JP4995398B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents

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Description

【０００１】
技術分野
本発明は、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性およびパラグロボシドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドを有効成分として含有する糖鎖合成剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する炎症、癌または癌転移検出剤、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を利用した該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた糖鎖または複合糖質の製造法、該形質転換体を利用した糖鎖または複合糖質の製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡより得られるオリゴヌクレオチドを用いた炎症、癌または癌転移の検出法、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いた免疫組織染色法、該抗体を含有する免疫組織染色剤、炎症性疾患、癌または癌転移の診断薬、該ポリペプチド、該ＤＮＡ、該組換え体ベクター、または該抗体を含有する医薬、該ポリペプチドのラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性およびパラグロボシドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法、該遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法、該遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ、該プロモーターＤＮＡによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法、これらのスクリーニング法により得られる化合物、および該遺伝子を欠損または変異させた非ヒトノックアウト動物等に関する。
【０００２】
背景技術
ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有する酵素である。ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）からは、ネオラクト系糖脂質、ラクト系糖脂質、ガングリオ系糖脂質、グロボ系糖脂質、およびイソグロボ系糖脂質が合成されるが、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ネオラクト系糖脂質とラクト系糖脂質の合成の鍵酵素である。
【０００３】
ラクトシルセラミドにＧＭ３合成酵素が働くとガングリオシドＧＭ３（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）が合成される。ラクトシルセラミドにＧＭ２合成酵素が働くとアシアロＧＭ２（ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）が合成される。ＧＭ３やアシアロＧＭ２からは他の多くのガングリオシドが合成されることから、ＧＭ３合成酵素やＧＭ２合成酵素はガングリオ系糖脂質の合成の鍵酵素と言える。一方、ラクトシルセラミドにラクトシルセラミドα１，４−ガラクトース転移酵素が働くとＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドが合成され、次いで一連のグロボ系糖脂質が合成される。ラクトシルセラミドにラクトシルセラミドα１，３−ガラクトース転移酵素が働くとＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドが合成され、次いで一連のイソグロボ系糖脂質が合成される。
【０００４】
従って、ラクトシルセラミドα１，４−ガラクトース転移酵素およびラクトシルセラミドα１，３−ガラクトース転移酵素は、それぞれグロボ系糖脂質とイソグロボ系糖脂質の合成の鍵酵素と言える。ある細胞においてどのタイプの糖脂質が合成されるかは、上記鍵酵素の発現や発現量によってコントロールされていると考えられる。
【０００５】
ネオラクト系糖脂質はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド骨格を有する糖脂質であり、ラクト系糖脂質はＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド骨格を有する糖脂質である。代表的なネオラクト糸糖脂質としては、パラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、シアリルパラグロボシド（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドなどがある。代表的なラクト系糖脂質としては、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドなどがある。
【０００６】
多くのヒトの癌（特に大腸癌または胃癌）においては、フコースやシアル酸が付加したラクト系またはネオラクト系の糖脂質が大量に蓄積していることが明らかになっている〔Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，１０３（１９８４）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，４２，２０９（１９８６）〕。大腸癌組織とその周辺の正常組織、あるいは各種大腸癌細胞株における糖転移酵素活性を測定した結果、大腸癌組織や各種大腸癌細胞株ではラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の活性が増加していることが判明した〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１５６４９（１９８７）〕。この結果は、大腸癌におけるラクト系またはネオラクト系の糖脂質の増加が、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の増加によりもたらされていることを示唆している。
【０００７】
ヒトの前骨髄球細胞株であるＨＬ−６０をジメチルスルフォキシド（ｄｉｍｅｔｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）またはレチノイン酸で処理すると顆粒球系の細胞に分化する。一方、ＨＬ−６０をホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）等のホルボールエステルで処理すると単球系マクロファージに分化する。顆粒球系の細胞への分化の際にはネオラクト系糖脂質（パラグロボシドやシアリルパラグロボシド）が増加しガングリオシドＧＭ３が減少するのに対し、単球系マクロファージへの分化の際にはガングリオシドＧＭ３が増加しネオラクト系糖脂質が減少する。また、ＨＬ−６０にネオラクト系糖脂質を添加して培養すると顆粒球系の細胞に分化し、ＨＬ−６０にガングリオシドＧＭ３を添加して培養すると単球系マクロファージへと分化する。以上の結果は、特定の糖脂質の発現が分化誘導や分化の方向の決定に重要であることを示している。ＨＬ−６０をレチノイン酸で処理すると、ＧＭ３合成酵素活性は変化しないがラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が増加する〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）〕。従って、レチノイン酸で処理したＨＬ−６０においては、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の増加が原因となってネオラクト系糖脂質の増加とガングリオシドＧＭ３の減少を引き起こし、その結果として顆粒球系の細胞へと分化すると考えられる。一方、ＨＬ−６０をＰＭＡで処理すると、ＧＭ３合成酵素活性が増加し、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が減少する〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）〕。
【０００８】
従って、ＰＭＡで処理したＨＬ−６０においては、ＧＭ３合成酵素活性の増加とラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の低下が原因となってガングリオシドＧＭ３の増加とネオラクト系糖脂質の減少を引き起こし、その結果として単球系マクロファージへと分化すると考えられる。ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とＧＭ３合成酵素は、前骨髄球細胞の分化誘導と分化方向の決定に重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００９】
白血球は、種類と分化ステージに応じて異なった糖脂質を発現していることが知られている。例えば、成熟した骨髄性細胞は、中性のネオラクト系の糖脂質のみを発現している〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７，８１（１９８２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１０６７（１９８５）〕。一方、成熟したリンパ球細胞は、グロボ系の糖脂質のみ発現している〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７，８１（１９８２）〕。白血球細胞株を用いた解析により、上記の糖脂質の違いはラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の違いが原因であることが示唆されている。Ｋ−５６２、ＫＧ−１、ＨＬ−６０などの骨髄性細胞株では、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出されるのに対し、Ｒｅｈ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｍｏｓ、ＲＰＭＩ８２２６などのリンパ球系細胞株では本酵素活性が検出されないことが明らかになっている〔Ａｒｃｈｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３０３，１２５（１９９３）〕。
【００１０】
グルクロン酸３−硫酸を糖鎖の非還元末端に有する糖脂質（例えば、ＳＯ４３ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）は、神経系の分化の際に特定の時期に特定の場所で発現することが知られている。これらの糖脂質は、神経系の細胞の相互認識や神経のマイグレーションなどに関与していることが示唆されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，８５０８（１９９８）〕。神経細胞におけるグルクロン酸３−硫酸含有糖脂質（ＳＯ４３ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）の発現は、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素によって制御されていることから、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の発現により、神経細胞の相互認識やマイグレーションがコントロールされていると考えられる〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，８５０８（１９９８）〕。グルクロン酸３−硫酸は、ヒトＮＫ細胞のマーカーに対する単クローン抗体ＨＮＫ−１によっても認識されることから、ＨＮＫ−１エピトープとも呼ばれている。従って、グルクロン酸３−硫酸含有糖脂質は、ＮＫ細胞の機能にも重要な役割を演じていると考えられている。
【００１１】
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖は、ネオラクト系やラクト系の糖脂質の糖鎖中に存在する他、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合型糖鎖やＯ−グリコシド結合型糖鎖中、およびオリゴ糖中にも存在する。例えば、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有するオリゴ糖としては、ヒトの乳中に存在するラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）やラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、あるいはそれらを母核とする様々なオリゴ糖が挙げられる〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）〕。ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の構成要素にもなっている。ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、Ｎ−アセチルラクトサミンがβ１，３結合で繰り返し結合した構造〔（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎ；ｎは２以上〕を有する糖鎖で、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合型糖鎖やＯ−グリコシド結合型糖鎖中に存在するほか、糖脂質の糖鎖中やオリゴ糖中にも存在する。ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が、ラクトシルセラミド以外の基質、例えば、パラグロボシド、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合型糖鎖やＯ−グリコシド結合型糖鎖、またはオリゴ糖を基質とするかどうかについては明らかになっていない。
【００１２】
ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性は、これまでに大腸組織、大腸癌組織、大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ４０３等）、ミエロイド系細胞株（Ｋ−５６２、ＫＧ−１、ＨＬ−６０）で検出されているが、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が高純度で精製された報告はない〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１５６４９（１９８７）、Ａｒｃｈｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２６０，４６１（１９８８）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０９，２６１（１９９１）、Ａｒｃｈｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３０３，１２５（１９９３）〕。
【００１３】
一方、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有する酵素（以下Ｇａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素という。）に関しては、これまでに部分精製の報告があるが、これらの酵素がラクトシルセラミドを基質とするかどうかは明らかになっていない〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１２４６１（１９８８）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．，４２，７７（１９８９）〕。
【００１４】
遺伝子のクローン化については、これまでに２種のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子がクローン化されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２９４−１４２９９（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４０６−４１１（１９９９）〕。この内の１つであるβ３ＧｎＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパラグロボシドを基質とすることが示されているが、ラクトシルセラミドを基質とした場合の活性は弱い〔Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，１１２３（１９９９）〕。また、β３ＧｎＴが細胞内でラクトシルセラミドやパラグロボシドを基質とするかどうかについては明らかにされていない。さらに別のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が存在するかどうかについては不明である。
【００１５】
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖は非常にたくさん存在することから、Ｇａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、受容基質特異性や発現組織が異なる複数の酵素が存在し、それぞれ別の機能を担っている可能性が高いと考えられている。従って、これまでにクローン化された２種の酵素とは異なるＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をクローン化し、受容基質特異性を調べることにより、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を同定することができると考えられる。
【００１６】
上述したように、ヒトの乳中にはラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）やラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、あるいはそれらを母核とする構造を有する様々なオリゴ糖が存在することが知られている〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）〕。該オリゴ糖は共通してＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有している。また、該オリゴ糖の中にはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を有するオリゴ糖も含まれる。これらのオリゴ糖には、乳児がウイルスや微生物に感染するのを防ぐ働きや、毒素を中和する働きがあると考えられている。また、善玉の腸内細菌であるビフィズス菌の増殖を促す活性もある。一方、ウシやマウスなどの動物の乳中に存在するオリゴ糖の種類は少なく、大部分がラクトースであり、ヒト乳中に存在する上記オリゴ糖はほとんど存在しない。
【００１７】
ヒトの乳中に含まれる上記オリゴ糖、あるいはそれらが含まれたミルクを効率よく生産することができれば、産業上非常に有用である。ヒトの乳中に含まれる上記オリゴ糖の合成に関与するＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子が取得できれば、上記オリゴ糖の効率的な合成に使用可能と考えられるが、該酵素は明らかになっていない。
【００１８】
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖の中で、特にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、多くの機能性糖鎖（セレクチンリガンド糖鎖、微生物やウイルスの受容体糖鎖、ＳＳＥＡ−１糖鎖、癌関連糖鎖など）の骨格糖鎖となっており、胚発生、細胞分化、あるいは炎症や癌などの疾患と深く関わっている。また、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、糖タンパク質の安定化にも重要な役割を果たしている。
【００１９】
それぞれの場面で機能しているポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は異なる可能性があるため、これまでにクローン化された２種の酵素とは異なるＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が存在する可能性がある。ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ラクトシルセラミドに加え、非還元末端にＧａｌβ１−４ＧｌｃまたはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖（例えばパラグロボシド）にもＮ−アセチルラクトサミンを転移し、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する可能性がある。
【００２０】
以下、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成、機能、応用について記す。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素（糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，４結合でガラクトースを転移する活性を有する酵素）とＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が交互に働くことにより合成される。ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素に関しては、これまでに４種類の酵素（β４Ｇａｌ−Ｔ１、β４Ｇａｌ−Ｔ２、β４Ｇａｌ−Ｔ３、β４Ｇａｌ−Ｔ４）の遺伝子がクローン化され、それぞれの酵素の受容基質特異性が解析されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３１９７９−３１９９１（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９３３１−２９３４０（１９９７）〕。
【００２１】
直鎖型または分岐型のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖上には、フコース、シアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースなどの糖、または硫酸基などが付加し、細胞特異的あるいは時期特異的に様々な糖鎖（機能性糖鎖、血液型糖鎖、癌関連糖鎖など）が形成される〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ（１）〜（６），講談社，（１９９３年）〕。
【００２２】
顆粒球、単球、または活性化Ｔ細胞上には、糖鎖の末端にシアリルルイスｘ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が存在していることが知られており、これらの糖鎖は接着分子であるＥ−セレクチンやＰ−セレクチンのリガンドとして機能し、これらの白血球が炎症部位へ集積するのに関与していると考えられている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ（１）〜（６），講談社，（１９９３年）〕。
【００２３】
また、大腸癌などの癌細胞上にも、末端にシアリルルイスｘ糖鎖やシアリルルイスａ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が存在していることが知られており、これらの糖鎖もＥ−セレクチンやＰ−セレクチンのリガンドとして機能し、癌の転移に関与していることが示唆されている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ（１）〜（６），講談社，（１９９３年）〕。
【００２４】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の構造は、胚発生、細胞分化、または細胞の癌化の過程で変化することが知られている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ（１）〜（６），講談社，（１９９３年）〕。ヒトの胎児の赤血球では直鎖型のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が発現しているのに対し、成人の赤血球では分岐型のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が発現する〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、グリコバイオロジーシリーズ（１）「糖鎖の多様な世界」、講談社、１９９３年〕。これら赤血球上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の末端には、ＡＢＯ式の血液型抗原が発現している。分岐したポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖のそれぞれの末端に血液型抗原が発現されると多価の抗原となり、血液型糖鎖に対する抗体との結合能は、直鎖型の抗原に比較して１０３以上も増加する。
【００２５】
マウスの初期胚の発生過程においては、一連の糖鎖抗原が規則正しく発現されることが知られている。ＳＳＥＡ−１（ｓｔａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−１）抗原は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖末端に存在するルイスｘ糖鎖〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕であるが、この抗原の発現は８細胞期に始まり、桑実胚でピークとなり、胚盤胞期以降は徐々に消失していく〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、グリコバイオロジーシリーズ（３）「細胞社会のグリコバイオロジー」、講談社、１９９３年〕。桑実胚期は、それまで細胞分裂による単純な数的増加を繰り返してきた胚細胞が、初めて分化した「形態」をもった胚盤胞の段階へ移行していく移行期にあたる。桑実胚の細胞は胚盤胞を形成する直前に互いに緊密に寄り集まり、細胞緊密化（ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）を起こす。ＳＳＥＡ−１抗原を有するオリゴ糖を添加すると、この細胞緊密化は阻害され、その後の正常な発生も阻害される〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６０，１５９１（１９８４）〕。また、マウスのテラトカルシノーマ細胞の接着が、抗ＳＳＥＡ−１抗体により阻害されることも知られている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編、グリコバイオロジーシリーズ（３）「細胞社会のグリコバイオロジー」、講談社、１９９３年〕。以上のことは、ＳＳＥＡ−１抗原が接着分子あるいは糖鎖シグナルとして作用し、初期胚の発生に重要な役割を果たしていることを示している。
【００２６】
癌細胞では、対応する正常細胞に比較して、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を多く発現することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１０８３４（１９８４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０７７２（１９８６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１７７２（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，５７００（１９９２）〕。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＮ−ｒａｓプロトオンコジーンを発現させると、細胞表面のＮ−結合型糖鎖の分子量が増加し、細胞は浸潤能を獲得するが、この時、Ｎ−結合型糖鎖中のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の量が増加するとともに、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，４−ガラクトース転移酵素とβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の活性が増加していることが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２１６７４（１９９１）〕。
【００２７】
ガレクチンは、β−ガラクトシドに親和性を有する一群のレクチンで、細胞の接着や情報伝達に関与し、癌などの疾患との関連も示唆されている〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，９（１９９７）〕。哺乳類ではこれまでに１０種類のものが知られている。このうちガレクチン−１および−３は、直鎖上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖と高親和性で結合することが知られており、それらの糖鎖を含有する特定の糖タンパク質が、これらのガレクチンのリガンドであると推定されている〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，９（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，４７（１９９７）〕。
末端にシアル酸が付加したポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、マイコプラズマや微生物の受容体となっている〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）〕。
【００２８】
このように、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、多くの機能性糖鎖（セレクチンリガンド糖鎖、微生物やウイルスの受容体糖鎖、ＳＳＥＡ−１糖鎖、癌関連糖鎖など）や血液型糖鎖の骨格糖鎖を形成し、それらの糖鎖を効率的に提示するのに重要な役割を果たしている。
【００２９】
シアリルルイスｘ糖鎖を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、セレクチンのアンタゴニストとして、抗炎症効果あるいは癌転移抑制効果を有する医薬品となることが期待される。
【００３０】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖上に多価（４個）のシアリルルイスｘ糖鎖（４糖）が結合したオリゴ糖では、多価にしていないシアリルルイスｘオリゴ糖（４糖）に比較して、１／１００以下の低濃度でセレクチンアンタゴニストとしての活性を示すことが知られている〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２，１１３３（１９９５）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，６，６５（１９９６）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，４５３（１９９７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１３６０（１９９７）〕。これらのオリゴ糖のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖部分の合成には、部分精製されたβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が利用されたが、この酵素の供給が律速となり、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を多量に合成することは難しい〔Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，４５３（１９９７）〕。
【００３１】
一方、化学合成によってもポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成可能であるが、その合成は非常に煩雑なステップを必要とする〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，２４，５２２３（１９９７）〕。
【００３２】
以上のことより、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の効率良い合成法が求められている。これまでにクローン化された２種のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素や該酵素遺伝子を利用することもできるが、目的に応じて基質特異性や機能の異なる別のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（例えば、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素）や該酵素遺伝子を用いた方が効率がよい場合があると考えられる。
【００３３】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、糖タンパク質の安定化にも重要である。ｌｙｓｏｓｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−１（ｌａｍｐ−１）およびｌｙｓｏｓｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−２（ｌａｍｐ−２）は、リソソームに存在する糖タンパク質（一部は細胞表面にも存在する）で、リソソーム膜の内面をほとんどもれなく覆っている。ｌａｍｐ−１およびｌａｍｐ−２には多くの糖鎖（いくつかはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を含む）が付加しており、ｌａｍｐ−１およびｌａｍｐ−２がリソソーム中の加水分解酵素によって分解されるのを防いでいる。ヒトの前骨髄球細胞株であるＨＬ−６０をジメチルスルフォキシド（ｄｉｍｅｔｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で処理すると、顆粒球系の細胞に分化するが、この分化の過程で、ｌａｍｐ−１およびｌａｍｐ−２に付加するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の数が増加し、それとともにｌａｍｐ−１およびｌａｍｐ−２の代謝速度（分解速度）が低下することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２０４７６（１９９０）〕。
【００３４】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成能を増加させた例としては、以下に示した例が挙げられる。
