JP2009537165A - 最適化されたグリコシル化活性を有するキメラ・グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列の製造及び使用 - Google Patents

最適化されたグリコシル化活性を有するキメラ・グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列の製造及び使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、キメラ膜グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列の製造に関し、前記配列により形質転換された細胞では最適化されたグリコシル化活性が示され、前記配列は、
−天然の全長グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン（ＣＤ）のＣ末端最小断片をコードする第一の核酸の
−そのＮ末端領域に膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）の上流に位置する細胞質尾部（ＣＴ）領域を含み、それ自身がステム（幹）領域（ＳＲ）の上流に位置する膜貫通ペプチドをコードする第二の核酸、との融合体に対応し
ただし、前記ＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲペプチドの少なくとも一つは、前記で定義した最適化したグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するＣＤ断片が由来する天然のグリコシルトランスフェラーゼにおける天然のペプチド対応物の一次構造とは異なる。
また、本発明は前記配列及び前記組換えタンパク質をコードする前記配列で形質転換された細胞による目的の組換えタンパク質の製造の枠組みにおける、前記遺伝子配列の使用に関する。

Description

発明の詳細な説明
本発明は最適化されたグリコシル化活性を示すキメラ・グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列の製造、及び前記配列及び前記組換えタンパク質をコードする前記配列により形質転換された細胞により、目的の組換えタンパク質を製造する枠組みにおけるその使用に関する。
《タンパク質及び脂質のグリコシル化》
タンパク質及び脂質は細胞膜の主要な構成要素である。膜に結合している炭水化物は、糖たんぱく質を形成するタンパク質及び糖脂質を形成する脂質に共有結合で結合している、もっぱらオリゴ糖の形態のみをとる。複合糖質（糖脂質及び糖タンパク質を含む）は多くの場合細胞−細胞相互作用及び細胞接着に関与すると考えられる、鍵を握る細胞表面分子である（Feizi, 1993; Crocker & Feizi, 1996）。
真核生物の糖タンパク質に見出される主要な単糖は、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び多くの場合ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）の形をとるシアル酸（Ｓｉａ）であり、これは哺乳動物ではＮ−アセチル化又はＮ−グリコシル化されていることもあるが、しかしヒトではＮ−アセチル化に限られる。グリカン（多糖）とも呼ばれる炭水化物鎖は、Ｏ−グリコシド又はＮ−グリコシド結合を介してポリペプチド骨格に結合している。Ｎ−グリコシド結合はアスパラギンのアミド基を介する。Ｏ−グリコシド結合は、セリン、トレオニン又はヒドロキシリジンの水酸基との結合である。ｓｅｒ−又はｔｈｒ−タイプＯ−結合型糖タンパク質では、タンパク質に直接結合する単糖は多くの場合ＧａｌＮＡｃである一方で、Ｎ−結合型糖タンパク質では、ＧｌｃＮＡｃのみが見出される。
Ｎ−グリコシド結合は酵母、植物、昆虫、哺乳動物及びヒトを含む真核生物界すべてで保存されている。Ｎ−結合型グリコシル化の部位はアミノ酸共通配列、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｎ−Ｘ−Ｓ（Ｔ））、であり、式中Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。公開されているデータベースでのタンパク質分析を行うと、全てのタンパク質の約６５％が少なくとも一つのそのような共通配列を含むことを示すことができる。全てのＮ−結合型糖タンパク質はペプチドに結合する共通の（不変の）五糖（類）を含む。この核は３個のＭａｎ及び２個のＧｌｃＮＡｃ残基より構成される。可変配列のアンテナによりグリカンが完成され、３種の主要なＮ−結合型サブクラスの分類が可能となる：
１．マンノース−リッチ（に富む）グリカンは末端の糖としてマンノースのみを含む。
２．ハイブリッド（雑種）グリカンは少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌのアンテナを含む。
３．複合グリカンは２〜５個のＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ又はシアル酸を端末とするアンテナを含む。
全ての真核細胞では、Ｎ−結合型糖タンパク質は小胞体（ＥＲ）に結合したポリリボソームから翻訳と共に合成される。Ｎ−結合型グリカンの処理は初期にＥＲ内腔中で起こり、そして糖タンパク質がその最終的、機能的多型性を達成するゴルジ装置及びトランスゴルジ網で継続する。Ｏ−結合型グリカンの結合は翻訳後にゴルジ装置で起こり、ここでは脂質のグリコシル化も起こる。Ｎ−及びＯ−グリコシル化の両方に使用される糖は、細胞質中の特定のヌクレオチドとカップルすることで活性化され、特定のトランスポータを介して細胞小器官の内腔へと運び込まれる。
グリコシル化はタンパク質に生じることがる最も洗練された翻訳後の修飾のセットである。その目的は次のとおりである：ｉ）タンパク質の生物的活性の制御、ｉｉ）レクチン様レセプターの結合及び／又は分解システムのためのシグナルタンパク質、ｉｉｉ）タンパク質を細胞表面へ向ける（ａｄｒｅｓｓ）（分泌）、ｉｖ）細胞内コンパートメント（区画）へ向けた標的タンパク質、ｖ）免疫学的同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の明確化（血液型）。結果として、グリコシル化タンパク質は糖型の混合物として存在し、その物理化学的及び生物学的性状は関連遺伝子により直接コードされた産物と異なる。タンパク質の翻訳後の修飾によりタンパク質の生物学的機能へのより良好な適合がもたらされることは、広く認められている（Helenius & Aebi, 2001）。
多くのヒト糖タンパク質は高い臨床的関連性を有する。例えば、細胞表面上でこれらは細胞間の情報交換、細胞構造の維持、及び免疫システムによる自己認識にとり重要である。
糖タンパク質は生物学的液体、例えばミルクや血液において可溶化した形で最も多量に存在する。この場合、グリカンはタンパク質をタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）から保護し、その溶解度を増加させ、その血漿でのクリアランスを支配し、そしてそれを標的器官へと向ける。
《グリコシル化酵素》
グリコシル化反応は原核生物及び真核生物の両方にとって際立った生物学的重要性を有し、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴｓ）と呼ばれる多数の酵素との共同作用を必要とする（Breton & Imberty, 1999）。
グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴｓ）は、原核生物界及び真核生物界それぞれにおける多糖及び複合糖質の生合成に関与する酵素の大きなファミリーを構成する。原核生物の酵素の配列は哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼと相同ではなく、一方、ヒト、哺乳動物及びショウジョウバエの酵素はしばしばかなりの相同性を共有する。これまでのところ、１０００以上のＧＴｓが広範な生物学的機能を調節していることが知られている。これら酵素の分子生物学における発展は、１個のヒトの生きた細胞中でグリコシル化の工程はおそらく約２５０個の遺伝子の関与を必要とすることを示唆する予期しない多様性が明らかにされた（Breton et al., 2001）。１６０個のヒト酵素を含む約５００個のグリコシルトランスフェラーゼが今日までにクローニングされた。ヒトではクローニングされた酵素の数は増えつつあり、間もなく２００個に達することもあるであろう（Narimatsu, 2004）。ＧＴｓは反応の基質及び産物の立体構造に従って、リテイニング（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）又はインヴァーティング（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）酵素として分類される（Sinnott, 1990）。ヌクレオチド２リン酸糖、ヌクレオチド１リン酸糖及び糖リン酸及び関連するタンパク質を使用してグリコシルトランスフェラーゼを異なる配列に基づくファミリーに分類することが確立されている。ヒトＧＴｓは今までのところ４２の構造ファミリーに分布することが示されている（http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/Homo-sapiens.html）。
グリコシルトランスフェラーゼは、糖残基をヌクレオチド糖（活性化ドナー基質）からアクセプター（脂質、タンパク質又は伸長中の炭水化物鎖）へ転移するのを触媒する。酵素の公式の分類に加えて、これらはその配列の類似性に基づき機能ファミリーにグループ化でき、それは酵素的な性質、例えば、ドナー特異性、アクセプター特異性、及びドナー及びアクセプターの間の結合特異性を反映することもある。それらが転移する糖に基づき、ＧＴｓはそれらが転移する糖によって、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃＴ）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、及びフコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）又はシアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａＴ又はＳＴｓ）のように命名される。グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子データの蓄積によると、グリコシルトランスフェラーゼはドナー及びアクセプターのいずれの基質の結合型並びに複合糖質アクセプターの性質（Ｎ−／Ｏ−結合型糖タンパク質又は脂質）に対して高い特異性を有すると考えられている。
＜グリコシルトランスフェラーゼの構造＞
脊椎動物のクローニングされた全てのＧＴｓは、これまでのところ、同じトポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）を示す。これらは４個の主要なドメインより構成されるＩＩ型膜タンパク質（Ｎ末端細胞質ドメイン）である：Ｎ末端の短い細胞質の尾部（ＣＴ）、１０〜２０アミノ酸よりなる膜アンカー領域（ＴＭＤ）、ステム領域（ＳＲ）及び大きなＣ末端触媒ドメイン（ＣＤ）（図１）（Paulson et al., 1987）。アンカー領域は開裂不能なシグナルペプチド及びまた膜貫通ドメインとしても作用し（Wickner & Lodisch, 1985）、ＧＴｓの触媒ドメインをゴルジ装置の内腔部分に配向させる。ＳＲはやはりＣＤをゴルジ装置の内腔に配向させるための柔軟性に富んだ領域と広く考えられている。通常の様に、ＣＤは種々の生物種のＧＴｓ内で保存されているのは理にかなっているが、一方ＳＲはトランスフェラーゼの超可変部を構成している。これら酵素のあるものはそのＳＲにおいて、内在性のタンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素で開裂され、ミルク又は血液酵素を生産するために細胞外に分泌されることもある（Paulson & Colley, 1989）。タンパク質分解酵素による開裂及びグリコシルトランスフェラーゼの分泌は、種々の病理学的条件、例えば悪性の形質転換及び炎症、により影響されることは十分記載されているが、しかし開裂及び分泌の基礎をなす分子的なメカニズムは未だ解明されていない。
ＧＴｓ及びネオ糖化タンパク質／脂質は、細胞膜の細胞下分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎｎａｔｉｏｎ）及び免疫電子顕微鏡を用いて、ＥＲ及びゴルジのサブ・コンパートメントの内部に局在していることが示された（Roth, 1987）。初期の研究は、ＧＴｓのコンパートメント化はオリゴ糖鎖修飾の配列を反映することがあることを示唆している（Kornfeld & Kornfeld, 1985）。この厳密な局在化は、酵素、基質及び糖ヌクレオチドドナーの間の効率的な近接度を提供することでグリカン鎖の最適化された生合成を確保することにあると考えられてきた。さらなる研究は、多くのグリコシル化酵素の局在化における重複及び細胞タイプ特異的なゴルジ・サブコンパートメント化を示した（Colley, 1997）。ＧＴｓはゴルジ層板（ｇｏｌｇｉ ｓｔａｃｋｓ）に広がり、これは所定のタンパク質について細胞のタイプ間で異なることができる（Roth, 1991）。
一般に、タンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、少なくともＧａｌＮＡｃＴｓ、ＧｌｃＮＡｃＴｓ、ＧａｌＴ、ＦｕｃＴ及びＳｉａＴがそのアクセプターを見出すために必須であるゴルジでの局在化を付与することを決定する鍵となることが示されている。ＴＭＤ及び／又は内腔面部分の隣接部位はやはり局在化に寄与していることが示された（Munro, 1998; Yang et al., 1996）。更に、ＧＴｓのＣＴ及びＳＲはそのｉｎ ｖｉｖｏでの細分化された機能的局在化及びゴルジ装置での安定化を特定する。３つのドメイン（ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ）のいずれを置換しても酵素の触媒活性を変化させないが、しかしそのゴルジ・コンパートメント内での分布を変化させることには寄与する（Grabenhorst & Conradt, 1999）。過去１０年間では特に明瞭な特異的標的化配列は見出されていないが、ただＧＴｓの、コンパートメント化のために不可欠な意味をもつ領域は同定されている（Opat et al., 2001）。更に最近、本発明者はＳＴ６Ｇａｌの可溶触媒ドメインは完全長酵素とは異なる細胞内経路をたどることを発見した（Ronin, Biochimie 2003）。
多数のＧＴｓの中で、強い興味を引くファミリーは末端のグリコシル化に関わるファミリーであり、その理由は、これらの糖がヒトにおいて認識とシグナル化の現象で重要な役割を担うということである。これらは、基本的にはシアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａＴｓ）、フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴｓ）及びガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴｓ）を含む。ガラクトース及びフコースは血液型（ＡＢＨ／Ｌｅｗｉｓ）抗原の認識に関与する。糖タンパク質及び糖脂質のシアル化されたオリゴ糖は多くの生物学的工程、例えば、炎症及び癌における細胞接着及びレセプター認識（シアリル・ルイス（Ｌｅｗｉｓ）抗原）並びにニューロン（神経細胞）の伸長（ポリシアリック抗原）に関与する（Paulson, 1989）。シアリル複合糖質の構造的な多様性及び制御された発現はそれらの機能とよく関連しているように思える（Sasaki, 1996）。
＜シアリルトランスフェラーゼ＞
シアル酸ファミリーは１００以上の誘導体より構成され、その中ではノイラミン酸が哺乳動物及びヒトで最も頻繁にみられる。シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴｓ）は、糖タンパク質又は糖脂質において、シアル酸残基を、その活性化された形体であるシチジル−１リン酸−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）からグルカン・アクセプターの非還元末端部位へ転移する反応を触媒する。その触媒反応は次のとおりである：
それぞれのＳＴはシアル酸残基及びアクセプター基質特異性（これはタンパク質又は脂質のいずれかであることができる）の間に確立された結合型（ｌｉｎｋａｇｅ）のタイプに従って分類される。従って、３つのグループを区別することができる：α２、３−シアリルトランスフェラーゼ（α２、３−ＳＴｓ）、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（α２、６−ＳＴｓ）及びα２、８−シアリルトランスフェラーゼ（α２、８−ＳＴｓ）。α２、６−ＳＴｓはシアル酸残基をα２、６部位（ＳＴ６Ｇａｌ）でガラクトース残基に、又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンに（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ）、又はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに（ＳＴ６ＧｌｃＮＡｃ）転位する。しかしながら、この最後のタイプの結合型の形成に関与する酵素は未知である。α２、３−ＳＴｓはシアル酸を、ガラクトース（ＳＴ３Ｇａｌ）の３位の炭素に、及びα２、８−ＳＴｓは他の１つのシアル酸残基（ＳＴ８Ｓｉａ）の８位の炭素に転移する。
また、ＳＴｓは全ての動物（トリからヒトまで）、細菌細胞及びウイルスで同定されている（Sujino et al., 2000）。ヒトＳＴｓのファミリーは表１に示すクローニングされた２０の異なる遺伝子で構成されている（Sasaki, 1996, Ronin 2003）。これらの基質特異性は次の通りである。
１）α２、６−ＳＴｓ
・ＳＴ６Ｇａｌ：
ＳＴ６ＧａｌＩはシアル酸残基を、多くの場合２糖であるグリカンのＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（van den Eijnden et al., 1980; Weinstein et al., 1982）へ転移する。それは、それが低レベルでしか発現されていない睾丸及び脳を除いて、ヒトの組織では普遍的に発現されている（表２）（Kitagawa & Paulson, 1994a）。
最近同定されたＳＴ６ＧａｌＩＩ（Krzewinski-Recchi et al., 2003; Takashima et al., 2002）は、２糖であるＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを、特にそれが遊離のオリゴ糖（未知タンパク質又は脂質）上に存在するときに、アクセプター基質として認識する。ＳＴ６ＧａｌＩＩの発現パターンは脳に限定され、睾丸、甲状腺、リンパ管（性）神経節（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｇａｎｇｌｉａ）及びいくつかの胎児組織では低レベルの発現を示す（表２）。
・ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ：
α２、６−ＳＴｓの二番目のサブファミリーはＳＴ６ＧａｌＮＡｃのグループで代表され、これはシアル酸残基をＮ−アセチルガラクトサミン残基に転移する。６つのメンバーはヒトで同定されている（表２）。
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩは、次に示すＯ−グリカン構造にシアル酸を転移することができることからも分かるように広い基質特異性を有する：Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ikehara et al., 1999; Kono et al., 2000; Kurosawa et al., 1994; Kurosawa et al., 1996; Harduin-Lepers et al., 2001）。これらの発現パターンは異なり、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは顎下腺及び乳腺、脾臓及び結腸に発現されており、一方ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩは多くの組織、例えば、睾丸、分泌中の乳腺で発現されている（Kurosawa et al., 1996; Kurosawa et al., 2000）。
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩの基質特異性は低い：これらは３糖であるＳｉａα２、３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃのみを認識する。しかしながら、現在ではＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ、Ｖ及びＶＩがＧＭ１ｂ糖脂質の形成を選択的に触媒することは確立されているが（Sjoberg et al., 1996; Lee et al., 1999）、一方ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶはシアル酸のＯ−グリカンへの転移を触媒する（Harduin-Lepers et al., 2000, Ikehara et al., 1999; Lee et al., 1999, Okajima et al., 2000）。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶは限定された基質特異性を示し、３糖配列であるＳｉａα２、３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃのみを使用するがα−及びβ−結合型ＧａｌＮＡｃの間の区別はしない。２つの異なるイソフォーム（同質異性体）が発見されている。ノーザンブロット分析により、種々の成体の組織で２．２ｋｂの転写産物が検出されており、脳、心臓、骨格筋では低レベルの付加的な転写産物の発現が検出されている（Harduin-Lepers et al., 2000）。
２）α２、３−ＳＴｓ
これらは全て、タンパク質又は脂質アクセプターにおいてガラクトース残基のシアル酸を転移するＳＴ３Ｇａｌである。
ＳＴ３ＧａｌＩは顎下腺ｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされその普遍的な発現（表２）はノーザンブロット法により確認された（Chang et al., 1995）。それは、多くのＯ−結合型オリゴ糖に共通の構造である、Ｓｉａα２、３Ｇａｌβ１−３−ＧａｌＮＡｃを合成する。それは他のＳＴｓと糖脂質アクセプター基質をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する能力において異なる（Kitagawa & Paulson, 1994b）。
ＳＴ３ＧａｌＩＩは、Ｋｉｍら（１９９６）により肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ、ノーザンブロット分析により高い発現が心臓、肝臓及び骨格筋で、中間レベルでの発現が胸腺、リンパ節、虫垂及び脾臓で、そして低いレベルの発現が肺の末梢血液リンパ球で示された（表２）。ＳＴ３ＧａｌＩＩは、シアル酸残基をアクセプター基質としてのＧａｌβ１−３−ＧａｌＮＡｃ又はガングリオシド（脂質）ＧＭ１またはアシアロ−ＧＭ１へ転移することができる（Giordanengo et al., 1997）。
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩは、シアリルモチーフに基づくプローブを使用してヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることでクローニングされ、その結果ＳＴ３ＧａｌＩＩＩをコードするｃＤＮＡが単離された（Kitagawa & Paulson, 1993）。転写産物は、骨格筋及び胎児組織に大量に、胎盤には少量発現している。この酵素はシアル酸のガラクトース含有基質への転移を触媒する（表２）。
ＳＴ３ＧａｌＩＶはＯ−結合型Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃのシアル化に関与する（表２）（Tetteroo et al., 1987）。５個の異なる発現したｍＲＮＡｓが存在し、５’末端を除き同一のタンパク質配列をコードする。これらの転写産物はオルタナティブ（選択的）スプライシングにより生産される。ノーザンブロット分析はこれらの一つが胎盤、睾丸、卵巣に特異的に発現していることを示し、その発現は他のものから独立して制御されていることを示している（Kitagawa et al., 1996）。
ＳＴ３ＧａｌＶは、ｃＤＮＡのヒト細胞ライブラリーから単離され、ＧＭ３シンターゼと呼ばれている。主要な２．４ｋｂ転写産物は多くの組織、特に脳、骨格筋、胎盤及び睾丸で発現されている。それはヒトの脳で広く分布しており、大脳皮質、側頭葉及び被殻では発現が僅かに上昇している。この酵素の基質特異性はアクセプターとしてラクトシルセラミドに厳密に限定されている（表２）（Ishii et al., 1998）。
ＳＴ３ＧａｌＶＩは、ヒト黒色腫ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。このＳＴは限定された基質特異性を示す：これはシアリル−パラブロボシドである、シアリル・ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｘ決定基の前駆体の合成に関与する（Okajima et al., 1999）。２つの形態のＳＴ３ＧａｌＶＩのｍＲＮＡ（タイプ１及び２と呼ばれる）が存在し、これらは５’非転写領域のみで異なる。この酵素は殆どの組織で同程度に発現されている（表２）（Taniguchi et al., 2001）。
３）α２、８−ＳＴｓ
ＳＴ８ＳｉａＩはまたガングリオシドＧＤ３合成酵素とも呼ばれ、α２、８−結合を介してシアル酸分子のＧＭ３の末端シアル酸への転移を触媒する（Sasaki et al., 1994）。この酵素はまたアクセプター基質としてＧＭ１ｂ、ＧＤ１ａ及びＧＴ１ｂを使用しることのできることが示されている（表２）（Nakayama et al., 1996; Nara et al., 1996; Watanabe et al., 1996）。
ＳＴ８ＳｉａＩＩはまたＳＴＸとも呼ばれている。Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒら（１９９５）は、ヒトｃＤＮＡを胎児心臓ライブラリーよりクローニングするために、げっ歯類ＳＴＸの配列を使用した。ＳＴＸは主として胎児組織、そして成体の心臓、脳及び胸腺で中程度に発現されている（Angata et al., 1997）。この酵素は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）及びポリシアル酸（ＰＳＡ）の間の結合を制御し、このようにしてＮＣＡＭの接着性を調節している。ＳＴＸは、Ｎ−グリカン上でα２、８結合を介して最初のシアル酸をα２、３又はα２、６に結合した他のシアル酸へ転移させる反応を触媒し（表２）（Angata et al., 1997）、次いでそれはα２、８−結合の形成による以前の残基を超えた伸長工程に関与している。
ＳＴ８ＳｉａＩＩＩは、シアル酸をＮ−グリカン及びＧＭ３のような糖脂質内のＳｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造に転移する（表２）（Lee et al., 1998; Yoshida et al., 1995a; Yoshida et al., 1995b）。
ＳＴ８ＳｉａＩＶは、またＰＳＴ（ポリシアリルトランスフェラーゼ）と呼ばれるが、Ｎａｋａｙａｍａら（１９９５）によりクローニングされた。ノーザンブロット分析は、ＰＳＴが多くの胎児組織、及び成体の心臓、脾臓、胸腺で発現され、また低いレベルでは他の臓器及び組織で発現されていることを示した（表２）。この酵素はまた神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）及びポリシアル酸（ＰＳＡ）の間の結合を制御している。更に、これはＳＴＸと同様の反応を触媒することが示されている（Angata et al., 2000; Nakayam et al., 1995）。
ＳＴ８ＳｉａＶはガングリオシドである、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ及びＧＤ３に対する転移活性を示す（表２）（Kono et al., 1996）。
ＳＴ８ＳｉａＶＩはごく最近ヒトでクローニングされ、これについてはほとんど何も知られていない。マウスのＳＴ８ＳｉａＶＩは、Ｏ−グリカン、Ｎ−グリカン及び遊離オリゴ糖、例えば、シアリルラクトースの非還元末端に見いだされるＮｅｕＡｃα２、３（６）Ｇａｌβ構造上へのシアル酸の転移活性を有する（表２）（Takashima et al., 2002）。
４）シアリルトランスフェラーゼ活性促進に必要な構造的構成
ＳＴｓファミリーの全てのメンバーはシアリルモチーフと命名されているそのＣＤにおける３つの保存された領域を有する：その一次配列の比較に基づき、モチーフＬはラージ、Ｓはスモール及びＶＳはベリー・スモールの意味である（Datta & Paulson, 1995; Geremia et al., 1997）。動物のゲノムの調査が、最近公開され（Harduin-Lepers, 2005）、それによるとシアリルモチーフを有する未知配列が見出され、従ってこれは潜在的に新規ＳＴｓである。
全てのヒト酵素では図２に示すように、シアリルモチーフＬは４４又は４５個のアミノ酸より構成され、その間に５つの不変残基を含んでいる。この領域はＣＤの中央である。二番目のシアリルモチーフＳは、ＣＯＯＨ末部位に存在するが、２３個のアミノ酸残基より構成され、その残基のうち２個は全てのＳＴｓで同一である（Drickamer, 1993）。三番目のシアリルモチーフ VSは、酵素の末端部位であるが、１３個のアミノ酸より構成され、そのうち２個は保存された残基である（ヒスチジン及びグルタミン酸）。
シアリルモチーフＬは、ドナー基質であるＣＭＰ−シアル酸との結合に関与することが明らかにされている（Datta & paulson, 1995）。このモチーフのいくつかのアミノ酸は、また酵素の触媒活性にも関与することができる（Sasaki, 1996）。シアリルモチーフＳはドナー及びアクセプターの両方の結合に関与することが提唱されている（Datta et al., 1998）。ＶＳの正確な役割は未だ明確でないが、しかし最近のＳＴＸ及びＰＳＴについての研究は保存されているＨｉｓのこのモチーフにおける機能的ルール（規則）を調べている（Kitazume-Kawaguchi et al., 2001）。ヒスチジンのリジン残基への変換はその触媒活性に影響し、そのことはモチーフＶＳが触媒反応に関与していることを示している。シアリルモチーフＶＳは触媒効率の最適化に必要であり、これは主にアクセプター部位上又はドナー及びアクセプターの糖基質の近隣における活性部位の一部である（Jeanneau et al., 2004）。以前の研究から、ＣＤのＣ末端部位（シアリルモチーフＳの一部、モチーフ３及びシアリルモチーフＶＳ）は主にアクセプター基質を認識する役割を担うことが決定されているが、一方、Ｎ末端部位（シアリルモチーフＬ及びＳの一部）は主にヌクレオチド糖の結合に関与していることは、今や明らかである（Datta & Paulson, 1995; Datta et al., 1998; Laroy et al., 2001; Kitazume-Kawaguchi et al., 2001; Jeanneau et al., 2004）。しかしながら、シアリルモチーフＬがアクセプターの認識にも関与し得ることも排除できない（Legaigneur et al., 2001）。
前記のように、ヒトシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列は、４つのドメインにおいて多くのＧＴｓで共有される同じ構成を示す：ｉ）短いN末端尾部（ＣＴ；約１０個のアミノ酸）、ｉｉ）膜貫通ドメイン（ＴＭＤ；約２０個のアミノ酸）、ｉｉｉ）ステム領域（ＳＲ）、長さが非常に変化し得る、及びｉｖ）触媒ドメイン（ＣＤ；約３００個のアミノ酸）。
ＳＲはＴＭＤ及びＣＤの間のペプチド領域として定義され、これは酵素活性を変化させることなく除くことができる（Paulson 1989, Ronin, 2001, Vallejo-Ruiz et al., 2001; Jeanneau et al., 2004）。しかしながら、本発明者はこの超可変領域はグリカンアクセプターの微妙な認識を決定するのに必須であることもあることもあり（バイ（ｂｉ）＞トリ（ｔｒｉ）＞テトラ（ｔｅｔｒａ）のアンテナ（ａｎｔｅｎｎａｒｙ））を示し、そしてこれは触媒部位を開くための構造変化に関連することもあることを提唱した（Ronin, 2001）。その結果、触媒効率は３５倍上昇し、そしてグリカンアクセプターの認識は広がる。
ＣＤはＳＴｓが酵素活性を発揮するのに決定的に重要である。それは全ての哺乳動物のクローニングされたＳＴｓに見いだされる同一アミノ酸部位を維持する、少なくとも３つの高度に保存された配列を含む。これらドメインは、Ｌ−、Ｓ−及びＶＳ−シアリルモチーフである（Livingston & Paulson, 1993; Geremia et al., 1997）。追加のドメイン（モチーフ３）もまたシアリルモチーフＳ及びＶＳの間から最近単離され、それは次の共通配列を有する４つの高度に保存された残基を含む：（Ｈ／ｙ）Ｙ（Ｙ／Ｆ／Ｗ／ｈ）（Ｅ／Ｄ／ｑ／ｇ）（大文字及び小文字は高率又は低率のアミノ酸の出現をそれぞれ示す）（Jeanneau et al., 2004）。文献に記載されている多くの研究は大きなＳＴｓファミリーの構造／機能に関連する洞察を得ることを目指しており、したがって、特に最小の内部触媒ドメイン部位を決めることを目指している。最小のＣＤは、部位特異的突然変異誘発法又はその代替として少数のＳＴｓに対する配列位置合わせ及び比較により実験的に明らかにされた（Vallejo-Ruiz et al., 2001; Chen & Colley, 2000, Ronin 2003）。
ＣＤ及び触媒活性の幅広い定義にも拘わらず、ＳＴｓの最少ＣＤを区切るのは依然として容易ではない。ＳＴｓの中でＳＴ６ＧａｌＩは最も研究された酵素であり、最小触媒ドメイン及び触媒活性の解明のための大部分の研究もこれで実現された。これは、ヒト組換えタンパク質を生産するために使用しる全ての細胞でＳＴ６Ｇａｌが存在しないためである。非動物細胞（酵母、昆虫及び植物）を使用した異種のシステムがどのようなシアル酸をも含まないので、この欠損は、このシステムの技術的障害となっている。一方、ＣＨＯ細胞ではＳＴ３活性のみが発現されている。
ＳＲ及びＣＤの間の境界設定は、実験的手法以外には行われたことはない。バイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ）に基づき、本発明者は３つのＳＴファミリーについてＳＲの端末を同定する方針を立てた（Ronin., 2003）。
ＣＤは、一般的には酵素のＮ末端の半分の超可変領域の末端と一致する（Ronin., 2003）。従って、触媒ドメインはシアリルモチーフＬの上流の７０〜９０残基あたりから、そしてＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ〜ＶＩでは４０〜４５残基あたりから始まると推定される。例えばシアリルモチーフでは、ＣＤの平均の大きさは約３００（±２０）個のアミノ酸であると概算されている（Jeanneau et al., 2004）（表３）。最小のＣＤは、少数のＳＴｓについて―切断実験又は配列比較のいずれかで―（Legaigneur et al., 2001; Vallejo-Ruiz et al., 2001; Chen & Colley, 2000）、例えばｈＳＴ３ＧａｌＩで（最小のＣＤはアミノ酸５７〜３４０で構成される； Vallejo-Ruiz et al., 2001）及びｈＳＴ８ＳｉａＩＶで（最小のＣＤはアミノ酸６２〜３５９で構成される； Angata et al., 2004）、その範囲が決められている。
ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされると、ｈＳＴ６ＧａｌＩの可溶性ＣＤ（アミノ酸９０〜４０６）は内在性のアクセプターに対して拡大した特異性を示すことが見出されたが、その理由はそれがゴルジ装置内の細胞内分泌経路に従うからである。従って、細胞内に存在するアクセプターから細胞表面複合糖質にアクセプター認識を移動させることを可能とする不可欠な配列を含むｈＳＴ６ＧａｌＩの最少のＣＤの範囲を決定することが可能となった（Donadio et al., 2003）。更に、ｈＳＴ６ＧａｌＩの分泌された可溶性ＣＤは、グリカンアクセプターの分枝パターンに無関係に、転移効率の上昇を示した（Legaigneur et al., 2001）。
《異種発現システムで生産されたグリコシル化タンパク質（薬剤）》
治療の目的のタンパク質は、最初は自然のソース、例えば血液、胎盤, ヒト又は動物組織、から抽出された。しかしながら、このアプローチは、そのソース、量及びヒト組織の使用可能性により限定を受け、また、生命の脅威となる汚染物（プリオン、癌遺伝子、ウイルス・・・）並びに動物タンパク質によるアレルギー誘発物質をふくむこともある。薬剤として認可されたタンパク質の出現及び臨床での需要の高まりとともに、異なる発現システムを使用してタンパク質を生産する新しいアプローチが開発された。
大部分の例では、最近の活発な研究は、薬物動態を改善し産物の免疫原性を低下させるために、自然界の糖タンパク質にみられるパターンにできる限り近づけるように組換えタンパク質のグリコシル化パターンをヒト化する方向に、向けられている。
シアル酸残基の合成、活性化及び導入のために必要とする機構は、種々の既存の組換えタンパク質発現システムでは貧弱な発現である。従って、生産される組換えヒトタンパク質は、その天然の対応物に比較しシアル化がしばしば低いか全くなされていない。
最も使用されているシステムの一つは、細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Swartz, 2001; Baneyx, 1999）であるが、その主要な不都合性は、翻訳後の修飾、特にタンパク質グリコシル化、がこの原核生物では行われないことで、その理由は、そのようなグリコシルトランスフェラーゼが大腸菌では発現されていないからである。これは、治療の目的のタンパク質の免疫システムでの拒絶、その循環半減期及び／又はその生物活性の減少の可能性をもたらすことができる。生産されたタンパク質は結果として誤って折りたたまれ封入体として凝集することができる。
酵母及び糸状菌もまた周知の真核生物発現システムであり、これらはヒト細胞に類似した細胞装置を有している。酵母はタンパク質複合体を生産し、そして翻訳後のいくつかの修飾、例えば、簡単なグリコシル化を行うことができる。しかしながら、酵母及び菌類による最初のステップにおける小胞体でのＮ−グリコシル化工程は哺乳動物の工程と同様であるが、シアル酸、ガラクトース、フコース及びＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合オリゴ糖はこれらの生物により生産される糖タンパク質内には見出されない（Blanchard, 2004）；酵母及び菌類は共に、通常は、ゴルジ装置において５糖の核に１００マンノース残基までを付加することで、マンノースに富むグリカンを生産する（酵母の場合）（Tanner & Lehele, 1987; Herscovics & Orlean, 1993）。このような過度のマンノース化はヒトでは免疫反応を増強する。
酵母におけるグリコシル化を操作することで（Hamilton et al., 2003; Roy et al., 2000）、まず、添加されるマンノース残基数を減らせるようになった。次いで、末端のＮ−アセチルグルコサミニル化及びガラクトシル化に必要な酵素がこれらのシステムに加えられた（Maras et al., 1999; Bretthauer, 2003; Vervecken et al., 2004）。しかしながら、末端シアル酸の添加は、この末端のステップには多数の酵素が関与するので、なお達成するのが困難である。
昆虫細胞で発現されるタンパク質は適正に折りたたまれ、翻訳後の修飾がおこなわれ、そして分泌されることもある。これらの細胞による初期のＮ−結合型グリコシル化は哺乳動物細胞で行われるものと類似している。しかしながら、この場合に得られるグリカン構造は、マンノース不足型であり、これは即ち、バキュロウイルス発現の間に発現される新生糖タンパク質を分解させる好ましくないＮ−アセチルヘキソサミニダーゼの存在による切断による（Blanchard, 2004）。更に、いくつかの昆虫細胞株では、α１、３／フコース残基が見出され、これらの残基は一般にヒトでは好ましくない免疫反応の引き金となることもある。従って、このシステムの使用はワクチン用抗原の生産に限定される。
