu Tyr Pro Asp Ser Asn Tyr Pro Pro Phe Cys Ser Gly Thr Gly 225 230 235 240 Tyr He Phe Ser Ala Aep Val Ala Glu Leu lie Tyr Lys Thr Ser Leu 245 250 255 His Thr Arg Leu Leu His Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Leu Cys Leu 260 265 270 Arg Lys Leu Gly He His Pro Phe Gln Asn Ser Gly Phe Asn His Trp 275 280 285 Lys Met Ala Tyr Ser Leu Cys Arg Tyr Arg Arg Val He Thr Val His 290 295" 300 Gln He Ser Pro Glu Glu Met His Arg He Trp Asn Asp Met Ser Ser 305 310 315 320 Lys Lys His Leu Arg Cys 325 <210> 12 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Ser Ala Leu Trp Thr Val Leu Pro Ser Arg Met Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Trp Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Phe Phe Val 20 25 30 Met Trp Tyr Leu Ser Leu Pro Hie Tyr Asn Val He Glu Arg Val Asn 35 40 45 Trp Met Tyr Phe Tyr Glu Tyr Glu Pro He Tyr Arg Gln Asp Phe His 50 55 60 Phe Thr Leu Arg Glu His Ser Asn Cys Ser His Gln Asn Pro Phe Leu 65 70 75 " 80 Val He Leu Val Thr Ser His Pro Ser Asp Val Lys Ala Arg Gln Ala 85 90 95 He Arg Val Thr Trp Gly Glu Lys Lys Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Val . 100 105 110 Leu Thr Phe Phe Leu Leu Gly Gln Glu Ala Glu Lys Glu Asp Lys Met 115 120 125 Leu Ala Leu Ser Leu Glu Asp Glu His Leu Leu Tyr Gly Asp He He 130 135 140 Arg Gln Asp Phe Leu Aep Thr Tyr Asn Asn Leu Thr Leu Lys Thr He 145 150 155 160 Met Ala Phe Arg Trp Val Thr Glu Phe Cys Pro Asn Ala Lys Tyr Val 165 170 175 Met Lys Thr Asp Thr Asp Val Phe He Asn Thr Gly Asn Leu Val Lys 180 185 190 Tyr Leu Leu Asn Leu Asn His Ser Glu Lys Phe Phe Thr Gly r Pro 195 200 205 Leu He Asp Asn Tyr Ser Tyr Arg Gly Phe Tyr Gln Lys Thr His He 210 215 220 Ser Tyr Gln Glu Tyr Pro Phe Lys Val Phe Pro Pro Tyr Cys Ser Gly 225 230 235 240 Leu Gly Tyr He Met Ser Arg Asp Leu Val Pro Arg He Tyr Glu Met 245 250 255 Met Gly His Val Lys Pro He Lys Phe Glu Asp Val Tyr Val Gly He 260 265 270 Cys Leu Asn Leu Leu Lys Val Asn He His He Pro Glu Asp Thr Asn 275 280 285 Leu Phe Phe Leu Tyr Arg He His Leu Aep Val Cys Gln Leu Arg Arg 290 295 300 Val He Ala Ala His Gly Phe Ser Ser Lys Glu He He Thr Phe Trp 305 310 315 320 Gln Val Met Leu Arg Asn Thr Thr Cys His Tyr 325 330 <210> 13 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Gln Leu Arg Leu Phe Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu 5 10 15 Val He Val Trp Thr Leu Phe Gly Pro Ser Gly Leu Gly Glu Glu Leu 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ala Pro Ala Ser Pro Gly 35 40 45 Pro Pro Leu Ala Leu Pro Arg Leu Leu He Pro Aen Gln Glu Ala Cye 50 55 60 Ser Gly Pro Gly Ala Pro Pro Phe Leu Leu He Leu Val Cye Thr Ala 65 70 75 80 Pro Glu Asn Leu Asn Gln Arg Asn Ala He Arg Ala Ser Trp Gly Gly 85 90 95 Leu Arg Glu Ala Arg Gly Leu Arg Val Gln Thr Leu Phe Leu Leu Gly 100 105 110 Glu Pro Asn Ala Gln His Pro Val frp Gly Ser Gln Gly Ser Asp Leu 115 120 125 Ala Ser Glu Ser Ala Ala Gln Gly Asp He Leu Gln Ala Ala Phe Gln 130 135 140 Asp Ser Tyr Arg Asn Leu Thr Leu Lys Thr Leu Ser Gly Leu Asn Trp 145 150 155 160 Ala Glu Lys His Cys Pro Met Ala Arg Tyr Val Leu Lys Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Tyr Val Asn Val Pro Glu Leu Val Ser Glu Leu Val Leu Arg 180 185 190 Gly Gly Arg Trp Gly Gln Trp Glu Arg Ser Thr Glu Pro Gln Arg Glu 195 200 205 Ala Glu Gln Glu Gly Gly Gln Val Leu His Ser Glu Glu Val Pro Leu 210 215 220 Leu Tyr Leu Gly Arg Val His Trp Arg Val Asn Pro Ser Arg Thr Pro 225 230 235 240 Gly Gly Arg Gly Arg Val Ser Glu Glu Gln Trp Pro His Thr Trp Gly 245 250 255 Pro Phe Pro Pro Tyr Ala Ser Gly Thr Gly Tyr Val Leu Ser Ala Ser 260 265 270 Ala Val Gln Leu He Leu Lys Val Ala Ser Arg Ala Pro Leu Leu Pro 275 280 285 Leu Glu Asp Val Phe Val Gly Val Ser Ala Arg Arg Gly Gly Leu Ala 290 295 300 Pro Thr Gln Cys Val Lys Leu Ala Gly Ala Thr His Tyr Pro Leu Asp 305 310 315 320 Arg Cys Cys Tyr Gly Lys Phe Leu Leu Thr Ser His Arg Leu Asp Pro 325 330 335 Trp Lys Met Gln Glu Ala Trp Lys Leu Val Gly Gly Ser Asp Gly Glu 340 345 350 Arg Thr Ala Pro Phe Cys Ser Trp Phe Gln Gly Val Leu Gly He Leu 355 360 365 Arg Cys Arg Ala He Ala Trp Leu Gln Ser 370 375 <210> 14 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 30 csgggtaccg gaaacgatga aatatacaag <210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 ggcggatcca ggeagatcae agccaagaga acccaaaacg 40 <210> 16 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 gcggatccca ggeagatcae agccaagaga acccaaaacg 40 <210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 gcggatcccc aggcagatca cagccaagag aacccaaaac g 41