Ｆ９細胞をレチノイン酸で処理した場合や、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞をＴＧＦ−βで処理した場合に、細胞の膜結合糖タンパク質の糖鎖にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付加することが示されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２４２（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２２１，３３０（１９９４）〕。
【００３５】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＮ−ｒａｓプロトオンコジーンを発現させると、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，４−ガラクトース転移酵素とβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の活性が増加し、膜タンパク質のＮ−結合型糖鎖中のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖量が増加することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２１６７４（１９９１）〕。Ｔ細胞株ＥＬ−４中でコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を発現させると、細胞表面の膜タンパク質であるＣＤ４３、ＣＤ４５、またはＣＤ４４の分子量が増加する〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８７３２（１９９６）〕。これは、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素により合成された糖鎖が、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素のよい基質となるためと考えられる。
【００３６】
また、ＨＬ−６０細胞を２７℃で培養すると、ｌａｍｐ−１またはｌａｍｐ−２に付加するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の量が増加することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２３１８５（１９９１）〕。
【００３７】
しかし、組換え糖タンパク質の生産に適した宿主細胞（例えばＮａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ＣＨＯ細胞など）において、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の付加された組換え糖蛋白質を効率よく生産させることに関してはこれまでに報告されていない。従って、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の付加された組換え糖蛋白質を効率よく生産することのできる方法の開発は、産業上重要な課題である。
【００３８】
これまでにクローン化された２種のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を利用することもできるが、目的に応じて基質特異性や機能の異なる別のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子（例えば、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素）を用いた方が効率がよい場合があると考えられる。
【００３９】
発明の開示
本発明の目的は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチドを利用し、有用糖鎖の合成、抗炎症、抗感染症、癌転移抑制等の医薬品、乳製品等の食品、タンパク質の安定化等の改善法、炎症性疾患や癌の種類や悪性度の診断法を提供することにある。
【００４０】
本発明は、以下の（１）〜（７９）に関する。
（１） 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２） 配列番号１で表されるアミノ酸配列の３９番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（３） （１）または（２）記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド。
（４） （１）または（２）記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド。
（５） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である（３）および（４）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【００４１】
（６） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である（３）〜（５）のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（７） ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質が、ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）である（６）記載のポリペプチド。
（８） 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、（６）または（７）に記載のポリペプチド。
（９） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する糖鎖合成剤。
（１０） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４２】
（１１） 配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（１２） 配列番号２で表される塩基配列の１３５〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（１３） 配列番号２で表される塩基配列の２４９〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（１４） （１０）〜（１３）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１５） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である（１４）に記載のＤＮＡ。
【００４３】
（１６） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である（１４）または（１５）記載のＤＮＡ。
（１７） ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質が、ラクトシルセラミドまたはパラグロボシドである（１６）記載のＤＮＡ。
（１８） 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である（１６）または（１７）記載のＤＮＡ。
（１９） （１０）〜（１８）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（２０） （１０）〜（１８）のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組込んで得られる組換え体ベクター。
【００４４】
（２１） （１０）〜（１８）のいずれか１項に記載のＤＮＡと相同な配列からなるＲＮＡをベクターに組込んで得られる組換え体ベクター。
（２２） （２０）または（２１）に記載の組換え体ベクターを保有する形質転換体。
（２３） 形質転換体が微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質転換体である、（２２）記載の形賀転換体。
（２４） 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、（２３）記載の形質転換体。
（２５） 動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞からなる群より選ばれる動物細胞である、（２３）記載の形質転換体。
【００４５】
（２６） 植物細胞が、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、大豆、アブラナ、アルファルファ、イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、または亜麻の植物細胞からなる群より選ばれる植物細胞である、（２３）記載の形質転換体。
（２７） 昆虫細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群より選ばれる昆虫細胞である、（２３）記載の形質転換体。
（２８） 形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である形質転換体である、（２２）記載の形質転換体。
（２９） （２２）〜（２７）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ，該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
（３０） （２８）記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
【００４６】
（３１） 蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、（３０）記載の製造法。
（３２） （２８）記載のトランスジェニック植物を栽培し、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（３３） （１０）〜（１８）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系により（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（３４） （９）記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、（ａ）該酵素源、（ｂ）ｉ）ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｖ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３５） （３４）記載の方法により得られるＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を受容基質として用い、（ａ）該受容基質、（ｂ）ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素、および（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，４結合でガラクトースが付与された反応産物を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該ガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ガラクトースが付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
【００４７】
（３６） （９）記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、（ａ）該酵素源、（ｂ）ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素、（ｃ）ｉ）ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｖ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質、およびｖ）（３４）または（３５）記載の方法により得られる糖鎖または複合糖質からなる群より選ばれる受容基質、（ｄ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルラクトサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、および（ｅ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された反応産物を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３７） （２２）〜（２７）のいずれか１項に記載の形質転換体を用い、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ネオラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖からなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成、蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３８） （２８）記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を用い、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ネオラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖からなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成、蓄積させ、該個体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３９） 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、（３４）〜（３８）のいずれか１項に記載の製造法。
（４０） 蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、（３８）記載の製造法。
【００４８】
（４１） （１０）〜（１９）のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列の連続した５〜１２０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体であるオリゴヌクレオチド。
（４２） （１０）〜（１９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、該ＤＮＡの部分断片、または（４１）記載のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション法により、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（４３） （４１）記載のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（４４） （４２）または（４３）記載の方法を用いた、炎症、癌または癌転移の検出法。
（４５） （１０）〜（１９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、該ＤＮＡの部分断片、または（４１）記載のオリゴヌクレオチドを含有する、炎症、癌または癌転移の検出剤。
【００４９】
（４６） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することによる、該遺伝子の機能異常の診断方法。
（４７） （１０）〜（１９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、該ＤＮＡの部分断片、または（４１）記載のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション法により、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出する方法。
（４８） （４１）記載のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出する方法。
（４９） （４１）記載のオリゴヌクレオチドを用い、（１）〜（８）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（５０） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
【００５０】
（５１） （５０）記載の抗体を用いる、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
（５２） （５０）記載の抗体を用い、（１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを検出することを特徴とする免疫組織染色法。
（５３） （５０）記載の抗体を含有する免疫組織染色剤。
（５４） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する医薬。
（５５） 医薬が、炎症性疾患、癌または癌転移の治療、予防および／または診断のための医薬である（５４）記載の医薬。
【００５１】
（５６） （１０）〜（１９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、該ＤＮＡの部分断片または（４１）記載のオリゴヌクレオチドを含有する医薬。
（５７） 医薬が、炎症性疾患、癌または癌転移の治療、予防および／または診断のための医薬である（５６）記載の医薬。
（５８） （２０）または（２１）記載の組換え体ベクターを含有する医薬。
（５９） 医薬が、炎症性疾患、癌または癌転移の治療、予防および／または診断のための医薬である（５８）記載の医薬。
（６０） （５０）記載の抗体を含有する医薬。
【００５２】
（６１） 医薬が、炎症性疾患、癌または癌転移の治療、予防および／または診断のための医薬である（６０）記載の医薬。
（６２） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料による該ポリペプチドが有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の変動を測定することを特徴とする、該ポリペプチドが有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
（６３） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である（６２）記載のスクリーニング法。
（６４） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である（６２）または（６３）記載のスクリーニング法。
（６５） ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質が、ラクトシルセラミドまたはパラグロボシドである（６４）記載のスクリーニング法。
【００５３】
（６６） 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、（６４）または（６５）記載のスクリーニング法。
（６７） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、パラグロボシドを認識する抗体、またはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体およびレクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を用い、パラグロボシドまたはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を定量することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（６８） （１）〜（８）記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、（５０）記載の抗体を用い、該ポリペプチドを定量することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（６９） （１）〜（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ。
（７０） プロモーターＤＮＡが、白血球細胞、神経細胞、気管の細胞、肺細胞、大腸細胞、胎盤の細胞、神経芽細胞腫細胞、グリオブラストーマ細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞および白血病細胞から選ばれる細胞で機能しているプロモーターである、（６９）記載のプロモーターＤＮＡ。
【００５４】
（７１） プロモーターＤＮＡが、ヒト、ラットまたはマウス由来のプロモーターＤＮＡである、（６９）または（７０）記載のプロモーターＤＮＡ。
（７２） （６９）〜（７１）のいずれか１項に記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被検試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物を定量することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
（７３） レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、（７２）記載のスクリーニング法。
（７４） （６２）〜（６８）、（７２）および（７３）のいずれか１項に記載のスクリーニング法により得られる化合物。
（７５） （１）〜（８）記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させた非ヒトノックアウト動物。
【００５５】
（７６） 非ヒトノックアウト動物がマウスである、（７５）記載のノックアウト動物。
（７７） （１０）〜（１８）記載のＤＮＡ若しくは該ＤＮＡと相同な配列からなるＲＮＡ、または（２０）または（２１）記載の組換え体ベクターを細胞へ導入し、（１）〜（８）記載のポリペプチドを発現させることを特徴とする、細胞の分化、相互認識、移動を制御する方法。
（７８） 細胞が、血球細胞、神経細胞、幹細胞または癌細胞のいずれかより選ばれる細胞である（７７）記載の方法。
（７９） （１０）〜（１８）記載のＤＮＡ若しくは該ＤＮＡと相同な配列からなるＲＮＡ、または（２０）または（２１）記載の組換え体ベクターを前骨髄球細胞へ導入して（１）〜（８）記載のポリペプチドを発現させることを特徴とする、前骨髄球細胞の顆粒球細胞への分化を促進する方法。
【００５６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの取得、ならびに該ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの製造
特開平６−１８１７５９で開示されているＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素（以下、β３Ｇａｌ−Ｔ１と略記する；別名ＷＭ１）はＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造の合成に関与するＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素である。遺伝子データベースから、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５１，４０３−４１０（１９９０）〕、ＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）、ＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ〔Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製〕等のプログラムを利用して、本酵素遺伝子と相同性のある遺伝子または本酵素とアミノ酸レベルで相同性を有する蛋白質をコードする可能性のある遺伝子を検索することにより本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡあるいは該ＤＮＡの一部の塩基配列の情報を取得することができる。データベースとしてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅｓｅｑ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社）等の公的なデータベースを利用することもできるし、私的なデータベースも利用できる。このようにして得られたβ３Ｇａｌ−Ｔ１遺伝子とアミノ酸レベルで相同性を有する蛋白質をコードする可能性のある遺伝子の塩基配列として配列番号３に示したラットｃＤＮＡの塩基配列をあげることができる。また配列番号３の塩基配列と相同性を有するヒトｃＤＮＡの塩基配列としてＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＩ０３９６３７のヒトＥＳＴ配列をあげることができる。これらの配列は本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列である。
【００５７】
各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、上記で得られた配列に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲと略記する）〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕を行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの存在を検出することができる。また、同様にして本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのＤＮＡ断片を取得することができる。
【００５８】
得られたＤＮＡ断片が不完全長の場合は、以下のようにしてその全長ｃＤＮＡを得ることができる。
上記で取得したＤＮＡ断片をプローブとして、該ＤＮＡが存在することが確認された臓器または細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ｃＤＮＡを取得することができる。
また、該ＤＮＡが存在することが確認された一本鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、５’ＲＡＣＥ法と３’ＲＡＣＥ法を行うことにより、該当する配列を有するｃＤＮＡの５’末端側の断片と３’末端側の断片を取得することができる。両断片を連結することにより、全長ｃＤＮＡを取得できる。
【００５９】
各種臓器または各種細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡは、常法または市販されているキットに従って調製することができる。一例を以下に示す。
各種臓器または各種細胞から酸グアニジウム チオシアネート フェノール−クロロホルム法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９（１９８７）〕により全ＲＮＡを抽出する。必要に応じて、全ＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、混入の可能性がある染色体ＤＮＡを分解する。得られた全ＲＮＡ各々について、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成する。一本鎖ｃＤＮＡとしては、例えばヒト大腸癌細胞株ｃｏｌｏ２０５やヒト胃粘膜から上記の方法で作製した一本鎖ｃＤＮＡを挙げることができる。
【００６０】
ｃＤＮＡライブラリーは常法により作製することができる。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）サプルメント１〜３８等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製〕を用いる方法等が挙げられる。各種臓器または各種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーは、市販されているものを購入することによっても入手できる。
【００６１】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための、クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、λＺＡＰ ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＣＸＮ２〔Ｇｅｎｅ，１０８，１９３（１９９１）〕等を挙げることができる。
【００６２】
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲＴＭＳｔｒａｉｎ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製〕およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等が用いられる。
【００６３】
ｃＤＮＡライブラリーとして、例えば以下のようにして作製したｃＤＮＡライブラリーを挙げることができる。
ヒト胃粘膜のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡよりｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、その両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩアダプター（Ｓｕｐｅｒ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を付加した後、クローニングベクターλＺＡＰ ＩＩ（λＺＡＰ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行うことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
また、市販のｃＤＮＡライブラリーを購入して使用することもできる。
【００６４】
データベース検索で明らかになった候補遺伝子の塩基配列を基に、該遺伝子に特異的なプライマーを設計し、上記のようにして取得した一本鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う。増幅断片が得られた際には、該断片を適当なプラスミドにサブクローニングする。サブクローニングは、増幅ＤＮＡ断片をそのまま、あるいは制限酵素やＤＮＡポリメラーゼで処理後、常法によりベクターに組み込むことにより行うことができる。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（いずれもＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ａｍｐ ＳＫ（＋）〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，６２６４（１９９２）〕、ｐＴ７Ｂｌｕｅ〔Ｎｏｖａｇｅｎ社製〕、ｐＣＲ ＩＩ〔Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６５７（１９９１）〕、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ〔Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ社製〕、ｐＮｏＴＡＴ７（５’→３’社製）などが挙げられる。
【００６５】
サブクローン化されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が取得されたか確認する。塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法，〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製〕等の塩基配列分析装置を用いて決定することができる。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーに対して、該ＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング 第２版）を行うことにより、β３Ｇａｌ−Ｔ１とアミノ酸レベルで相同性を有する蛋白質をコードする可能性のあるｃＤＮＡを取得することができる。プローブとしては、該ＤＮＡ断片をアイソトープあるいはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）標識したものを使用することができる。
【００６６】
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｐｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいはＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、ＤＮＡシークエンサーｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
【００６７】
該方法により取得される本発明のＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の内、３９番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ等を挙げることができ、具体的には、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の内、１３５〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の内、２４９〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ等を挙げることができる。
【００６８】
尚、配列番号２で表される塩基配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ由来の塩基配列であり、配列番号２で表される塩基配列の内、１３５〜１２６８番目の塩基配列は、該ポリペプチドのコード領域のみの塩基配列であり、配列番号２で表される塩基配列の内、２４９〜１２６８番目の塩基配列は、該ポリペプチドの糖転移酵素活性を有する領域をコードする塩基配列である。
配列番号２で表される塩基配列の内、１３５〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＡＭｏ−Ｇ６、ｐＣＸＮ２−Ｇ６、ｐＢＳ−Ｇ６を挙げることができる。
【００６９】
一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、配列番号２とは異なる塩基配列を有するＤＮＡであっても本発明のポリペプチドをコードしていれば本発明のＤＮＡに含まれる。
【００７０】
また、上記の方法で得られた本発明のＤＮＡの塩基配列の情報に基づき、本発明のＤＮＡの塩基配列の全体あるいは任意の部分について、その５’端の１５〜３０塩基の配列を含むＤＮＡおよび３’端の１５〜３０塩基の配列と相補的な配列を含むＤＮＡをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによって、本発明のＤＮＡおよびその任意の部分の断片を調製することができる。プライマーに用いるＤＮＡはアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社の３８０Ａ、３９２、３９００等のＤＮＡ合成機により合成できる。
【００７１】