昆虫細胞では免疫原性を有する糖の転移を触媒するＧＴｓは欠損し、シアル化は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミニル・リアーゼ及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼをコードする３つの遺伝子を添加することで達成することができた（Jarvis et al., 1998; Aumiller et al., 2003）。それ自身のＣＭＰ−シアル酸を合成するようにデザインされた新規の昆虫細胞株（ＳｆＳＷＴ−３）が創出された。結果として得られた細胞は、血清を含まない成長培地で培養すると全ての7つの哺乳動物遺伝子を発現し、ＣＭＰ−シアル酸を生産することができ、そして異種タンパク質をシアル化することができる（Aumiller et al., 2003）。
真核細胞として、植物は複雑で洗練された細胞装置を揃えており、これは治療用タンパク質に使用されることもある。植物がタンパク質の成熟に必要とされる多くの酵素を持っているので、組換えタンパク質は、非常に良好な薬剤学的性質を有する。しかしながら、アレルギー原性タンパク質を生産しないように、グリコシル化経路は広範囲にわたり調整される必要がある。実際のところ、植物におけるＮ−グリコシル化（Lerouge et al., 2000）は、核となるグリコシル化に関する限りはヒトでなされるそれと類似している。しかしながら、グリカンはそれでもシアル化されたアンテナを欠いており、そして内部β１、２−キシロース及びα１、３−フコースを含む。両方の残基はヒトに対して高いに免疫原性を示し、最近はトランスジェニック植物は治療用の発現システムとしての承認にあたっては歩み寄りを必要としている。
植物では、使用されている最初の戦略は、タンパク質が小胞体を出ることを阻止することでアレルギー原性の糖の付加を阻止することを目指した。その結果、Ｎ−結合型グリカンは複合型に成熟できない。他の戦略は、ゴルジ装置内のいくつかのＧＴｓを阻害することに基づいている。この阻害により、成熟のための内在的な機構が完成しないようにできるか、及び／又は、それと競合するようにできる。
哺乳動物発現システム、すなわち、ＣＨＯ細胞は、組換え治療薬生産のための現在の唯一の薬剤承認システムである。この細胞は、高分子及び／又は多量体の複合Ｎ−結合型糖タンパク質を合成できるので、際立つ利点を有している。哺乳動物細胞は生来ヌクレオチド糖の合成及び輸送に関与する酵素を発現するばかりでなく、また３−結合型シアル酸の満足できる量を伴う組換えタンパク質の複合グリコシル化を達成するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼを発現している。しかしながら、末端Ｏ−結合型及びＮ−結合型グリコシル化を実現するいくつかの酵素、例えばα１、３／４−フコシルトランスフェラーゼ及びα２、６−シアリルトランスフェラーゼに欠損がある。更に、哺乳動物細胞ではシアル化はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を通して起るが、これはまたヒト細胞で見いだされるＮ−アセチル化誘導体（ＮｅｕＡｃ）とは非常に異なる。
哺乳動物細胞の場合、α２、３−ＳＴ及びβ１、４ＧａｌＴの過剰発現を通して研究が行われた（Weikert et al.,1999）；両方の酵素はゲノムには存在するが、その活性は細胞培養の条件により高度に変化する。これは、末端のＧａｌ及びシアル酸の存在に関して広い変化をもたらし、そしてグルコシル化タンパク質における著しい微小不均一化（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）をもたらした。研究はまた、哺乳動物細胞におけるα２、６−ＳＴの導入による（Bragonzi et al., 2000）ガラクトシル化及びシアル化の最適化に向けられた（Granbenhorst et al., 1999）。天然ラットα２、６−ＳＴを安定に発現するＣＨＯ細胞株が樹立された。これらＣＨＯ細胞により生産される糖タンパク質は、ヒトに類似の両方のα２、６及びα２、３−結合型シアル酸残基を示した；付加されているα２、６及びα２、３−結合型末端シアル酸残基の間の比率は、α２、６−及びα２、３−シアル酸残基でそれぞれ４０．４％及び５９．６％であり、これはクリアランス試験における薬物動態で証明された（Bragonzi et al., 2000）。細胞のヒト化によるこれらの改善にも拘わらず、α２、６及びα２、３−結合型末端シアル酸残基間の比率は制御することができず、６−活性にとってさえ好ましいものにはならなかった。第一に、シアル化はグルカン構造にとり不可欠なステップであり、また、第二の困難性は、細胞の特定のコンパートメント中で異種ＳＴを発現すること（指定（ａｄｒｅｓｓｉｎｇ））及びこの酵素に対するドナー基質が存在する（担体（ｃａｒｒｉｅｒ））という条件下で、その活性を最適化することに存在するようにみえる。
従って、承認された糖タンパク質薬剤の末端シアル化がこれまでに使用可能な全ての発現システムにおいて、取得するのがおおよそ最も困難なステップであるということは、指摘しておく価値がある。
《発明の目標（ゴール）》
本発明の目標は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するキメラ膜酵素をコードする新しい遺伝子配列のパネルを創出するための、特に、必要とされるシアル化活性を細胞に具備させ、組換え糖化タンパク質の性質と収量を改善するために新規のキメラ・シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列をデザインするための方法を提供することである。
本発明は、対応する天然のグリコシルトランスフェラーゼのグリコシル化活性との比較において、キメラ膜グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列で形質転換された細胞中で最適化されたグリコシル化活性、すなわちアクセプター基質に対して選択性がより少なく及び／又はより効率的な（天然全長グリコシルトランスフェラーゼの最初の活性より少なくとも３０倍までの）グリコシル化活性を示す、前記配列を作成する方法に関し、前記方法は次の第一核酸配列の第二配列への融合を含む：
−第一の核酸配列、これは天然全長グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン（ＣＤ）のＣ末端最小断片をコードし、前記Ｃ末端最小ＣＤ断片はトランスフェラーゼ活性を示し（これは天然ＣＤの最初の活性より少なくとも３０倍まで高めることができる）、前記の第一核酸配列は、前記ＣＤのＮ末端の最初のアミノ酸から伸長した１個ないし数個の隣接アミノ酸をコードするヌクレオチドの除去、そして前記Ｃ末端最小ＣＤ断片からの選択、により取得されるが、この場合、ｎが前記で定義される除去される隣接アミノ酸の数を示すのであれば、前記に定義された少なくともｎ＋１の隣接アミノ酸を切除して得られた断片は実質的なトランスフェラーゼ活性を有しないように設定されており、
−第二の可変配列、これは細胞内コンパートメントへのグリコシルトランスフェラーゼの固定を特定する膜内ペプチド鎖をコードし、そしてそのＮ末端領域に、膜貫通領域（ＴＭＤ）の上流に位置する細胞質尾部（ＣＴ）領域を、ステム（stem）領域（ＳＲ）の又は隣接アミノ酸の少なくとも３個よりなるＳＲ断片の上流に位置する膜貫通ドメインを、前記触媒ドメインに、場合によりリンカー又は前記の天然のＣＤをコードするヌクレオチド配列には存在しない制限酵素サイトによりコードされるアミノ酸少なくとも２個の結合ペプチドを介して、結合している前記ＳＲ又はその一部を含み（又は、それらで構成され）、
ただし、前記ＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲペプチドの少なくとも１つが、前記で定義した最適のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するＣＤ断片が由来する天然のグリコシルトランスフェラーゼに存在する天然のペプチドのカウンターパート（counterparts）の一次構造とは、異なるものであり、
前記融合は、第一の核酸は第二の核酸の下流に位置し、ＣＤがＣ末端の半分であるタンパク質産物を提供するように行われることを条件とする。
対応する天然グリコシルトランスフェラーゼのグリコシル化活性と比較した場合に、キメラ膜グリコシルトランスフェラーゼが前記配列で形質転換された細胞の最適化されたグリコシル化活性を示すことで、前記のキメラ膜グリコシルトランスフェラーゼは次の活性を有することが理解されるであろう：
−糖転移活性、これは、既知のバイ（ｂｉ−）、トリ（ｔｒｉ−）又はテトラ（ｔｅｔｒａ）のアンテナのグリカンを有する外来性／市販のアクセプター糖タンパク質を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した場合に示される、対応する天然グリコシルトランスフェラーゼより選択性の小さいアクセプター基質に対する活性であって、すなわち、それは全ての細胞糖タンパ質アクセプターに対して細胞で示されるｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化活性であり、前記グリコシル化活性はレクチンＳＮＡ結合を使用した次の一般的な手順に従って、好ましくは細胞内及び細胞表面のコンパートメントで測定することができ、
−及び／又は、対応する天然のグリコシルトランスフェラーゼに比較してアクセプター基質に対するより効率的な糖転移活性を有し、すなわち、天然全長のグリコシルトランスフェラーゼの最初の活性より少なくとも３０倍まで高いグリコシル化活性を示し、前記グリコシル化活性は既知のバイ（ｂｉ−）、トリ（ｔｒｉ−）又はテトラ（ｔｅｔｒａ）のアンテナのグリカンを有する外来性／市販のアクセプター糖タンパク質を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏの手順で測定可能である。
前記で使用した「キメラ・グリコシルトランスフェラーゼ」の表現は、その全長配列が天然遺伝子の直接の産物又は転写産物でなく、もっぱら他のグリコシルトランスフェラーゼからの配列のみを使用してデザインされたグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
前記で使用した「天然グリコシルトランスフェラーゼ」の表現は、天然に存在するコード配列により代表される全長酵素の配列に対応する。
前記で使用した「グリコシル化活性」の表現は、ヌクレオチドドナーからアクセプター基質への糖の転移の触媒反応に対応する。
前記で使用した「最小触媒ドメイン（ＣＤ）」の表現は、転位活性を失うことなくそれ以上削除できないグリコシルトランスフェラーゼ配列のＣ末端ペプチドドメインに対応する。
前記で使用した「膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）」の表現は、疎水性の１７〜２４個のアミノ酸のストレッチ（伸長）より構成されるペプチド部分に対応する。
前記で使用した「細胞質尾部（ＣＴ）」の表現は、ＴＭＤより上流の少なくとも３個より多いアミノ酸を包含することもあるグリコシルトランスフェラーゼのN末端ペプチドに対応する。
前記で使用した「ステム領域（ＳＲ）」の表現は、ＴＭＤの下流／ＣＤの上流の最大２４６個のアミノ酸のストレッチに対応する。
本発明は、より具体的には、第一及び第二の核酸が、真核生物由来の、好ましくは哺乳動物及びヒトのグリコシルトランスフェラーゼにおける、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲ領域のそれぞれをコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、前記の定義された方法に関し、前記グリコシルトランスフェラーゼは：
・細胞におけるタンパク質のＯ−グリコシル化、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニル−、Ｎ−アセチルグルコサミニル−、グルコシル−、フコシル−、ガラクトシル−、又はシアリルトランスフェラーゼ、
・細胞におけるタンパク質のＮ−グリコシル化、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニル−、ガラクトシル−、フコシル−又はシアリルトランスフェラーゼ、
・ 脂質のグリコシル化、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニル−、Ｎ−アセチルグルコサミニル−、フコシル−、ガラクトシル−、又はシアリルトランスフェラーゼ、
に関連する。
前記で使用した「Ｏ−グリコシル化」の表現は、アスパラギン残基ではない、好ましくは水酸基アミノ酸、例えば、セリン、トレオニン又はヒドロキシリジン残基であることができるアミノ酸に共有結合で結合する単糖又はオリゴ糖を合成する生合成経路に対応する。
前記で使用した「Ｎ−グリコシル化」の表現は、共通のトリペプチドＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリンでない）内でアスパラギン残基に結合するオリゴ糖を合成する生合成経路、に対応する。
前記で使用した「ガラクトシルトランスフェラーゼ」の表現は、ＵＤＰ−ＧａｌからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質アクセプターへガラクトース残基を転移する、グリコシルトランスフェラーゼ、に対応する。
前記で使用した「シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸の誘導体を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質アクセプターに転移するグリコシルトランスフェラーゼ、に対応する。
本発明は、より具体的には、第一及び第二の核酸が、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ又は、シアリルトランスフェラーゼにおける、それぞれＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、前記で定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、第一及び第二の核酸が、アルファ６フコシルトランスフェラーゼ（核のグリコシル化）、ベータ２／４／６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（分枝化）、ベータ４ガラクトシルトランスフェラーゼ及びアルファ３／６／８シアリルトランスフェラーゼ（末端グリコシル化）において、それぞれＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする前記で定義された方法に関する。
有利なことに、第一及び第二の核酸は、Ｎ−グリコシル化経路に関与する酵素のＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列に由来する。
本発明は、より具体的には、第一及び第二の核酸が、シアリルトランスフェラーゼにおける、それぞれＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、前記で定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、第一及び第二の核酸が、α２、６−シアリルトランスフェラーゼ、α２、３−シアリルトランスフェラーゼ、又はα２、８−シアリルトランスフェラーゼにおいて、それぞれ、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、前記で定義された方法に関する。
有利なことに、前記のＣＴ、ＴＭＤび及び／又はＳＲ又はＳＲ断片をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは合成由来である。
前記で使用した「α２、６−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体、をＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質タイプ由来の炭水化物アクセプターの６−部位へ転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
前記で使用した「α２、３−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体、をＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質タイプ由来の炭水化物アクセプターの６−部位へ転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
前記で使用した「α２、８−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体、をＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質タイプ由来の炭水化物アクセプターの６−部位へ転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
本発明は、より具体的には、第一及び第二の核酸が、
−それぞれ配列番号２、及び配列番号４で表され、それぞれ配列番号１、及び配列番号３のヌクレオチド配列でコードされる、ヒトβ１、４−ガラクトシドα２、６−シアリルトランスフェラーゼＩ及びＩＩ（ｈＳＴ６ＧａｌＩ、及びｈＳＴ６ＧａｌＩＩ）又は
＊それぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１６で表され、それぞれ配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５のヌクレオチド配列でコードされる、ヒトＮ−アセチルガラクトサミニド−α２、６−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ〜ＶＩ）、
の中から選択されるα２、６−シアリルトランスフェラーゼ：、
−それぞれ配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８で表され、それぞれ配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７のヌクレオチド配列でコードされる、ヒトガラクトシド−α２、３−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ｈＳＴ３ＧａｌＩ〜ＶＩ）、又はラットガラクトシド−α２、３−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ラットＳＴ３ＧａｌＩ〜ＶＩ）、例えば、配列番号３０で表され、配列番号２９のヌクレオチド配列でコードされるｒＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、若しくは他の動物由来の任意のＳＴ（但し、ヒト酵素と少なくとも８５％の相同性を共有する）、
の中から選択されるα２、３−シアリルトランスフェラーゼ：
−それぞれ配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号４２で表され、それぞれ配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、及び配列番号４１のヌクレオチド配列でコードされている、ヒトシアル酸−α２、８−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ｈＳＴ８ＳｉａＩ〜ＶＩ）の中から選択されるα２、８−シアリルトランスフェラーゼ、
において、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、及びＳＲ領域を、それぞれコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、前記で定義された方法に関する。
前記で使用した「ガラクトシド−α２、６−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質タイプ由来のガラクトシル化されたアクセプターの６−部位まで転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
前記で使用した「Ｎ−アセチルガラクサミニドα２、６−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質アクセプターのＮ−アセチルガラクサミニル残基の６−部位まで転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
前記で使用した「ガラクトシドα２、３−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからガラクトシル化されたＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質のアクセプターの６−部位まで転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
前記で使用した「ガラクトシド−α２、８−シアリルトランスフェラーゼ」の表現は、シアル酸残基、好ましくはノイラミン酸誘導体を、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからＮ−／Ｏ−結合型タンパク質又は糖脂質のアクセプターまで転移することのできるグリコシルトランスフェラーゼに対応する。
本発明は、より具体的には、第一の核酸に含まれるＣＤドメインをコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号１において、５’末端が部位２６８〜３３０に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１２１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２においてＮ末端が部位９０〜１１０に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４０６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３において、５’末端が部位３０７〜３６９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１５８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号４においてＮ末端が部位１０３〜１２３に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５２９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号５において、５’末端が部位８１４〜８７６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１８００に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩのＣＤドメインに対応する、配列番号６においてＮ末端が部位２７２〜２９２に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６００に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号７において、５’末端が部位１７２〜２３４に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号８においてＮ末端が部位５８〜７８に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号９において、５’末端が部位７３〜１３５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９１５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号１０においてＮ末端が部位２５〜４５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３０５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１１において、５’末端が部位６１〜１２３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９０６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩＶのＣＤドメインに対応する、配列番号１２においてＮ末端が部位２１〜４１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３０２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１３において、５’末端が部位１２１〜１８３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１００８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＶのＣＤドメインに対応する、配列番号１４においてＮ末端が部位４１〜６１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３３６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１５において、５’末端が部位１５４〜２１６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９９９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＶＩのＣＤドメインに対応する、配列番号１６においてＮ末端が部位５２〜７２に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３３３に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１７において、５’末端が部位１４５〜２０７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０２０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインに対応する、配列番号１８においてＮ末端が部位４９〜６９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３４０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１９において、５’末端が部位１７５〜２３７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０５０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２０においてＮ末端が部位５９〜７９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２１において、５’末端が部位１９９〜２６１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１３３２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２２においてＮ末端が部位６７〜８７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４４４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２３において、５’末端が部位７９〜１４１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＣＤドメインに対応する、配列番号２４においてＮ末端が部位２７〜４７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３２９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２５において、５’末端が部位１３６〜１９８に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０８６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶのＣＤドメインに対応する、配列番号２６においてＮ末端が部位４６〜６６に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３６２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２７において、５’末端が部位７３〜１３５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９９３に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２８においてＮ末端が部位２５〜４５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３３１に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２９において、５’末端が部位１０３〜１６５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３０においてＮ末端が部位３５〜５５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３１において、５’末端が部位１３３〜１９５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０６８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３２においてＮ末端が部位４５〜６５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３３において、５’末端が部位１９０〜２５２に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３４においてＮ末端が部位６４〜８４に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３５において、５’末端が部位２０５〜２６７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１４０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３６においてＮ末端が部位６９〜８９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３８０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３７において、５’末端が部位１４５〜２０７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０７７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＤドメインに対応する、配列番号３８においてＮ末端が部位４９〜６９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３９において、５’末端が部位２１１〜２７３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶのＣＤドメインに対応する、配列番号４０においてＮ末端が部位７１〜９１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号４１において、５’末端が部位２７７〜３３９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１９４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＣＤドメインに対応する、配列番号４２においてＮ末端が部位９３〜１１３に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３９８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
で構成されるか、又は含む配列の中から選択されることを特徴とする、前記で定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、第一の核酸が、配列番号１の部位２６８および１２１８に位置するヌクレオチドにより区切られた配列に対応する、配列番号４３のヌクレオチド配列であり、前記の配列番号４３のヌクレオチド配列は、配列番号２の部位９０〜４０６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインのＣ末端最小断片に対応する配列番号４４のポリペプチド配列をコードすることを特徴とする、前記で定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、
−第二の核酸に含まれるＣＴ領域をコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号４５のヌクレオチド配列（これは配列番号１の部位１及び２７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４５のヌクレオチド配列は配列番号２の部位１〜９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＴ領域に対応する配列番号４６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号４７のヌクレオチド配列（これは配列番号３の部位１及び３０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４７のヌクレオチド配列は配列番号４の部位１〜１０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号４８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号４９のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位１及び４２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４９のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１〜１４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ領域に対応する配列番号５０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５１のヌクレオチド配列（これは配列番号７の部位１及び２１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５１のヌクレオチド配列は配列番号８の部位１〜７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号５２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５３のヌクレオチド配列（これは配列番号９の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５３のヌクレオチド配列は配列番号１０の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号５４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５５のヌクレオチド配列（これは配列番号１１の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５５のヌクレオチド配列は配列番号１２の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号５６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５７のヌクレオチド配列（これは配列番号１３の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５７のヌクレオチド配列は配列番号１４の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶのＣＴ領域に対応する配列番号５８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５９のヌクレオチド配列（これは配列番号１５の部位１及び１２９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５９のヌクレオチド配列は配列番号１６の部位１〜４３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶＩのＣＴ領域に対応する配列番号６０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号６１のヌクレオチド配列（これは配列番号１７の部位１及び３９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６１のヌクレオチド配列は配列番号１８の部位１〜１３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩのＣＴ領域に対応する配列番号６２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号６３のヌクレオチド配列（これは配列番号１９の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６３のヌクレオチド配列は配列番号２０の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号６４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号６５のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６５のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号６６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号６７のヌクレオチド配列（これは配列番号２３の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６７のヌクレオチド配列は配列番号２４の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号６８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号６９のヌクレオチド配列（これは配列番号２５の部位１及び１５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６９のヌクレオチド配列は配列番号２６の部位１〜５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶのＣＴ領域に対応する配列番号７０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７１のヌクレオチド配列（これは配列番号２７の部位１及び１２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７１のヌクレオチド配列は配列番号２８の部位１〜４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶＩのＣＴ領域に対応する配列番号７２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７３のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７３のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７５のヌクレオチド配列（これは配列番号３１の部位１及び８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７５のヌクレオチド配列は配列番号３２の部位１〜２９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩのＣＴ領域に対応する配列番号７６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７７のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７７のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７９のヌクレオチド配列（これは配列番号３５の部位１及び２７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７９のヌクレオチド配列は配列番号３６の部位１〜９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号８０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号８１のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位１及び２１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８１のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位１〜７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号８２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号８３のヌクレオチド配列（これは配列番号３９の部位１及び５１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８３のヌクレオチド配列は配列番号４０の部位１〜１７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶのＣＴ領域に対応する配列番号８４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号８５のヌクレオチド配列（これは配列番号４１の部位１及び９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８５のヌクレオチド配列は配列番号４２の部位１〜３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＣＴ領域に対応する配列番号８６のポリペプチド配列をコードする）、