Claims

REIVINDICACIONES Un ácido nucleico aislado de menos que 10,000 nucleótidos o un complemento del mismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica UDP-galactosa: ß-N-acetilglucosamina ßl,3galactosiltranferasa (ß3Gal-T5) (SEQ ID NO: 9). El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 que es ADN. El ADN aislado de la reivindicación 2 que es ADNc o ADN genómico. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, que es ARN . Un ácido nucleico aislado de menos que 10,000 nucleótidos o un complemento del mismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ß3Gal-T5 (SEQ ID ?O:9), o una variante que conserva la función del mismo . Un ácido nucleico aislado de menos que 10,000 nucleótidos o un complemento del mismo que comprende los nucleótidos 73-930 de conformidad con lo establecido en la figura 1, o bien una variante que conserva la secuencia o que conserva la función del mismo . Un ácido nucleico de menos que 10,000 nucleótidos o un complemento del mismo que consiste de por lo menos 20 nucleótidos contiguos seleccionados entre los nucleótidos 1-115 y 428-1Q11 de SEQ ID NO: 8. . Un ácido nucleico aislado de menos que 10,000 nucleótidos o un complemento del mismo que se hibrida en condiciones preferidas de hibridación con un ácido nucleico que consiste de por lo menos 20 nucleótidos contiguos seleccionados entre los nucleótidos 1-115 y 428-1011 de SEQ ID NO:8. 9. Un vector de ácido nucleico de menos que 50,000 nucleótidos que comprende una primera secuencia de nucleótidos idéntica o derivada de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica ß3Gal-T5 (S?Q ID NO: 9) o un fragmento del mismo que tiene por lo senos 15 residuos de aminoácidos 10. Un vector de aminoácido de menos que 10,000 nuclecridos que comprende una primera secuencia de nuclec idos idéntica o derivada de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica ß3Gal-T5 (SEQ ID NO: 9) o un fragmento del mismo que tiene por lo menos 120 residuos de aminoácidos . 11. El vector de conformidad con la reivindicación 13, en donde la primera secuencia de nucleótidos se encuentra enlazada de manera operativa con un elemento de regulación de la transcripción. 12. Un vector de ácido nucleico de menos que 50,000 nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 5. 13. Un vector de ácido nucleico de menos que 50,000 nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 6. 14. Una célula huésped que comprende el vector de ácido nucleico de la reivindicación 10. 15. Una célula huésped transfectada de manera estable con el vector de ácido nucleico de la reivindicación 11. 16. La célula huésped de la reivindicación 14, en donde el vector de ácido nucleico es transfectado de manera estable. 17. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 14 que produce actividad enzimática ß3Gal-T5. 18. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 14 que se selecciona dentro del grupo que consiste de una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de ave y una célula de mamífero . 19. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 17 que se selecciona dentro del grupo que consiste de una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de ave y una célula de mamífero. 20. La célula de insecto > de conformidad con la reivindicación 19 que es una célula- de Spodoptera frugiperda . 21. La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 19 que es una célula de ovario de hámster chino. 22. Una célula huésped que comprende el vector de ácido nucleico de la reivindicación 12. 23. Una célula huésped que comprende el vector de ácido nucleico de la reivindicación 13. 