また、本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても本発明のＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したアプライド・バイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機３８０Ａ、３９２、３９００等を用いて行うことができる。
【００７２】
また、上記の方法で取得したＤＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする目的のＤＮＡを取得することができる。例えば、他種（マウス、ラット、ウシ、サルなど）の生物のホモログＤＮＡなどをクローニングできる。具体的には、配列番号３で表されるラットのホモログＤＮＡが挙げられる。
【００７３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはＤＮＡ合成機で合成する方法を除いては、二本鎖ＤＮＡとして取得され、本発明のポリペプチドをコードするセンス鎖のＤＮＡおよび該ＤＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡからなる。両ＤＮＡは１００℃で５分間加熱し、氷上で急冷することにより分離させることができる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡは、上記のようにして分離した本発明のポリペプチドをコードするセンス鎖のＤＮＡを鋳型として、その３’端の５〜３０塩基の配列と相補的な配列からなるＤＮＡをプライマーとし、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼの反応を行うことによっても合成できる。
【００７４】
該ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記で取得したＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００７５】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕などの解析ソフトで、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算したときに、上記で取得したＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００７６】
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により、あるいは該ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するセンス・オリゴヌクレオチド、本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列の一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００７７】
該オリゴヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの有する塩基配列または該塩基配列と相補的な塩基配列中の連続した５〜１２０塩基、より好ましくは連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡを挙げることができ、具体的には、配列番号２で表される塩基配列中の連続した５〜１２０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは配列番号２で表される塩基配列と相補的な配列中の連続した５〜１２０塩基と同じ配列を有するＤＮＡを挙げることができる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には配列番号２５および２８等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００７８】
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
【００７９】
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
【００８０】
以上のようにして取得される本発明のＤＮＡがコードする本発明のポリペプチドとしては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３９番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド、前記ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性およびパラグロボシドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドの有するアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性およびパラグロボシドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド等を挙げることができる。
【００８１】
上記のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。欠失、置換および／または付加されるアミノ酸の数は１から数個であり、その数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００８２】
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号１記載のアミノ酸配列との相同性は、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトで、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の相同性を有していることが好ましい。例えば、他種（マウス、ラット、ウシ、サルなど）の生物のホモログのポリペプチドを挙げることができる。具体的には、配列番号３で表されるラットのポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチドがβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有することは下記（３）に記載の方法で確認することができる。
【００８３】
（２）本発明のポリペプチドの製造
上記の方法により得られた本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するために、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・サプルメント１〜３８等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
【００８４】
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体（ヒト個体を除く）や植物個体を用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００８５】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より市販）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅ ＩＩ ＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｐｍａｃｉａ社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等を例示することができる。
【００８６】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００８７】
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００８８】
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００８９】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＷ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０を挙げることができる。
【００９０】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
【００９１】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
【００９２】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００９３】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等を挙げることができる。
【００９４】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
【００９５】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）、フナコシ社製〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）〕、ｐＡＭｏＡ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等を例示することができる。
【００９６】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００９７】
宿主細胞としては、ＤＮＡを細胞内に導入できる動物細胞であるならいかなる細胞も用いることができる。例えば、哺乳動物の細胞としてはヒト、サル、マウス、ラット、モルモットまたはミンクの細胞などを用いることができる。具体的には、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４３２）またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株等を挙げることができる。
【００９８】
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３、２９３〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．３６，５９−７２（１９７７）〕等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等を挙げることができる。
治療用タンパク質性医薬品の製造などが目的の場合は、哺乳動物の細胞、特にＣＨＯ細胞を宿主とすることが好ましい。
【００９９】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、ＤＥＡＥデキストラン法（羊土社 バイオマニュアルシリーズ４，１６）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、マイクロインジェクション法（羊土社 バイオマニュアルシリーズ４，３６）、アデノウイルス法（羊土社 バイオマニュアルシリーズ４，４３）、ワクシニアウイルス（羊土社 バイオマニュアルシリーズ４，５９）レトロウイルスベクター（羊土社 バイオマニュアルシリーズ４，７４）等を用いることができる。
【０１００】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
【０１０１】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
【０１０２】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【０１０３】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
【０１０４】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５（別名ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等を挙げることができる。
【０１０５】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。
【０１０６】
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
【０１０７】
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率を上げることもできる。
【０１０８】
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ニンジン、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等を挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）、特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等を挙げることができる。
【０１０９】
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
【０１１０】
動物個体（ヒト個体を除く）を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、遺伝子を導入した動物（ヒトを除く）中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
【０１１１】
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０１１２】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
【０１１３】
形質転換体が動物個体（ヒト個体を除く）または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等を挙げることができる。
【０１１４】
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のポリペプチドを該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
【０１１５】
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０１１６】
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【０１１７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等がを用いることができる。
【０１１８】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【０１１９】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【０１２１】
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【０１２２】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２３】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。培養は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２４】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２５】
遺伝子の発現方法としては、ポリペプチド全長を発現させる以外に、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する領域を含む部分ポリペプチドとして発現させることもできる。糖転移酵素は、一般にタイプＩＩ型の膜タンパク質のトポロジーを有し、Ｎ末端の数から数十アミノ酸からなる細胞質領域、疎水性の高いアミノ酸配列を有する膜結合領域、数から数十アミノ酸からなる幹領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなっている。幹領域と触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分は、ゴルジ体内腔に露出していると考えられる。幹領域と触媒領域の境界は、Ｎ末端を欠失させたポリペプチドを作製し、どこまで欠失させると活性がなくなるかを検討することにより、実験的に求めることができる。一方、幹領域と触媒領域に関する知見のある類似の糖転移酵素とアミノ酸配列を比較することにより、幹領域と触媒領域を予想することもできる。
【０１２６】
本発明の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｎ末端の１４アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１８アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると予想することができる。従って、４５番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
【０１２７】
幹領域は、他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素やβ１，３−ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、ならびに他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素やβ１，３−ガラクトース転移酵素の幹領域に関する知見を基に推定した。具体的には、本願の実施例４および特開平６−１８１７５９に開示された知見をもとに推定することができる。例えば、配列番号１の３６番目から３７８番目のアミノ酸を含む分泌型ポリペプチド、または配列番号１の３９番目から３７８番目のアミノ酸を含む分泌型ポリペプチドは、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する。
【０１２８】
上記のポリペプチド全長またはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する領域（触媒領域）を含む部分ポリペプチドは、直接発現させる以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌タンパク質または融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどが挙げられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
【０１２９】
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造に応じて適宜、選択することができる。
【０１３０】
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４１２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１３１】
即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１３２】
具体的には、触媒部位を含むと考えられるアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと触媒領域を含むポリペプチドの間、または触媒領域を含むポリペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
【０１３３】
精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどが挙げられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
【０１３４】
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【０１３５】
本発明のポリペプチドの製造法として他に、本発明のＤＮＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系による製造法がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系とは、無細胞システムを用いてＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を行うことによりポリペプチドを生産する系のことであり、目的のＤＮＡまたは目的のｍＲＮＡから目的のポリペプチドを生産できる無細胞システムであればどのようなものでも用いることができる。代表的な無細胞翻訳系として、例えば、ウサギの網状赤血球ライゼート（Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）や小麦杯ライゼート（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｌｙｓａｔｅ）を用いた系などが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は各社からキットが販売されており、市販のキットを用いてポリペプチドを比較的容易に製造できるようになっている。市販キットとして例えば、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）が挙げられる。また、本発明のポリペプチドは、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）〕に準じたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて生産することもできる。
【０１３６】
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１３７】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
【０１３８】
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【０１３９】
細胞外に該ポリペプチドが分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【０１４０】
また、通常の糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）に準じて精製できる。
【０１４１】
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
【０１４２】
更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【０１４３】
更に、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシアバイオテク社製、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）社製、シンセセル・ベガ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ）社製、パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）社製、島津製作所製等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
【０１４４】
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
【０１４５】
（３）本発明のポリペプチドの活性測定と利用
本発明のポリペプチドの発現ベクターを保有する形質転換体から調製した細胞抽出液、あるいは該形質転換体またはその培養物から単離精製した本発明のポリペプチドを酵素サンプルとして用い、公知の測定法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１２４６１（１９８８）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．，４２，７７（１９８９）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４６２，２８９（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１−１６２（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）〕に基づいて本発明のポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定することができる。また、種々の受容基質を用いて測定することにより、本発明のポリペプチドの受容基質の特異性を調べることができる。
【０１４６】
酵素サンプルとして細胞抽出液を用いる場合は、宿主細胞自身がもつ糖転移酵素活性の影響を除くため、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含まないコントロールベクターを導入した形質転換体の細胞抽出液をコントロールとして、そのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を比較する。コントロールと比較してβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が増加していれば、形質転換体が保有する本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有しているといえる。
【０１４７】
複数のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現している細胞や組織の場合、細胞や組織の抽出液を酵素源とした酵素学的解析では、発現しているＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の各々を特定すること、ならびにそれらのＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の各々についての酵素学的特性を明らかにすることはできない。（２）に記載の方法により本発明のポリペプチドを精製することにより、該ポリペプチドが有するＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の酵素学的特性を明らかにすることができる。
【０１４８】
以下に測定法の例を示す。
（ｉ）蛍光標識したオリゴ糖を受容基質として用いる方法
２−アミノベンゼン化あるいはピリジルアミノ化により蛍光標識したオリゴ糖を受容基質とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として反応を行い、反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析する。２−アミノベンゼン化糖鎖基質の調製は、ＳＩＧＭＡ ２ＡＢ ｇｌｙｃａｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、キットの説明書に従って行うことができる。ピリジルアミノ化による蛍光標識は常法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９（１９９０）〕により行うことができる。糖供与体のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを添加しない場合に比べて添加した場合に増加するピークを生成物のピークとする。生成物の量をその蛍光強度から測定し、添加した受容基質に対する生成物の割合を、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性とする。生成物の同定は、生成物のＨＰＬＣの保持時間が、スタンダード（反応に用いた受容基質のオリゴ糖の還元末端にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付加した構造の標識オリゴ糖）の保持時間と一致することを指標に行うことができる。
【０１４９】
（ｉｉ）無標識のオリゴ糖を受容基質に用いる方法
標識しないオリゴ糖を受容基質として用いて（ｉ）と同様に反応を行い、ＨＰＬＣの代わりに高速陰イオン交換クロマトグラフィーで反応液を分析する。糖供与体のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを添加しない場合に比べて添加した場合に増加するピークを生成物のピークとして生成物の量を測定し、添加した受容基質に対する生成物の割合を、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性とする。添加した受容基質に対する生成物の割合を、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性とする。生成物の同定は、生成物の高速陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出時間が、スタンダード（反応に用いた受容基質のオリゴ糖の還元末端にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付加した構造のオリゴ糖）の溶出時間と一致することを指標に行うことができる。
【０１５０】
（ｉｉｉ）糖脂質を受容基質に用いる方法
糖脂質を受容基質とし、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として反応を行う。反応液から逆相クロマトグラフィーにより糖脂質を抽出し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートを用いて展開する。プレート上の放射能を測定することにより生成物の検出と定量を行う。添加した受容基質に対する生成物の割合をβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性とする。生成物の同定は、生成物のＲｆ値がスタンダード（受容基質に用いた糖脂質の還元末端にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付加した構造の糖脂質）のＲｆ値と一致することを指標に行うことができる。
【０１５１】
また、以下のようにして本発明のポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏでの糖鎖の合成に関与するか否かを解析することができる。（２）の記載に基づいて、動物細胞に本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを導入して作製した形質転換細胞を培養し、本発明のポリペプチドを発現させる。該形質転換細胞について、各種の糖鎖（ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖、シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖）に特異的に結合する抗体やレクチンを用いて蛍光染色した後、フルオレッセンス・アクティベーテッド・セル・ソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；以下、ＦＡＣＳと略記する）を用いて、抗体やレクチンが結合する糖鎖の量を解析する。
【０１５２】
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含まないコントロールベクターを導入した形質転換細胞と比較して、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖量の増加を確認することにより、本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドが、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有していることがわかる。
【０１５３】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体やレクチンとしては、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識するものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体としては、直鎖状のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（ｉ抗原）を特異的に認識する抗ｉ抗体、および分岐鎖を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（Ｉ抗原）を特異的に認識する抗Ｉ抗体〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，３２２１（１９７９）〕、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識するレクチンとしては、ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ（ＰＷＭと略す）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＥＡと略す）、Ｄａｔｕｒａｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＳＡと略す）を用いることができる〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，８１７９−８１８９（１９８７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，６２５３−６２６０（１９８４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１６０２−１６０７（１９８７）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２０，１８７−１９５（１９８３）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２０，２８３−２９２（１９８３）、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．７，３２３−３３４（１９９０）〕。
【０１５４】
本発明のポリペプチドが糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質の糖鎖のｉｎ ｖｉｖｏでの合成に関与していることは、上記の方法において、該形質転換細胞の培養時にそれぞれの複合糖質の糖鎖に特異的な糖鎖合成阻害剤を添加し、糖鎖の合成を阻害した細胞をＦＡＣＳ解析することにより確認できる。例えば、糖蛋白質のＯ結合型糖鎖の合成に特異的な阻害剤の存在下で、該形質転換細胞を培養した後、該形質転換細胞をポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体を用いて蛍光染色しＦＡＣＳ解析したときに、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖量が低下していることにより、本発明のポリペプチドが糖蛋白質のＯ結合型糖鎖中のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与していることがわかる。
【０１５５】
複合糖質の糖鎖に特異的な糖鎖合成阻害剤としては、糖蛋白質のＯ結合型糖鎖の合成阻害剤であるＢｅｎｚｙｌ−α−ＧａｌＮＡｃ、糖蛋白質のＮ結合型糖鎖の合成阻害剤として働くマンノシダーゼＩＩ阻害剤のスワインソニン、糖脂質糖鎖の合成阻害剤として働くグルコシルセラミド合成酵素の阻害剤であるＤ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）等をあげることができる。
【０１５６】