の中から選択され、
−第二の核酸に含まれるＴＭＤ領域をコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号８７のヌクレオチド配列（これは配列番号１の部位２８及び７８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８７のヌクレオチド配列は配列番号２の部位１０〜２６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号８８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号８９のヌクレオチド配列（これは配列番号３の部位３１及び９０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８９のヌクレオチド配列は配列番号４の部位１１〜３０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号９１のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位４３及び１０５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９１のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１５〜３５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号９３のヌクレオチド配列（これは配列番号７の部位２２及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９３のヌクレオチド配列は配列番号８の部位８〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号９５のヌクレオチド配列（これは配列番号９の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９５のヌクレオチド配列は配列番号１０の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号９７のヌクレオチド配列（これは配列番号１１の部位１９及び８１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９７のヌクレオチド配列は配列番号１２の部位７〜２７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号９８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号９９のヌクレオチド配列（これは配列番号１３の部位２５及び８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９９のヌクレオチド配列は配列番号１４の部位９〜２９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１００のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１０１のヌクレオチド配列（これは配列番号１５の部位１３０及び１１７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０１のヌクレオチド配列は配列番号１６の部位４４〜５９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１０３のヌクレオチド配列（これは配列番号１７の部位４０及び１０２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０３のヌクレオチド配列は配列番号１８の部位１４〜３４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１０５のヌクレオチド配列（これは配列番号１９の部位１９及び８１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０５のヌクレオチド配列は配列番号２０の部位７〜２７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１０７のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０７のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１０９のヌクレオチド配列（これは配列番号２３の部位２５及び７８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０９のヌクレオチド配列は配列番号２４の部位９〜２６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１１のヌクレオチド配列（これは配列番号２５の部位１６及び７８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１１のヌクレオチド配列は配列番号２６の部位６〜２６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１３のヌクレオチド配列（これは配列番号２７の部位１３及び７５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１３のヌクレオチド配列は配列番号２８の部位５〜２５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶｌのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１５のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１５のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１７のヌクレオチド配列（これは配列番号３１の部位８８及び１４４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１７のヌクレオチド配列は配列番号３２の部位３０〜４８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１９のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１９及び６９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１９のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位７〜２３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１２１のヌクレオチド配列（これは配列番号３５の部位２８及び９９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２１のヌクレオチド配列は配列番号３６の部位１０〜３３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１２３のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位２２及び６０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２３のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位８〜２０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１２５のヌクレオチド配列（これは配列番号３９の部位５２及び１１４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２５のヌクレオチド配列は配列番号４０の部位１８〜３８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１２７のヌクレオチド配列（これは配列番号４１の部位１０及び７２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２７のヌクレオチド配列は配列番号４２の部位４〜２４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２８のポリペプチド配列をコードする）、
の中から選択され、
−第二の核酸に含まれるＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列、又はそれの少なくとも２個のアミノ酸断片をコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号１において、５’末端が部位７９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２６７〜３２７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２においてＮ末端が部位２７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位８９〜１０９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３において、５’末端が部位９１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位３０６〜３３６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号４においてＮ末端が部位３１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位１０２〜１１２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号５において、５’末端が部位１０６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位８１３〜８７３に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域に対応する、配列番号６においてＮ末端が部位３６に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位２７１〜２９１に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号７において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１７１〜２３１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＳＲ領域に対応る、配列番号８においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５７〜７７に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号９において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０２〜１３２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号１０においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３４〜４４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１１において、５’末端が部位８２に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９０〜１２０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶのＳＲ領域に対応する、配列番号１２においてＮ末端が部位２８に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３０〜４０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１３において、５’末端が部位８８に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１２０〜１８０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶのＳＲ領域に対応する、配列番号１４においてＮ末端が部位３０に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４０〜６０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１５において、５’末端が部位１７８に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１８３に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶＩのＳＲ領域に対応する、配列番号１６においてＮ末端が部位６０に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６１に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１７において、５’末端が部位１０３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１４４〜２０４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩのＳＲ領域に対応する、配列番号１８においてＮ末端が部位３５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４８〜６８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号１９において、５’末端が部位８２に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１７４〜２３４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２０においてＮ末端が部位２８に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５８〜７８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２１において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１９８〜２５８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２２においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６６〜８６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２３において、５’末端が部位７９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０８〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＳＲ領域に対応する、配列番号２４においてＮ末端が部位２７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３６〜４６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２５において、５’末端が部位７９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１３５〜１９５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶのＳＲ領域に対応する、配列番号２６においてＮ末端が部位２７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４５〜６５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２７において、５’末端が部位７６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０２〜１３２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２８においてＮ末端が部位２６に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３４〜４４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号２９において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０５〜１６５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３０においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５〜５５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３１において、５’末端が部位１４５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１６２〜１９２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３２においてＮ末端が部位４９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５４〜６４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３３において、５’末端が部位７０に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１８９〜２４９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３４においてＮ末端が部位２４に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６３〜８３に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３５において、５’末端が部位１００に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２０４〜２６４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３６において、Ｎ末端が部位３４に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６８〜８８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３７において、５’末端が部位６１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１４４〜２０４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＳＲ領域に対応する、配列番号３８においてＮ末端が部位２１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４８〜６８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号３９において、５’末端が部位１１５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２１０〜２７０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶのＳＲ領域に対応する、配列番号４０においてＮ末端が部位３９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位７０〜９０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊配列番号４１において、５’末端が部位７３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２７６〜３３６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＳＲ領域に対応する、配列番号４２においてＮ末端が部位２５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位９２〜１１２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
＊又は、前記ＳＲ領域に対応するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の、少なくとも６個のヌクレオチドの任意の断片であって、前記ＳＲ領域の少なくとも２個の連続するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、例えば：
＊＊配列番号５の部位１０６〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１２９の断片であって、それは配列番号６の部位３６〜７４に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３０のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号５の部位１０９〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３１の断片であって、それは配列番号６の部位３７〜７４に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３２のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号５の部位１０６〜４２０に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３３の断片であって、それは配列番号６の部位３６〜１４０に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３４のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号５の部位１０６〜７７４に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３５の断片であって、それは配列番号６の部位３６〜２５８に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３６のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号２１の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３７の断片であって、それは配列番号２２の部位２９〜４６に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３８のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号２９の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３９の断片であって、それは配列番号３０の部位２９〜４６に位置するアミノ酸により区切られたｒＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４０のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号３３の部位７０〜２３７に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４１の断片であって、それは配列番号３４の部位２４〜７９に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４２のポリペプチド配列をコードする断片、
＊＊配列番号３７の部位６１〜２０１に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４３の断片であって、それは配列番号３８の部位２１〜６７に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４４のポリペプチド配列をコードする断片、
で構成されるか、又は含む配列の中から選択されることを特徴とする、前記定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には
−第二の核酸に含まれるＣＴ領域をコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号４９のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位１及び４２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４９のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１〜１４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ領域に対応する配列番号５０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号６５のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６５のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号６６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７３のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７３のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号７７のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７７のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号８１のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位１及び２１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８１のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位１〜７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号８２のポリペプチド配列をコードする）、
の中から選択され、
−第二の核酸に含まれるＴＭＤ領域をコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号９１のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位４３及び１０５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９１のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１５〜３５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１０７のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０７のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１５のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１５のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１１９のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１９及び６９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１９のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位７〜２３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号１２３のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位２２及び６０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２３のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位８〜２０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２４のポリペプチド配列をコードする）、
の中から選択され、
−第二の核酸に含まれるＳＲ領域又はその断片をコードするヌクレオチド配列が、
＊配列番号５の部位１０６〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１２９のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３６〜７４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５の部位１０９〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３１のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３７〜７４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５の部位１０６〜４２０に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３３のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３６〜１４０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３４のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号５の部位１０６〜７７４に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３５のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３６〜２５８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３６のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号２１の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３７のヌクレオチド配列（これは配列番号２２の部位２９〜４６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３８のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号２９の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３９のヌクレオチド配列（これは配列番号３０の部位２９〜４６に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４０のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号３３の部位７０〜２３７に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４１のヌクレオチド配列（これは配列番号３４の部位２４〜７９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４２のポリペプチド配列をコードする）、
＊配列番号３７の部位６１〜２０１に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４３のヌクレオチド配列（これは配列番号３８の部位２１〜６７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４４のポリペプチド配列をコードする）、
の中から選択されることを特徴とする、前記定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、第二の核酸に含まれるＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲ、又はＳＲ断片のペプチドが、同じ天然のグリコシルトランスフェラーゼに由来する相同配列であり、後者は前記定義した最適のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するＣＤ断片が由来する天然のグリコシルトランスフェラーゼにおけるペプチドとは異なることを特徴とする、前記で定義した方法に関する。
本発明は、より具体的には、
第二の核酸が、
−配列番号５の部位１〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４５の配列（これは配列番号４９、９１、及び１２９を含み、配列番号６の部位１〜７４に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの断片に対応する配列番号１４６のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号５０、９２、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
−配列番号５の部位１〜４２０に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４７の配列（これは配列番号４９、９１、及び１３３を含み、配列番号６の部位１〜１４０に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの断片に対応する配列番号１４８のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号５０、９２、及び１３４にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
−配列番号５の部位１〜７７４に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４９の配列（これは配列番号４９、９１、及び１３５を含み、配列番号６の部位１〜２５８に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの断片に対応する配列番号１５０のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号５０、９２、及び１３６にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
−配列番号２１の部位１〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５１の配列（これは配列番号６５、１０７、及び１３７を含み、配列番号２２の部位１〜４６に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩの断片に対応する配列番号１５２のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号６６、１０８、及び１３８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
−配列番号２９の部位１〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５３の配列（これは配列番号７３、１１５、及び１３９を含み、配列番号３０の部位１〜４６に位置するアミノ酸により区切られているラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩの断片に対応する配列番号１５４のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号７４、１１６、及び１４０にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
−配列番号３３の部位１〜２３７に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５５の配列（これは配列番号７７、１１９、及び１４１を含み、配列番号３４の部位１〜７９に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ８ＳｉａＩＩの断片に対応する配列番号１５６のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号７８、１２０、及び１４２にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む）、
−配列番号３７の部位１〜２０１に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５７の配列（これは配列番号８１、１２３、及び１４３を含み、配列番号３８の部位１〜６７に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ８ＳｉａＩＶの断片に対応する配列番号１５８のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号８２、１２４、及び１４４にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む）、
の中から選択されることを特徴とする、前記定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、第二の核酸に含まれるＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲ、又はＳＲ断片ペプチドは異なる天然のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子又は転写産物に由来する異種配列であることを特徴とする、前記定義した方法に関する。
本発明は、より具体的には、第二の核酸が、それぞれが配列番号６６及び１０８に対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤ領域をコードする配列番号６５及び１０７を含む配列番号１７７のヌクレオチド配列と、配列番号６の部位３７〜７４に位置するアミノ酸によって区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３２のポリペプチド配列をコードする配列番号１３１のヌクレオチド配列との融合体に対応する配列番号１５９の配列であり、前記配列番号１５９の配列は一方においてｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤの領域及び他方においてｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３７〜７４断片との間の配列番号１６０の融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする、前記定義した方法に関する