24. Un método para la producción de polipéptido de ß3Gal-T5 (SEQ ID NO: 9), un fragmento del mismo que tiene por lo menos 30 residuos de aminoácidos, o bien una variante conservadora de la función del polipéptido o fragmento, que comprende : (i) la introducción en una célula huésped de ácido nucleico que codifica el polipéptido ß3Gal-T5, fragmento o variante; (ii) el cultivo de la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico introducido; y (iii) el aislamiento del polipéptido de ß3Gal-T5, fragmento o variante expresado por la célula huésped. 25. Un polipéptido de ß3Gal-T5 aislado (SEQ ID NO: 9) . 26. Un polipéptido ß3Gal-T5 aislado (SEQ ID NO: 9) o un fragmento del mismo que tiene por lo menos 5 residuos de aminoácidos . 27. Un polipéptido ß3Gal-T5 aislado (SEQ ID NO: 9), un fragmento del mismo que tiene por lo menos 50 residuos de aminoácidos, o bien una variante conservadora de la función del polipéptido o fragmento. 28. Un polipéptido ß3Gal-T5 aislado que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos de conformidad con SEQ ID NO: 9. 29. Un derivado o fragmento aislado del polipéptido de la reivindicación 28 que consiste de por lo menos 10 aminoácidos contiguos del polipéptido ß3Gal-T5. 30. El derivado o fragmento de la reivindicación 29 que muestra una o varias actividades funcionales del polipéptido ß3Gal-T5. 31. El derivado o fragmento de la reivindicación 29 que es capaz de enlazarse de manera inmunoespecífica a un anticuerpo preparado contra un polipéptido de ß3Gal-T5. 32. Una proteína de fusión que comprende un fragmento del polipéptido de ß3Gal-T5 de la reivindicación 28 que consiste de por lo menos 10 aminoácidos contiguos del polipéptido de ß3Gal-T5 fusionado por enlace covalente con una secuencia de aminoácidos de una segunda proteína, dicha segunda proteína no es un polipéptido de ß3Gal-T5. Una galactosiltransferasa aislada capaz de transferir galactosa ßl-3 a un sustrato de aceptador, que se selecciona dentro del grupo que consiste de GalNAcfil-3Galal-4Galßl-4Glcßl-Cer, Glcßl-Cer, GalNAcßl-4Galßl-Cer, GlcNAcßl-3Galßl-4Glcßl-Cer, y GlcNAcßl-3Galßl-4GlcNAcßl-4Glcßl-Cer. Un polipéptido de ß3Gal-T5 aislado (SEQ ID NO: 9), un fragmento del mismo o bien una variante conservadora de la función del polipéptido o fragmento que puede transferir galactosa ßl-3 a GalNAcßl-3Galal-4Galßl-4Glcßl-Cer. Un anticuerpo purificado o un fragmento de enlace de antígeno o derivado del mismo capaz de enlazarse de manera inmunoespecífica con el polipéptido de cualesquiera de las reivindicaciones 25-28 y no con otra galactosiltransferasa. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35 que se selecciona dentro del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 36, que es UH9. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se presenta un gen novedoso que define una enzima novedosa en la familia de UDP-D-galactosa: ß-N-acetilglucosamina/ß-N-acetilgalactosamina ßl, 3galactosiltransferasa, ß3Gal-T5, con propiedades enzimáticas únicas. La actividad enzimática de ß3Gal-T5 es distinta de la actividad enzimática de enzimas previamente identificadas de esta familia de genes. La invención divulga moléculas de ADN aisladas y constructos de ADN que codifican ß3Gal-T5 y derivados de la misma mediante remoción, sustitución o inserción de aminoácidos que muestran una actividad ß3Gal-T5, así como la clonación y vectores de expresión que incluyen dicho ADN, células transfectadas con los vectores, y métodos recombinantes para proporcionar ß3Gal-T5. 'Se divulga la enzima ß3Gal-T5 y derivados activos de ß3Gal-T5, particularmente derivados solubles que comprenden el dominio catalíticamente activo de ß3Gal-T5. Además, la invención divulga métodos para obtener sacáridos, glicopéptidos o glicoproteínas ßl, 3galactosilglicosilados mediante el uso de una proteína ß3Gal-T5 enzimáticamente activas o proteína de fusión de la misma o bien mediante el uso de células transfectadas de manera estable con un vector que incluye ADN que codifica una proteína ß3Gal-T5 enzimáticamente activa como un sistema de expresión para la producción recombinante de dichos glicopéptidos o glicoproteínas. Así mismo se divulga un método para identificar variaciones de secuencias de ADN en el gen de ß3Gal-T5 mediante el aislamiento de ADN de un paciente, amplificación de exones que codifican ß3Gal-T5 por reacción en cadena de polimerasa, y detección de la presencia de variación de secuencia de ADN.