また、動物細胞に本発明のポリペチドの発現ベクターを導入した形質転換細胞と本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含まないコントロールベクターを導入した形質転換細胞から糖脂質を抽出し、両者の糖脂質の組成をＴＬＣプレートを用いて分析し比較することにより、本発明のポリペプチドが糖脂質の糖鎖の合成に関与することを確認できる。糖脂質の抽出および組成の分析は公知の方法〔秀潤社 細胞工学別冊 グライコバイオロジー実験プロトコール、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３，２３２（１９９４）〕に従って行うことができる。ＴＬＣプレートで展開した糖脂質はオルシノール染色、あるいは特定の糖鎖構造と結合する抗体を用いた免疫染色により検出および定量をし、スタンダードとなる糖脂質のＲｆ値と比較することにより同定する。例えば、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を認識する抗体を用いてパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）およびネオラクトヘキサオシルセラミド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）を免疫染色したとき、本発明のポリペプチドを発現する形質転換細胞がコントロールの形質転換細胞と比較して、パラグロボシドおよびネオラクトヘキサオシルセラミドの量が増加していることにより、本発明のポリペプチドがパラグロボシドおよびネオラクトヘキサオシルセラミドの合成に関与していることがわかる。
【０１５７】
本発明のポリペプチドは、炎症性疾患、癌、癌の転移等、本発明のポリペプチドの発現変動を伴う疾患の治療、予防および／または診断のための医薬として利用することができる。
【０１５８】
本発明のポリペプチドを含有する医薬は、薬剤として該ポリペプチド単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の坦体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１５９】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１６０】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該蛋白質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１６１】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０１６２】
さらに、本発明のラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡを取得できたことで、以下に示すような機能解析や応用が可能になる。
（ｉ）分子生物学的手法、あるいはノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどを用いた本発明のポリペプチドの機能解析。
（ｉｉ）本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現分布解析。
（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現と各種疾患との関連の解析。
（ｉｖ）本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を指標とした疾患の診断。
（ｖ）本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現を指標とした細胞の種類や分化ステージの同定。
（ｖｉ）本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現や本発明のポリペプチドが有する酵素活性を増強または抑制する化合物の探索。
（ｖｉｉ）本発明のポリペプチドを用いた有用糖鎖の合成。
以下に、本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの使用例について具体的に記す。
【０１６３】
（４）Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造と利用
本発明のポリペプチドは、受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性、即ちβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有している。従って、本発明のポリペプチドは、糖鎖合成剤として利用できる。受容基質としては、例えば、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質等が挙げられる。本発明のポリペプチドは上記ｉ）〜ｉｉｉ）より選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する酵素活性を有する。複合糖質としては、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質が挙げられる。ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質としては、例えば、ラクトシルセラミドまたはパラグロボシドなどが挙げられる。
【０１６４】
Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造（ｎは１以上の整数）、または（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造（ｎは１以上の整数）等を挙げることができる。
【０１６５】
以下にその詳細を記す。
（ｉ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換体を用いた糖鎖の製造法
上記（３）で取得した微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体から選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にＮ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質、具体的には、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ネオラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成、蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することにより、該糖鎖または複合糖質を製造することができる。
【０１６６】
培養は上記（３）に準じて行うことができる。上記形質転換体において、本発明のポリペプチドと任意の組換え糖タンパク質（例えば医薬用組換え糖タンパク質）を、糖鎖合成可能な形質転換体中で同時に生産させることにより、該組換え糖タンパク質にＮ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖を付加することができる。
【０１６７】
（ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した動物個体または植物個体を用いた糖鎖の製造法
上記（３）で取得した動物個体または植物個体を用い、上記（３）の方法に準じて、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
【０１６８】
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質、具体的には、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ネオラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該生成物を採取することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
【０１６９】
該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等を挙げることができる。
【０１７０】
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該生産物を採取することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
【０１７１】
（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドを用いた糖鎖の製造法
上記（３）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、水性媒体中で、ガラクトース単糖、ガラクトース残基を非還元末端に有するオリゴ糖、またはガラクトース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質を受容基質として、該糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基またはガラクトース単糖に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付与された反応産物を、以下の方法で製造することができる。
【０１７２】
即ち、ｉ）ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、またはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｖ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質からなる群より選ばれる少なくとも一種を受容基質として、上記（３）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、該受容基質、該酵素源およびウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと称する）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトースまたはガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該反応産物を製造することができる。
【０１７３】
酵素源は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を基質として、３７℃で１分間に１μモルのＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
【０１７４】
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などを挙げることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。また、上記（２）記載の培養により得られた形質転換体の培養液、上記（２）記載の非ヒトトランスジェニック動物より得られたミルクを水性媒体として用いることもできる。水性媒体に、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
【０１７５】
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【０１７６】
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとしては、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。該ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは０．１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いることができる。
【０１７７】
上記において、ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、またはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖としては、上記の他に、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、またはこれらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖などを挙げることができる。ガラクトース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質としては、上記オリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖を含有する複合糖質、あるいはアシアロ複合型Ｎ結合型糖鎖を含有する複合糖質などを挙げることができる。具体的には、例えば、ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）やパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）などの糖脂質を挙げることができる。
【０１７８】
受容基質は０．０１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いることができる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２等の無機塩、β−メルカプトエタノール、ポリエチレングリコール等を添加することができる。生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
【０１７９】
上記方法により生産される糖鎖または複合糖質より、公知の酵素的手法または化学的手法により糖鎖の一部を切り出すことができる〔日本生化学会編，続生化学実験講座，第４巻，複合糖質研究法Ｉ，ＩＩ，東京化学同人，（１９８６年）、谷口直之・鈴木明身・古川清・菅原和幸 監修，グリコバイオロジー実験プロトコール，秀潤社，（１９９６年）〕。
【０１８０】
また、上記方法により得られるＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を受容基質として用い、（ａ）該受容基質、（ｂ）ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素、および（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（以下、ＵＤＰ−Ｇａｌと称す）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，４結合でガラクトースが付与された反応産物を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該ガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質を採取することにより該ガラクトースが付与された該糖鎖または複合糖質を製造することができる。
【０１８１】
また、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖〔（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）構造が２回以上繰り返す糖鎖〕は、ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素とＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が交互に働くことにより合成されることが知られている。従って、ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素と本発明のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成することができる。
【０１８２】
即ち、本発明のポリペプチドを酵素源として用い、（ａ）ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素、（ｂ）ｉ）ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｖ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質、およびｖ）上記の方法により得られる糖鎖または複合糖質から選ばれる受容基質、（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルラクトサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、および（ｄ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された反応産物を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を採取することにより、該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された該糖鎖または複合糖質を製造することができる。
【０１８３】
さらに、ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子と本発明のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞中で共発現することにより、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖あるいは該糖鎖が付加した複合糖質を生産することができる。ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素はほとんどの細胞で発現しているため、Ｇａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡのみを細胞中で発現することによっても、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖あるいは該糖鎖が付加した複合糖質を生産することができる。
【０１８４】
（ｉｖ）各種糖鎖または複合糖質の利用法
以上のようにして製造された各種糖鎖または複合糖質の利用法として、例えば以下のような応用が考えられる。
【０１８５】
ヒトの乳中にはラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）やラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、あるいはそれらを母核とする構造を有する様々なオリゴ糖が存在することが知られている〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）〕。該オリゴ糖は共通してＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有している。また、該オリゴ糖の中にはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を有するオリゴ糖も含まれる。これらのオリゴ糖には、乳児がウイルスや微生物に感染するのを防ぐ働きや、毒素を中和する働きがあると考えられている。また、善玉の腸内細菌であるビフィズス菌の増殖を促す活性も知られている。一方、ウシやマウスなどの動物の乳中に存在するオリゴ糖の種類は少なく、大部分がラクトースであり、ヒト乳中に存在する上記オリゴ糖はほとんど存在しない。
【０１８６】
ヒトの乳中に含まれる上記オリゴ糖、あるいはそれらが含まれたミルクを効率よく生産することができれば、産業上非常に有用と考えられる。本発明のラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドが、乳腺においてヒトの乳中に含まれる上記オリゴ糖の合成に関与している可能性があり、抗感染症および善玉ビフィズス菌の増殖促進に有効なオリゴ糖の生産に利用できる可能性がある。
【０１８７】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、タンパク質の安定化に寄与していることから、任意のタンパク質に人為的にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を付加することにより、タンパク質を安定化することができる。また、血中タンパク質の腎臓からのクリアランス速度は、タンパク質の実効分子量が大きいほど遅くなることから、任意のタンパク質に人為的にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を付加し、実効分子量を増加させることにより、腎臓からのクリアランス速度を低下させ、血中安定性を増加させることができる。さらに、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を付加することにより、任意のタンパク質を特定の細胞にターゲティングすることもできる。
【０１８８】
（５）本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの利用
本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いた利用法について、以下にその詳細を記す。
【０１８９】
（ｉ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量の定量
また、本発明のＤＮＡあるいは該ＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量、または遺伝子の構造変化を検出することができる。
【０１９０】
本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現量を定量または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡやｍＲＮＡの構造変化を検出する方法としては、例えば（ａ）ノーザンブロット法（ｂ）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼイション法、（ｃ）定量的ＰＣＲ法／リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）法、（ｄ）デファレンシャル・ハイブリダイゼイション法、（ｅ）ＤＮＡマイクロアレイ法／ＤＮＡチップ法、（ｆ）ＲＮａｓｅ保護アッセイ法などの方法等が挙げられる。
【０１９１】
上記方法による分析に供する検体としては、培養細胞あるいは各種組織、血清、唾液等の生体試料、（３）に記載した形質転換体から取得したＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用いられる。以後、該ｍＲＮＡおよび全ＲＮＡを検体由来ＲＮＡと称する。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。
【０１９２】
ノーザンブロット法では、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、本発明のＤＮＡより調製した標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的に結合したバンドを検出することにより、該ｍＲＮＡの発現量ならびに構造の変化を検出することができる。ハイブリダイゼーションを行う際には、検体由来ＲＮＡ中の該ｍＲＮＡとプローブが安定なハイブリッドを形成する条件でインキュベーションする。偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている。
【０１９３】
ノーザンブロット法に用いる標識プローブは、例えば、公知の方法（ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナージング）により放射性同位体、ビオチン、蛍光基、化学発光基等を、本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡの１００塩基以上の部分断片、あるいは該ＤＮＡの配列から設計したオリゴヌクレオチドに取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量は該ｍＲＮＡの発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該ｍＲＮＡの発現量を定量することができる。また、標識プローブ結合部位を分析することで、該ｍＲＮＡの構造変化を知ることができる。
【０１９４】
上記標識プローブ、および生体から取得した組織をパラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いてハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行うｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によって、該ｍＲＮＡの発現量を検出することができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼイションならびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニング 第２版に記載されている。
【０１９５】
定量的ＰＣＲ法、デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、あるいはＤＮＡマイクロアレイ法／ＤＮＡチップ法等による該ｍＲＮＡの検出は、検体由来ＲＮＡ、または該ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡを用いて行うことができる。以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮＡと称する。ｃＤＮＡの合成には、ランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーを用いることができる。
【０１９６】
定量的ＰＣＲ法では、検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとし、本発明のＤＮＡが有する塩基配列に基づき設計したプライマー（本発明のＤＮＡが有する塩基配列の連続した５〜１２０塩基と同じ配列を有するＤＮＡおよび本発明のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜１２０塩基と同じ配列を有するＤＮＡの１組のオリゴヌクレオチドからなる）を用いてＰＣＲを行うことで、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片が増幅される。該増幅ＤＮＡ断片の量は該ｍＲＮＡの発現量を反映することから、アクチンやグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下Ｇ３ＰＤＨと略記する。）等をコードするＤＮＡを内部コントロールとして置くことで該ｍＲＮＡの量を定量することが可能である。また、該増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離することで、該ｍＲＮＡの構造の変化を知ることもできる。本検出法では、標的配列を特異的にかつ効率的に増幅する適当なプライマーを用いることが望ましい。適当なプライマーは、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合して、変性条件で標的ｃＤＮＡからはずれる等の条件に基づき設計することができる。増幅ＤＮＡ断片の定量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ反応の内に行うことが必要である。このようなＰＣＲ反応は、各反応ごとに生産される該増幅ＤＮＡ断片を回収してゲル電気泳動で定量分析することで知ることができる。
【０１９７】
リアルタイムＰＣＲ法〔Ｊｕｎｋｏ Ｓｔｅｖｅｎｓ，実験医学（増刊），１５，４６−５１（１９９７）〕は、上記の定量的ＰＣＲと原理は同一で、ＴａｑＭａｎプローブと２種類の蛍光色素でそれぞれラベルされたフォーワードプライマー、リバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片の量を放出される蛍光量としてリアルタイムに検出できる。
【０１９８】
検体由来ｃＤＮＡをプローブとして、本発明のＤＮＡを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対してハイブリダイゼイションならびに洗浄を行うことで、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現量の変動を検出することができる。このような原理に基づく方法には、デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，３１４−３１７（１９９１）〕やＤＮＡマイクロアレイ法／ＤＮＡチップ法〔Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６，６３９−６４５（１９９６）〕と呼ばれる方法がある。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にアクチンやＧ３ＰＤＨなどの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での該ｍＲＮＡの発現の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡをもとにそれぞれ異なる標識ｄＮＴＰを用いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることで正確な該ｍＲＮＡの発現量の定量を行うことができる。
【０１９９】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ法では、まず本発明のＤＮＡの３’端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合した後、標識したｒＮＴＰの存在下、ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎｖｉｔｒｏで転写を行わせることにより、標識されたアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡは、検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、ＲＮａｓｅで消化し、消化から保護されたＲＮＡ断片をゲル電気泳動によりバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量することで、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現量を定量することができる。
【０２００】
上記に挙げた検出方法は、炎症性疾患、癌または癌の転移等、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現変化を伴う疾患の検出または診断に利用することができる。上記の検出または診断を行う場合は、炎症性疾患、癌または癌の転移を有する患者、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現変化を伴う疾患を有する患者、また健常者より取得したＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡを検体として用いる。該ＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡは、患者または健常者の各種組織、血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞から取得することができる。複数の患者および健常者の検体について本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を上記にあげた検出方法で測定して比較し、患者および健常者の該遺伝子の発現レベルの範囲を決定する。被験者の検体の該遺伝子の発現レベルを健常者の発現レベルと比較することにより、該遺伝子の発現変化を伴う疾患の検出または診断を行うことができる。
【０２０１】
尚、本発明のポリペプチド以外にも既に２種類のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素がクローニングされているが、特定のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の発現を検出するためには、遺伝子の塩基配列に基づいた検出法（例えばノーザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法）を用いる必要がある。本発明のＤＮＡにより、既にクローン化された２種の酵素と区別して、その発現を正確に調べることが可能となる。
【０２０２】
以下に発現量の定量の具体例を記す。
ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の発現により、血球細胞の分化、神経細胞の相互認識やマイグレーションが制御されていると考えられており、本酵素の発現異常や、本酵素の変異による活性低下や活性増強により、各種疾患が起こる可能性が推測されているが、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することで、上記各種疾患の診断を行うことができる。
【０２０３】
例えば、骨髄性白血病とリンパ球性白血病の治療は異なることから、この２種の白血病を正確に区別する方法があれば、医療上非常に有用であると考えられている。骨髄系細胞株では、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出されるのに対し、リンパ球系細胞株では活性が検出されないことから、骨髄性白血病の細胞では本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が発現し、リンパ球性白血病の細胞では本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が発現していないと推定される。患者から採取した白血病細胞からｍＲＮＡ、全ＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの１００ｂｐ以上の部分断片あるいは本発明のＤＮＡの塩基配列より設計した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量することで、骨髄性白血病とリンパ球性白血病を区別できる。
【０２０４】
（ｉｉ）本発明のＤＮＡのプロモーター領域および転写制御領域の取得、同定
更に、本発明のＤＮＡをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該ＤＮＡのプロモーター領域および転写制御領域を取得、同定することが可能である。
【０２０５】
マウス、ラットあるいはヒトの細胞や組織から単離した染色体ＤＮＡを用いて作製したゲノムＤＮＡライブラリーに対して、本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド（特にｃＤＮＡの５’側の部分）をプローブとして、プラークハイブリダイゼーション等の方法でスクリーニングすることにより、本発明のＤＮＡのマウス、ラットあるいはヒトのゲノムＤＮＡ上のプロモーター領城および転写制御領域を得ることができる。また、得られたゲノムＤＮＡの塩基配列とｃＤＮＡの塩基配列を比較することにより該ＤＮＡのエキソン／イントロン構造を明らかにすることができる。なお、同様の方法を用いて、他の非ヒトほ乳動物においても該ＤＮＡのプロモーター領域および転写制御領域を取得することができる。
【０２０６】