本発明は、より具体的には、第二の核酸が、配列番号６６に対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴをコードする配列番号６５のヌクレオチド配列、配列番号１２０に対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域をコードする配列番号１１９のヌクレオチド配列、及び配列番号６の部位３６〜７４に位置するアミノ酸によって区切られるｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３０のポリペプチド配列をコードする配列番号１２９のヌクレオチド配列との融合体に対応する配列番号１７９の配列であり、前記配列番号１７９の配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域、及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３６〜７４断片との間の配列番号１８０の融合ポリペプチドをコードする、ことを特徴とする前記定義された方法に関する。
本発明は、より具体的には、
第一の核酸としての配列番号４３の配列と、以下の配列から選択される第二の核酸の融合体を含むことを特徴とする前記定義した製造方法に関する：
−配列番号１４５の配列（これから配列番号５０、９２、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６２の融合タンパク質をコードする配列番号１６１のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
−配列番号１４７の配列（これから配列番号５０、９２、及び１３４にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６４の融合タンパク質をコードする配列番号１６３のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
−配列番号１４９の配列（これから配列番号５０、９２、及び１３６にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６６の融合タンパク質をコードする配列番号１６５のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合している）、
−配列番号１５１の配列（これから配列番号６６、１０８、及び１３８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６８の融合タンパク質をコードする配列番号１６７のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
−配列番号１５３の配列（これから配列番号７４、１１６、及び１４０にそれぞれ対応するラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１７０の融合タンパク質をコードする配列番号１６９のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合している）、
−配列番号１５５の配列（これから配列番号７８、１２０、及び１４２にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７２の融合タンパク質をコードする配列番号１７１のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合している）、
−配列番号１５７の配列（これから配列番号８２、１２４、及び１４４にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７４の融合タンパク質をコードする配列番号１７３のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合している）、
−配列番号１５９の配列（これから配列番号６６及び１０８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤの領域、及び配列番号１３２に対応するｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩのＳＲ領域の３７〜７４断片を含む配列番号１７６の融合タンパク質をコードする配列番号１７５のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
−配列番号１７９の配列（これから配列番号６６、１２０及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤの領域、及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域を含む配列番号１８２の融合タンパク質をコードする配列番号１８１のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）。
また、本発明はキメラ・グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列、例えば前記で定義した方法により得られる遺伝子配列に関する。
本発明は、より具体的には、
−配列番号１６１の配列（配列番号５０、９２、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６２の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６１の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１４５の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１６３の配列（配列番号５０、９２、及び１３４にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６４の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６３の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１４７の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１６５の配列（配列番号５０、９２、及び１３６にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６６の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６５の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１４９の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１６７の配列（配列番号６６、１０８、及び１３８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６８の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６７の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５１の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１６９の配列（配列番号７４、１１６、及び１４０にそれぞれ対応するｒＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１７０の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６９の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５３との配列の融合体に対応する）、
−配列番号１７１の配列（配列番号７８、１２０、及び１４２にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７２の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合していて、前記配列番号１７１の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５５の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１７３の配列（配列番号８２、１２４、及び１４４にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７４の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合していて、前記配列番号１７３の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５７の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１７５の配列（配列番号６６及び１０８にそれそれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤ領域、及び配列番号１３２に対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３７〜７４断片を含む配列番号１７６の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１７５の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５９の配列との融合体に対応する）、
−配列番号１８１の配列（配列番号６６、１２０、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域、及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３６〜７４断片を含む配列番号１８２の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１８１の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１７９の配列との融合体に対応する）、
の中から選択される前記で定義された遺伝子配列に関する。
また、本発明は前記で定義した遺伝子配列の少なくとも１つを含むベクター、例えば、プラスミド、ウイルス又は細菌の構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）に関する。
また、本発明は、前記の少なくとも一つのベクターを使用して、前記で定義した少なくとも一つの遺伝子配列で形質転換した、酵母、真菌、昆虫、植物、哺乳動物又はヒト由来の真核細胞宿主に関する。
また、本発明は、目的の組換えタンパク質の作製の枠組みの中での、前記で定義した少なくとも一つの遺伝子配列、又は前記で定義したベクターを前記で定義した細胞の形質転換のための使用、又はこのような形質転換細胞より得られたトランスジェニック（遺伝子移植）動物の使用に関する。
また、本発明は、前記で定義した細胞の形質転換を含む、目的の組換えタンパク質の製造のための方法に関し、これは、前記の目的の組換えタンパク質をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むベクターを使用して行われる。
本発明による前記方法に従って製造することのできる好ましい目的の組換えタンパク質は、ホルモン、酵素、凝固因子、炭水化物の抗原／血清バイオマーカー、サイトカイン、成長因子、抗体又はレセプターから選択される。
前記の目的の組換えタンパク質の製造のための好ましい宿主細胞は、薬剤用の承認を受けた細胞、又は生物、好ましくはげっ歯類、哺乳動物又はヒトの細胞から選択される。
図１はグリコシルトランスフェラーゼの膜トポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）を示す。グリコシルトランスフェラーゼは、細胞質Ｎ末端尾部（ＣＴ）、膜貫通（ＴＭＤ）アンカーシグナル、続くステム領域（ＳＲ）及び大きなＣ末端触媒ドメイン（ＣＤ）を含むＩＩ型膜タンパク質である。 図２は２０個のヒトのシアリルトランスフェラーゼにおけるシアリルモチーフＬ、Ｓ、及びＶＳのアミノ酸配列。全てのシアリルトランスフェラーゼの共通アミノ酸残基は太字で示される。 図３はラットのＳＴ６ＧａｌＩのＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲ及びＣＤの分布を図示し、鍵となる残基であるｔｙｒ１２３及び７個の保存されたｃｙｓを示す。ＣＴ：細胞質尾部（９アミノ酸）；ＴＭＤ：膜貫通ドメイン（１７ａａ）；ＳＲ：ステム領域（７０ａａ）；ＣＤ：触媒ドメイン（３０７ａａ）；Ｌ：シアリルモチーフＬ；Ｓ：シアリルモチーフL及びＶＳ：シアリルモチーフＶＳ 図４はそれぞれの２つの酵素イソ型（ｒＳＴ６ＧａｌＩのＴｙｒ又はＣｙｓ１２３）におけるキメラ調製及び細胞質尾部、膜貫通ドメインの評価のためのＤＮＡ構築物を示す（Fenteany & Colley, 2005）。 図５はラット及びヒトＳＴ６ＧａｌＩの配列アラインメントを示す。ＣＴ（１〜９）、ＴＭＤ（１０〜２６）を含むN末端配列は完全に保存されている一方で、膜近傍ペプチド、特にリジン及びシステイン残基は積極的に良く保存されているが、膜近傍のＳＲ部分（２７〜８９）はより変化に富んでいることを指摘することができる。 図６は総合的細胞グリコシル化の関連におけるヒト細胞でのシアル酸経路を示す。この連続的工程に関与する酵素は次の通りである：（ａ及びｂ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン／２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／ＭａｎＮＡｃ６−キナーゼ）−反応：（ａ）エピメラーゼ及び（ｂ）キナーゼ、（ｃ）Ｎ−アセチルノイラミン酸ホスフェート合成酵素；（ＮＡＮＳ ＳＡＳ；Ｎ−アセチルノイラミン酸ホスフェート合成酵素）-反応及びホモ・サピエンスＮ−アセチルノイラミネート・ピルベート・リアーゼ（ＮＰＬ；Ｎ−アセチルノイラミネート・ピルベート・リアーゼ）−反応、（ｄ）ＮｅｕＡｃ９−ホスファターゼ、（ｅ）シチジン５’−モノホスフェートＮ−アセチルノイラミン酸合成酵素、（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素）、（ｆ）シチジンモノホスフェート−シアル酸トランスポータ（ゴルジＣＭＰ−ＮｅｕＡｃトランスポータ）、及び（ｇ）シアリルトランスフェラーゼ。特記すべきは、本略図で示されるシアル酸誘導体、すなわち、“Ｎｅｕ５Ａｃ”は、広く「ヒト型」のシアル酸であると考えられてきた。鶏を除く他の全ての動物では経路において追加のステップ（本略図に示されている）があり、ここではＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃは更に水酸化されて、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸水酸化酵素による酵素反応によりＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃに変換される。 図７は本発明により創出された種々の合成キメラ構築物の全体像を図示する。図７Ａは、合成キメラの一般的な構築物を示し、これは付加された制限酵素サイトを通じて最小触媒ドメイン（ＣＤ）に融合したＦＬＡＧエピトープで標識されたＮ末端合成ドメインを含む。図７Ｂは、ＢａｍＨＩ制限酵素サイトを使用したN末端合成ドメイン及び触媒ドメインの間のライゲーションを示す。構築物はベクターに、ライゲーション部位とは異なる制限酵素サイト、すなわち、ＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩ、を使用してベクターに挿入されたことを特記したい。 図８はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）の構造と性質を示す。 図９はＦＬＡＧ−ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤ及び他の種々の長さのシアリルトランスフェラーゼのいくつかのＮ末端断片にこのＣＤを融合させたキメラ体の構造を示す。図９ＡはＦＬＡＧ−ＣＤに対応する。図９ＢはｈＳＴ８ＳｉａＩＩ−７９／ＣＤに対応する。図９ＣはｈＳＴ８ＳｉａＩＶ−６７／ＣＤに対応する。図９ＤはｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−２５８／ＣＤに対応する。図９Ｅはｒ／ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−４６／ＣＤに対応する。 図１０は合成キメラの各構築物に使用されたｈＳＴ６ＧａｌＩの消化した最少触媒ドメイン及びその増幅したＰＣＲ産物を示す。試料は１．５％アガロースゲルの上にスマートラダー（ＳＬ）核酸マーカーとともにロードした。図１０ＡはＣＭＶベクター由来のｈＳＴ６ＧａｌＩの消化した最少触媒ドメインを示し、これは研究室においてクローニングされたものに由来する。図１０Ｂは９６６ｂｐの最小触媒ドメインのＰＣＲ産物を示す。図１０Ｃはゲルに載せた５μＬのｈＳＴ６ＧａｌＩの最少触媒ドメインの濃縮ＰＣＲ産物を示す。 図１１は再構成した合成ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのN末端領域のＤＮＡバンドを示すアガロースゲル（２％）を示す。レーン１は１７４ｂｐのＰＣＲ産物に対応する；レーン２はスマートラダーＳＦに対応する；レーン３は５μＬのサイズ１７４ｂｐの濃縮ＰＣＲ産物に対応する。 図１２はｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤの再構築した酵素遺伝子全体を示す。図１２Ａでは、アガロースゲル（１．５％）はＰＣＲで増幅した再構成した合成ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤのＤＮＡバンドを示す。図１２Ｂはサイズが約１２００ｂｐの５μＬの濃縮ＰＣＲ産物に対応する。図１２Ｃは、ＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩの制限酵素による組換えベクターの消化産物を示し、キメラ遺伝子（予想サイズは１２００ｂｐ）の挿入を示している。 図１３は再構成し合成ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４のＮ末端領域のＤＮＡバンドを示すアガロースゲル（２％）を示す。レーン１は２７０ｂｐのＰＣＲ産物に対応する；レーン２はスマートラダーＳＦに対応する；レーン３はサイズ２７０ｂｐの５μＬの濃縮ＰＣＲ産物に対応する。 図１４はｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤの完全に再構築した合成遺伝子を示す。図１４Ａは再構成した合成ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤのＰＣＲで増幅したＤＮＡバンドのアガロースゲル（１．５％）を示す。図１４Ｂはサイズが約１２００ｂｐのキメラの５μＬの濃縮ＰＣＲ産物を示す。図１４Ｃは、ＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩの制限酵素による組換えベクターの消化産物を示し、キメラ遺伝子（期待されるサイズは１２２５ｂｐ）の挿入を示している。 図１５は再構成した合成ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−１４０のＮ末端領域のＤＮＡバンドを示すアガロースゲル（１．５％）を示す。レーン１：スマートラダーＳＦ；レーン２：４６８ｂｐのＰＣＲ産物。 図１６はｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２９／３７−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４で構成される再構成した合成ハイブリッド遺伝子のＤＮＡバンドを示すアガロースゲル（１．５％）を示す。レーン１はスマートラダーＳＦに対応する；レーン２は２４９ｂｐのＰＣＲ産物に対応する。 図１７はＣＤと連結したｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２９／３７−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４で構成される再構成した合成ハイブリッド遺伝子のＤＮＡバンドを示すアガロースゲル（１．５％）を示す。レーン１はスマートラダーＳＦに対応する；レーン２は１１９７ｂｐのＰＣＲ産物に対応する。 図１８は６−結合型シアル酸に結合したＦＩＴＣ−ＳＮＡ及び抗ＦＬＡＧｍＡｂによる二重標識及び共焦点顕微鏡法の使用に基づきなされたＣＨＯ細胞におけるｈＳＴ６ＧａｌＩの最少触媒ドメイン（ＣＤ）の発現（パネルＡ）を示す。ＣＤのトランジエントな発現は抗ＦＬＡＧ標識（パネルＢ）で分析し、ＳＮＡ−ＦＩＴＣ結合（パネルＣ）についても分析した。パネルＤはパネルＢ及びＣからのシグナルを重ね合わせた部位を示す（Donadio et al., 2003）。 図１９はＣＨＯ細胞における２つのキメラ酵素、ｈＳＴ８ＳｉａＩＶ−６７／ＣＤ、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ−７９／ＣＤの発現を示す。トランスフェクションされた細胞は抗ＦＬＡＧｍＡｂ（Ａ及びＤ）、及びＦＩＴＣ−ＳＮＡ（Ｂ及びＥ）で二重標識した。重ね合わせた像はＣ及びＦに示した。 図２０はＣＨＯ細胞におけるＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ及びＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤの発現を示す。トランスフェクションされた細胞は抗ＦＬＡＧｍＡｂ（Ａ及びＤ）、及びＦＩＴＣ−ＳＮＡ（Ｂ及びＥ）で二重標識した。重ね合わせた像はＣ及びＦに示した。 図２１はＣＨＯ細胞におけるｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ及び２５８／ＣＤの発現を示す。トランスフェクションされた細胞は抗ＦＬＡＧｍＡｂ（Ａ及びＤ）、及びＦＩＴＣ−ＳＮＡ（Ｂ及びＥ）で二重標識した。重ね合わせた像はＣ及びＦに示した。 図２２は再構成した合成ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＮ末端領域のＤＮＡバンドを示すアガロースゲル（２％）を示す。レーン１は２４０ｂｐのＰＣＲ産物に対応する；レーン２はスマートラダーＳＦに対応する；レーン３は３μＬの２４０ｂｐ濃縮のＰＣＲ産物に対応する。 図２３は制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩによる組換えベクターの消化産物を示し、触媒ドメイン遺伝子（期待されるサイズ９６０ｂｐ）の挿入を示している。試料はＳＬ核酸マーカーとともに１．５％アガロースゲルに載せた。 図２４はｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ／ＣＤの再構築された酵素遺伝子を示す。図２４ａでは、アガロースゲル（１．５％）は制限酵素ＸｂａＩ及びＡｆｌＩＩによる組換えベクターの消化産物を示し、キメラ遺伝子（期待されるサイズ１２００ｂｐ）の挿入を示している。図２４ｂは少量調製試料の増幅後に得られたＰＣＲ産物を示し、キメラ遺伝子の挿入を確認している。 図２５はＣＨＯ細胞におけるキメラ酵素ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ／ＣＤの発現を示す。トランスフェクションされた細胞は抗ＦＬＡＧｍＡｂ（Ａ）及びＦＩＴＣ−ＳＮＡ（Ｂ）で二重標識した。重ね合わせた像はＣに示す。
《表１〜５の説明》
表１：ヒトで知られる２０個のシアリルトランスフェラーゼ配列とアクセションナンバー（受入番号）。
表２：Ｈａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓら、２００１及びＪｅａｎｎｅａｕら、２００３により記載されたヒトシアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質及び発現部位。
表３：ヒトＳＴｓで共有される４個のペプチドドメインの分布。短いＮ末端細胞質尾部（ＣＴ；約１０アミノ酸）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ；約２０アミノ酸）、長さが大きく変化するステム領域（ＳＲ）、及びシアリルモチーフＬ、Ｓ及びＶＳを含む触媒ドメイン（ＣＤ；約３００アミノ酸）。
表４：超可変ＳＲ領域内で同定された提案された約３１〜８５アミノ酸の保存ペプチド。５個のモチーフが見出された：モチーフＡはＳＴ６Ｇａｌ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩに共通、モチーフＢはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩに共通、モチーフＣ及びＤは全てのＳＴ８Ｓｉａに共通であり、モチーフＥはＳＴ３ＧａｌＩ及びＩＩを除くＳＴ３Ｇａｌに存在する（Donadio et al., 2003）。
表５：ＰＣＲ増幅に使用された４対のプライマーのデザイン。




《本発明の記載》
本発明は次に続く詳細な説明において更に記載されよう。
＜Ｉ−序論＞
本発明の基盤:
本発明者はｈＳＴ６ＧａｌＩの研究に焦点を絞ったが、なぜならばこの酵素活性は異種タンパク質の製造にこれまでに使用されてきた全ての宿主細胞、特に薬剤のために承認されている細胞システムで、欠損しているからである。ヒト酵素は本発明者であるＲｏｎｉｎ、２００１によりクローニングされている。
文献とは対照的に、本発明者は最初に、完全長の酵素はシアル化された２、３及び／又は４アンテナのグリカン構造を有するアクセプター糖タンパク質を個別にシアル化することができることを示し（Ronin 2001）、当時本発明者は、トランスフェラーゼ構造内では、超可変ＳＲ領域に存在する立体的支配がＣＤに影響し酵素特異性を調節し、自然に制約しているはずであるという仮説を立てていた。生物医学的目的でシアル化されたタンパク質を作製する目的においては、この調節制御は消去させることが好ましく、その結果特異性を拡大することができる。ｈＳＴ６ＧａｌＩの保存された領域内（９３〜１６５）では、疎水性配列が注目された：９３−ＱＶＷｘＫＤＳ−１００。この配列の重要性は、新たに同定された保存領域のＮ末端部分のｈＳＴ６ＧａｌＩを少しずつ削除させることで、研究された。Δ３５、Δ４８、Δ６０及びΔ８２の欠損変異体は転移効率の増大を示した。保存ドメイン（ＳＴ６ＧａｌＩの９３〜１６５）の前後で行われた削除操作により、Δ１００変異体はその触媒活性を失うが、一方Δ８９（疎水性配列ＱＶＷｘＫＤＳを含む）は至適触媒活性を保持していることが示された。この結果は、この短い配列が活性を促進させるのに不可欠であることを明瞭に示している。この疎水性配列は、活性部位がシアル酸転移を促進するために必須な局所的立体構造変化に寄与することもある。
二番目の研究は、ＳＴｓのアクセプター選択性を支配している分子的、細胞的基盤の解明を目指した本発明者により実現された（Ronin 2003）。ＣＤをＳＲの超可変領域から区切るのは困難だったので、彼らは、ＳＴｓのＳＲはアクセプター選択性に関係する構造的特徴を含んでいるであろうという仮説を立てた。酵素のサブファミリーに対するアクセプターの認識を制限するためのペプチド部分をＳＴｓが共有していることがあるかどうか決めるために、既知の特異性を持つ５３個の動物及びヒト酵素がバイオインフォマティクスにより分析された。約３１〜８５アミノ酸の保存性の極めて高い領域が同定され、そしてこの領域内に５個のモチーフが見出された：モチーフＡはＳＴ６Ｇａｌ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩに共通であり、モチーフＢはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩに共通であり、モチーフＣ及びＤは全てのＳＴ８Ｓｉａ、及びＳＴ３ＧａｌＩ及びＩＩ（表４）を除くＳＴ３Ｇａｌに存在するモチーフＥに共通である。
この５個のモチーフは類似の触媒活性を共有するＳＴｓサブグループに典型的であり、従ってシアル酸の転移に同じように関与している。これらはシアリルモチーフＬの近傍のＳＲの末端に位置し、アクセプター認識にとり重要な鍵を握るＣＤ部分であると考えることができる。
また、特に興味深いのは、Δ８９変異体は、ＣＨＯ細胞ではきわめて効率的であり、それは初期のゴルジからトランスゴルジ／トランスゴルジ・ネットワークへの細胞内経路に従っているという発見であった。Δ８９はゴルジ装置の全体の層板において糖タンパク質及び糖脂質の細胞内経路にそって発現されている（Ronin, 2003）。この研究により、不可欠な疎水性配列（ＱＶＷｘＫＤＳ）を含むｈＳＴ６ＧａｌＩの最少ＣＤを区切り、それによりアクセプター認識を細胞内固有のアクセプターから細胞表面の複合糖質へ移動させることが可能になった。これらの発見は、糖タンパク質が薬剤として産生されるときに設計された宿主細胞に封入されるようにするために、分泌経路内で新たに合成された糖タンパク質と遭遇するために類似の輸送経路を示すこともある新規の膜に固定されたキメラをデザインするための新規の基盤を提供した。
ｈＳＴ６ＧａｌＩΔ８９の最少ＣＤは本発明において拡大された特異性及び増大した転移効率を有する「最適化されたＣＤ」として使用され、これからは、ＣＤと命名されることになろう。
ゴルジ装置におけるシアリルトランスフェラーゼの分布
ＧＴｓのゴルジでの局在は厳密には組織化されておらず、酵素はゴルジ装置の１つのコンパートメントに分布し、分離しているわけではなく、多くは重なりコンパートメントを共有している（Colley, 1997; Berger et al., 1998; Berger, 2002）。明瞭な保留シグナルはまだ同定されていないが、酵素はその層板に亘り重複する勾配を形成していて（Opat et al., 2001）、不可欠な領域のみ同定されている。
ゴルジでの保留メカニズムに関しては２つの仮説が存在し：ｉ）ＴＭＤの長さがゴルジでの保留を駆動する（二重層厚さモデル（ｂｉｌａｙｅｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｍｏｄｅｌ）；Bretscher & Munro, 1993; Colley, 1997; Munro, 1998）及びｉｉ）タンパク質のオリゴマー化がゴルジでの保留をもたらす（オリゴマー化／同類認識仮説（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ／ｋｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）；Machamer, 1991; Colley, 1997）、この場合著者らは酵素がゴルジ槽と相互作用して、輸送小胞に入るには大きすぎる構造を形成すると仮定している（Munro, 1998）。
また、ＴＭＤの長さは保留シグナルとしては不可欠のようである。ＴＭＤは保留工程にあって鍵となる因子を代表し、多くの場合それはゴルジでの、シス、中間、トランス・コンパートメントを通じて、局在を促進するのに十分である。ＳＴｓのＴＭＤの長さを伸ばすことは保留の現象をもたらし、１７個のロイシンよりなる合成ＴＭＤ（遺伝子変異により創出）はゴルジで保留されるが２３個のロイシンよりなるものの一つの合成ＴＭＤは保留されない（Munro, 1991, 1995, 1998）。ＳＴｓの保留シグナルに関して、いくつかの領域はゴルジ装置における酵素の保留に、独立した方法で関与している。隣接領域を伴ったＴＭＤはゴルジでの保留に十分である（Colley, 1997）。他の研究は、ＴＭＤにおける特異的配列は必要ではないこと、特に、適切な空間をもつ細胞質及び内腔配列及び／又はＳＲの存在する場合には、このことがあてはまる（Colley, 1997）ことを示唆している。ＳＴｓ上の、特に膜固定部位近傍の、負荷電のアミノ酸配列は、ゴルジ装置においてタンパク質を誤った箇所に局在させることが発見された。ＣＴにおけるＦＬＡＧ又はＭＹＣのエピトープの存在は、ＳＴ６ＧａｌＩのゴルジでの局在を乱すが、ＴＭＤから一定の間隔を空けて負荷電を配置するための追加のスペーサー配列を使用しることはゴルジでの保留にとり非常に好都合であることが示された（Yang et al., 1996）。ＳＲ配列のみでも別のタイプのゴルジの保留機能を有するようにみえる（Colley, 1997）。
おそらく、トランスゴルジ及びトランスゴルジ・ネットワークにおけるＳＴｓの共局在を説明する、１つ以上の保留機能が存在する。更にまた、酵素の局在はそれが発現されている細胞のタイプに依存する（Colley, 1997）。ＳＴｓのＴＭＤのみでもＭＤＣＫ細胞ではゴルジでの保留に十分であることもあるが、しかしＣＨＯ細胞では同一のＴＭＤ及びその隣接配列が明らかにゴルジでの保留に必要である（Colley, 1997）。興味深いことに、使用可能なデータによれば、ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲの変化はＳＴｓの触媒活性を乱さないが、ゴルジ装置内での非局在化を招くことが明らかにされている（Grabenhorst et Conradt, 1999）。
ゴルジでの保留シグナルについて最も研究されている酵素は、ラットＳＴ６ＧａｌＩ（ｒＳＴ６ＧａｌＩ）であり、これは肝細胞のトランスゴルジ及びトランスゴルジ・ネットワーク（Roth et al., 1985; Opat et al., 2001）及び他の細胞のゴルジ以降のコンパートメント（Colley, 1997）に存在する。２つの天然のｒＳＴ６ＧａｌＩのイソ型が存在し、これらは部位１２３の１つのアミノ酸のみで異なる。これはA〜G ヌクレオチドの１変化によるものであり、Ｔｙｒ〜Ｃｙｓアミノ酸の変化をもたらす。２つの酵素のイソ型の間には触媒活性の変化は認められなかった（Chen et al., 2003）。ＳＴｃｙｓ型は中程度に発現している細胞のゴルジに見いだされ、細胞表面には見いだされず、又は開裂し、ＣＯＳ−１又はＨｅＬａ細胞の培地に分泌されることは決してないが、一方ＳＴｔｙｒイソ型はゴルジに見いだされ、低いレベルで細胞表面にも見出され、開裂してＣＯＳ−１及びＨｅＬａ細胞から分泌される（Ma et al., 1997）。タンパク質の２つの異なる局在を説明するために、著者らは保留メカニズムについて２つの仮説を提案した：二重層厚さ及びオリゴマー化。第一に、ＳＴｃｙｓ及びｔｙｒのＴＭＤの伸長の分析は、二重層厚さはＳＴ６ＧａｌＩのゴルジでの保留にとり有力な工程ではないことを示唆した。第二に、オリゴマー化の分析は、ＳＴｃｙｓ及びＳＴｔｙｒのそれぞれの１００％及び１３％はｐＨ６．３（後期ゴルジｐＨ）では不溶であるが、ｐＨ８．０では両方のイソ型が可溶であることを示している。この結果は、ＣＤにおける立体構造変化及びジスルフィド結合の形成がオリゴマーを形成するためのＳＴｃｙｓの能力を増強しそしてそのゴルジ装置での安定な局在化のための基盤を示すことを示唆している。アミノ酸１２３の性質はオリゴマー形成に影響する（Chen et al., 2000）。更にまた、オリゴマー化の工程及び触媒活性は他の７つの保存システイン残基（Ｃ２４、１３９、１８１、３３２、３５９、３６１及び４０３）に依存する。ＴＭＤ内のＣｙｓ２４は二量化に必要であり、一方ＣＤ内のシステイン残基は輸送及び触媒活性に必要である。Ｃｙｓ１８１及びＣｙｓ３３２（それぞれ、シアリルモチーフＬ及びＳ内で）酵素は小胞体中に保留され、そしてそれぞれ最小活性及び不活性示す。Ｃｙｓ３５９及び３６１（シアル化されたモチーフＳ及びＶＳの間）はその局在化、及び輸送を損なうことなく不活性化された酵素である。Ｃｙｓ１３９又はＣｙｓ４０３の変異酵素は触媒活性及びゴルジ局在の変化をもたらさない。これら２つのシステイン残基の交換は開裂及び分泌を低下させ、これらはシグナル開裂に必要であることを示唆している（Qian et al., 2001）（図３）。
ＳＲの欠損を共有するＳＴｔｙｒ酵素の変異体について特性を明らかにした：ＳＴｔｙｒΔ４及びＳＴｔｙｒΔ５（それぞれ、アミノ酸３２〜１０４及び８６〜１０４を欠損）は不活性であり、及び／又は分泌されず、ＳＴｔｙｒΔ１、Δ２及びΔ３（アミノ酸３２〜８６の間を欠損）は開裂可能な型を示さず細胞表面発現の増加を示す（Kitazume et al., 1999）。
最近の研究（Fenteany & Colley, 2005）は、実際のところ多数のシグナルがｒＳＴ６ＧａｌＩのオリゴマー化及びゴルジでの局在化に必要であることを示している。著者らは２つの酵素イソ型（Ｔｙｒ又はＣｙｓ１２３）のＣＴ、ＴＭＤの役割を再評価することを目的とした。彼らは図４に示すキメラを作製するためのいくつかのＤＮＡ構築物を実現させた。膜貫通ドメインの伸長（１７アミノ酸以上の）はゴルジからの排出を亢進しないし、輸送又はゴルジでの局在を変化させない。イソ型のＳＴｃｙｓのＣＴ及びＴＭＤの役割に関しては、ＥＲから外への排出シグナルとして認識されているＣＴ内の３個のリジン残基で構成されるシグナルが存在する。著者らは、ＣＴ及びＴＭＤの両方を変化させることが酵素の経路を乱すことを示している。ｒＳＴ６ＧａｌＩのイソ型の間の唯一の違いは、ｐＨに応じてオリゴマーを形成するその能力である。ＳＴｃｙｓについては、ｐＨに応じたオリゴマー形成は、ＣＴ及びＴＭＤが変化したときのみ危険にさらされる。ＳＴｔｙｒついては、それはゴルジからの排出速度を僅かに増加させる（Fenteany & Colley, 2005）。
これら全てのｒＳＴ６ＧａｌＩに関する最近の発見はヒトＳＴ６ＧａｌＩに適用できると考えられるが、それは両方の酵素が８５％の相同性を共有し、両方のＣＤが事実上同一であるからである。実際のところ、２つの配列アラインメント（図５）は、前記の７つのシステインはｈＳＴ６ＧａｌＩで保存されており、そしてまたチロシン１２３も存在するということを明瞭に示している。
科学者による多大な努力にも拘わらず、ＳＴｓ又はＦｕＴｓにおけるシグナルを示すことはできなかった。多因子性の工程が、ＳＴ６Ｇａｌのためのトランスゴルジ・ネットワークである適切なコンパートメントである標的に向けた、酵素を運ぶための表面経路における行程を遅らすことこともあると信じられている。従って、本発明者は関連遺伝子を欠損し関連するトランスフェラーゼ活性を発現できない宿主細胞において、ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲが代替として他の明確なＣＤと置き換わって固定されることもあると仮定した。従って、５５個の動物の既知遺伝子からこれらの３つの部分を選択できるので、広範な組み合わせ配列の創出が可能である。これらのそれぞれは、潜在的に、２０個の既知の異なる触媒ドメインと融合させることで、シアル酸転移活性を示すことができる。これは、未だこれらの活性を発現し、組換え薬剤を生産するための使用に至っていない酵母（Pichia pastoris又はShyzosaccharomyces piombae）、植物及び昆虫のヒト化にとって決定的な興味の対象である。試験済みではないが、この論法はそれが非常に臨床と関連の深いグリコトープの生合成を支配しているので、ＦｕＴｓ、ＧａｌＴｓ、ＧａｌＮＡｃＴｓ及びＧｌｃＮＡｃｓにもうまく適用されることができる。
いくつかの残基の重要性
前記のように、四番目のモチーフ（モチーフ３）はＳ及びＶＳモチーフの間で同定された。それは次の共通配列を有する４つの非常に良く保存されたアミノ酸で構成される：（Ｈ／ｙ）Ｙ（Ｙ／Ｆ／Ｗ／ｈ）（Ｅ／Ｄ／ｑ／ｇ）。ｈＳＴ３ＧａｌＩの部位指定変異導入はこのモチーフにおける２つのアミノ酸の重要性を示した：Ｈｉｓ２９９及びＴｙｒ３００。結果は芳香族残基の重要性と、これらのアクセプター認識への関与の可能性及び至適触媒効率への寄与の可能性を示唆した。特に、不変のＴｙｒ３００は主要な立体構造的役割を担っている。変異解析は、変異体Ｈ２９９Ａ及びＹ３００Ａは触媒活性を示さないが、一方、変異Ｙ３００Ｆはその活性を部分的に回復することを示した（Jeanneau et al., 2004）。また、このモチーフはｈＳＴ６ＧａｌＩの触媒ドメインにも存在する。更に、いくつかのシステイン残基は、以前に喚起したように、二量化と触媒活性において主として重要である（Qian et al., 2001）。少なくとも１つのジスルフィド結合は、シアリルモチーフＬ及びＳ内の２つの保存されたシステイン残基の間に証明されている。この連結はタンパク質の立体構造を維持するうえで必須である。同様の観察はこの結合がＰＳＴに存在することを示したが（Angata et al., 2001）、更に、二番目のジスルフィド結合がシアリルモチーフ及びC末端領域の間に存在する。ジスルフィド結合を介したＳＴ６ＧａｌＩの二量化は明らかにされた。ゴルジ装置内のこの酵素は約２０〜３０％が二量体であり、これはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃに対する親和性が低減しているのでその活性は低い（Jeanneau, 2003）。
「自己グリコシル化」
ＧＴｓはしばしばそれ自身がグリコシル化されている。ＳＴｓのグリコシル化状態及びその酵素の生物学的機能の重要性に関して使用できるデータはほとんどない。ＳＴ６ＧａｌＩのＮ−グリコシル化は酵素のｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的活性には必要がないらしい。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異体での試験では、酵素活性は第一番目のグリコシル化部位に変異が入ったタンパク質でのみ認められる。これらの結果は、タンパク質の分解に対して安定化及び／又は阻害をもたらすことのできる２つのＮ−グリカン（Ａｓｎ１４６及びＡｓｎ１５８）の存在を示唆する。二番目のグリコシル化部位の変異はタンパク質の凝集又は分解をもたらすこともある（Chen & Colley, 2000; Chen et al., 2000）。しかしながら、ＳＴ８ＳｉａＩのＮ−グリコシル化はその活性及びその細胞内局在に影響を与えることができる（Martina et al., 1998）。Ｎ−グリカンの除去はそのｉｎ ｖｉｖｏ活性を、最初の活性の１０％未満程度まで低減する。ＳＴ８ＳｉａＩＩ及びＳＴ８ＳｉａＩＶは、その古典的活性に加えて自己ポリシアル化活性を有することが最近示された（Muhlenhoff et al., 2001）。この自己ポリシアル化は、ＰＳＴの部位Ａｓｎ７４及び、ＳＴＸの部位Ａｓｎ６９及び２１９のＮ−グリカン上で起きる。これら部位への部位指定変異導入はｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で酵素を失活させる。その結果、ＳＴ８ＳｉａＩＶ及びＳＴ８ＳｉａＩＩのそれぞれのＳＲを使用してキメラの遺伝子を構築するに際してはＡｓｎ７４及びＡｓｎ６９のグリコシル化部位を保存するように注意を払うこととなった。