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。従って、本発明のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡの配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、その構造を明らかにできる。ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造を決定することができる。
【０２０７】
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域および転写制御領域が挙げられる。転写制御領域としては、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の基本転写を増強するエンハンサー配列および減弱するサイレンサー配列などを含む領域が挙げられる。例えば、白血球細胞、神経細胞、気管の細胞、肺細胞、大腸細胞、胎盤の細胞、神経芽細胞腫細胞、グリオブラストーマ細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞および白血病細胞から選ばれる細胞で機能しているプロモーター領域および転写制御領域を挙げることができる。得られたプロモーターおよび転写制御領域は後述のスクリーニング方法に利用することができる他、該遺伝子の転写の制御機構を解析するのに役立つ。
【０２０８】
（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの変異および多型の検出
本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素はポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成にも関与することから、白血球におけるシアリルルイスｘ糖鎖や、癌細胞における癌関連糖鎖（シアリルルイスｘ糖鎖、シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ダイメリック・ルイスａ糖鎖）の合成に関与すると考えられる。従って、本発明のＤＮＡの変異や多型を調べることにより、炎症性疾患、癌または癌転移の診断、あるいは癌の予後の予測が可能と考えられる。
【０２０９】
また、本発明のＤＮＡまたはポリペプチドを用いて、本発明のＤＮＡの多型および変異と、該ＤＮＡが発現している臓器における疾患との関連を調べることにより、該遺伝子の多型および変異に基づく該遺伝子の機能異常など他の疾患の診断にも利用できる。
【０２１０】
以下に本発明のＤＮＡの変異を検出する方法について述べる。
本発明のＤＮＡ中に存在する疾患の原因となる変異の存在の有無を評価するための最も明確な試験は、対照集団からのＤＮＡと疾患患者からのＤＮＡとを直接比較することである。
【０２１１】
具体的には、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの変異が原因となっている疾患の患者ならび健常者から、組織、血清、唾液等のヒト生体試料、あるいは該生体試料から樹立した初代培養細胞を集め、該生体試料または該初代培養細胞からＤＮＡを抽出する（以後、該ＤＮＡを検体由来ＤＮＡと称する）。次いで、該検体由来ＤＮＡをテンプレートとして、本発明のＤＮＡが有する塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅する。別法として、上記の生体試料または該初代培養細胞由来のｃＤＮＡをテンプレートとして同様のＰＣＲを行うことで、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅することができる。このようにして取得した患者由来の該増幅ＤＮＡと健常者由来の該増幅ＤＮＡを比較することにより、変異の有無を調べることができる。比較の方法としては、該増幅ＤＮＡの塩基配列を直接調べる方法、野生型の配列を有するＤＮＡと変異を有するＤＮＡとのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法（下記参照）等を用いることができる。
【０２１２】
また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに上記疾患の原因となる変異があるかどうかを検出する方法として、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
【０２１３】
ヘテロ二本鎖を検出する方法には、（ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法〔Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，７，５（１９９１）〕、（ｂ）一本鎖コンフォメーション多型解析法〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，３２５−３３２（１９９３）〕、（ｃ）ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ，ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）〔Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６），Ｔｏｍ Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｐ．Ｒｅａｄ（ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）〕、（ｄ）ミスマッチの酵素的切断法〔Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９，１０３−１０４（１９９６）〕、（ｅ）変性ゲル電気泳動法〔Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２８８，１０３−１１２（１９９３）〕等の方法が挙げられる。
【０２１４】
（ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法
検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２に記載の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅する。プライマーは、２００ｂｐ以下のＤＮＡが増幅するようにデザインする。増幅したＤＮＡ（患者由来のＤＮＡ、または患者由来の増幅ＤＮＡと健常人由来の増幅ＤＮＡを混合したもの）を熱変性により一本鎖ＤＮＡに変換後、緩やかに温度を下げることにより、再度二本鎖ＤＮＡを形成させる。該二本鎖ＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。ヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができる。特製のゲル（Ｈｙｄｒｏ−ｌｉｎｋ，ＭＤＥなど）を用いた方が分離度はよい。２００ｂｐよりも小さい断片の検索ならば、挿入、欠失、ほとんどの１塩基置換を検出可能である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション多型解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。
【０２１５】
（ｂ）一本鎖コンフォメーション多型解析法（ＳＳＣＰ解析；ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）
（ａ）に記載した方法で調製した増幅ＤＮＡを変性後、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。ＤＮＡ増幅を行う際にプライマーを放射性同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅した該ＤＮＡをバンドとして検出することができる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、変異を持った断片を移動度の違いから検出できる。
【０２１６】
（ｃ）ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法）
検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２に記載の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅する。次いで、本発明のＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をとり込ませた標識ＤＮＡと該増幅ＤＮＡをハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ変異を検出することができる。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
【０２１７】
（ｄ）ミスマッチの酵素的切断法
上記（ｃ）の四酸化オスミウムの代わりにＴ４ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮａｓｅＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
【０２１８】
（ｅ）変性ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）
（ｃ）に記載した方法で調製した増幅ＤＮＡを、化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。増幅したＤＮＡ断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。該ＤＮＡに変異がある場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル内での移動度が異なることから、変異の存在を検出することが可能である。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けるとよい。
【０２１９】
該ＤＮＡの変異を検出する別の方法として、タンパク質短縮試験（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＰＴＴ法）〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０，１−４（１９９４）〕がある。該試験によりポリペプチドの欠損を生み出すフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出することができる。具体的には、検体由来ｃＤＮＡ（染色体遺伝子にイントロンがない場合には検体由来ＤＮＡも使用可能）をテンプレートとして、配列番号２に記載の塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本発明のポリペプチド全長をコードするＤＮＡを増幅する。その際、該ポリペプチドのＮ末端側に対応するプライマーの５’末端には、Ｔ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列を付加しておく。該増幅ＤＮＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、翻訳を行うことにより、ポリペプチドを生産することができる。該ポリペプチドをゲルに泳動した際の永動位置から、ポリペプチドの欠損を生み出す変異の有無を知ることができる。該ポリペプチドの泳動位置が完全長ポリペプチドに相当する位置にあれば欠損を生み出す変異は存在しない。一方、該ポリペプチドに欠損がある場合は、完全長ポリペプチドより小さい位置に該ポリペプチドは泳動され、該位置より変異の位置を予測することができる。
【０２２０】
本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子中のコード領域以外の変異に起因する疾患も存在し得る。非コード領域中の変異に起因する疾患の患者では、ｍＲＮＡのサイズや発現量に異常が検出されるため、ノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ法によりそれらの異常を調べることができる。
【０２２１】
非コード領域における変異の存在が示唆された場合は、該遺伝子のプロモーター領域、転写制御領域、あるいはイントロン領域に変異があるかどうかを検査する。上記遺伝子領域は、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをハイブリダイゼイション用のプローブとして用いることにより、クローン化することができる。また、上記遺伝子領域の配列情報は、各種データベースに登録されたヒト染色体遺伝子配列と比較することによっても得られる場合がある。実施例１２に示したように、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子の場合にはイントロンは存在しなかった。非コード領域における変異は上述のいずれかの方法に準じて探索することができる。
【０２２２】
本発明のＤＮＡの多型解析は、該ＤＮＡの遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、サザンブロット法、ダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる〔臨床検査，４２，１５０７−１５１７（１９９８）、臨床検査，４２，１５６５−１５７０（１９９８）〕。
【０２２３】
見い出された変異や多型は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｉｎｋａｇｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）に記載された方法に従い統計処理を行うことで、疾患との連鎖があるＳＮＰｓ（シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム）として同定することができる。また、上記疾患の病歴を持つ家族から、先に示した方法に従いＤＮＡを取得し、変異を検出することで、疾患の診断をすることができる。
【０２２４】
（ｉｖ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写および翻訳の抑制
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕等を用い、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写または翻訳を抑制することができる。例えば、本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを投与することにより、本発明のポリペプチドの生産を抑制することができる。即ち、本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いることにより、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写、または本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を、それぞれ抑制できる。該抑制方法は、炎症性疾患、癌、癌の転移等、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現変動を伴う疾患の治療または予防のための医薬として利用することができる。
【０２２５】
本発明のポリペプチドは、癌細胞においてネオラクト系糖脂質やラクト系糖脂質の合成に関与していると考えられる。従って、本発明のＤＮＡの転写およびポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより、癌の治療が可能と考えられる。
【０２２６】
また、上述の炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、白血球や癌細胞上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制することによって、炎症反応を抑制したり癌転移を防止することが期待できる。本発明のＤＮＡの転写およびポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより、白血球や癌細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制することができる可能性がある。
【０２２７】
また、特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与しているＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は異なることが考えられる。ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が、特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与している可能性があり、本発明のＤＮＡの転写およびポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより、該ポリペプチドを発現している特定の白血球や癌細胞のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成を特異的に抑制することができると考えられる。
【０２２８】
（ｖ）本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡの部分断片または本発明のオリゴヌクレオチドを含有する医薬は、（３）に記載した本発明のポリペプチドを含有する医薬に準じた方法で作製および投与することができる。
【０２２９】
（６）本発明のポリペプチドを認識する抗体の生産
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上述（３）の方法により取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
【０２３０】
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
【０２３１】
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊１９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
【０２３２】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
【０２３３】
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法が挙げられる。
【０２３４】
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【０２３５】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。
【０２３６】
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
【０２３７】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
【０２３８】
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
【０２３９】
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
【０２４０】
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
【０２４１】
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法を挙げることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【０２４２】
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドの抗ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０２４３】
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
【０２４４】
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０２４５】
（ｅ）中和抗体
本発明の抗体には、本発明のポリペプチドと結合することにより本発明のポリペプチドの活性を抑制できる性質を持つ中和抗体が含まれる。（３）に記載の方法で本発明のポリペプチドの活性を測定するときに、上記で得られた抗体を添加して測定し、該抗体を添加しなかった場合と比較して本発明のポリペプチドの活性が低下する場合には、該抗体が中和抗体であると確認できる。
【０２４６】
（７）本発明の抗体の利用
（ｉ）本発明のポリペプチドの検出および定量
本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体を用い、抗原抗体反応を行わせることにより、本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドを含む細胞または組織を免疫学的に検出することができる。該検出法は、炎症性疾患、癌、または癌の転移等、本発明のポリペプチドの発現変動が伴う疾患の診断に利用することができる。また、該検出方法は、タンパク質の定量にも用いられる。
【０２４７】
免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）、続生化学実験講座５，免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕等が挙げられる。
【０２４８】
蛍光抗体法とは、本発明のポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【０２４９】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【０２５０】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
【０２５１】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、該ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【０２５２】
ウェスタンブロッティング法とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の該ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【０２５３】
ドットブロッティング法とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【０２５４】
免疫沈降法とは、本発明のポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を該ポリペプチドを特異的に認識する抗体と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
【０２５５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体を吸着させたプレートに、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を反応させた後、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、またはペルオキシダーゼやビオチンなどの酵素で標識した本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体（上記抗体とは抗原認識部位が異なる）を反応させ、標識物質に応じた反応を行う方法である。
【０２５６】
尚、本発明のポリペプチド以外にも既に２種類のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素がクローニングされているが、特定のＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の発現を検出するためには、特異的抗体を用いた免疫的検出を用いる必要がある。従って、本発明の抗体により、本発明のポリペプチドの発現を正確に調べることが可能となる。
【０２５７】
（ｉｉ）炎症性疾患や癌の診断および治療への利用
ヒト生体試料ならびヒト初代培養細胞での、該ポリペプチドの発現量の変化ならびに発現しているポリペプチドの構造変化を同定することは、将来、疾患を発症する危険性や既に発症した疾患の原因を知る上で有用である。
【０２５８】
本発明のポリペプチドは、白血球や癌細胞においてネオラクト系糖脂質やラクト系糖脂質の合成、あるいはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与していることが示唆される。従って、本発明の抗体を用いて、白血球または癌細胞等における本発明のポリペプチドの発現量を調べたり、本発明の中和抗体を用いて本発明のポリペプチドの活性を制御することにより、炎症性疾患や癌の悪性度の診断、予防および治療が可能となる。
【０２５９】
また、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の発現により、血球細胞の分化、神経細胞の相互認識やマイグレーションが制御されていると考えらており、本酵素の発現異常や、本酵素の変異による活性低下や活性増強により、各種疾患が起こる可能性がある。従って、本発明の抗体を用いて、血球細胞または神経細胞における本発明のポリペプチドの発現量を調べたり、本発明の中和抗体を用いて本発明のポリペプチドの活性を制御することにより、血球細胞の分化、または神経細胞の相互認識やマイグレーションが関与する疾患の診断、予防および治療が可能となる。
【０２６０】
例えば、骨髄性白血病とリンパ球性白血病の治療は異なることから、この２種の白血病を正確に区別する方法があれば、医療上非常に有用であると考えられる。骨髄系細胞株では、ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出されるのに対し、リンパ球系細胞株では活性が検出されないことから、骨髄性白血病の細胞では本発明のポリペプチドが発現し、リンパ球性白血病の細胞では本発明のポリペプチドが発現していないと推定される。患者から採取した白血病細胞における本酵素蛋白質の発現を本発明の抗体で検出することにより、骨髄性白血病とリンパ球性白血病を区別できる可能性がある。
【０２６１】
また、特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与しているＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は異なることが考えられる。ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が、特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与している可能性があり、本発明のポリペプチドが有するラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を中和抗体により抑制することにより、該ポリペプチドを発現している特定の白血球や癌細胞のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成を特異的に抑制することができる。
【０２６２】
該ポリペプチドの発現量や構造変化を検出して診断する方法としては、上記の蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。
【０２６３】
上記方法による診断に供する検体としては、炎症性疾患、癌または癌の転移等、本発明のポリペプチドの発現変動が伴うことが知られている疾患の患者より取得した組織、血液、血清、尿、便、唾液等の生体試料そのものあるいは、該生体試料から取得した細胞ならびに細胞抽出液が用いられる。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。
【０２６４】
免疫学的に検出する方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が挙げられる。
免疫学的に定量する方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドを認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等が挙げられる。
【０２６５】
本発明の抗体を含有する医薬は、（３）に記載した本発明のポリペプチドを含有する医薬に準じた方法で作製および投与することができる。
【０２６６】
（８）本発明のポリペプチドを生産する組換えウイルスベクターの調製法
以下に、本発明のポリペプチドを特定のヒト組織内で生産するための組換えウイルスベクターの調製法について述べる。
【０２６７】
本発明のＤＮＡの完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列の１３５〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２で表される塩基配列の２４９〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
【０２６８】
完全長ｃＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡ断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
【０２６９】
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、本発明の遺伝子の完全長ｃＤＮＡに相同なｃＲＮＡ，若しくは該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片に相同なＲＮＡ断片を調整し、それらを、ウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖の他、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のどちらか一方の１本鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同するＲＮＡを、センダイウイルスベクターの場合は、逆にアンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。
【０２７０】
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、対応する組換えウイルスベクターにおいて欠損しているウイルスのパッケジーングに必要な遺伝子がコードするタンパク質を補給できる細胞は全て用いることができ、例えば下記タンパク質を発現したヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。
【０２７１】
パッケージング細胞で補給するタンパク質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖなどのタンパク質が、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，ｖｐｒ，ｖｐｕ，ｖｉｆ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｎｅｆなどのタンパク質、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ・Ｅ１Ｂなどのタンパク質が、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０），Ｖｐ（Ｃａｐ）などのタンパク質が、センダイウイルスの場合はＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＨＮなどのタンパク質が挙げられる。
【０２７２】
ウイルスベクターとしては上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７（１９９５）〕、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，３５８７−３５９６（１９９０）〕、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８１５０−８１５７（１９９８）〕、ｐＡｄｅｘ１〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，３８１６−３８２１（１９９５）〕等が用いられる。
【０２７３】
プロモーターとしては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０２７４】
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔特開平２−２２７０７５号公報〕、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。
【０２７５】
本発明のＤＮＡおよび該ＤＮＡに相同な配列からなるＲＮＡを含有するウイルスベクターは、後述する遺伝子治療剤として、炎症性疾患、癌、癌の転移等、本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現変動を伴う疾患の治療または予防のための医薬として利用することができる。
【０２７６】
（９）スクリーニング法への応用
本発明のポリペプチドは、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性即ち、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有している。具体的には、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）ラクトシルセラミドまたはパラグロボシドなどを含む、ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有している。従って、本発明のポリペプチドと被験試料とを接触させることにより、上記の活性を変動させる化合物をスクリーニングすることができる。
【０２７７】
また、本発明のポリペプチドは、各種細胞においてネオラクト系糖脂質やラクト系糖脂質の合成、あるいはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与することから、該ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を増強または阻害する化合物を用いて、細胞におけるネオラクト系糖脂質、ラクト系糖脂質、あるいはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を増加または低下させることが可能である。
【０２７８】
また、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物からタンパク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、該ポリペプチドの発現を制御し、細胞におけるネオラクト系糖脂質、ラクト系糖脂質、あるいはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を制御することが可能である。
【０２７９】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖上に存在するシアリルルイスｘ糖鎖やシアリルルイスａ糖鎖は、セレクチンのリガンドとなることが知られていることから、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を抑制する化合物は、抗炎症や癌転移抑制に有用と考えられる。一方、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を増加させる化合物は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成やポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付加した複合糖質の生産に有用と考えられる。
【０２８０】
該化合物は、以下（ｉ）〜（ｖｉ）に示す方法により取得可能である。
（ｉ）上記（３）で記載した方法を用いて調製した本発明のポリペプチド（精製物あるいは該ポリペプチドを発現する形質転換体の細胞抽出液または培養上清）を酵素として用い、被験化合物の存在下、（３）に記載した方法を用いてβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定し、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し、取得する。
【０２８１】
（ｉｉ）本発明のポリペプチドを発現する細胞または上記（２）で記載した形質転換体を、被験化合物の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞表面のパラグロボシドまたはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の量を、パラグロボシドを認識する抗体、またはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体（抗ｉ抗体、抗Ｉ抗体）やレクチン（ＬＥＡ、ＰＷＭ、ＤＳＡ）を用いて測定し、該糖鎖量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し、取得する。
【０２８２】
上記抗体やレクチンを用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法を挙げることができる。また、ＦＡＣＳを用いて測定することもできる。
【０２８３】
（ｉｉｉ）該ポリペプチドの一部を構成するペプチドを多数、プラスチックピンまたはある種の固体支持体上で高密度に合成し、該ペプチドに選択的に結合する化合物を効率的にスクリーニングした後（ＷＯ８４／０３５６４）、上記（ｉ）、（ｉｉ）の方法でβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を増加または低下させる活性、あるいはパラグロボシドやポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し、取得する。
【０２８４】
（ｉｖ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験化合物の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチド量を、上記（６）で記載した本発明の抗体を用いて測定し、該ポリペプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し、取得する。
該ポリペプチドの発現の増減は、上記（７）に記載した蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出できる。
【０２８５】
（ｖ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験化合物の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチドをコードするＤＮＡ転写産物の量を、上記（４）で記載したノーザンハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法またはＲＮａｓｅ保護アッセイ法等の方法を用いて測定し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し、取得する。
【０２８６】
（ｖｉ）上記（４）で取得したプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記（２）記載の動物細胞に、上記（２）に記載の方法に準じて導入し、形質転換体を取得する。該形質転換体を、被験化合物の存在下、上記（２）記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し、取得する。
【０２８７】
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等を挙げることができる。
【０２８８】
本発明のポリペプチドは、癌細胞においてネオラクト系糖脂質やラクト系糖脂質の合成に関与していると考えられる。従って、上記スクリーニングによって取得される本発明のポリペプチドまたはＤＮＡの発現を抑制する化合物を用いることにより、癌細胞におけるネオラクト系糖脂質やラクト系糖脂質の合成を抑制し、癌の治療が可能と考えられる。
【０２８９】
また、上述の炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、白血球や癌細胞上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制することによって、炎症反応を抑制したり癌転移を防止することが期待できる。上記スクリーニングによって取得される本発明のポリペプチドまたはＤＮＡの発現を抑制する化合物を用いることにより、白血球や癌細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制し、炎症反応を抑制したり癌転移を防止することが可能となると考えられる。
【０２９０】
特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与しているＧａｌβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は異なることが考えられる。ラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が、特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与している可能性があり、本発明のＤＮＡまたはポリペプチドの発現を抑制する化合物により、該ポリペプチドを発現している特定の白血球や癌細胞のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成を特異的に抑制することが期待できる。
【０２９１】
（１０）非ヒトノックアウト動物の作製
本発明のＤＮＡを含むベクターを用い、目的とする動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）において染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）〕。
【０２９２】
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体（非ヒトノックアウト動物）を得ることができる。
【０２９３】
このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。
【０２９４】
またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。この方法としては、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させる方法〔Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７（１９９６）〕やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させる方法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）〕があげられる。
【０２９５】
従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。
【０２９６】
このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。従って、本発明の非ヒトノックアウト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
【０２９７】
（１１）本発明のＤＮＡおよび該ＤＮＡに相同な配列からなるＲＮＡを含有する遺伝子治療剤
本発明のＤＮＡおよび該ＤＮＡに相同な配列からなるＲＮＡを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、（７）項で作製した組換えウイルスベクターおよび遺伝子治療剤に用いる基剤を調合することにより製造することができる〔Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）〕。本発明のＤＮＡおよび該ＤＮＡに相同な配列からなるＲＮＡを含有するウイルスベクターを用いた遺伝子治療剤は、炎症性疾患、癌、癌の転移等、本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするＤＮＡの発現変動を伴う疾患の治療または予防のための医薬として利用することができる。
【０２９８】
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウムまたは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与方法としては、患者の治療部位に吸収されるように、局所的に投与する方法を挙げることができる。
【０２９９】
適当なサイズの本発明のＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン・タンパク質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
【０３００】
ＲＮＡウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクターの他、（−）鎖ＲＮＡウイルスであるセンダイウイルスをベースにしたウイルスベクターも開発されており（特願平９−５１７２１３、特願平９−５１７２１４）、遺伝子治療を目的として本発明のＤＮＡを組み込んだセンダイウイルスベクターを作製することができる。
該ＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
【０３０１】
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）〕、マイクロインジェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４（１９８１）〕、リポソームを介した膜融合−介在移入法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）〕あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）〕等を挙げることができる。
【０３０２】
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている〔Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，３９９−４１０（１９９２）〕。従って同様の効果が本発明のＤＮＡおよびポリペプチドが関与する疾患病巣でも期待される。ＤＮＡを病巣に直接ターゲッティングするには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体−媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、タンパク質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−タンパク質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
【０３０３】
本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡと相同な配列からなるＲＮＡまたは該核酸を含む組換えベクター等を含有する上記の遺伝子治療剤を、細胞へ導入し、該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを発現させることにより、該細胞の分化、相互認識、移動などを制御することができる。その際の細胞として、例えば、血球細胞、神経細胞、幹細胞または癌細胞等が挙げられる。
【０３０４】
また、上記遺伝子治療剤を、前骨髄球細胞へ導入して発現させることにより、前骨髄球細胞の顆粒球細胞への分化を促進することができる。
【０３０５】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。但し、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【０３０６】
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例に記載の遺伝子操作的手法として、特に断らない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載された公知の方法を用いた。
【０３０７】
(実施例１) ラット頚骨由来ｃＤＮＡライブラリーからのβ１，３−ガラクトース転移酵素ホモログ（ラットＧ６）遺伝子のクローン化
（１）ＲＮＡの調製
ラット頚骨から、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）〕により、全ＲＮＡ２．２ｍｇを調製した。次いで、全ＲＮＡ２．０ｍｇをオリゴｄＴセルロースカラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に通過させることにより、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡ１５．７μｇを取得した。
【０３０８】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記（２）で取得したｍＲＮＡ４．０μｇを用いて、リンカープライマー法〔野島博編、遺伝子ライブラリーの作製法、羊土社、１９９４年〕に従い、ｃＤＮＡ合成、ＢａｍＨＩアダプターの付加、ＮｏｔＩによる切断反応を行った。得られた２本鎖ｃＤＮＡを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ間に挿入することにより、ｃＤＮＡの５’端が常にベクターのＢａｍＨＩサイト側にあるｃＤＮＡライブラリーを造成した。ｃＤＮＡライブラリー造成用の宿主としては、大腸菌ＭＣ１０６１Ａ〔モレキュラー・クローニング 第２版〕を用いた。
【０３０９】
（３）ランダムシークエンス
上記（２）で得られた各大腸菌クローンから常法に従ってプラスミドＤＮＡを取得し、各プラスミドが含有するｃＤＮＡの５’末端および３’末端の３００〜４００ｂｐの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、市販のキット（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。プライマーとしては、Ｔ３プライマー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）およびＴ７プライマー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を使用した。
【０３１０】
得られた塩基配列についてはＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）〕、該塩基配列から予想されるアミノ酸配列に関してはＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ〔Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製〕のプログラムを利用して、相同性のある遺伝子や蛋白質の解析を行った。その結果、ＯＶＸ２−０３８と名づけたプラスミドが含有するｃＤＮＡは、β１，３−ガラクトース転移酵素β３Ｇａｌ−Ｔ１（別名ＷＭ１：特開平６−１８１７５９）と相同性を有する蛋白質をコードすると考えられた。ＯＶＸ２−０３８が含有するｃＤＮＡの塩基配列（７３８ｂｐ）を配列番号３に、該ＤＮＡがコードすると考えられるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３２に示す。ＯＶＸ２−０３８が含有するｃＤＮＡは、ラットのβ１，３−ガラクトース転移酵素ホモログ（ラットＧ６と命名）をコードするｃＤＮＡの部分断片であると考えられた。
【０３１１】
(実施例２) ヒトＧ６をコードする遺伝子の検索
実施例１で取得したラットＧ６ｃＤＮＡに対応するヒトＧ６遺伝子の検索を行った。遺伝子データベースから、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）〕およびＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製）のプログラムを利用して、実施例１で取得したＯＶＸ２−０３８が含有するｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３に記載）と相同性のある遺伝子、または該ｃＤＮＡがコードすると思われるポリペプチド（配列番号３２に記載）とアミノ酸レベルで相同性を有するポリペプチドをコードする可能性のある遺伝子を検索した結果、一つのＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＩ０３９６３７）を見出した。該ＥＳＴ配列は４２８ｂｐであり、この配列情報だけでは、このＥＳＴに対応する遺伝子のコードするポリペプチドの全アミノ酸配列や該ポリペプチドの機能は分からない。
【０３１２】
(実施例３) ヒトＧ６ｃＤＮＡのクローン化
実施例２で見出したＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＩ０３９６３７）に特異的なプライマーセットを設計し、候補遺伝子断片のクローン化を試みた。プライマーとしては、配列番号４で表される塩基配列を有するＣＢ−４６２と配列番号５で表される塩基配列を有するＣＢ−４６４を使用した。該プライマーセットを用いて、各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡ、あるいは各種ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＧ６ｃＤＮＡの存在を調べた。その結果、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５由来のｃＤＮＡライブラリー、またはヒト胃粘膜由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした時に、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【０３１３】
該増幅断片をプローブとして、上記２種のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、約３ｋｂのヒトＧ６ｃＤＮＡクローンを得た。該クローンは５’末端を欠失していたため、５’ＲＡＣＥ法を用いてヒトＧ６ｃＤＮＡの５’末端側のＤＮＡを取得した。ヒトＧ６ｃＤＮＡの約３ｋｂのｃＤＮＡクローンと５’末端側のＤＮＡの塩基配列を決定し、それらの配列をつなぎ合わせることでヒトＧ６ｃＤＮＡの全長配列（配列番号２）を決定した。該配列を基に造成したプライマーを用いてＰＣＲを行い、コーディング領域全部を含むＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片の配列を決定し、ＰＣＲに由来する塩基配列に由来する塩基配列の変異がないことを確認した。具体的な方法を以下に示す。
【０３１４】
（１）ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５由来ｃＤＮＡのライブラリーの作製とＰＣＲによる解析
ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５より、ｍＲＮＡ抽出キットであるＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、約３０μｇのｍＲＮＡを取得した。具体的試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。取得したｍＲＮＡ８μｇとＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用い、オリゴｄＴをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０３１５】
これら二本鎖ｃＤＮＡの両末端に以下の方法でＳｆｉＩリンカーを付与した。ＳｆｉＩリンカーを構成する配列番号６で表される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（１１塩基）および配列番号７で表される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（８塩基）を３８０Ａ・ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて合成した。
【０３１６】
該合成一本鎖ＤＮＡをそれぞれ５０μｇずつ、別々に５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／ｌ ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）および１ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰを含む緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記する）５０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３０単位を加えて、３７℃で１６時間リン酸化反応を行ない、５’末端をリン酸化した。
【０３１７】
５’末端をリン酸化した、１１塩基の合成ＤＮＡ４μｇ、８塩基の合成ＤＮＡ２．９μｇおよび上記で合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液４５μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０５０単位を加え、１６℃で１６時間反応させ、該二本鎖ｃＤＮＡ各々にＳｆｉＩリンカーを付与した。
得られた反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。
【０３１８】
直接発現クローニングベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕２４μｇを、１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、６ｍｍｏｌ／ｌ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）５９０μｌに溶解後、８０単位のＳｆｉＩ（宝酒造社製、以下、特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行った。
【０３１９】
該反応液に４０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約８．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
【０３２０】
上記で調製したＳｆｉＩリンカーを付与した二本鎖ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ ８μｇ由来分）をＴ４リガーゼ緩衝液２５０μｌに溶解後、それぞれの溶解液に、該約８．８ｋｂのＤＮＡ断片２μｇおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位を加えて、１６℃で１６時間結合反応を行った。
反応後、それぞれの反応液にトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡからなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）２０μｌに溶解した。
【０３２１】
該反応液を用い、エレクトロポーレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕により大腸菌ＬＥ３９２株〔モレキュラー・クローニング第２版〕を形質転換し、約１００万個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０３２２】
更に、該ｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）および、プラスミド調製キットである／ｐｌａｓｍｉｄ／ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品番号 ４１０３１）を用い、ｃＤＮＡを含有するプラスミドを調製した。
【０３２３】
該プラスミドＤＮＡを鋳型、配列番号４で表される塩基配列を有するＣＢ−４６２と配列番号５で表される塩基配列を有するＣＢ−４６４をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ヒトＧ６ｃＤＮＡの存在を調べた。ＰＣＲは以下の条件で行った。１０ｎｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌヒトＧ６遺伝子特異的プライマー（ＣＢ−４６２およびＣＢ−４６４）、１ｕｎｉｔ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）からなる反応溶液（５０μｌ）を９５℃で１１分間加熱後、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして５０サイクル行った。ＰＣＲの結果、いくつかのプールからヒトＧ６ｃＤＮＡ由来と思われる約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【０３２４】
（２）ヒト胃粘膜ｃＤＮＡのライブラリーの作製
ヒト胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーは以下のように作製した。ヒト胃粘膜のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡよりｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、その両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩアダプター（Ｓｕｐｅｒ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を付加した後、クローニングベクターλＺＡＰ ＩＩ（λＺＡＰ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行うことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【０３２５】
該胃粘膜ｃＤＮＡライブラリー（ファージライブラリー）を約５万種の独立クローン毎にプール分けした後、各プールのファージ（約１×１０７個）を鋳型としてＰＣＲを行った。方法は９９℃で１０分間、熱処理したファージ（約１×１０７個）を鋳型として用いた以外は、上記（１）で述べた方法と同じである。ＰＣＲの結果、いくつかのプールからヒトＧ６ｃＤＮＡ由来と思われる約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。該ＤＮＡ断片をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて精製し、制限酵素（ＡｖａＩＩまたはＲｓａＩ）切断により該増幅断片が上記ＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＩ０３９６３７）の部分配列（配列番号２の９４６番目から１１９６番目に示した配列、２５１ｂｐ）を有することを確認した。該増幅断片は、ＡｖａＩＩ切断により、９６ｂｐ、８０ｂｐ、７２ｂｐの３つのＤＮＡ断片に、ＲｓａＩ切断により１７６ｂｐ、７２ｂｐの２つのＤＮＡ断片に消化された。
【０３２６】
（３）ヒトＧ６ｃＤＮＡのクローン化
Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、上記（２）で取得した約２５０ｂｐのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をラジオアイソトープで標識し、プローブの作製を行った。５０ｎｇの該ＤＮＡ断片とランダムプライマー、ラジオアイソトープ（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を含む反応溶液５０μｌを３７℃で３０分間反応させた。反応液の組成と操作はキットの説明書に従った。次いで、ボルテックスにより反応を停止させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを用いたゲルろ過により、ラジオアイソトープ標識プローブの精製を行った。
【０３２７】
上記（２）で増幅が見られた胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーの７プール（合計約３５万独立クローン）について、ラジオアイソトープ標識プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションを行った。
【０３２８】
プラーク由来のＤＮＡをトランスファーしたフィルター（バイオダインＡ：ＰＡＬＬ社製）を、５倍濃度のＳＳＰＥ〔１倍濃度のＳＳＰＥの組成は、１８０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸二水素ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡよりなる（ｐＨ７．４）〕、５倍濃度のデンハルト溶液〔１倍濃度のデンハルト溶液の組成は、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）フィコール４００、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドンよりなる〕、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡよりなる緩衝液（以下ハイブリダイゼーション用緩衝液と呼ぶ）２５ｍｌに浸し、６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【０３２９】
次いで、該フィルターを上記で作製したラジオアイソトープ標識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液１０ｍｌに浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０３３０】
その後、０．１倍濃度のＳＳＣ〔１倍濃度のＳＳＣの組成は、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムよりなる（ｐＨ７．０）〕、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で４２℃、２０分間浸漬する条件で２回洗浄した。
【０３３１】
該プラークハイブリダイゼーションの結果、ハイブリダイズする１１個の独立したファージクローンが得られた。ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のキットを用いてｉｎｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎを行い、各ファージクローンをプラスミドクローンに変換した。これにより、各ファージクローンのインサートｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入された形のプラスミドを取得することができる。方法はキットの説明書に従った。
【０３３２】
上記で取得した１１種のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、各プラスミドが含むｃＤＮＡのサイズを調べた。その結果、全てのプラスミドは約３ｋｂのｃＤＮＡを含むことが明らかになった。複数の制限酵素（ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＢｓｍＩ）による切断パターンから、１１種のプラスミドは全て同一であると考えられた。これらのプラスミドの１つをｐＢＳ−Ｇ６ｓと命名した。
【０３３３】
（４）プラスミドｐＢＳ−Ｇ６ｓ中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定
上記（３）で得られたｐＢＳ−Ｇ６ｓ含むｃＤＮＡの全塩基配列を、以下の方法で決定した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中の配列に特異的なプライマー〔Ｍ１３（−２０）ＰｒｉｍｅｒおよびＭ１３ Ｒｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＯＹＯＢＯ社製〕を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
【０３３４】
塩基配列の決定には、ＤＮＡシークエンサーｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）と反応キット（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ ＥＸＣＥＬ ＩＩＴＭ Ｌｏｎｇ−ＲｅａｄＴＭ ＤＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ−Ｌｃ：エア・ブラウン社製）、またはＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）と反応キット（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【０３３５】
ｐＢＳ−Ｇ６ｓが含むｃＤＮＡは、配列番号２の９８９番目から３７５０番目に示した塩基配列（全塩基配列２７６２ｂｐ）を有することが明らかになった。該塩基配列より、該ｃＤＮＡはヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素ホモログ（ヒトＧ６）をコードすると考えられたが、Ｎ末端側のポリペプチド部分を欠失していた。
【０３３６】
（５）ヒトＧ６の全長ｃＤＮＡのクローン化
上記（１）の結果から、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５でヒトＧ６転写物が発現していることが明らかとなった。そこで、Ｃｏｌｏ２０５の全ＲＮＡを鋳型として５’ＲＡＣＥ法を行うことにより、ヒトＧ６ｃＤＮＡの５’側ＤＮＡ断片の取得を試みた。５’ＲＡＣＥ法は、キット（５’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。
【０３３７】