＜ＩＩ−発現システムにおける新規トランスフェラーゼ活性導入のための本発明の配列の使用＞
ＩＩａ−グリカンの役割、免疫システムにおけるその役割
グリカンは大部分の生命体の認識シグナルであるが、またタンパク質の生物学的有効性の構造的鍵を握る決定要因でもある。
これは、タンパク質の折りたたみによるオリゴマー化、特性の制御、仕分け及び輸送において重要な役割を果たす（Helenius & Aebi, 2001）。グリカンは炭水化物抗原として考えることのできるオリゴシディク（oligosidic）エピトープを代表する。グリカンの性質には免疫活性の修飾がある。オリゴシディク抗原のいくつかのファミリーが存在する：ＡＢＨ血液型決定基、ルイス組織グループ、Ｔファミリーの抗原メンバー及びポリシアル化された又は硫酸化された細胞接着に特異的な抗原（Legaigneur et al., 1999）。グリカンは多数の役割を有する：またこれは細胞間及び細胞とマトリックス間の相互作用のメカニズムに関与する。レクチンと命名されているいくつかの細胞タンパク質はグリカン様構造を特異的に認識し、そして特異的レセプターとして作用する（Gabius et al., 2004）。ほとんどの場合、これは細胞表面複合糖質の組成物である。
炭水化物の構成成分は免疫システムでは認識シグナルとして作用し、少なくとも２つのやり方で免疫的認識に影響を与える：ｉ）これはタンパク質の立体構造に変化をもたらし生物学的機能を調節する；ｉｉ）このオリゴ糖は認識決定基としての役割を果たす。特に、シアル酸はこれらの両方の効果に大きく寄与するが、その理由はその強い負荷電及び親水性の性質がシアル化された巨大分子の立体構造に影響を与えることもあるからであり、このことは特に糖タンパク質に関係する。シアル酸は生物学的マスク（ｍａｓｋｓ）として接近性を阻止又は低減する能力を有し、自己／非自己の区別の認識過程において細胞表面上で重要な役割を果たす（Pilatte et al., 1993, Glycobiology 2006追加）。
Ｎ−グリカンは人体の血清糖蛋白質及び多数の他の組織タンパク質に良く発現されているので、組換えグリコシル化薬剤として提示する際には、抗原性を有しないのが好ましいということが強く要請される。しかしながら、ＣＨＯ細胞で製造されたＨｕＥＰＯは第一番目の承認薬剤として開発されたので、いくつかの末端糖がヒトにおいて抗原性を有することもあるようであった：ポリＬａｃＮＡｃ、アルファ１、３Ｇａｌ及びＮ−グリコリルノイラミン酸。最近の規制機関によると、これらはもはや組換え治療薬には存在してはならないことになっている。
ＩＩｂ−クリアランス（清掃率）
タンパク質の物理化学的性状及び生物学的機能に対するその影響は別にして、また、グリカンは血中における糖タンパク質の持続性に主要な役割を有している。この現象は代謝クリアランスと命名され、天然化合物又は薬剤が肝臓又は腎臓により体内から除去される速度を表す。これは、時間あたり浄化される血漿体積（ｍＬ／分）として定義される。このメカニズムにより生命体は薬剤を除去できる。
大部分の循環血漿タンパク質はＮ−結合型オリゴ糖を共有する糖タンパク質ファミリーに属し、そしてその全て、特にヒトでは、末端がシアル酸で終わる。ノイラミニダーゼによりシアル酸を除去すると、血清糖タンパク質の血漿での寿命が、分レベルへと劇的に減少し、その肝臓による取り込みを促進する（van den Hamer et al., 1970; Morell et al., 1971）。例えば、妊娠ホルモン（より最近は組換えＨｕＥＰＯ）がシアル酸を欠損していると、その半減期は２分に減少するが、一方通常はその半減期は約４８時間である。シアル酸は、２つのサブユニットから構成され肝細胞の膜に含まれるシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰＲ又は肝レクチン）により循環タンパク質が排除されるのを阻止するので、糖タンパク質を血中に保留するために必要とされることが、現在では広く知られている（Hudgin et al., 1974; Kawasaki & Ashwell, 1976; Bianucci & Chiellini, 2000）。このレセプターは脱シアル化されたＮ−グリカンのガラクトース又はＮ−アセチルグルコサミン残基に結合する（Meier et al., 2000）。次いで、認識された糖タンパク質はクラスリンで覆われた小胞体の内部に取り込まれ、リソゾームへ再度方向付けされて、ここで分解される（Ashwell & Hardford, 1982）。
下位の生命体はタンパク質をシアル化することができないので、このステップは組換え糖タンパク質治療薬の薬理動態の性状として不可欠であるように考えられ、そしてＣＨＯ細胞では、シアル酸の付加は培養細胞のエネルギー状態に非常に敏感であり（ＮｅｕＡｃはピルビン酸と乳酸の縮合で合成される）、めったに完結されない。全てのシアル化された大ヒット商品（ＥＰＯ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＳＨ、Ａｂ．．．）は高いシアル酸含量を示すように製造業者が精製し、バッチ間が一定であるように制御されることが好ましい。
ＩＩｃ−グリコシル化＆アレルゲン性の制御
Ｎ−グリカンの末端部位のシアル酸残基は、タンパク質のシアル化が糖タンパク質に重要な性状を付与するので、治療用タンパク質にとり大変重要である。シアル化された残基の合成、活性化及び導入に必要なメカニズムは、種々の組換えタンパク質発現システムでは不十分にしか発現されていない。従って、生産される組換えヒトタンパク質はほとんどの場合、その天然の対応物に比較してシアル化は弱いか又はなされない。更に、仮にそれが哺乳動物細胞で発現されると、シアル化はＮ−アセチル化誘導体（ＮｅｕＡｃ）とは非常に異なるＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を介して起ることもあるが、その理由はそれが哺乳動物には存在するがヒトには存在しないからである。
組換え薬剤の市場においてはシアル酸に関して重要な課題が存在するので、多くの研究チームが種々の既存の発現システムにおいてＮ−グリコシル化の方法の改良に従事している。組換えタンパク質のグリコシル化パターンが可能な限り天然の糖タンパク質に見いだされるパターンに近づくために、そして薬物動態並びに産物の安全性を改善するために、そのグリコシル化パターンのヒト化を目的として集中的な研究がなされている。その一方で、免疫原性決定基の存在を減らす方向での手段も取られようとしている。この観点では、ごく最近の研究は６−結合型シアル酸及び３−結合型シアル酸は糖タンパク質が免疫システムのレセプターに結合し活性化させるのを阻止することを確認した（Glycobiology 2006）。組換えグリコシル化タンパク質への６−結合型シアル酸の付加は、従って、薬剤の安全にとって、概ね利益をもたらし、そしてこの分野に大きな進歩をもたらす可能性がある。
治療の上で、目的のタンパク質は、最初は天然源、例えば血液、胎盤、ヒト又は動物の組織、から抽出された。しかしながら、このアプローチは、使用可能なヒト組織の量により制限され、そして汚染という重要な危険性（ウイルス、プリオン、癌遺伝子）及び／又は微量の動物タンパク質又は毒素によるアレルギー性反応の惹起をもたらすこともある。分子生物学の発展に伴い、まったく異なる発現システムを使用したタンパク質生産のための新しいアプローチが開発された。広範な異種発現システムが使用可能となり（Andersen & Krummen, 2002）、そしてその各々は利点と欠点を有し、特別な注意がこれらのシステムで生産される組換えタンパク質のＮ−グリコシル化パターンに払われている。
ＩＩｄ−既知発現システムにおけるＮ−グリカンの生合成：グリコシル化経路のヒト化の必要性
細菌
最も使用されているシステムの一つは細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であるが（Swartz, 2001; Baneyx, 1999）、しかしその主な不便性はヒトにみられる翻訳後修飾、特にグリコシル化、がこの真核生物では実現されないことであり、それはそのようなグルコシルトランスフェラーゼがＥ．ｃｏｌｉでは発現されていないからである。これは、誤った折り畳みとそれに続く免疫システムによる目的の治療用タンパク質の拒絶、その寿命及び生物活性の低減をもたらしてしまう。
これまでのところ、ヒト型のＮ−グリコシル化はこの微生物には見いだされていない。
酵母及び糸状菌
酵母及び糸状菌は、また、良く確立された真核生物の発現システムであり、ヒト細胞のメカニズムに近い細胞メカニズムを有している。酵母は複合タンパク質を生産し、そしてグリコシル化を含むいくつかの翻訳後の修飾を実現する。酵母及びマッシュルームは典型的には、共に５単糖の核の先端に１００マンノース残基まで（酵母に関して）付加することでマンノースに富むグリカンを生産する（Tanner & Lehele, 1987; Herscovics & Orlean, 1993）。この超マンノシル化はヒトにおける免疫反応を確実に増強する。更に、現在まで、シアル酸、ガラクトース、フコース及びＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合オリゴ糖は、これらの微生物により生産される糖タンパク質の中には見いだされていない（Blanchard, 2004）。
酵母及びマッシュルームにより実現されるＮ−グリコシル化の工程は、ＥＲにおける最初のステップについては哺乳動物の工程に類似しているが、しかしゴルジ装置において付加されるポリマンナンの存在は、規制機関からのその承認を得るのを阻止している。
昆虫細胞
昆虫細胞で発現されたタンパク質は適切に折りたたまれ、分泌されそして翻訳後修飾をうけることもある。これらの細胞で行われる翻訳後修飾は、哺乳動物で実現されるもの、（特にタンパク質のＮ−グリコシル化において）と類似している。この場合に得られるグリカン構造は、しかしながら、不完全であり、バキュロウイルス発現の間に発現される新生糖タンパク質を分解する望ましくないＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の存在によるマンノース欠乏と定義されている（Blanchard, 2004）。
昆虫細胞におけるノイラミン酸の欠乏については、依然として活発に議論されている（Marchal et al., 2001, Lerouge et al 2005）。いくつかの昆虫細胞株では、α１、３結合型フコース残基が見出され、これはヒトにおける免疫反応を誘発することもある。従って、現在のところこのシステムの使用はワクチン抗原の生産に限定されている。
トランスジェニック植物
他の真核細胞のように、植物は治療用タンパク質の生産に使用することのできる複雑で洗練された細胞メカニズムを示す。組換えタンパク質は、植物がタンパク質の成熟に必要な酵素を発現しているので、非常に良い薬剤学的性質を有している。
しかしながら、グリコシル化の工程はアレルギー性のタンパク質を生産しないようにするためにいくつかの調整を必要としている。実際のところ、植物のＮ−グリコシル化（Lerouge et al., 2000）は、グリコシル化に関する限りヒトで実現されているものと類似している。そのグリコシル化はそれでもなおシアル化されたアンテナ（突起）を欠損し、そしてβ１、２−キシロース及びα１、３−フコースの付加が存在する。両方の残基ともに、ヒトに対して高い免疫原性を示し、そしてそのために、最近は、治療用発現システムの承認ではかなりの障害に出会っている。
哺乳動物細胞
哺乳動物細胞の発現システム、すなわちＣＨＯ細胞、は最近では組換え治療薬生産のための唯一の薬剤承認システムである。このような細胞は大きな有利性を示すが、その理由は、それが複合タンパク質を合成することができ、巨大な分子の複合型Ｎ−グリコシル化を達成することができるからである。哺乳動物は、自然界ではヌクレオチド糖の合成及び輸送に関与する酵素ばかりでなく、高いレベルのα２、３−シアル化を伴った異種組換えタンパク質の複合グリコシル化を保証するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼもまた使用する。しかしながら、他の酵素、例えば、ヒト組織のＮ−グリカンに特異的なグリコシドモチーフを転移するα１、３／４−フコシルトランスフェラーゼ及びα２、６−シアリルトランスフェラーゼ、の欠損が存在する。げっ歯類では、Ｎ−グリコリルノイラミン酸は実質的にＮ−グリカンで優先され、またＮ−アセチルノイラミン酸のＯ−アセチル化は部位４、７、８及び最も頻繁に９で起こり、各々のこの誘導体はヒトに潜在的に免疫原性を有することもある。このことは、マウス細胞又は授乳中のマウス／ウサギを組換えタンパク質の生産に使用する際の限界を示す（Blanchard, 2004）。
ＩＩｅ−糖エンジニアリング
前記で議論したように、承認された糖タンパク質の末端のシアル化の達成は、これまでに使用可能な全ての発現システムの中で、最も困難なステップである。一例として、α２、６−結合型シアル酸の付加は、それはヒト血液では最も一般的であるが、達成できなかった。全ての生命体の中で、これに必要とされる酵素メカニズムは、とにかく見当たらない（図６）。
この分野での研究の最終ゴールは、組換えタンパク質のグリコシル化工程、産物の収量及び組換えタンパク質の質の改善である。グリコシル化のために遺伝的に修飾された発現システムの使用は、そのグリカン構造の比類なき均一性を有する糖タンパク質の生産を可能にする。次いで、このようなシステムは、明確な構造を持ち生物医学的興味を有するタンパク質のための高レベルの生産を開発するのに使用することができた。酵母におけるグリコシル化エンジニアリングでは（Hamilton et al., 2003; Roy et al., 2000）、最初はポリマンノース（polymannosidic）鎖の付加が阻害されていた。次いで、ガラクトシル化及びＮ−アセチルグルコサミニル化に必要な酵素がこのシステムに付加された（Maras et al., 1999; Bretthauer, 2003; Vervecken et al., 2004）。しかしながら、この工程に関与する酵素の数及び位置のために、末端シアル酸の付加を実施するのはそれでも困難であるが、しかし日本において最近実施された（図６）。
昆虫細胞では、免疫原性を有する糖の転移を触媒するＧＴｓは除去され、シアル化は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミニル・リアーゼ及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ合成酵素（Jarvis et al., 1998; Aumiller et al., 2003）をコードする３つの遺伝子の付加により実現した。著者らはそれ自身のＣＭＰ−シアル酸を合成するようにデザインされた新規昆虫細胞株（ＳｆＳＷＴ−３）を創出した。得られたた細胞は、血清を含まない成長培地で培養すると、Ｎ−グリカンの形成に必要な７つの全ての哺乳動物遺伝子を発現し、ＣＭＰ−シアル酸を生産し、そして組換えタンパク質のシアル化を行った（Aumiller et al., 2003）。この研究は特許化された。
植物では、使用された最初の戦略はＥＲ内にタンパク質を貯蔵することでアレルギー性糖の付加を阻止することを目的とした。しかしこの場合、グリカンは複合型で存在することはできない。他の戦略はゴルジ装置内のいくつかのＧＴｓの阻害に基盤を置いた。この阻害は完結されるか、及び／又は成熟のための内在メカニズムとの競合へと向かうことができる。また、シアル化メカニズムの付加は進行中である。
哺乳動物細胞の場合、α２、３−ＳＴ及びβ１、４Ｇａｌの過剰発現を通じて研究が実現され（Weikert et al.,1999）、これら酵素は共にゲノムに存在するが、しかしその活性は培養条件により変動する。このことで、末端のＧａｌ及びシアル酸の存在に関して広範な変動と、また、分泌されたタンパク質のグリカン構造における広範な微小不均一性がもたらされる。
大部分の研究は、α２、６−ＳＴの導入（Bragonzi et al., 2000）によるガラクトシル化及びシアル化の最適化に向けられた（Granbenhorst et al., 1999）。全長のα２、６−ＳＴを安定に発現するＣＨＯ細胞株はかなり以前に樹立され、また、それは失望的なものであった。α２、６及びα２、３−結合型の間に保存されている末端シアル酸残基の観察された比率はα２、６−び及びα２、３−シアル酸残基についてはそれぞれ４０．４％、５９．６％であり、クリアランス試験では薬理動態を改善した（Bragonzi et al., 2000）。細胞のヒト化における改善にも拘わらず、α２、６及びα２、３−結合型末端シアル酸残基の間の比率は制御することができず、６−活性にとってさえ好ましくない。
まとめると、シアル化は遺伝子工学により生産されたタンパク質のグリカン構造を制御するために不可欠なステップである。主要な困難性は、欠損した活性の発現にはそれほどあるわけではなく、異種の生産システムを成功裏に作動させることにある。実際のところ、３つの主要な目的が最近の発現システムのヒト化グリコシル化で対処されることが好ましい：１）ゴルジ内で酵素が働くために必要なドナーの基質及び関連するトランスポータを得ること。２）内在性シアリルトランスフェラーゼ活性と競合できるように酵素を適切にコンパートメント化させること。３）酵素が任意の関連アクセプター基質にシアル酸転移を触媒することを可能にすること。
ＩＩｆ−発明の背景：
本発明者の戦略は、全長ＳＴ６酵素がこれまでのところ前記目的、特にほとんどの哺乳動物に存在する内在性ＳＴ３活性との競合、に対処することができていないという考察に基づき、それはおそらく遺伝子産物が分泌経路に関連する細胞内コンパートメントに挿入されていないという理由による。従って、新生糖タンパク質が分泌顆粒の中に分別され、及び／又はそれが既存のＳＴ３より前に／又はその代わりに工学的に作製されたＳＴに出会う場所であるゴルジ装置に、トランスフェラーゼＣＤが到達することもあることができるように、発明者は最適の機会を付与する方法を開発した。
＜ＩＩＩ-合成膜ＳＴｓのデザイン＞
本発明の本質は、既知触媒活性を有するキメラＳＴｓのパネルを提供する方法にあり、これは、キメラＳＴｓを真核細胞のゴルジ装置に標的化するための膜アンカー（固定物）を含む。これらのものはいずれも生存細胞には存在せず、その構築はＣＴ、ＴＭＤ又はＳＲをコードするいずれのＤＮＡ配列も必要としないので、「合成ＳＴｓ」と考えられる。関連するオリゴヌクレオチドは長さが２００ｂｐ（６０アミノ酸）以内であり、情報科学によるデザイン及び市販により取得が可能である。ＰＣＲ法により、標識をつけた合成アンカーがＳＴタンパク質のＮ末端半分をコードするように構築され、最適化されたｈＳＴ６ＧａｌＩの触媒ドメインに融合される。
本発明は３つの型の膜キメラＳＴｓを構築するための種々の分子的方法を記載する：
・ヘテロ構築物：ＳＴ６ＧａｌのＣＤΔ８９に融合されたＳＴアンカー。ＰＣＲにより合成されるか又は最終的にコピーされる。この場合、ＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲ部分は同一のＳＴに由来する：ＳＴ３Ｇａｌ／ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ／ＳＴ８Ｓｉａ。例は２００ｂｐ配列を記載。
・ハイブリッド構築物：ＣＴ＋ＴＭＤは或るＳＴ由来、及びＳＲは他のＳＴ由来。ここでも、最小サイズは２００ｂｐ。
・ヘテロ構築物：ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片は異なるＳＴｓ由来。ここでも、最小サイズは２００ｂｐ。
・長い構築物：２００ｂｐのＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲ１構築物は調製され、ＳＲ２はＳＲ１の下流に位置するように最大２００ｂｐの第二番目のＳＲ２構築物と融合される。この重複構築物は更に３’末端で任意の他のＳＲ構築物と必要に応じて繰り返し連結することができる。
２００ｂｐのサイズは全てのヒトのＳＴｓの最短Ｎ末端部分は、ＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲ＝２００ｂｐのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩであるという観察に基づいた。この酵素は実質的にステムを有しない。
現在のところ、発明者は、望みの活性の新規トランスフェラーゼ酵素を創出するための、合成ＤＮＡ断片を構築しこれを最少触媒ドメインと融合させる方法の認証を行った。いくつかの代表的な構築物は、さらなる発現のために利用可能である。合成キメラは活性を有し、トランジエントな発現及び共焦点顕微鏡法を使用してＣＨＯ細胞にて研究された。
《実施例１：ｈＳＴ６ＧａｌＩ（配列番号４４をコードする配列番号４３）の最少触媒ドメイン（ＣＤ）の生産》
Ｌｅｇａｉｇｎｅｕｒら（２００１）によりクローニングされたヒトＳＴ６ＧａｌＩ（ｈＳＴ６ＧａｌＩ）は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ベクター（シグマ）にクローニングされた最小ＣＤを増幅するために使用され（Donadio et al., 2003）、これは全てのキメラ構築物に使用された。
最初、組換えベクターはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤの存在を証明するために消化された。泳動アガロースゲルは約１０００ｂｐ近辺にヌクレオチドバンドの存在を示し、これは最小触媒ドメインの期待されるサイズに対応する（図１０Ａ〜Ｃ）。
ｈＳＴ６ＧａｌＩのアミノ酸９０〜４０６に対応するＣＤは次のプライマーを使用したＰＣＲにより得られた：
５’ＢａｍＨＩ−Δ４：５’−ＧＡＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣ−３’及び
３’Δ４−ＸｂａＩ：５’ＴＡＡＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＡＧＣ−３’。
これらプライマーはＢａｍＨ１（５’ＢａｍＨＩ−Δ４）及びＸｂａＩ（３’Δ４−ＸｂａＩ）の制限酵素サイト及び配列の天然ストップ・コドンを含む。ＢａｍＨ１制限酵素サイトは、キメラ酵素形成のために、ｈＳＴ６Ｇａｌの９０〜４０６のＣＤを他のＳＴｓの合成Ｎ末端部分に連結させるために使用した。３’末端のＸｂａＩ制限酵素サイトはキメラをｐｃＤＮＡ３．１ベクター内に導入するために使用した（インビトロジェン）（図１１）。
ＰＣＲはＩ−サイクラー装置（バイオラッド）で、次の試薬を使用して行われた：２００ｎｇのｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−ｈＳＴ６ＧａｌＩ−９０−４０６を含む５０μｌの最終容積中の２．５単位プルーフスタート（ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）、３００μＭの各ｄＮＴＰ（シグマ・アルドリッチ）、１μＭの各プライマー、１Ｘのプルーフスタート製造業者緩衝液（キアゲン）、１Ｘの製造業者Ｑ溶液（キアゲン）及び１．５ｍＭのＭｇ２＋。反応は次のようにして行われた：９５℃で５分、次いで、９４℃で３０秒の４０サイクル、５５℃で３０秒及び７２℃で１分。増幅されたＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上の電気泳動で分析され（期待サイズ１０００ｂｐの１つのＰＣＲ産物の増幅；図１７Ｂ）、製造業者の使用説明書に従いキアゲンのゲル抽出用キットを使用して精製した。
いくつかのＰＣＲ増幅産物は一緒にして濃縮しアガロースゲル中でＤＮＡ量を見積もった（図１０Ｃ）。精製したPCR産物は使用するまで−２０℃で保存した。
《実施例２：合成Ｎ末端ドメインのアセンブリング（組立）》
生物情報科学的分析の分別による広範なＳＴｓ配列を創出するために、異なるＳＴｓ由来のＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲが合成されアセンブリングされた。
全ての選択されたキメラのＮ末端部分は、３つの典型的なＳＴファミリーの領域を含む：ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ。注目すべきことに、ＳＲは長さが変化することもあり、そして合成遺伝子の重複により作製できた。これらの全ての断片、すなわちＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲは、以下に記載する相補的ハイブリッド化及びリン酸化ステップにより全体が再構成された。
ａ−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（配列番号１５２をコードする配列番号１５１）の非触媒ドメインの構築
ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＮ末端領域（１〜１３８ｂｐ）配列の部分に対応する６つのセンス・オリゴヌクレオチ及び５つのアンチセンス・オリゴヌクレオチドがデザインされ合成された（ユーロジェンテック：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）。この実施例は、目的の天然に生じる配列を合成する方法を示す。ＦＬＡＧエピトープ（太字及び下線）はｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ配列の開始コドンＡＴＧ及び二番目のコドン（ＧＧＡ）の間に付加された：
ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡ。
１マイクログラムの各内部ヌクレオチドは２ｍＭのＡＴＰ（シグマ）を含むキナーゼ緩衝液中の１単位のポリヌクレオチドキナーゼ（ユーロジェンテック）でリン酸化された。反応は６０分、３７℃で行い、最後にインキュベーションは１０分、６５℃で不活化した。全てのオリゴヌクレオチドは別々に１０分、８０℃で変性させ、次いでマッチング（させるために混合した。マッチングは一晩８０℃〜２０℃の温度勾配で温度を下げて行った。次いで、得られた断片はＰＣＲに供した。
ｂ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４（配列番号１４６をコードする配列番号１４５）の非触媒ドメインの構築
ＳＴファミリー内で最短のステムの一つは、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩのステムであり、これは約６個のアミノ酸より構成されている。このＳＴの可能性として考えられるＮ末端ドメインは、２２２ｂｐに対応する７４個のアミノ酸（ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ）である。従って、最短のＳＲを有する構築物を描くために、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの７４個の最初のアミノ酸に対応する合成Ｎ末端ドメインが再構成された。
ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの完全なＮ末端領域（１〜２２２ｂｐ）配列に対応する９個のセンス・オリゴヌクレオチド及び８個のアンチセンス・オリゴヌクレオチドをデザインし合成した（ユーロジェンテック）。ＦＬＡＧ配列（太字及び下線）はｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ配列の開始コドンＡＴＧ及び二番目のコドン（ＧＧＡ）の間に付加された：
ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡ。
リン酸化及びマッチング反応は前記のように行った。
ｃ−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ１−１４０（配列番号１４８）の非触媒ドメイン・アセンブリングのための合成オリゴヌクレオチド複製
ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは最長のＳＲ（２４６アミノ酸）を示すシアリルトランスフェラーゼとして選択された。この例では、合成的に再構成されたＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲ部分（１〜３５アミノ酸残基）の長さは、Ｄｏｎａｄｉｏら（２００３）の報告のように、他のＳＲストレッチ（伸び）（３６〜１４０アミノ酸残基）と結合させて長さを複製し、１４０アミノ酸残基のアンカー・メンバーを付加できるようにした。
ｄ−ハイブリッド合成ドメインの構築：ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ１−２８−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４（配列番号１６０）
一番目にｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（１〜２８アミノ酸残基）のＣＴ及びＴＭＤ、及び二番目にｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ（アミノ酸３７〜７４）のＳＲの始めの領域を含む、ハイブリッドＮ末端領域が構築された。
この合成ハイブリッドの全長は、１９８ヌクレオチド（配列番号１５９）に対応する６６アミノ酸である。ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの配列を使用する、前記のＮ末端領域（１〜２２５ｂｐ）に対応する９個のセンス・オリゴヌクレオチド及び８個のアンチセンス・オリゴヌクレオチドをデザインし合成した（ユーロジェンテック）。ＦＬＡＧエピトープ（太字及）はｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ配列の開始コドンＡＴＧ及び二番目のコドン（ＧＧＡ）の間に付加された：
５’−ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡ−３’。
リン酸化及びマッチング反応は前記のように行った。
ｅ−合成構築物のＰＣＲ増幅
合成再構成ステップの後に、産物はＰＣＲ法により増幅されたが、この際に使用するプライマーは、最構成されたＤＮＡ断片を最初は選択されたＣＤと、次いでベクターｐｃＤＮＡ３．１．に連結するために、前記のＤＮＡ断片の各端に要求される制限酵素サイトを有するようにデザインされている。
次のプライマーがデザインされた：
５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ３：５’−ＧＡＧＣＣＣＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧ−３’、及び
３’ＳＴ３−ＢａｍＨＩ：５’−ＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＡＧＴＧＡＣＴＡＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡ−３；
５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ６：５’−ＧＡＧＣＣＣＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧ−３’、及び
３’ＳＴ６−ＢａｍＨＩ：５’−ＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＧＧＧＡ−３’；
３’ＳＴ６−ＢａｍＨＩｎ２：５’−ＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＧＴＴＣＡＣ−３’。
これらプライマーは、さらなるライゲーションを確保するためにＡｆｌＩＩ（５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ３及び５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ６）及びＢａｍＨＩ（３’ＳＴ３−ＢａｍＨＩ、３’ＳＴ６−ＢａｍＨＩ及び３’ＳＴ６−ＢａｍＨＩｎ２）制限酵素サイトを含む。
ＰＣＲは表５に記載する一対のプライマーセットを使用して行った。これはＰＣＲ装置（Ｉ−サイクラー、バイオラッド）により、次の組成を含む５μＬ溶液中の各合成断片を使用して行った：最終容積５０μＬ中の２．５単位プルーフスタートＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）、３００μＭの各ｄＮＴＰ（シグマ・アルドリッチ）、１μＭの各プライマー、１Ｘプルーフスタート製造業者緩衝液（キアゲン）、１Ｘ製造業者Ｑ−溶液（キアゲン）及び１．５ｍＭのＭｇ２＋。
この反応は次のように行った：９５℃で５分、次いで９４℃で３０秒４０サイクル、５５℃で３０秒、５３℃、５３℃及び５５℃、それぞれｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（配列番号１５１）、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４（配列番号１４５）、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−１４０（配列番号１４７）及びｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／３７−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４（配列番号１５９）について、そして７２℃で１分。増幅したＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上の電気泳動で、ＰＣＲ産物のサイズ順番に分析した（表５）：
−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ：期待サイズ１７４ｂｐに対応する、推測サイズ１７０ｂｐの１つのＰＣＲ産物のみが増幅された（図１１）。
−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ：図１３は期待サイズ２７０ｂｐに対応する、推測サイズ２７０ｂｐの１つのＰＣＲ産物を示す。
−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−１４０：４６８ｂｐのヌクレオチド配列が増幅された（図１５）。
−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４：２４９ｂｐのヌクレオチド配列が増幅された（図１７）。
ＰＣＲ産物はゲル・抽出キット・キアゲンにより製造業者の使用説明書に従って精製した。
−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−１４０のＰＣＲ産物はゲノム・エクスプレス（メイラン、フランス）による両鎖ＤＮＡの直接シークエンシングに委託した。
−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４のＰＣＲ産物は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）に導入する前にＣＤ（配列番号４３）と連結し、やはりゲノム・エクスプレス（メイラン、フランス）によりシークエンシングを行った。
−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４の合成断片はＣＤ（配列番号４３）と連結し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）に挿入する前に両鎖を直接シークエンシングした。
ｆ−ＰＣＲ産物の定量
全てのＰＣＲ産物は、それぞれの合成構築物について一緒にし、濃縮した。２容量のエタノール及び０．１容量のｐＨ５．２の３Ｍ酢酸ナトリウムをＰＣＲ産物試料に添加した。この混合物は、３０分、−２０℃でインキュベーションし２０分、１００００ｇ、４℃で遠心分離した。ペレット（沈澱）は１００μＬの７０％エタノールで洗浄し、１０分、１００００ｇ、４℃で遠心分離した。次いで、上清は除去し、ペレットは乾燥してから５０μＬの精製水に懸濁した。試料は使用するまで−２０℃で保存した。
５マイクロリットルの４つの濃縮合成断片はその量を見積もるために２％アガロースゲルの上に載せた（図１１、１２、１３及び１４）。
《実施例３：非触媒Ｎ末端膜ドメインとシアルリルトランスフェラーゼ活性とのアセンブリング》
ａ−消化及び精製
全てのＰＣＲ産物（合成Ｎ末端構築物又は触媒ドメインのいずれも）はＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。
２００ナノグラムの合成Ｎ末端構築物は、最終容積２０μＬ中に３単位のＢａｍＨＩ制限酵素、０．１μｇ．μＬ−１の牛血清アルブミン及び適切な１Ｘ製造業者緩衝液Ｅ（プロメガ）を含む溶液で消化した。
５００ナノグラムのＣＤは、最終容積２０μＬ中の５単位のＢａｍＨＩ、０．１μｇ．μＬ−１の牛血清アルブミン及び１Ｘ緩衝液Ｅ（プロメガ）で消化した。
消化は９０分、３７℃で行い、インキュベーションは最終的には１５分、６５℃で不活化した。消化したＤＮＡはＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。
ｂ−ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）
各Ｎ末端断片はＣＤ断片に、次のものを含む溶液中で連結した：２つとも市販のものである（プロメガ）最終容積２０μＬ中の１．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、１Ｘのライゲーション緩衝液、それぞれが６２．５ｎｇ、７８．２ｎｇ及び７５ｎｇであるｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４及びハイブリッドｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４断片及び１００ｎｇのＣＤ。この混合物は１５℃で一晩インキュベーションし、次いで１０分７０℃での失活ステップを踏んだ（図１７）。
ｃ−標識合成挿入物の増幅
ライゲーションが適切であることを証明するために、ライゲーション産物は直接次の一対のプライマーを使用したＰＣＲにかけた：５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ３／３’Δ４−ＸｂａＩ、５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ６／３’Δ４−ＸｂａＩ及び５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ３／３’Δ４−ＸｂａＩはそれぞれＳＴ３／ＣＤ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−７４／ＣＤ及びハイブリッド／ＣＤに対するものである。
反応は、最終容積５０μＬ中の２．５単位のプルーフスタートＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）、３００μＭの各ｄＮＴＰ（シグマ・アルドリッチ）、１μＭの各プライマー、１Ｘプルーフスタート製造業者緩衝液（キアゲン）、１Ｘ製造業者Ｑ−溶液（キアゲン）及び３ｍＭのＭｇ２＋を使用して行った。反応は次のように行った：９５℃で５分、次いで９４℃で１分の４０サイクル、５７℃で１分、及び７２℃で１分３０秒。
増幅したＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上の電気泳動で分析した：
−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ合成挿入物（配列番号１６７）：１２００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅したが（図１２）、これはＳＴ３ＧａｌＩＩＩ＋ＣＤの連結ＤＮＡ断片の期待サイズに対応した。
−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ合成挿入物（配列番号１６１）：１２００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅したが（図１４）、これは正確に１２２５ｂｐの連結ＤＮＡ断片：ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ＋ＣＤ、の期待サイズに対応した。
−ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／３７ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−７４／ＣＤ合成挿入物（配列番号１７５）：１２００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅したが、（図１７）、これはｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２９／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃ３７−７４プラスＣＤの連結ＤＮＡ断片の期待サイズに対応した。