Ｇ６ｃＤＮＡ特異的プライマーとしては、配列番号８および９に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。その結果、約４６０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。該ＤＮＡ断片を常法に従って平滑末端化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＶ部位に組み込んだ。次いで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中の配列に特異的なプライマー〔Ｍ１３（−２０）ＰｒｉｍｅｒおよびＭ１３ Ｒｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＯＹＯＢＯ社製〕を用いて、該ＤＮＡ断片の配列を決定した。塩基配列の決定には、ＤＮＡシークエンサーｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）またはＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｐｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、ならびに各シークエンサー用の反応キットを使用した。該ＤＮＡ断片（ＲＯ２−１６と命名）は、配列番号２の５１３番目から９６９番目に示した塩基配列（全塩基配列４５７ｂｐ）を有していた。該ＤＮＡ断片はＧ６ポリペプチドのＮ末端側はカバーできていなかった。そこで、さらに以下の実験を行った。
【０３３８】
上記（２）で造成した胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ベクターに特異的なプライマーとヒトＧ６ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、ヒトＧ６ｃＤＮＡの５’末端側のＤＮＡ断片を増幅することができる。具体的には、ベクターに特異的なプライマーとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中の配列に特異的なプライマーであるＭ１３ Ｒｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ヒトＧ６ｃＤＮＡ特異的プライマーとして配列番号１０で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いた。ＰＣＲ反応は、５０ｎｇ／ｍｌのｃＤＮＡライブラリー（プラスミド）を鋳型として、上記（１）に記載の条件で行った。次いで、該ＰＣＲ反応液１μｌを鋳型、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中の配列に特異的なプライマーとしてＭ１３ Ｒｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ヒトＧ６ｃＤＮＡ特異的プライマーとして配列番号９で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は上記（１）に記載の条件で行った。その結果、約１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。
【０３３９】
該ＤＮＡ断片を常法に従って平滑末端化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＶ部位に組み込んだ。次いで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中の配列に特異的なプライマー〔Ｍ１３（−２０）ＰｒｉｍｅｒまたはＭ１３ Ｒｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：いずれもＴＯＹＯＢＯ社製〕を用いて、該ＤＮＡ断片の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、ＤＮＡシークエンサーｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）またはＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）、ならびに各シークエンサー用の反応キットを使用した。該ＤＮＡ断片（Ｎｏ．１９と命名）は、配列番号２の１番目から９６９番目に示した塩基配列（全塩基配列９６９ｂｐ）を有していた。
【０３４０】
上記で決定したｐＢＳ−Ｇ６ｓが含むｃＤＮＡの配列、上記（２）で決定したＰＣＲ断片の配列、ＲＯ２−１６の配列、およびＮｏ．１９の配列を連結することにより、Ｇ６ポリペプチド全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。決定したヒトＧ６全長ｃＤＮＡの塩基配列（３７５０ｂｐ）を配列番号２に示した。該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３７８アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。このポリペプチドをＧ６ポリペプチドと呼び、アミノ酸配列を配列番号１に示す。
【０３４１】
Ｇ６ポリペプチド全長をコードするＤＮＡを取得するために、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ヒトＧ６ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。具体的には、５０ｎｇ／ｍｌのｃＤＮＡライブラリー（プラスミド）、ＥｃｏＲＩ認識配列を付加したプライマー〔ＣＢ−４９７（配列番号１１）とＣＢ−５０１（配列番号１２）〕、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含む反応溶液５０μｌ（詳しい組成はＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキットの説明書に従った）を９４℃で２分間加熱後、９４℃で２０秒間、５５℃で４５秒間、６８℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４５サイクルの反応を行うことによりＰＣＲを行った。その結果、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。該断片をＥｃｏＲＩで消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＢＳ−Ｇ６を取得した。組み込まれたＤＮＡ断片の配列を決定した結果、該ＤＮＡ断片は配列番号２の４６番目から１３７２番目で示される塩基配列を有することが確認された。塩基配列の決定には、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）と該シークエンサー用の反応キット、およびヒトＧ６ｃＤＮＡ特異的プライマーを使用した。該ＤＮＡ断片は、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３７８アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。このポリペプチドはＧ６ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有していた。ＰＣＲで増幅された約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を用いてダイレクトシークエンスを行うことにより、ｐＢＳ−Ｇ６中に組み込まれたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の配列にエラーがなかったことを確認した。
【０３４２】
上記で決定したｐＢＳ−Ｇ６ｓが含むｃＤＮＡの配列、Ｎｏ．１９の配列、およびｐＢＳ−Ｇ６の含むＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の配列を連結することにより、Ｇ６ポリペプチド全長をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。決定したヒトＧ６全長ｃＤＮＡの塩基配列（３７５０ｂｐ）は配列番号２と同じ塩基配列を有していた。
【０３４３】
(実施例４) 相同性解析
Ｇ６ポリペプチドは、これまでにクローン化された５種のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素β３Ｇａｌ−Ｔ１（特開平６−１８１７５９）、β３Ｇａｌ−Ｔ２〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕、β３Ｇａｌ−Ｔ３〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕、β３Ｇａｌ−Ｔ４〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕、β３Ｇａｌ−Ｔ５〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１２４９９−１２５０７（１９９９）〕とアミノ酸レベルでそれぞれ３５．６％、３２．８％、３０．８％、３０．３％、および３３．９％の相同性を示した。また、該ポリペプチドはこれまでにクローン化されたヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴ１）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４０６−４１１（１９９９）〕とアミノ酸レベルで２９．４％の相同性を示した。
【０３４４】
アミノ酸配列（配列番号１）から、Ｇ６ポリペプチドは糖転移酵素に特徴的なタイプＩＩ型の膜タンパク質であると考えられる。Ｎ末端の１４アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１８アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。相同性を有する上記糖転移酵素とのアミノ酸配列の比較、ならびに上記糖転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔特開平６−１８１７５９〕を基に、幹領域は少なくとも１２アミノ酸からなると予想された。従って、４５番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
【０３４５】
これらの結果および後述する実施例６、７、９および１０の結果より、該ポリペプチドは新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であり、配列番号１の３６番目から３７８番目および配列番号１の３９番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、分泌型ポリペプチドであることが明らかとなった。
【０３４６】
(実施例５) 動物細胞用発現プラスミドの造成
実施例３で取得したヒトＧ６ｃＤＮＡがコードするＧ６ポリペプチドを動物細胞で発現させるために、ヒトＧ６ｃＤＮＡを発現ベクターｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平５−３３６９６３）〕、あるいはｐＣＸＮ２〔Ｇｅｎｅ，１０８，１９３（１９９１）〕に組み込み、発現プラスミドの造成を行った。
【０３４７】
（１）Ｇ６ポリペプチドを発現させるためのプラスミドｐＡＭｏ−Ｇ６の造成
ｐＢＳ−Ｇ６を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片により平滑末端に変換した。その後、実施例３の（１）で作製したＳｆｉＩリンカーを付与し、約１３５０ｂｐのＳｆｉＩ断片を取得した。一方、ｐＡＭｏをＳｆｉＩとＢａｍＨＩで切断後、８．７ｋｂのＳｆｉＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、発現プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ６を造成した。
【０３４８】
（２）Ｇ６ポリペプチドを発現させるためのプラスミドｐＣＸＮ２−Ｇ６の造成
ｐＢＳ−Ｇ６を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、約１３３０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を取得した。一方、ｐＣＸＮ２をＥｃｏＲＩで切断後、約３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、発現プラスミドｐＣＸＮ２−Ｇ６を造成した。
【０３４９】
(実施例６) Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したヒト培養細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成
（１）Ｎａｍａｌｗａ細胞を宿主とした安定形質転換株の取得
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）および実施例５で造成したＧ６ポリペプチド発現プラスミド（ｐＡＭｏ−Ｇ６）を、それぞれ１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕によりヒトＢ細胞株Ｎａｍａｌｗａ細胞に導入し、形質転換細胞を得た。
１．６×１０６細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地〔７．５％ ＮａＨＣＯ３を１／４０量、２００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を０．５％添加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）。以下、ＲＰＭＩ１６４０培地とは、上記の添加物を添加したＲＰＭＩ１６４０培地をいう。〕８ｍｌに懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で２４時間培養した。培養後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）を０．８ｍｇ／ｍｌになるように添加し、更に１４日間培養し安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８と１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で継代した。
【０３５０】
（２）ＨＣＴ−１５細胞を宿主とした安定形質転換株の取得
コントロールプラスミド（ｐＣＸＮ２）および実施例５で造成したＧ６ポリペプチド発現プラスミド（ｐＣＸＮ２−Ｇ６）を、それぞれ１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕によりヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１５細胞に導入し、形質転換細胞を得た。
【０３５１】
８×１０６細胞あたり１０μｇのプラスミドを導入した後、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地８ｍｌに懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で２４時間培養した。
【０３５２】
培養後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）を０．８ｍｇ／ｍｌになるように添加し、更に２０日間培養し安定形質転換株を取得した。また、限界希釈法を用いて該形質転換細胞からシングルクローンも取得した。該安定形質転換株は、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８と１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で継代した。
【０３５３】
（３）各形質転換細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現量の測定
以下、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗ｉ抗体（ＯＳＫ２８）を用いた具体例を示す。
【０３５４】
上記（２）で作製したｐＣＸＮ２−Ｇ６またはｐＣＸＮ２を導入したＨＣＴ−１５細胞（各５×１０６個）を、３ｍｌのリン酸緩衝液ＰＢＳ（８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）、０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４）を用いて洗浄を行った。
【０３５５】
上記細胞（約１×１０６個）をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。
【０３５６】
該細胞を０．９ｍｌの０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（Ａ−ＰＢＳ：８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）、０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄した後、該洗浄細胞に、Ａ−ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体（ＯＳＫ２８）を１００μｌ（下記精製抗体を２０倍希釈したもの）加えて懸濁し、４℃暗所で３０分間反応させた。
ＯＳＫ２８（精製抗体）は、大阪府赤十字血液センター研究１課の高橋順子先生より供与を受けた。ＯＳＫ２８は、抗Ｔｊａ＋抗ｉ抗体を産生するヒトのリンパ球からＥＢＶ−ハイブリドーマ法を用いて樹立された不死化Ｂ細胞株が生産するヒトモノクローナル抗体（ＩｇＭ抗体）である。本実験で使用した精製ＯＳＫ２８は、上記Ｂ細胞株を大量培養後、発明の実施の形態の（６）の（ｉ）に記載した方法を用いて精製されたものである。
【０３５７】
反応後、細胞を３ｍｌのＡ−ＰＢＳで２回洗浄した後、１０μｇ／ｍｌに希釈したＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ抗体〔医学生物学研究所（ＭＢＬ）製〕を１００μｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。反応後に細胞を３ｍｌのＡ−ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの０．５％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに懸濁、固定した。これをＦＡＣＳ（エピックス・エリート・フローサイトメーター）を用いて解析を行った。また対照実験として、抗体の代わりにＡ−ＰＢＳを用いて同様の解析を行った。
【０３５８】
Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミド（ｐＣＸＮ２−Ｇ６）またはコントロールプラスミドｐＣＸＮ２を導入したＨＣＴ−１５細胞に対し、各種抗糖鎖抗体（ＯＳＫ２８、ＫＭ９３、ＰＭ８１、ＣＡ１９−９、ＫＭ２３１、ＴＴ４２、または７ＬＥ）を用いた間接蛍光抗体染色を行った後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を第１図に示す。間接蛍光抗体染色を用いたＦＡＣＳ解析は常法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１２４９９−１２５０７（１９９９）〕に従った。
【０３５９】
ｐＣＸＮ２−Ｇ６を導入した細胞においては、ｐＣＸＮ２を導入した細胞に比較して、ＯＳＫ２８への反応性が増加していた（第１図）。これらの結果は、Ｇ６ポリペプチドをＨＣＴ−１５細胞で発現させることにより、細胞表面の糖タンパク質あるいは糖脂質の糖鎖上にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が新たに合成されたことを意味している。
【０３６０】
一方、シアリルルイスａ糖鎖に対する抗体であるＣＡ１９−９またはＫＭ２３１を用いて蛍光染色を行った時には、ｐＣＸＮ２−Ｇ６を導入したＨＣＴ−１５細胞とｐＣＸＮ２を導入したＨＣＴ−１５細胞において抗体への反応性は変化しなかった（第１図）。ＨＣＴ−１５細胞はα１，３／１，４−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ）を発現しており、該細胞にβ１，３−ガラクトース転移酵素を発現させると上記抗体で検出されるシアリルルイスａ糖鎖が合成されることが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１２４９９−１２５０７（１９９９）〕。従って、以上の結果はＧ６ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有していないことを示している。
【０３６１】
同様に、シアリルルイスｘ糖鎖に対する抗体であるＫＭ９３、ルイスｘ糖鎖に対する抗体であるＰＭ８１、ルイスｂ糖鎖に対する抗体であるＴＴ４２、またはルイスａ糖鎖に対する抗体である７ＬＥを用いて蛍光染色を行った時にも、ｐＣＸＮ２−Ｇ６を導入したＨＣＴ−１５細胞とｐＣＸＮ２を導入したＨＣＴ−１５細胞において抗体への反応性は変化しなかった（第１図）。
【０３６２】
（４）糖鎖合成阻害剤を用いた実験
Ｇ６ポリペプチドが、糖タンパク質糖鎖または糖脂質糖鎖の合成に関与しているかを検討するために、糖鎖合成阻害剤を用いた実験を行った。上記（２）で取得したｐＣＸＮ２−Ｇ６を導入したＨＣＴ−１５細胞（シングルクローン）を各種の糖鎖合成阻害剤の存在下で５日間培養後、ＯＳＫ２８を用いてＦＡＣＳによる解析をした。糖蛋白質のＯ結合型糖鎖の阻害剤としては、Ｂｅｎｚｙｌ−α−ＧａｌＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）を４ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用した。糖蛋白質のＮ結合型糖鎖の阻害剤としては、マンノシダーゼＩＩ阻害剤のスワインソニン（Ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ：生化学工業株式会社製）を１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。糖脂質糖鎖の阻害剤としては、グルコシルセラミド合成酵素の阻害剤であるＤ−ＰＤＭＰ（Ｄ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ：Ｍａｔｒｅｙａ社製）を１０μｍｏｌ／ｌの濃度で使用した。また、Ｄ−ＰＤＭＰのネガティブコントロールとして、Ｌ−ＰＤＭＰ（Ｌ−ｔｈｒｅｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｄｅｃａｎｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ：Ｍａｔｒｅｙａ社製）を１０μｍｏｌ／ｌの濃度で使用した。培養方法は上記（２）に従った。結果を第２図に示す。コントロールとして、ベクター（ｐＣＸＮ２）を導入したＨＣＴ−１５細胞に対してＯＳＫ２８を用いた間接蛍光抗体染色を行った結果を併せて示している。
【０３６３】
糖鎖合成阻害剤Ｂｅｎｚｙｌ−α−ＧａｌＮＡｃの存在下で培養した際には、非存在下に比べてＯＳＫ２８抗体への反応性が大幅に低下していた。このことは、Ｇ６ポリペプチドを発現させたＨＣＴ−１５細胞で観察されたポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖のｄｅ ｎｏｖｏ合成は、主に糖蛋白質のＯ結合型糖鎖上で起こっていることを示唆している。一方、スワインソニン処理した細胞でもＯＳＫ２８抗体への反応性が低下していたことから、Ｇ６ポリペプチドを発現させたＨＣＴ−１５細胞で観察されたポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖のｄｅ ｎｏｖｏ合成は、糖蛋白質のＮ結合型糖鎖上でも起こっていることを示唆している。以上の結果から、動物細胞中で高発現させた場合、Ｇ６ポリペプチドは糖蛋白質糖鎖上にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成することができると考えられる。
【０３６４】
また、Ｇ６ポリペプチドを発現させた細胞から分泌される糖蛋白質やオリゴ糖の糖鎖にも、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が新たに合成されると考えられる。従って、Ｇ６ポリペプチドを発現させた細胞を宿主として有用な糖タンパク質を分泌生産することにより、分泌生産される糖蛋白質にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを含有する糖鎖を付与することが可能である。
【０３６５】
(実施例７) Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したヒト培養細胞におけるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定
実施例６の（１）で取得した、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入した安定形質転換細胞（Ｎａｍａｌｗａ細胞）の細胞抽出液を用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を調べた。
【０３６６】
（１）２−アミノベンゼン化オリゴ糖を基質とした活性測定
実施例６の（１）で取得した形質転換細胞（約２×１０７個）をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。該細胞を０．９ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、該洗浄細胞を２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００からなる溶液（１００μｌ）に懸濁し、超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ；コスモ・バイオ社製）を用いて細胞を破砕した。４℃で１時間放置した後、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により上清を取得した。該上清を酵素サンプルとした。
【０３６７】
上記酵素サンプルと２−アミノベンゼン化糖鎖基質を用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定した。
【０３６８】
２−アミノベンゼン化糖鎖基質の調製は、ＳＩＧＭＡ，２ＡＢ ｇｌｙｃａｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、キットの説明書に従って行った。ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮｎＴと略記する）とＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、２ＬＮと略記する場合がある）を２−アミノベンゼン化したものを基質として使用した。ＬＮｎＴはオックスフォード・グライコシステムズ社から購入した。２ＬＮは生化学工業株式会社より入手した。
【０３６９】
活性測定は公知の方法〔ＦＥＢＳ，４６２，２８９（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）〕を用いた。具体的には、２０μｌのアッセイ溶液〔１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、２０ｍｍｏｌ／ｌカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、０．４％Ｔｒｉｒｏｎ ＣＦ−５４、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、１５ｍｍｏｌ／ｌ ２−アミノベンゼン化糖鎖基質、上記細胞抽出液（蛋白質２０μｇ分）〕中で３７℃、１６時間反応後、生産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出した。該細胞抽出液の蛋白質濃度は、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、キットの説明書に従って行った。
【０３７０】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
【０３７１】
反応が終了したアッセイ溶液を１００℃で５分間処理後、ＨＰＬＣ用純水５０μｌを加え、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取得した。アッセイ溶液の入っていたチューブに再度ＨＰＬＣ用純水５０μｌを加えてチューブを洗浄後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取得し、最初の上清と合わせた。次いで、該上清をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通した後、その一部（１０μｌ）をＨＰＬＣに供した。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラムの使用法は付属の説明書に従って行った。
【０３７２】
ＨＰＬＣは、カラムとしてＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー）、溶出液として７％メタノール含有０．０２ｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度５０℃、流速１ｍｌ／分の条件で行った。
生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光社製）を用いて行った（励起波長３３０ｎｍ、放射波長４２０ｎｍ）。
【０３７３】
生成物の同定は、スタンダード糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。スタンダード糖鎖としては、２−アミノベンゼン化したＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを使用した。
【０３７４】
生成物の定量は、２−アミノベンゼン化したグルコースポリマー（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
【０３７５】
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）またはＧ６ポリペプチドの発現プラスミド（ｐＡＭｏ−Ｇ６）を導入した安定形質転換細胞（Ｎａｍａｌｗａ細胞）の細胞抽出液を用いて活性測定を行った結果、生産物（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に転換された基質（ＬＮｎＴ）の割合は、コントロールプラスミドを導入した細胞ではほぼ０％であったのに対し、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、６．１１％に増加していた。また、生産物（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に転換された基質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）の割合は、コントロールプラスミドを導入した細胞ではほぼ０％であったのに対し、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、３．９５％に増加していた。即ち、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、コントロールプラスミドを導入した細胞に比較して、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が増加していることが判明した。
【０３７６】
以上の結果から、Ｇ６ポリペプチドは、新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることが証明された。この結果は、Ｇ６ポリペプチドを用いて、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付加した糖鎖を合成可能なことを示している。
【０３７７】
（２）糖脂質を基質とした活性測定
既知の方法〔ＦＥＢＳ，４６２，２８９（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）〕に準じて、糖脂質を基質としてＧ６ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定した。具体的には２０μｌの反応溶液〔１５０ｍｍｏｌ／ｌカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、４８０μｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、０．４％Ｔｒｉｒｏｎ ＣＦ−５４、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、２５０μｍｏｌ／ｌ糖脂質、上記（１）で調製した細胞抽出液（蛋白質２０μｇ分）〕中で３７℃、１６時間反応した。糖脂質としては、ラクトシルセラミド（ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：ＳＩＧＭＡ社製）およびパラグロボシド（ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ：東京医科歯科大学櫛泰典先生より入手）を使用した。反応終了後、０．１ｍｏｌ／ｌ ＫＣｌを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌ ＫＣｌで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）に該上清を通し、上清中の糖脂質をカートリッジに吸着させた。１０ｍｌのＨＰＬＣ用純水にて２回カートリッジを洗浄後、５ｍｌのメタノールで吸着した糖脂質を溶出した。真空乾燥機にて溶出液を１０μｌ程度まで濃縮後、該濃縮液をＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にスポットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）＝６５：３５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。ＴＬＣプレートの上端から５ｍｍの所まで展開し、プレートを乾燥後、バイオ・イメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）を用いて糖脂質に取り込まれた放射線の量を測定した。
【０３７８】
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）またはＧ６ポリペプチドの発現プラスミド（ｐＡＭｏ−Ｇ６）を導入した安定形質転換細胞（Ｎａｍａｌｗａ細胞）の細胞抽出液を用いて活性測定を行った結果、ラクトシルセラミドを基質とした場合、コントロールプラスミドを導入した細胞では活性が検出されなかったのに対し、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、明らかな活性が検出された（生産物への転換効率０．１２５％）。パラグロボシドを基質とした場合、コントロールプラスミドを導入した細胞でも弱い活性（生産物への転換効率０．００６％）が検出されたが、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、明らかに活性が増加していた（生産物への転換効率０．１２６％）。以上の結果と上記（１）の結果から、Ｇ６ポリペプチドは、ラクトシルセラミドおよびパラグロボシドを基質とする新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることが証明された。ラクトシルセラミドを基質として用いた時のＧ６ポリペプチドの活性を１００％とすると、パラグロボシドを基質として用いた時の活性は９６％であった。
【０３７９】