増幅したＰＣＲ産物はゲル抽出・キット・キアゲンを使用し製造業者の使用説明書に従い精製した。
同一ＳＴの増幅したＰＣＲ産物は一緒にして濃縮し、そして前記のように１．５％アガロースゲル上で定量したが（図１２、１３及び１６）、その結果キメラをｐｃＤＮＡ３．１ベクターに連結するのに十分な量のＤＮＡが得られた。
ｄ−発現ベクターへ挿入した合成ＳＴのクローニング
１−消化及び精製
合成挿入物、例えばｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ又はｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ挿入物は、ＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩの制限酵素サイトでｐｃＤＮＡ３．１ベクターへ連結した。
合成挿入物及びｐｃＤＮＡ３．１ベクター（図１２）（インビトロジェン）は最初に制限酵素ＸｂａＩで消化した：
−各構築物について、５００ｎｇのベクターは、製造業者の使用説明書に従い、最終容積２０μＬ中の２．５単位のＸｂａＩ（プロメガ）、０．１μｇ．μＬ−１のＢＳＡ及び製造業者（プロメガ）により供給された１Ｘの適切な緩衝液Ｄを使用して消化した；
−挿入物は最終容積２０μＬ中の次の試薬で消化した：２〜２．５単位のＸｂａＩ（プロメガ）、この量はＰＣＲ後に使用可能な挿入物の量に依存（たとえば、２００ｎｇのｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４／ＣＤ及び５００ｎｇのｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤはそれぞれ２及び２．５単位のＸｂａＩで消化した）、０．１μｇ．μＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液Ｄ（プロメガ）。
消化は３７℃で６０分間行い、６５℃で１５分間失活させた。
次いで、消化産物は製造業者の使用説明書（バイオラッド）に従い制限酵素ＡｆｌＩＩにより消化した：最終容積５０μＬ中の、ＤＮＡ量に従い適切な量の酵素単位を使用（それぞれｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４／ＣＤ、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ及びｐｃＤＮＡ３．１について、２、２、２．５及び２．５単位）、０．１μｇ．μＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液２（バイオラボ）を使用した。消化は３７℃で６０分間行い、６５℃で２０分間失活させた。消化物はＰＣＲ精製キット（キアゲン）で精製した。
２-ライゲーション
ライゲーション条件は下記の式に従って算出した：

式中挿入物のサイズは合成構築物（例えば、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４／ＣＤ又はｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ）について約１２００ｂｐであり、ベクターｐｃＤＮＡ３．１のサイズは５４２８ｂｐ、そして最後に使用したベクターの量は５０ｎｇ又は１００ｎｇ、及び挿入物／ベクターのモル比はは３／１である。
・組換えベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＳＴ３／ＣＤの構築は、最終容積１５μＬ中の、３３ｎｇの消化されたキメラｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ（配列番号１６７）、５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１の消化されたベクター、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（プロメガ）及び１Ｘライゲーション緩衝液を使用して行われた。混合物は一晩４℃でインキュベーションし、反応は１０分間、７０℃で失活させた。
・二番目のｐｃＤＮＡ３．１／ＳＴ６／ＣＤ組換えベクターの構築は、最終容積１５μＬ中の、６６．５ｎｇの消化されたキメラｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ（配列番号１６１）、１００ｎｇの消化されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（プロメガ）及び１Ｘライゲーション緩衝液を使用して行われた。混合物は一晩１５℃でインキュベーションし、反応は１０分間、７０℃で失活させた。
・三番目のｐＣＤＮＡ３．１／ＨＹＢ／ＣＤ組換えベクターの構築は、最終容積１５μＬ中の、６６．５ｎｇの消化したキメラｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４／ＣＤ（配列番号１７５）、１００ｎｇのｐＣＤＮＡ３．１ベクター、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（プロメガ）及び１Ｘライゲーション緩衝液を使用して行われた。混合物は一晩１５℃でインキュベーションし、反応は１０分間、７０℃で失活させた。
３−クローニング
コンピテント（適格）細胞の化学的形質転換
ワンショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（インビトロジェン）は製造業者の使用説明書に従い組換えベクターで形質転換した。２マイクロリットルの各ライゲーション反応物は２５μＬの化学的コンピテント細胞に添加し、丁寧にタッピングして（軽くたたいて）混合した。バイアルは氷上で３０分間インキュベーションした。化学的形質転換は４２℃の水浴にて正確に４０秒行った。バイアルは４２℃の水浴より取り出し、２分氷上に置いた。２５０マイクロリットルの予め温めたインビトロジェンにより供給されたＳ．Ｏ．Ｃ培地は、各バイアルに無菌条件下で添加した。次いで、混合物は３７℃で正確に１時間、２２５ｒｐｍで振盪インキュベータ内にて振盪した。各形質転換体は無菌状態で５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガープレート（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製の１０ｇのバクト・トリプトン、５ｇのバクト・酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ及び１リットル溶液当たり５ｇの寒天）上に広げた。プレートは裏返しにして３７℃で一晩インキュベーションし、形質転換体の選別まで４℃で保存した。
増幅
その日の終わりに、単一コロニーを単離し５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ（ディフコ製の１０ｇのバクト・ペプトン、５ｇバクト・酵母抽出液、１０ｇのＮａＣｌ）へ移植した。増殖は振盪インキュベータにより一晩、３７℃で確保した。翌日、培養物のグリセロール・ストックは０．８５ｍＬの培養物を０．１５ｍＬの無菌グリセロールと混合して調製し、クリオバイアル（冷凍バイアル）へ移した。グリセロール・ストックは配列の解明及び更なる使用のために−８０℃で貯蔵した。
プラスミドの少量調製
組換えベクターは少量調製方法（マニアティス）により精製し、１．５ｍＬの培養液を採取し、５分間、１００００ｇで遠心分離して細菌をペレット（沈澱）とした。冷却溶液Ｉ（５ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、ペレットを再度懸濁し（１００μＬ）、２００μＬの溶液ＩＩ（０．２ＮのＮａＯＨ及び１％ＳＤＳ）及び１５０μＬの溶液ＩＩＩ（３Ｍカリウム及び５Ｍアセテート）もまた添加した。混合物はボルテックスにより丁寧に混合し、氷上に５分置き、そして４℃で５分、１５０００ｇで遠心分離した。上清は採取し、１容量のイソプロパノールを添加した。少量調製物は５分室温でインキュベーションし、４℃で、５分、１５０００ｇで遠心分離した。次いで、上清は除去した。ＤＮＡのペレットは乾燥し、５０μＬの水に再度懸濁した。ＤＮＡ量は分光光度計ＤＯ装置（バイオフォトメータ、エッペンドルフ）を使用して測定した。少なくとも３０個の少量調製物について、各構築物で目的の挿入物が存在するかどうかスクリーニングされた。
各３０個の少量調製物の１マイクログラムが、挿入物が存在することの証明のためにＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素を使用して二重に消化された。最初の消化では、消化溶液は最終容積２０μＬ中に、１０単位のＸｂａＩ（プロメガ）、０．１μｇ．μＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘの適切な製造業者の緩衝液Ｄ（プロメガ）を含んだ。消化は３７℃水浴中で１時間行い、そして６５℃で１５分失活させた。試料は、最終容積５０μＬ中の１０単位のＡｆｌＩＩ制限酵素（バイオラボ）、０．１ＸのＢＳＡ及び１Ｘの緩衝液２（バイオラボ）を使用して二番目の消化が行われた。反応は３７℃水浴中で１時間行い、６５℃で２０分間失活させた。消化した試料は全てＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。消化産物はキメラ挿入物の存在を検出するために１．５％アガロースゲル上に載せた。電気泳動は１００Ｖで約３５分間行った。
ｐｃＤＮＡ３．１／ＳＴ３／ＣＤ及びｐｃＤＮＡ３．１／ＳＴ６／ＣＤの場合は、１２００ｂｐの挿入物が検出された（図１９Ｃ又は２３Ｃ）。この挿入物のサイズは再構成されたキメラＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ又はＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤの期待サイズに正確に対応する。
陽性クローンは期待挿入物ＤＮＡ配列であるかどうかを評価するために完全配列を決定した。
シークエンシング（配列決定）
クローニングのステップは、両鎖ＤＮＡの配列決定をゲノム・エクスプレス（メイラン、フランス）によりベクター内に存在するユニバーサル・プライマーを使用して行うことで検証した：Ｔ７プロモータ及びＢＧＨリバース。
最終的な３個のキメラの期待配列は次の通りである；ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ（配列番号１６７）、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ−２８／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ３７−７４／ＣＤ（配列番号１７５）、及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ（配列番号１６１）。得られたヌクレオチド配列は期待配列と並べ、その結果これら３つの配列では１００％の一致が見られた。また、推定アミノ酸配列はキメラの期待配列(http://www.infobiogen.fr/services/analyseq/cgi-bin/alignp_in.pl)と並べ、その結果これら２つのアミノ酸配列の間には１００％の一致が見られた。
ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−１４０について得られたヌクレオチド配列は、理論的配列と８４％の一致を示した。配列で見当たらない部位は最初の３６及び最後の３９ヌクレオチドであり、これらは両方とも両鎖のＤＮＡ断片をデザインするためのプライマーに対応する。更に、期待配列と実際の配列の間のアミノ酸配列は、７６．９％の同一性を示した。最初の１２及び最後の２４のアミノ酸は、この配列決定に使用した特異的プライマーに相当するので見いだされなかった。
少量調製
ＤＮＡ挿入物配列の検証後、組換えプラスミドは、大量の各構築物（ｐｃＤＮＡ３．１／ＳＴ３／ＣＤ及びｐｃＤＮＡ３．１／ＳＴ６／ＣＤ及びｐｃＤＮＡ３．１／ＨＹＢ／ＣＤ）を取得するために１００ｍＬ培養で増幅した。新たにストリークした選択用プレートから単一コロニーを拾い、選択用抗生物質（アンピシリン５０μｇ．μＬ−１）を含む開始培養であるＬＢ培地に移植した。この培養は激しく振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションした。この開始培養は１００ｍＬの選択ＬＢ培地に希釈し、再度激しく振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションした。細菌細胞はハーベスト（回収）し、組換えベクターはキアゲン（登録商標）プラスミド・ミディ・キット（キアゲン）を使用し製造業者の使用説明書に従って精製した。収率は、ＵＶ分光光度計を用いてＤＮＡ濃度を定量することで（バイオフォトメータ−、エッペンドルフ）決定した。各構築物は使用するまで−２０℃で貯蔵した。
《実施例４：ＣＨＯ細胞における合成構築物の機能発現》
発現された挿入物は図１５に示す。
＜Ａ−ＣＨＯ細胞における合成ＳＴ６ｓのトランジエントな発現＞
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株はＤｏｎａｄｉｏら（２００３）により記載されているように構築物を発現させるために使用した。簡単に述べると、細胞は１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）、ファンギゾン（２．５μｇ／ｍＬ）及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充したハム（Ｈａｍ）培地中で、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベータで増殖させた。ＦＬＡＧ−ＣＭＶベクター構築物のトランスフェクションは、３μｇの組換えプラスミドＤＮＡによりリポフェクタミン（ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬を使用して、製造業者の推奨する方法に従って行った。免疫蛍光実験はトランスフェクション後３６〜４８時間で行った。
ＦＩＴＣ−ＳＮＡ及び抗−ＦＬＡＧｍＡｂによる二重標識はＤｏｎａｄｉｏら（２００３）が記載したように行った。細胞は１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液中で固定し、１％ＢＳＡで飽和し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＩＴＣ−ＳＮＡとインキュベーションした。ＳＴ６活性を発現する細胞は緑色に標識した。試料はＰＢＳで２度洗浄し、１％ＰＦＡで固定し、更にＰＢＳで洗浄し、０．０５ＭのＮＨ４Ｃｌとインキュベーションし、そしてＰＢＳで洗浄した。細胞はＰＢＳ中の０．１％トライトンでパーミアビライズ（透過処理）し、更に１０％羊血清を含むＰＢＳとインキュベーションした。抗ＦＬＡＧ標識は、５％の不活化した羊又は馬血清を含むＰＢＳ中のＭ２抗ＦＬＡＧｍＡｂ（１：６００）を使用し、続いて同じ緩衝液中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（１：２００）で標識した二次抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベーションして行った。ＦＬＡＧ標識したシアリルトランスフェラーゼを発現する細胞は、赤色に標識した。洗浄後、細胞はモウイオール（Ｍｏｗｉｏｌ）に包埋し、暗所中で−２０℃で保存した。共焦点顕微鏡法はオリンパス又はライカの機器により実施された。共焦点の像はメタモルフ・イメージング・システムで処理された。ボリュームは最初２４ビットのトルーカラー・イメージ（ＴｒｕｅＣｏｌｏｒ Ｉｍａｇｅｓ）として写し、そしてアドベ・フォトショップへＲＧＢ ＴＩＦＦ又はＪＰＧファイルとして移動した。このような条件下では、トランスフェクションされていないＣＨＯ−Ｋ１細胞は前記のいずれの試薬によっても標識されない。
＜Ｂ−ＣＨＯ細胞中の合成ＳＴ６ｓの酵素活性＞
（Ｂ１ ｈＳＴ６ＧａｌＩの最適化された触媒ドメインの活性）
ｈＳＴ６ＧａｌＩＣＤは、プレプロトリプシノーゲンのシグナルペプチドを使用して、シグマ製のｐＦＬＡＧ−サイトメガロウイスル・ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１）にクローニングした。この構築物及びこれらのプラスミドは以前に、Ｌｅｇａｉｇｎｅｕｒら（２００１）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで性状解析が行われ、細胞培地に放出される期待サイズの酵素タンパク質を生産することが示された。この可溶性ＣＤは、種々の程度の分枝を有する既知の外来性糖タンパク質アクセプターに対して同様に活性を示すことが見出された。
ｈＳＴ６ＧａｌＩの最少ＣＤ可溶性形体を創出するために、次の間の配列によりコードされるＰＣＲ断片が創出された：
５’（５’−ＴＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧ−３’）、これはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを導入しており、
３’（５’−ＣＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴ−３’）、これはＢａｍＨＩ部位をコードする。
次いで、この断片はＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＦＬＡｇ−ＣＭＶ１哺乳動物発現ベクターに挿入され、そして更なる構築のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳベクター（ストラタジェン）へ、サブクローニングされた。
ＦＬＡＧエピトープで標識した最小のＳＴ６ＧａｌＩＣＤ（配列番号４４）（図１８）はＣＨＯ細胞で高いレベルで発現される（図１８Ｂ、Ｄ）。その活性及び局在性について、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体及びＦＩＴＣ−ＳＮＡで二重標識することで、性状解析が行われた。興味深いことに、変異ＦＬＡＧ−ＣＤは、図１８Ｃ及びＤに示すように、細胞表面アクセプターのシアル化で高い効率を示した。
（Ｂ２−ＳＴ８／ＣＤの機能発現）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞はｈＳＴ８ＳｉａＩＶ（１〜６７）／ＣＤ（配列番号１７３）、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ（１〜７９）／ＣＤ（配列番号１７１）のキメラ物でトランジエントにトランスフェクションされた。これらの活性及び局在性について、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体及びＦＩＴＣ−ＳＮＡで二重標識することで、図１９に示すように性状解析が行われた。
ｈＳＴ８ＳｉａＩＶ（１〜６７）／ＣＤ（配列番号１７４）及びｈＳＴ８ＳｉａＩＩ（１〜７９）／ＣＤ（配列番号１７２）の両方のキメラは共に、ＳＮＡレクチンが強い細胞表面標識を示すことから（図１９Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦ）、内在性細胞アクセプターに対して活性を持つことが分かり、このことはＣＤが触媒ドメインと融合しているＮ末端部分の由来とは独立に活性を有することを示す。α２、６−シアリルトランスフェラーゼ活性は両方のキメラで維持されており、このことはキメラ酵素では、最小ＣＤに含まれている情報はアクセプター認識及び転移効率にとって必要かつ十分であることを示す。
（Ｂ３−ＳＴ３／ＣＤ及びハイブリッドＳＴ３−ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ／ＣＤの機能発現）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ＣＤ（配列番号１６７）、及びＳＴ３１−２８−ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ３７−７４／ＣＤ（配列番号１７５）のキメラ構築物によりトランジエントにトランスフェクションされた。図１９に示すように、これらの活性及び局在性について、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体及びＦＩＴＣ−ＳＮＡで二重標識することで、性状解析が行われた。
再度、両方のキメラ共に、ＳＮＡ結合が強い細胞表面標識を示すので（図１９Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦ）、内在性細胞アクセプターに対して活性を持つことが分かった。このことはＣＤが付加したＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲの由来とは独立に活性を有することを示す。α２、６−シアリルトランスフェラーゼ活性は両方のキメラで維持されているので、最小ＣＤに含まれている情報は完全な転移効率にとって必要かつ十分であることを示すと結論することができる。
従って、ＣＤの上流にＳＴ３／８配列を融合することはＳＴ６触媒活性の発現を変化させない。ラット及びヒトのＳＴ３ＧａｌＩＩＩ及び、より一般的にはげっ歯類及び哺乳動物のＳＴ３ＧａｌｌＩＩＩはそのＮ末端（ＣＴ＋ＴＭＤ＋膜近傍ＳＲ）部分が同一なので、このペプチドの任意の部分を非ヒトのヘテロのものと置き換えてもＳＴ６触媒活性には影響しないように見える。更に、ＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲをＯ−グリコシル化酵素、例えばＳＴＧａｌＮＡｃＩ、から選択されるヘテロ部分と置き換えても、細胞内アクセプターの認識又は酵素活性に影響しない。
（Ｂ４−ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−７４／ＣＤ及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃ２５８／ＣＤの機能発現）
同様のアプローチはｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ（１−７４）／ＣＤ（配列番号１６２）及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ−２５８／ＣＤ（配列番号１６６）酵素の発現と活性を評価するために使用された。両方のキメラトランスフェラーゼは活性を有する：ＳＮＡによる結合は同様の強い細胞表面のシアル化を示し、そしてＦＬＡＧ標識は同一のゴルジ内の局在性を示した（図２１Ｇ、Ｈ及びＩ）。
従って、キメラＳＴ６Ｇａｌ触媒活性の機能発現及び細胞内局在に影響することなく、ＳＲ領域の長さを広範に変化させ、そして２５８残基まで伸長させることができるということが、結論できる。更に、このことは、ヘテロのＮ末端膜アンカーの長さは、新たにデザインされたシアリルトランスフェラーゼの生物学的活性を有する立体構造に影響しないということを確認する。
前記の例に基づき、本発明に記載された方法はＣＤ活性を支配するＳＲ領域の調整制御を消失させることができると、言うことができる。その結果、Ｎ−又はＯ−グリコシル化経路のグリコシルトランスフェラーゼ（シアリルトランスフェラーゼ）に存在するＣＴ＋ＴＭＤ＋ＳＲの任意の可能な組み合わせを、関連するＣＤを通して必要とするトランスフェラーゼ活性を宿主細胞に付与するために、選択できる。更にまた、本発明に記載された方法は、新たに合成された糖タンパク質の細胞表面への移動が起きる細胞内コンパートメントにおいて必要とされる活性を標的にすることができる。この発見は、本発明に記載されているように、細胞（酵母からヒトまで）において治療用に興味のあるシアル化されたタンパク質を適切に分別し分泌するためのエンジニアリングで、決定的な重要性を有する。
《実施例５：ハイブリッド合成ドメインの構築：ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、及びｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤへの融合》
最初にｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（１〜８アミノ酸残基；配列番号６６）のＣＴ、次いでｈＳＴ８ＳｉａＩＩ（７〜２３アミノ酸残基；配列番号１２０）のＴＭＤそして最後にｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ（アミノ酸３６〜７４；配列番号１３０）のＳＲを含むハイブリッドＮ末端領域（配列番号１８０）が構築された。ＦＬＡＧエピトープ（太字、下線）は開始コドンＡＴＧ及びｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ配列の二番目のコドン（ＧＧＡ）の間に付加された：
５’−ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡ−３’
このハイブリッドの全長は、２１６個のヌクレオチド（配列番号１７９）に対応する７２個のアミノ酸（配列番号１８０）である。ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ配列を使用した、前記ハイブリッドＮ末端領域（１〜２１６ヌクレオチド）に対応する８個のセンス・オリゴヌクレオチド及び７個のアンチセンス・オリゴヌクレオチドがデザインされ合成された（ユーロジェンテック）。
リン酸化及びマッチング反応は前記のように行われた。
＜合成構築物のＰＣＲ増幅＞
合成再構成ステップの後で、産物をｐｃＤＮＡ３．１ベクター中に連結するために、再構成されたＤＮＡ断片の各末端に希望する制限酵素サイトを付与するための特異的プライマーを使用して高いフィデリティのＰＣＲにより、産物を増幅した。ＡｆｌＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素サイトはそれぞれ５’及び３’の最末端に導入した。
次のプライマーが指定された：
５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ３：５’−ＧＡＧＣＣＣＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧ−３’、及び
３’ＳＴ６−ＢａｍＨＩｎ３：５’−ＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴ−３’
ＰＣＲはＰＣＲ装置（Ｉ−サイクラー、バイオラッド）で５μＬの合成断片を使用し、次のものを含む溶液で行われた：最終容積５０μＬ中の１Ｘプルーフスタート製造業者緩衝液及び１Ｘ製造業者Ｑ溶液、１．５ｍＭのＭｇ２＋、３００μＭの各ｄＮＴＰ（シグマ・アルドリッチ）、１μＭ前向きプライマーＡｆｌＩＩ−ＳＴ３、１μＭ逆向きプライマーＳＴ６−ＢａｍＨＩｎ３、２．５単位のプルーフスタートＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）。使用したサーモサイクル・プロフィルは：９５℃で５分間、次いで３０秒、９４℃で４０サイクル、５５℃で３０秒及び７２℃で１分。
増幅したＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。期待サイズの断片（図２２レーン１）に対応する２４０ｂｐのヌクレオチド配列を増幅した。ＰＣＲ産物はゲル抽出キット（キアゲン）を使用し製造業者の使用説明書に従って精製した。
＜ＰＣＲ産物の定量＞
全てのＰＣＲ産物は一緒にして濃縮した。２容積のエタノール及び０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、をＰＣＲ産物に添加した。混合物は３０分間−２０℃でインキュベーションし、２０分、１００００ｇにて４℃で遠心分離した。ペレットは１００μＬの７０％エタノールで洗浄し、再度１０分、１００００ｇにて４℃で遠心分離した。次いで、上清は除去し、ペレットは乾燥し、３０μＬの再蒸留水に再度懸濁した。ＤＮＡ試料は使用するまで−２０℃で保存した。
３マイクロリッターの濃縮断片はその量を見積もるために２％アガロースゲルに載せた（図２２レーン３）。
＜発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）への触媒ドメインのライゲーション＞
１−消化及び精製
ｈＳＴ６ＧａｌＩ（配列番号４３）の触媒ドメインＣＤのヌクレオチド配列はＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素サイトでｐｃＤＮＡ３．１ベクターに連結した。
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター及びＣＤの両方は最初にＢａｍＨＩ制限酵素で消化した：
５００ｎｇのＣＤは、最終容積２０mＬ中の５単位ＢａｍＨＩ（プロメガ）、０．１mｇ．mＬ−１の牛血清アルブミン及び１Ｘ緩衝液Ｅ（プロメガ）で消化した。
１mｇのｐｃＤＮＡ３．１ベクターは最終容積２０mＬ中の１０単位ＢａｍＨＩ（プロメガ）、０．１mｇ．mＬ−１の牛血清アルブミン及び１Ｘ緩衝液Ｅ（プロメガ）で消化した。
消化は６０分間３７℃で行い、そしてインキュベーションは最終的には１５分間６５℃で失活させた。消化産物はＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。
次いで、消化産物は制限酵素ＸｂａＩ（プロメガ）で、製造業者の使用説明書に従って消化した：最終容積５０mＬ中で、ＤＮＡ量に従った適切な単位数の酵素（ＣＤ及びｐｃＤＮＡ３．１それぞれについて５及び６）、０．１mｇ．mＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液Ｄ（プロメガ）を使用した。消化は３７℃で６０分間行った。消化産物はＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。
２−ライゲーション
ライゲーション条件は前記の式に従って算出した。挿入物ＣＤのサイズは約９６０ｂｐ、ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサイズは５４２８ｂｐ、使用したベクター量は１００ｎｇ、及び最後に挿入物／ベクターのモル比率は３／１である。
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクターの構築は、最終容積２０mＬ中の５３ｎｇの二重に消化されたＣＤ、１００ｎｇの二重に消化されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター、６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（プロメガ）及び１Ｘライゲーション緩衝液を使用して行われた。混合物は一晩１５℃でインキュベーションし、反応は１０分間、７０℃で失活させた。
３−クローニング
＜コンピテント細胞の化学的形質転換＞
ワンショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（インビトロジェン）は製造業者の使用説明書に従い組換えベクターで形質転換した。５マイクロリットルのライゲーション産物は５０μＬのＴＯＰ１０細胞に添加し、丁寧にタッピングして（軽くたたいて）混合した。混合物は氷上で３０分間インキュベーションし、次いで熱ショックは４２℃の水浴にて正確に３０秒間行い、２分間氷上に置いた。２５０マイクロリットルの予め温めたＳ．Ｏ．Ｃ培地（インビトロジェン）は、形質転換反応に添加し、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。形質転換反応物は５０μｇ．ｍｌ−１のアンピシリンを含むＬＢアガープレート（組成は前記のとおり）上に広げた。プレートは３７℃で一晩インキュベーションした。
＜増幅＞
翌日の終わりに、単一コロニーを拾い、５０μｇ．ｍｌ−１のアンピシリンを含む３ ｍｌのＬＢ培養液（組成は前記のとおり）で、一晩３７℃で、２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。
＜プラスミドの少量調製＞
組換えベクターは１．５ｍＬ量の以前の培養物からキアゲン製のＱＩＡプレップ・スピン・ミニプレップ・キットを使用して製造業者の使用説明書に従って精製した。２４個の少量調製物について、挿入物が存在するかどうかスクリーニングした。
５マイクロリットルの各２４少量調製物は、挿入物の存在を検証するために、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を使用して二重に消化した。
最初の消化のための溶液は、最終容積１０mＬ中に１２単位のＸｂａＩ（プロメガ）、０．１mｇ．mＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液Ｄ（プロメガ）を含んでいた。消化は２時間、３７℃で行われた。二番目に、試料は最終容積２０mＬ中の２０単位ＢａｍＨＩ（プロメガ）及び１Ｘ緩衝液Ｅ（プロメガ）を使用して消化した。反応は一晩、３７℃で行った。消化産物は、ＣＤの存在を検出するために１．５％アガロースゲルに載せた。ＣＤの期待サイズ（９６０ｂｐ）に対応した、約１０００ｂｐの挿入物が検出された（図２３）。
１個の陽性クローンが、次の構築のステップのために選択された。
＜Ｎ末端領域のｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクターへのライゲーション＞
１−消化及び精製
Ｎ末端領域（配列番号１７９）のヌクレオチド配列はＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位で、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクターに連結された。Ｎ末端断片及びｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクターは両方共に、最初にＢａｍＨＩ制限酵素で消化した：
３００ｎｇのＮ末端断片は最終容積２０mＬ中の５単位のＢａｍＨＩ（プロメガ）、０．１mｇ．mＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘの緩衝液Ｅ（プロメガ）で消化した。
２mｇのｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクターは、最終容積２０mＬ中の２０単位のＢａｍＨＩ（プロメガ）、０．１mｇ．mＬ−１のＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液Ｅ（プロメガ）で消化した。
消化は１００分間、３７℃で行い、そしてインキュベーションは最終的には１５分間、６５℃で失活させた。消化産物はＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。
次いで、消化産物は制限酵素ＡｆｌＩＩ（ニューイングランド、バイオラボ）で、製造業者の使用説明書に従って消化した：最終容積５０mＬ中で、ＤＮＡ量に従った適切な単位数の酵素（Ｎ末端断片及びｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクターそれぞれについて１０及び２０）、１ＸＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液２（プロメガ）を使用した。消化は３７℃で６０分間行った。消化は６０分間、３７℃で行い、そしてインキュベーションは最終的には２０分間、６５℃で失活させた。消化産物はＰＣＲ精製キット（キアゲン）を使用して精製した。
２−ライゲーション
ライゲーション条件は前記の式に従って算出した。挿入物Ｎ末端断片のサイズは２４０ｂｐ、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤのサイズは６３８８ｂｐ、使用したベクター量は１００ｎｇ、及び最後に挿入物／ベクターのモル比率は３／１である。
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎ末端断片／ＣＤ組換えベクターの構築は、最終容積２０mＬ中の５ｎｇの消化されたＮ末端断片、１００ｎｇの消化されたｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ組換えベクター、６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素（プロメガ）及び１Ｘライゲーション緩衝液を使用して行われた。混合物は一晩１５℃でインキュベーションし、反応は１０分間、７０℃で失活させた。
３−クローニング
＜コンピテント細胞の化学的形質転換＞
ワンショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（インビトロジェン）は製造業者の使用説明書に従い、前記のように組換えベクターで形質転換した。
＜増幅＞
翌日の終わりに、単一コロニーを拾い、５０μｇ．ｍｌ−１のアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培養液（組成は前記のとおり）で、一晩３７℃で、２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。
＜プラスミドの少量調製＞
組換えベクターは１．５ｍＬ量の以前の培養物からキアゲン製のＱＩＡプレップ・スピン・ミニプレップ・キットを使用して製造業者の使用説明書に従って精製した。２４個の少量調製物について、挿入物が存在するかどうかスクリーニングした。
５マイクロリットルの各２４少量調製物は、挿入物（Ｎ末端断片＋ＣＤ；配列番号１８１）の存在を検証するために、ＸｂａＩ及びＡｆｌＩＩ制限酵素を使用して二重に消化した。
消化溶液は、最終容積２０mＬ中に２０単位のＸｂａＩ（バイオラボ）、２０単位のＡｆｌＩＩ（バイオラボ）、１ＸＢＳＡ及び１Ｘ緩衝液２（バイオラボ）を含んでいた。消化は２時間３０分、３７℃で行った。消化産物は、Ｎ末端断片及びＣＤの両方の存在を検出するために１．５％アガロースゲルに載せた。挿入物の期待サイズに対応した、約１２００ｂｐの挿入物が検出された（図２４ａ）。
ＰＣＲは、最終的に５つの少量調製試料で挿入物ＤＮＡ（ＣＤ：配列番号１８１に続くＮ末端断片）の存在を検証するために行われた。ＰＣＲは、ＰＣＲ装置（Ｉ−サイクラー、バイオラッド）により、１μＬの各少量調製試料とともに、次の組成を含む溶液中で行った：最終容積５０μＬ中の１Ｘプルーフスタート製造業者緩衝液及び１Ｘ製造業者Ｑ溶液、３ｍＭのＭｇ２＋、３００μＭの各ｄＮＴＰ（シグマ・アルドリッチ）、１μＭ前向きプライマーＡｆｌＩＩ−ＳＴ３、１μＭ逆向きプライマーΔ４−ＸｂａＩ、２．５単位のプルーフスタートＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）。
反応に含まれるオリゴヌクレオチドは次の通りである：
５’ＡｆｌＩＩ−ＳＴ３：５’−ＧＡＧＣＣＣＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧ−３’、及び
３’Δ４−ＸｂａＩ：５‘−ＴＡＡＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＧＧＡＡＧＣ−３’
使用したサーモサイクル・プロフィルは次の通りであった：９５℃で５分間、次いで１分、９４℃で４０サイクル、５７℃で１分及び７２℃で１分３０秒。増幅したＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上の電気泳動で分析した：１２００ｂｐヌクレオチド配列を挿入物の期待サイズに対応する各少量調製試料について増幅した（図２４ｂ）。
＜配列決定＞
クローニングのステップは、両鎖ＤＮＡの配列決定をＧＥＮＯＭＥエクスプレス（メイラン、フランス）によりベクター内に存在するユニバーサル・プライマーを使用して行うことで、検証された：Ｔ７プロモータ及びＢＧＨリバース。
得られたヌクレオチド配列は期待配列と並べ、そして配列には１００％の一致が見られた。また、推定アミノ酸配列もキメラの期待配列番号１８１と並べ、それは１００％の一致を示した。
＜少量調製＞
ＤＮＡ挿入物配列の検証の後に、大量の構築物を取得するために組換えプラスミドを１００ｍＬ培養で増幅した。前記の３ｍＬのＬＢの培養用培地の４００マイクロリットルを５０μｇ．ｍｌ−１のアンピシリンを含む、１００ｍＬのＬＢ培地に移植し、一晩３７℃で２５０ｒｐｍにて振盪しながらインキュベーションした。細菌細胞は回収し、組換えベクターをキアゲン・プラスミド・ミディ・キット（キアゲン）を使用して製造業者の使用説明書に従って精製した。収率は、ＤＮＡ構築物の定量をＵＶ分光光度計で行うことで決定した。構築物は−２０℃で貯蔵した。
＜細胞培養：ＣＨＯ細胞でのキメラ酵素ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩ／ｈＳＴ８ＳｉａＩＩ／ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ／ＣＤ（配列番号１８２）の発現＞
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％ＦＢＳ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンで補充したＤＭＥＭで、３７℃で、５％ＣＯ２にて型どおり培養した。トランスフェクションを行う前日に、ウエルあたり３つのガラス片を含む６穴に、１０００００細胞／ｍＬの密度で細胞を播種した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｆｕ遺伝子６トランスフェクション試薬（ロシュ）を使用して３：１の比率でトランジエントにトランスフェクションを行った。
培養１日後に、細胞は１％パラホルムアルデヒドにより１５分間室温（ＲＴ）で固定した。細胞はＰＢＳで３回洗浄し３０分間ＲＴで１％ ＢＳＡによりブロックし、次いで１０μｇ／ｍＬのＳＮＡ−ＦＩＴＣ（ベクター・ラボラトリー）とともに、１時間４℃でインキュベーションした。細胞は続いてＰＢＳで３回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドにより２０分間ＲＴで固定し、更に、ＰＢＳで洗浄し、そして０．０５ＭＮＨ４Ｃｌとともに１０分間ＲＴでインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、細胞は０．２５％トライトンＸ−１００により５分間ＲＴで透過処理（peamialised）し、そして不活化した１０％羊血清及び１％ＢＳＡにより３０分間ＲＴでブロックした。細胞は、不活化した５％羊血清及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（シグマ）と１時間ＲＴでインキュベーションした。細胞はＰＢＳで３回洗浄し、不活化した５％羊血清及び０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の５．７μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４−結合二次羊抗マウス抗体（モレキュラー・プローブ）とともに４５分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、細胞はモウイオール（Ｍｏｗｉｏｌ）に包埋し、オリンパスの顕微鏡で分析した（図２５）。
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Claims (22)

  1. キメラ膜グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列を作製するための方法であって、対応する天然のグリコシルトランスフェラーゼのアクセプター基質に対するグリコシル化活性と比較した場合に、前記遺伝子配列で形質転換された細胞中で最適化されたグリコシル化活性を示す遺伝子配列であり、前記方法は：
    −天然の全長グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン（ＣＤ）のＣ末端最小断片をコードする第一の核酸であって、
    前記ＣＤのＮ末端の端の最初のアミノ酸から伸長する隣接するアミノ酸１つ又はいくつかをコードするヌクレオチドを除去すること、及びｎを前記で定義した除去される隣接するアミノ酸の数を示す場合、前記で定義した隣接するアミノ酸少なくともｎ＋１を削除して得られる断片が実質的なトランスフェラーゼ活性を示さないように、前記Ｃ末端最小ＣＤ断片をコードするヌクレオチドが選択されることによって得られる、前記第一の核酸の、
    −細胞内コンパートメントにおけるグリコシルトランスフェラーゼの固定を特定する膜貫通ペプチド鎖をコードする可変配列である第二の核酸であって、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）から上流に位置する細胞質尾部（ＣＴ）領域をそのＮ末端領域に含み、ステム領域（ＳＲ）の上流に位置するか又はＳＲの隣接するアミノ酸少なくとも３個の上流に位置する膜貫通ドメインを含み、前記触媒ドメインに、場合によりリンカー又は前記の天然のＣＤをコードするヌクレオチド配列には存在しない制限酵素サイトによりコードされるアミノ酸少なくとも２個の結合ペプチドを介して、結合している前記ＳＲ又はその一部を含む前記第二の核酸、
    への融合を含み、
    ただし、前記ＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲペプチドの少なくとも１つが、前記で定義した最適のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するＣＤ断片が由来する天然のグリコシルトランスフェラーゼに存在する天然のペプチドのカウンターパートの一次構造とは、異なるものであり、
    前記融合は、第一の核酸が第二の核酸の下流に存在し、ＣＤがＣ末端側の半分であるタンパク質産物を提供する手段で実施される、前記方法。
  2. 第一又は第二の核酸が、真核生物、好ましくは哺乳動物又はヒト起源のグリコシルトランスフェラーゼにおける、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、及びＳＲ領域を、それぞれコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とし、前記グリコシルトランスフェラーゼが：
    ・真核細胞におけるタンパク質のＯ−グリコシル化、例えばＮ−アセチルガラクトサミニル−、Ｎ−アセチルグルコサミニル−、フコシル−、ガラクトシル−、又はシアリルトランスフェラーゼ、
    ・真核細胞におけるタンパク質のＮ−グリコシル化、例えばグルコサミニル−、ガラクトシル−、フコシル−、又はシアリルトランスフェラーゼ、
    ・脂質のグリコシル化、例えばグルコシル−、Ｎ−アセチルガラクトサミニル−、グルコサミニル−、フコシル−、ガラクトシル−、又はシアリルトランスフェラーゼ、
    に関与するものである、請求項1に記載の前記方法。
  3. 第一又は第二の核酸が、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、又はシアリルトランスフェラーゼにおける、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、及びＳＲ領域を、それぞれコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 第一又は第二の核酸が、シアリルトランスフェラーゼにおける、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、及びＳＲ領域を、それぞれコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 第一又は第二の核酸が、α２、６−シアリルトランスフェラーゼ、α２、３−シアリルトランスフェラーゼ、又はα２、８−シアリルトランスフェラーゼにおける、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、及びＳＲ領域をそれぞれコードするヌクレオチド配列に由来するということを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 第一の核酸及び第二の核酸が、
    −＊それぞれ配列番号２、及び配列番号４で表され、それぞれ配列番号１、及び配列番号３のヌクレオチド配列でコードされる、ヒトβ１、４−ガラクトシドα２、６−シアリルトランスフェラーゼＩ及びＩＩ（ｈＳＴ６ＧａｌＩ、及びｈＳＴ６ＧａｌＩＩ）又は
    ＊それぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１６で表され、それぞれ配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５のヌクレオチド配列でコードされる、ヒトＮ−アセチルガラクトサミニド−α２、６−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ〜ＶＩ）、
    の中から選択されるα２、６−シアリルトランスフェラーゼ：
    −それぞれ配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８で表され、それぞれ配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７のヌクレオチド配列でコードされる、ヒトガラクトシド−α２、３−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ｈＳＴ３ＧａｌＩ〜ＶＩ）、又はラットガラクトシド−α２、３−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ラットＳＴ３ＧａｌＩ〜ＶＩ）、例えば、配列番号３０で表され、配列番号２９のヌクレオチド配列でコードされるｒＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、若しくは他の動物由来の任意のＳＴ（但し、ヒト酵素と少なくとも８５％の相同性を共有する）、
    の中から選択されるα２、３−シアリルトランスフェラーゼ：
    −それぞれ配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号４２で表され、それぞれ配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、及び配列番号４１のヌクレオチド配列でコードされている、ヒトシアル酸−α２、８−シアリルトランスフェラーゼＩ〜ＶＩ（ｈＳＴ８ＳｉａＩ〜ＶＩ）の中から選択されるα２、８−シアリルトランスフェラーゼ、
    において、ＣＤドメイン、又はＣＴ、ＴＭＤ、及びＳＲ領域を、それぞれコードするヌクレオチド配列に由来することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 第一の核酸に含まれるＣＤドメインをコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号１において、５’末端が部位２６８〜３３０に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１２１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２においてＮ末端が部位９０〜１１０に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４０６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３において、５’末端が部位３０７〜３６９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１５８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号４においてＮ末端が部位１０３〜１２３に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５２９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号５において、５’末端が部位８１４〜８７６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１８００に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩのＣＤドメインに対応する、配列番号６においてＮ末端が部位２７２〜２９２に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６００に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号７において、５’末端が部位１７２〜２３４に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号８においてＮ末端が部位５８〜７８に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号９において、５’末端が部位７３〜１３５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９１５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号１０においてＮ末端が部位２５〜４５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３０５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１１において、５’末端が部位６１〜１２３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９０６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩＶのＣＤドメインに対応する、配列番号１２においてＮ末端が部位２１〜４１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３０２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１３において、５’末端が部位１２１〜１８３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１００８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＶのＣＤドメインに対応する、配列番号１４においてＮ末端が部位４１〜６１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３３６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１５において、５’末端が部位１５４〜２１６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９９９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＶＩのＣＤドメインに対応する、配列番号１６においてＮ末端が部位５２〜７２に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３３３に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１７において、５’末端が部位１４５〜２０７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０２０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインに対応する、配列番号１８においてＮ末端が部位４９〜６９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３４０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１９において、５’末端が部位１７５〜２３７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０５０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２０においてＮ末端が部位５９〜７９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２１において、５’末端が部位１９９〜２６１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１３３２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２２においてＮ末端が部位６７〜８７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４４４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２３において、５’末端が部位７９〜１４１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＣＤドメインに対応する、配列番号２４においてＮ末端が部位２７〜４７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３２９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２５において、５’末端が部位１３６〜１９８に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０８６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶのＣＤドメインに対応する、配列番号２６においてＮ末端が部位４６〜６６に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３６２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２７において、５’末端が部位７３〜１３５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９９３に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶＩのＣＤドメインに対応する、配列番号２８においてＮ末端が部位２５〜４５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３３１に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２９において、５’末端が部位１０３〜１６５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３０においてＮ末端が部位３５〜５５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３１において、５’末端が部位１３３〜１９５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０６８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３２においてＮ末端が部位４５〜６５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３３において、５’末端が部位１９０〜２５２に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３４においてＮ末端が部位６４〜８４に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３５において、５’末端が部位２０５〜２６７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１４０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＣＤドメインに対応する、配列番号３６においてＮ末端が部位６９〜８９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３８０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３７において、５’末端が部位１４５〜２０７に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０７７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＤドメインに対応する、配列番号３８においてＮ末端が部位４９〜６９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３９において、５’末端が部位２１１〜２７３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１２８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶのＣＤドメインに対応する、配列番号４０においてＮ末端が部位７１〜９１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３７６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号４１において、５’末端が部位２７７〜３３９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１１９４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＣＤドメインに対応する、配列番号４２においてＮ末端が部位９３〜１１３に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３９８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    で構成されるか、又は含む配列の中から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 第一の核酸が、配列番号１の部位２６８および１２１８に位置するヌクレオチドにより区切られた配列に対応する、配列番号４３のヌクレオチド配列であり、前記の配列番号４３のヌクレオチド配列は、配列番号２の部位９０〜４０６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインのＣ末端最小断片に対応する配列番号４４のポリペプチド配列をコードすることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
    −第二の核酸に含まれるＣＴ領域をコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号４５のヌクレオチド配列（これは配列番号１の部位１及び２７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４５のヌクレオチド配列は配列番号２の部位１〜９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＴ領域に対応する配列番号４６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号４７のヌクレオチド配列（これは配列番号３の部位１及び３０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４７のヌクレオチド配列は配列番号４の部位１〜１０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号４８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号４９のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位１及び４２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４９のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１〜１４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ領域に対応する配列番号５０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５１のヌクレオチド配列（これは配列番号７の部位１及び２１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５１のヌクレオチド配列は配列番号８の部位１〜７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号５２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５３のヌクレオチド配列（これは配列番号９の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５３のヌクレオチド配列は配列番号１０の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号５４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５５のヌクレオチド配列（これは配列番号１１の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５５のヌクレオチド配列は配列番号１２の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号５６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５７のヌクレオチド配列（これは配列番号１３の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５７のヌクレオチド配列は配列番号１４の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶのＣＴ領域に対応する配列番号５８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５９のヌクレオチド配列（これは配列番号１５の部位１及び１２９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号５９のヌクレオチド配列は配列番号１６の部位１〜４３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶＩのＣＴ領域に対応する配列番号６０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号６１のヌクレオチド配列（これは配列番号１７の部位１及び３９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６１のヌクレオチド配列は配列番号１８の部位１〜１３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩのＣＴ領域に対応する配列番号６２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号６３のヌクレオチド配列（これは配列番号１９の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６３のヌクレオチド配列は配列番号２０の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号６４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号６５のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６５のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号６６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号６７のヌクレオチド配列（これは配列番号２３の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６７のヌクレオチド配列は配列番号２４の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号６８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号６９のヌクレオチド配列（これは配列番号２５の部位１及び１５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６９のヌクレオチド配列は配列番号２６の部位１〜５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶのＣＴ領域に対応する配列番号７０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７１のヌクレオチド配列（これは配列番号２７の部位１及び１２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７１のヌクレオチド配列は配列番号２８の部位１〜４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶＩのＣＴ領域に対応する配列番号７２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７３のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７３のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７５のヌクレオチド配列（これは配列番号３１の部位１及び８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７５のヌクレオチド配列は配列番号３２の部位１〜２９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩのＣＴ領域に対応する配列番号７６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７７のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７７のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７９のヌクレオチド配列（これは配列番号３５の部位１及び２７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７９のヌクレオチド配列は配列番号３６の部位１〜９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号８０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号８１のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位１及び２１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８１のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位１〜７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号８２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号８３のヌクレオチド配列（これは配列番号３９の部位１及び５１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８３のヌクレオチド配列は配列番号４０の部位１〜１７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶのＣＴ領域に対応する配列番号８４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号８５のヌクレオチド配列（これは配列番号４１の部位１及び９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８５のヌクレオチド配列は配列番号４２の部位１〜３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＣＴ領域に対応する配列番号８６のポリペプチド配列をコードする）、
    の中から選択され、
    −第二の核酸に含まれるＴＭＤ領域をコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号８７のヌクレオチド配列（これは配列番号１の部位２８及び７８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８７のヌクレオチド配列は配列番号２の部位１０〜２６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号８８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号８９のヌクレオチド配列（これは配列番号３の部位３１及び９０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８９のヌクレオチド配列は配列番号４の部位１１〜３０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号９１のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位４３及び１０５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９１のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１５〜３５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号９３のヌクレオチド配列（これは配列番号７の部位２２及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９１のヌクレオチド配列は配列番号８の部位８〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号９５のヌクレオチド配列（これは配列番号９の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９５のヌクレオチド配列は配列番号１０の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号９７のヌクレオチド配列（これは配列番号１１の部位１９及び８１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９７のヌクレオチド配列は配列番号１２の部位７〜２７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号９８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号９９のヌクレオチド配列（これは配列番号１３の部位２５及び８７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９９のヌクレオチド配列は配列番号１４の部位９〜２９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１００のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１０１のヌクレオチド配列（これは配列番号１５の部位１３０及び１１７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０１のヌクレオチド配列は配列番号１６の部位４４〜５９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１０３のヌクレオチド配列（これは配列番号１７の部位４０及び１０２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０３のヌクレオチド配列は配列番号１８の部位１４〜３４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１０５のヌクレオチド配列（これは配列番号１９の部位１９及び８１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０５のヌクレオチド配列は配列番号２０の部位７〜２７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１０７のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０７のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１０９のヌクレオチド配列（これは配列番号２３の部位２５及び７８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０９のヌクレオチド配列は配列番号２４の部位９〜２６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１１のヌクレオチド配列（これは配列番号２５の部位１６及び７８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１１のヌクレオチド配列は配列番号２６の部位６〜２６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１３のヌクレオチド配列（これは配列番号２７の部位１３及び７５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１３のヌクレオチド配列は配列番号２８の部位５〜２５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＶｌのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１５のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１５のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１７のヌクレオチド配列（これは配列番号３１の部位８８及び１４４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１７のヌクレオチド配列は配列番号３２の部位３０〜４８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１９のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１９及び６９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１９のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位７〜２３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１２１のヌクレオチド配列（これは配列番号３５の部位２８及び９９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２１のヌクレオチド配列は配列番号３６の部位１０〜３３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１２３のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位２２及び６０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２３のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位８〜２０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１２５のヌクレオチド配列（これは配列番号３９の部位５２及び１１４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２５のヌクレオチド配列は配列番号４０の部位１８〜３８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１２７のヌクレオチド配列（これは配列番号４１の部位１０及び７２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２７のヌクレオチド配列は配列番号４２の部位４〜２４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２８のポリペプチド配列をコードする）、
    の中から選択され、
    −第二の核酸に含まれるＳＲ領域をコードするヌクレオチド配列、又はそれの少なくとも３個のアミノ酸断片をコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号１において、５’末端が部位７９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２６７〜３２７に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２においてＮ末端が部位２７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位８９〜１０９に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３において、５’末端が部位９１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位３０６〜３３６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号４においてＮ末端が部位３１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位１０２〜１１２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号５において、５’末端が部位１０６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位８１３〜８７３に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域に対応する、配列番号６においてＮ末端が部位３６に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位２７１〜２９１に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号７において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１７１〜２３１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩのＳＲ領域に対応る、配列番号８においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５７〜７７に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号９において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０２〜１３２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号１０においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３４〜４４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１１において、５’末端が部位８２に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位９０〜１２０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＶのＳＲ領域に対応する、配列番号１２においてＮ末端が部位２８に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３０〜４０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１３において、５’末端が部位８８に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１２０〜１８０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶのＳＲ領域に対応する、配列番号１４においてＮ末端が部位３０に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４０〜６０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１５において、５’末端が部位１７８に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１８３に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＶＩのＳＲ領域に対応しする、配列番号１６においてＮ末端が部位６０に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６１に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１７において、５’末端が部位１０３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１４４〜２０４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩのＳＲ領域に対応する、配列番号１８においてＮ末端が部位３５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４８〜６８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号１９において、５’末端が部位８２に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１７４〜２３４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２０においてＮ末端が部位２８に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５８〜７８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２１において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１９８〜２５８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２２においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６６〜８６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２３において、５’末端が部位７９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０８〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＶのＳＲ領域に対応する、配列番号２４においてＮ末端が部位２７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３６〜４６に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２５において、５’末端が部位７９に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１３５〜１９５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶのＳＲ領域に対応する、配列番号２６においてＮ末端が部位２７に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４５〜６５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２７において、５’末端が部位７６に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０２〜１３２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＶＩのＳＲ領域に対応する、配列番号２８においてＮ末端が部位２６に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３４〜４４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号２９において、５’末端が部位８５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１０５〜１６５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３０においてＮ末端が部位２９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位３５〜５５に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３１において、５’末端が部位１４５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１６２〜１９２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３２においてＮ末端が部位４９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位５４〜６４に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３３において、５’末端が部位７０に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１８９〜２４９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３４においてＮ末端が部位２４に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６３〜８３に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３５において、５’末端が部位１００に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２０４〜２６４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩＩのＳＲ領域に対応する、配列番号３６において、Ｎ末端が部位３４に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位６８〜８８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３７において、５’末端が部位６１に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位１４４〜２０４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＳＲ領域に対応する、配列番号３８においてＮ末端が部位２１に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位４８〜６８に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号３９において、５’末端が部位１１５に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２１０〜２７０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶのＳＲ領域に対応する、配列番号４０においてＮ末端が部位３９に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位７０〜９０に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊配列番号４１において、５’末端が部位７３に位置するヌクレオチド及び３’末端が部位２７６〜３３６に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は、ｈＳＴ８ＳｉａＶＩのＳＲ領域に対応する、配列番号４２においてＮ末端が部位２５に位置するアミノ酸及びＣ末端が部位９２〜１１２に位置するアミノ酸により区切られたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
    ＊又は、前記ＳＲ領域に対応するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の、少なくとも６個のヌクレオチドの任意の断片であって、前記ＳＲ領域の少なくとも２個の連続するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、例えば：
    ＊＊配列番号５の部位１０６〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１２９の断片であって、それは配列番号６の部位３６〜７４に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３０のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号５の部位１０９〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３１の断片であって、それは配列番号６の部位３７〜７４に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３２のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号５の部位１０６〜４２０に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３３の断片であって、それは配列番号６の部位３６〜１４０に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３４のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号５の部位１０６〜７７４に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３５の断片であって、それは配列番号６の部位３６〜２５８に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３６のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号２１の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３７の断片であって、それは配列番号２２の部位２９〜４６に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３８のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号２９の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３９の断片であって、それは配列番号３０の部位２９〜４６に位置するアミノ酸により区切られたｒＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４０のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号３３の部位７０〜２３７に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４１の断片であって、それは配列番号３４の部位２４〜７９に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４２のポリペプチド配列をコードする断片、
    ＊＊配列番号３７の部位６１〜２０１に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４３の断片であって、それは配列番号３８の部位２１〜６７に位置するアミノ酸により区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４４のポリペプチド配列をコードする断片、
    で構成されるか、又は含む配列の中から選択されることを特徴とする、前記方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、
    −第二の核酸に含まれるＣＴ領域をコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号４９のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位１及び４２に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号４９のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１〜１４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ領域に対応する配列番号５０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号６５のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号６５のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号６６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７３のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位１及び２４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７３のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位１〜８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号７７のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１及び１８に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号７７のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位１〜６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ領域に対応する配列番号７８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号８１のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位１及び２１に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号８１のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位１〜７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ領域に対応する配列番号８２のポリペプチド配列をコードする）、
    の中から選択され、
    −第二の核酸に含まれるＴＭＤ領域をコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号９１のヌクレオチド配列（これは配列番号５の部位４３及び１０５に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号９１のヌクレオチド配列は配列番号６の部位１５〜３５に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号９２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１０７のヌクレオチド配列（これは配列番号２１の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１０７のヌクレオチド配列は配列番号２２の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１０８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１５のヌクレオチド配列（これは配列番号２９の部位２５及び８４に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１５のヌクレオチド配列は配列番号３０の部位９〜２８に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１１６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１１９のヌクレオチド配列（これは配列番号３３の部位１９及び６９に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１１９のヌクレオチド配列は配列番号３４の部位７〜２３に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号１２３のヌクレオチド配列（これは配列番号３７の部位２２及び６０に位置するヌクレオチドで区切られたヌクレオチド配列に対応し、前記の配列番号１２３のヌクレオチド配列は配列番号３８の部位８〜２０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＴＭＤ領域に対応する配列番号１２４のポリペプチド配列をコードする）、
    の中から選択され、
    −第二の核酸に含まれるＳＲ領域又はその断片をコードするヌクレオチド配列が、
    ＊配列番号５の部位１０６〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１２９のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３６〜７４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５の部位１０９〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３１のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３７〜７４に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５の部位１０６〜４２０に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３３のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３６〜１４０に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３４のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号５の部位１０６〜７７４に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３５のヌクレオチド配列（これは配列番号６の部位３６〜２５８に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３６のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号２１の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３７のヌクレオチド配列（これは配列番号２２の部位２９〜４６に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３８のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号２９の部位８５〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１３９のヌクレオチド配列（これは配列番号３０の部位２９〜４６に位置するアミノ酸で区切られたラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４０のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号３３の部位７０〜２３７に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４１のヌクレオチド配列（これは配列番号３４の部位２４〜７９に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４２のポリペプチド配列をコードする）、
    ＊配列番号３７の部位６１〜２０１に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４３のヌクレオチド配列（これは配列番号３８の部位２１〜６７に位置するアミノ酸で区切られたｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１４４のポリペプチド配列をコードする）、
    の中から選択されることを特徴とする、前記方法。
  11. 第二の核酸に含まれるＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲ、又はＳＲ断片のペプチドが、同じ天然のグリコシルトランスフェラーゼに由来する相同配列であり、後者は請求項１で定義した最適のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するＣＤ断片が由来する天然のグリコシルトランスフェラーゼにおけるペプチドとは異なることを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、第二の核酸が、
    −配列番号５の部位１〜２２２に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４５の配列（これは配列番号４９、９１、及び１２９を含み、配列番号６の部位１〜７４に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの断片に対応する配列番号１４６のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号５０、９２、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
    −配列番号５の部位１〜４２０に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４７の配列（これは配列番号４９、９１、及び１３３を含み、配列番号６の部位１〜１４０に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの断片に対応する配列番号１４８のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号５０、９２、及び１３４にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
    −配列番号５の部位１〜７７４に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１４９の配列（これは配列番号４９、９１、及び１３５を含み、配列番号６の部位１〜２５８に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの断片に対応する配列番号１５０のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号５０、９２、及び１３６にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
    −配列番号２１の部位１〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５１の配列（これは配列番号６５、１０７、及び１３７を含み、配列番号２２の部位１〜４６に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩの断片に対応する配列番号１５２のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号６６、１０８、及び１３８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
    −配列番号２９の部位１〜１３８に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５３の配列（これは配列番号７３、１１５、及び１３９を含み、配列番号３０の部位１〜４６に位置するアミノ酸により区切られているラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩの断片に対応する配列番号１５４のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号７４、１１６、及び１４０にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む）、
    −配列番号３３の部位１〜２３７に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５５の配列（これは配列番号７７、１１９、及び１４１を含み、配列番号３４の部位１〜７９に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ８ＳｉａＩＩの断片に対応する配列番号１５６のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号７８、１２０、及び１４２にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む）、
    −配列番号３７の部位１〜２０１に位置するヌクレオチドで区切られた配列番号１５７の配列（これは配列番号８１、１２３、及び１４３を含み、配列番号３８の部位１〜６７に位置するアミノ酸により区切られているｈＳＴ８ＳｉａＩＶの断片に対応する配列番号１５８のポリペプチド配列をコードし、そして配列番号８２、１２４、及び１４４にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む）
    の中から選択されることを特徴とする、前記方法。
  13. 第二の核酸に含まれるＣＴ、ＴＭＤ、ＳＲ、又はＳＲ断片ペプチドは異なる天然のグリコシルトランスフェラーゼに由来する異種配列であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
  14. 第二の核酸が、それぞれが配列番号６６及び１０８に対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤ領域をコードする配列番号６５及び１０７を含む配列番号１７７のヌクレオチド配列と、配列番号６の部位３７〜７４に位置するアミノ酸によって区切られたｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３２のポリペプチド配列をコードする配列番号１３１のヌクレオチド配列との融合体に対応する配列番号１５９の配列であり、前記配列番号１５９の配列は一方においてｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤの領域及び他方においてｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３７〜７４断片との間の配列番号１６０の融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 第二の核酸が、配列番号６６に対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴをコードする配列番号６５のヌクレオチド配列、配列番号１２０に対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域をコードする配列番号１１９のヌクレオチド配列、及び配列番号６の部位３６〜７４に位置するアミノ酸によって区切られるｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の断片に対応する配列番号１３０のポリペプチド配列をコードする配列番号１２９のヌクレオチド配列との融合体に対応する配列番号１７９の配列であり、前記配列番号１７９の配列は、ｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域、及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３６〜７４断片との間の配列番号１８０の融合ポリペプチドをコードする、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  16. 第一の核酸としての配列番号４３の配列と、以下の配列から選択される第二の核酸の融合体を含むことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法：
    −配列番号１４５の配列（これから配列番号５０、９２、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６２の融合タンパク質をコードする配列番号１６１のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１４７の配列（これから配列番号５０、９２、及び１３４にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６４の融合タンパク質をコードする配列番号１６３のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１４９の配列（これから配列番号５０、９２、及び１３６にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６６の融合タンパク質をコードする配列番号１６５のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１５１の配列（これから配列番号６６、１０８、及び１３８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６８の融合タンパク質をコードする配列番号１６７のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１５３の配列（これから配列番号７４、１１６、及び１４０にそれぞれ対応するラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１７０の融合タンパク質をコードする配列番号１６９のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１５５の配列（これから配列番号７８、１２０、及び１４２にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７２の融合タンパク質をコードする配列番号１７１のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１５７の配列（これから配列番号８２、１２４、及び１４４にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７４の融合タンパク質をコードする配列番号１７３のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１５９の配列（これから配列番号６６及び１０８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤの領域、及び配列番号１３２に対応するｈＳＴ６ＧａｌＮａｃＩのＳＲ領域の３７〜７４断片を含む配列番号１７６の融合タンパク質をコードする配列番号１７５のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）、
    −配列番号１７９の配列（これから配列番号６６、１２０及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤの領域、及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域を含む配列番号１８２の融合タンパク質をコードする配列番号１８１のヌクレオチド配列がもたらされ、これはｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のC末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合している）。
  17. キメラ・グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列、例えば請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られる遺伝子配列。
  18. 請求項１７に記載の遺伝子配列であって、
    −配列番号１６１の配列（配列番号５０、９２、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６２の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６１の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１４５の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１６３の配列（配列番号５０、９２、及び１３４にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６４の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６３の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１４７の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１６５の配列（配列番号５０、９２、及び１３６にそれぞれ対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６６の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６５の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１４９の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１６７の配列（配列番号６６、１０８、及び１３８にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１６８の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６７の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５１の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１６９の配列（配列番号７４、１１６、及び１４０にそれぞれ対応するｒＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ断片領域を含む配列番号１７０の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＳＲリンカーを介して結合していて、前記配列番号１６９の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５３との配列の融合体に対応する）、
    −配列番号１７１の配列（配列番号７８、１２０、及び１４２にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７２の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合していて、前記配列番号１７１の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５５の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１７３の配列（配列番号８２、１２４、及び１４４にそれぞれ対応するｈＳＴ８ＳｉａＩＶのＣＴ、ＴＭＤ及びＳＲ領域を含む配列番号１７４の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＫＬリンカーを介して結合していて、前記配列番号１７３の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５７の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１７５の配列（配列番号６６及び１０８にそれそれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ及びＴＭＤ領域、及び配列番号１３２に対応するｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３７〜７４断片を含む配列番号１７６の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１７５の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１５９の配列との融合体に対応する）、
    −配列番号１８１の配列（配列番号６６、１２０、及び１３０にそれぞれ対応するｈＳＴ３ＧａｌＩＩＩのＣＴ領域、ｈＳＴ８ＳｉａＩＩのＴＭＤ領域、及びｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのＳＲ領域の３６〜７４断片を含む配列番号１８２の融合タンパク質をコードし、ｈＳＴ６ＧａｌＩのＣＤドメインの９０〜４０６のＣ末端最小断片とＧＳリンカーを介して結合していて、前記配列番号１８１の配列は配列番号４３の配列及び配列番号１７９の配列との融合体に対応する）、
    の中から選択される前記遺伝子配列。
  19. 請求項１７又は１８に記載の遺伝子配列の少なくとも１つを含むベクター、例えば、プラスミド、ウイルス又は細菌ベクター。
  20. 請求項１９に記載のベクターを使用し、請求項１７又は１８に記載の遺伝子配列少なくとも１つにより形質転換された宿主細胞、例えば、酵母、真菌、植物、昆虫、鳥、哺乳動物又はヒトの細胞。
  21. 目的の組換えタンパク質の製造の枠組みの中における、請求項２０に記載の細胞の形質転換のための、請求項１７又は１８に記載の遺伝子配列の少なくとも１つの又は請求項１９に記載のベクターの使用。
  22. 目的の前記組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターによる、請求項２０に記載の細胞の形質転換を含む、目的の組換えタンパク質の製造のための方法。
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