また上記の結果は、Ｇ６ポリペプチドを用いて、ラクトシルセラミドやパラグロボシドなどの糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付加した糖脂質を合成可能なことを示している。
【０３８０】
(実施例８) 昆虫細胞を宿主としたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドの分泌生産
クローン化したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｇ６は、その一次配列から、Ｎ末端の１４アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１８アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。
そこで、Ｇ６ポリペプチドのＮ末端の１４アミノ酸からなる細胞質領域、１８アミノ酸からなる膜結合領域、および幹領域の一部（３アミノ酸、または６アミノ酸）を除去し、該除去領域に免疫グロブリンのシグナル配列ならびにＦＬＡＧペプチドを付加することによりＧ６ポリペプチドの分泌発現を試みた。
【０３８１】
（１）動物細胞用ＦＬＡＧペプチド融合型分泌ベクターｐＡＭｏＦ２の造成
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＦＬＡＧペプチドを任意のタンパク質のＮ末端に付加した形で分泌発現するための分泌ベクターｐＡＭｏＦ２の造成を行った。
ｐＡＭｏをＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８で切断することにより、約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＡｓｐ７１８切断部位を連結するためのリンカーとして以下の６種のＤＮＡ〔ＩｇＫ−１（塩基配列：配列番号１４）、ＩｇＫ−２（塩基配列：配列番号１５）、ＩｇＫ−３（塩基配列：配列番号１６）、ＩｇＫ−４（塩基配列：配列番号１７）、ＩｇＫ−５（塩基配列：配列番号１８）、ＩｇＫ−６（塩基配列：配列番号１９）〕を合成した。なお、これらのＤＮＡによって構築されるリンカーは免疫グロブリンκのシグナル配列およびＦＬＡＧペプチドをコードし、ＰｍａＣＩ、ＳｔｕＩ、ＳｎａＢＩの各制限酵素切断部位が組み込まれている。６種のＤＮＡはそれぞれアプライド・バイオシステムズ社製の３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同じ）を用いてリン酸化した後に使用した。
上記で取得した６種のリン酸化合成ＤＮＡと約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、プラスミドｐＡＭｏＦ２を構築した。
【０３８２】
（２）プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓの造成
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号２０で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、Ｃ１２−７と呼ぶ）および配列番号２１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、Ｃ１２−９と呼ぶ）を合成した（サワディー・テクノロジーから購入することも可能）。Ｃ１２−７にはＢａｍＨＩサイトがＣ１２−９にはＮｏｔＩサイトが導入されるようにデザインされている。
【０３８３】
ＰＣＲは、宝酒造社製のキット（ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法に従って行い、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；宝酒造社販売）を用いて、９４℃で３０秒、６５℃で１分、７２℃で２分の反応を１０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としてはプラスミドｐＡＭｏ−ｉ（特開平１１−２３６３９８）を１０ｎｇ使用した。該ＰＣＲにより、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
約１．１ｋｂのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とＴ−ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を結合することにより、プラスミドｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ Ｎｏ．３を構築した。
【０３８４】
次いでプラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓの造成を行った。
ｐＡＭｏＦ２をＳｔｕＩとＢａｎＩＩＩで切断し、約７．２ｋｂのＳｔｕＩ−ＢａｎＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＭｏをＢａｎＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、約１．７ｋｂのＢａｎＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ Ｎｏ．３をＢａｍＨＩで切断後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を用いてＢａｍＨＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え、引き続きＮｏｔＩで切断することにより、約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ断片を取得した。
【０３８５】
上記で得られた、約７．２ｋｂのＳｔｕＩ―ＢａｎＩＩＩ断片、約１．７ｋｂのＢａｎＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片および約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓを構築した。
【０３８６】
（３）プラスミドｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ１およびｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ２の造成
Ｇ６ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号１の３６番目のアスパラギン酸から３７８番目のイソロイシンまで、または配列番号１の３９番目のイソロイシンから３７８番目のイソロイシンまで〕をコードするＤＮＡ断片のサブクローン化を行った。
【０３８７】
配列番号２２で表される塩基配列を有するＣＢ−５４３と配列番号２３で表される塩基配列を有するＣＢ−５４５をプライマー、実施例３で造成したプラスミドｐＢＳ−Ｇ６を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、配列番号１の３６番目のアスパラギン酸から３７８番目のイソロイシンまでをコードする約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣＢ−５４３にはＢａｍＨＩ切断サイトが、ＣＢ−５４５にはＸｂａＩ切断サイトが付加してある。ＰＣＲ増幅断片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断後、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ間に組み込むことにより、ｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ１を造成した。
【０３８８】
配列番号２４で表される塩基配列を有するＣＢ−５４４と配列番号２５で表される塩基配列を有するＣＢ−５４５をプライマー、実施例３で造成したプラスミドｐＢＳ−Ｇ６を鋳型としてＰＣＲを行うにより、配列番号１の３９番目のイソロイシンから３７８番目のイソロイシンまでをコードする約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣＢ−５４４にはＢａｍＨＩ切断サイトが、ＣＢ−５４５にはＸｂａＩ切断サイトが付加してある。ＰＣＲ増幅断片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断後、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ間に組み込むことにより、ｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ２を造成した。
【０３８９】
ＰＣＲはＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いた。鋳型としてはプラスミドｐＢＳ−Ｇ６を１ｎｇ使用した。ＰＣＲ反応溶液５０μｌを９４℃で２分間加熱後、次いで９４℃で２０秒間、５５℃で４５秒間、６８℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクルの反応を行った。方法はＰｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキットの説明書に従った。
ｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ１およびｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ２中に組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
【０３９０】
（４）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドを昆虫細胞で分泌発現するための組換えウィルスの作製
目的タンパク質をコードするＤＮＡをトランスファーベクターと呼ばれる特殊なプラスミドに組み込む工程（工程１）と、工程１で作製した目的ＤＮＡを組み込んだトランスファーベクターと野生型ウィルスとを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組み換えにより組換えウィルスを取得する工程（工程２）の２工程で、組換えウィルスを作製した。該工程は、ファーミンジェン社製バキュロゴールドスターターキット（製品番号ＰＭ−２１００１Ｋ）を用い、該キットのマニュアルに従い以下の手順で行った。
【０３９１】
（工程１）ＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチドをコードするＤＮＡのトランスファーベクターへの組み込み
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に、ＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１およびｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２の造成を行った。
【０３９２】
上記（２）で作製したｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を得た。
ｐＶＬ１３９３由来を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｓｔＰＩで切断し、３．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｓｔＰＩ断片を得た。
ｐＶＬ１３９３由来を制限酵素ＮｏｔＩとＢｓｔＰＩで切断し、６．４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｔＰＩ断片を得た。
ＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを連結するためのリンカーとして配列番号２６、２７に示すＤＮＡを合成し、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅを用いて５’末端のリン酸化を行った。
【０３９３】
上記３断片とリンカーを結合することにより、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ２を造成した。
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ２をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断し、約９．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。また、上記（３）で造成したｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ１を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断し、約１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１を造成した。
【０３９４】
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２ｉ５２Ｓ２をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断し、約９．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。また、上記（３）で造成したｐＢＳ−Ｇ６ｓｅｃ２を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断し、約１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２を造成した。
【０３９５】
（工程２）組換えウィルスの作製
ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウム（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて培養した昆虫細胞Ｓｆ９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）に、線状バキュロウィルスＤＮＡ〔バキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ）、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製〕および上記で作製したプラスミド（ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１またはｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２）をリポフェクチン法〔蛋白質核酸酵素、３７，２７０１（１９９２）〕により導入することにより、組換えバキュロウィルスを作製した。以下、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１由来の組換えバキュロウィルスを作製する方法を記す。ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えバキュロウィルスの作製も同様にして行った。
【０３９６】
１〜５μｇのｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１と１５ｎｇの線状バキュロウィルスＤＮＡを１２μｌの蒸留水に溶解後、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）６μｌ（６μｇ）と蒸留水６μｌとを混和したものを添加し、室温で１５分間放置した。
【０３９７】
約２×１０６個のＳｆ９細胞を２ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）に懸濁し、直径３５ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた後、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１、線状バキュロウィルスＤＮＡ、およびリポフェクチンの混和溶液全量を添加し、２７℃で３日間培養した。
【０３９８】
該培養液より、組換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを採取した。
該培養上清を取得したシャーレには、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを新たに１ｍｌ加え、更に２７℃で４日間培養した。培養後、同様にして組換えウィルスを含む培養上清を更に１．５ｍｌ取得した。
【０３９９】
（５）組み換えウィルス溶液の取得
約８×１０６個のＳｆ９細胞を５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地（ＪＲＨ社製）に懸濁し、２５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに１ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地と上記（４）で取得した組換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを添加した。
【０４００】
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを４ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。
該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液５．５ｍｌを得た。
【０４０１】
約２×１０７個のＳｆ９細胞を１５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地に懸濁し、７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に入れ、室温で３０分間放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地と上記で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
【０４０２】
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。 該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、換えウイルスが感染したＳｆ９細胞および組み換えウィルス溶液１５ｍｌを得た。
【０４０３】
該組み換えウィルス溶液のウィルスの力価は以下の方法で算定することができる（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製バキュロゴールドスターターキット・マニュアルに基づく）。
【０４０４】
約６×１０６個のＳｆ９細胞を４ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地に懸濁し、直径６０ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で３０分間放置して細胞をシャーレに付着させた後、上清を除き、該シャーレにＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地４００μｌおよびＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地で１０−４または１０−５に希釈した上記組み換えウィルス溶液１００μｌを添加する。
【０４０５】
添加後、該シャーレを室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させる。
【０４０６】
接触後、シャーレより培地を除去し、該シャーレに、２％低融点アガロース〔アガープラーク・アガロース（Ａｇａｒｐｌａｑｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製〕を含む２ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地（４２℃に保温）と、２ｍｌのＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウム（４２℃に保温）の混合液を流し込み、室温で１５分間放置する。
【０４０７】
放置後、乾燥を防ぐために該シャーレにビニルテープをまき、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、２７℃で５日間培養する。
培養後、該シャーレに０．０１％ニュートラルレッドを含むＰＢＳ緩衝液１ｍｌを加え、更に１日培養した後、出現したプラークの数を数える。
【０４０８】
（６）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドの分泌生産と精製
プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１またはｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスのコードするＧ６ポリペプチドは、ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されることになるため、抗ＦＬＡＧＭ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；コスモ・バイオ社製）を用いて、容易に精製が可能である。
【０４０９】
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１由来の組換えウイルスは、８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドのＣ末端に、Ｇｌｙ残基とＳｅｒ残基を介して、Ｇ６ポリペプチドの推定触媒領域〔配列番号１の３６番目のアスパラギン酸から３７８番目のイソロイシンまで〕が融合したポリペプチドを分泌生産することができる。
【０４１０】
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスは、８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドのＣ末端に、Ｇｌｙ残基とＳｅｒ残基を介して、Ｇ６ポリペプチドの推定触媒領域〔配列番号１の３９番目のイソロイシンから３７８番目のイソロイシンまで〕が融合したポリペプチドを分泌生産することができる。
【０４１１】
約２×１０７個のＳｆ２１細胞を１５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地に懸濁し、７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに４ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地と上記（５）で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
【０４１２】
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、培養上清を各１５ｍｌずつ得た。
【０４１３】
上記で取得した培養上清１５ｍｌにアジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化カルシウムを、それぞれ最終濃度０．１％、１５０ｍｍｏｌ／ｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加した後、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；コスモ・バイオ社製）を１００μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
【０４１４】
攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することにより抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを回収し、該ゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウムを含む緩衝液１ｍｌで２回洗浄した。
【０４１５】
洗浄後、該ゲルに５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で３０分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。
【０４１６】
該ゲルに再度５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で１０分間処理した後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計３回溶出操作を行い、計８５μｌの溶出液を取得した。
該溶出液には、最終濃度が４ｍｍｏｌ／ｌになるように１ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウムを添加した。
【０４１７】
このようにして調製した溶出液の８μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、銀染色または抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。銀染色は銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて行った。方法はキットの説明書に従った。抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングは、ＹＥＡＳＴ ＡＭＩＮＯ−ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＡＧ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＫＩＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて行った。方法はキットの説明書に従った。
【０４１８】
銀染色または抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を第３図に示す。第３図のＡは、ＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミド〔ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１（レーン３、４）またはｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２（レーン５、６）〕由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清（レーン４、６）から、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチド（Ｇ６ｓｅｃ１またはＧ６ｓｅｃ２）を精製し（レーン３、５）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、銀染色を行った結果を示した図である。コントロールとして、プラスミドｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清（レーン２）から同様にしてサンプルを調製した（レーン１）。矢印は、生産された分泌型Ｇ６ポリペプチドの位置と大きさを示している。
【０４１９】
第３図のＢは、ＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６の発現プラスミド〔ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１（レーン２）またはｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２（レーン３）〕由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチド（Ｇ６ｓｅｃ１またはＧ６ｓｅｃ２）を精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロティングを行った結果を示した図である。コントロールとして、プラスミドｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製した（レーン１）。矢印は、生産された分泌型Ｇ６ポリペプチドの位置と大きさを示している。
【０４２０】
その結果、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、約４１〜４７ｋＤのブロードなバンドが確認された。メインのバンドの大きさは約４３ｋＤであった。該組換えウイルスは、８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドのＣ末端に、Ｇｌｙ残基とＳｅｒ残基を介して、Ｇ６ポリペプチドの推定触媒領域〔配列番号１の３６番目のアスパラギン酸から３７８番目のイソロイシンまで〕が融合したポリペプチドを分泌生産すると考えられるので、アミノ酸配列から計算されるポリペプチドの分子量は４０．９５ｋＤである。検出されたバンドの分子量が計算値に比較して大きいのは、糖鎖が付加したためと考えられる。該ポリペプチドはＮ結合型糖鎖の推定付加部位を４個有している。バンドがブロードなのは、付加する糖鎖の数や大きさが異なるポリペプチドが存在することを示している。
【０４２１】
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際にも、約４１〜４７ｋＤのブロードなバンドが確認された。メインのバンドの大きさは約４３ｋＤであった。該組換えウイルスは、８アミノ酸からなるＦＬＡＧペプチドのＣ末端に、Ｇｌｙ残基とＳｅｒ残基を介して、Ｇ６ポリペプチドの推定触媒領域〔配列番号１の３９番目のイソロイシンから３７８番目のイソロイシンまで〕が融合したポリペプチドを分泌生産すると考えられるので、アミノ酸配列から計算されるポリペプチドの分子量は４０．６ｋＤである。検出されたバンドの分子量が計算値に比較して大きいのは、糖鎖が付加したためと考えられる。該ポリペプチドはＮ結合型糖鎖の推定付加部位を４個有している。バンドがブロードなのは、付加する糖鎖の数や大きさが異なるポリペプチドが存在することを示している。
【０４２２】
一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、該バンドは検出されなかった。
抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出されたバンドの強度は、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１由来の組換えウイルス由来の溶出液で検出されたバンドの強度を１とした時、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルス由来の溶出液で検出されたバンドの強度は１．０５であった。
【０４２３】
以上の結果より、昆虫細胞を用いてＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドを分泌生産可能なこと、および該ポリペプチドを抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることが示された。
【０４２４】
(実施例９) 昆虫細胞で生産したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドを用いた活性検討
各種基質を用いて、実施例８で生産・精製したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定を行った。
【０４２５】
（１）２−アミノベンゼン化オリゴ糖を基質として用いた活性測定 実施例８の（６）で調製した溶出液を用いて、昆虫細胞で分泌生産させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定を行った。活性測定は実施例７の方法を用いた。
【０４２６】
基質としては、オリゴ糖〔ＬＮｎＴ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、２ＬＮと略記する）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、３ＬＮと略記する）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、４ＬＮと略記する）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、５ＬＮと略記する）、またはＧａｌβ１−４（ＳＯ３−６）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（ＳＯ３−６）ＧｌｃＮＡｃ（以下、Ｌ２Ｌ２と略記する）〕を２−アミノベンゼン化したものを使用した。オリゴ糖の２−アミノベンゼン化は、ＳＩＧＭＡ ２ＡＢ ｇｌｙｃａｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、キットの説明書に従って行った。ＬＮｎＴはオックスフォード・グライコシステムズ社から購入した。それ以外のオリゴ糖は生化学工業株式会社より入手した。
【０４２７】
具体的には、２０μｌのアッセイ溶液〔１５０ｍｍｏｌ／ｌカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、０．４％Ｔｒｉｒｏｎ ＣＦ−５４、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、５μｍｏｌ／ｌ ２−アミノベンゼン化糖鎖基質、上記精製酵素溶液〕中で３７℃、１６時間反応後、生産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、詳細は後述する）により検出した。酵素としては、実施例８の（６）において、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液（１．５μｌ）、またはｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液（１．４μｌ）を使用した。
【０４２８】
反応が終了したアッセイ溶液を１００℃で５分間処理後、ＨＰＬＣ用純水５０μｌを加え、１０，０００×ｇで５分間遠心して上清を取得した。アッセイ溶液の入っていたチューブに再度ＨＰＬＣ用純水５０μｌを加えてチューブを洗浄後、１０，０００×ｇで５分間遠心して上清を取得し、最初の上清と合わせた。次いで、該上清をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通した後、その一部（１０μｌ）をＨＰＬＣに供した。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラムの使用法は付属の説明書に従って行った。
【０４２９】
ＨＰＬＣは、カラムとしてＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー）、溶出液として７％メタノール含有０．０２ｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度５０℃、流速１ｍｌ／分の条件で行った。
【０４３０】
生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光社製）を用いて行った（励起波長３３０ｎｍ、放射波長４２０ｎｍ）。
【０４３１】
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ１由来の組換えウイルスを用いて生産・精製した分泌型酵素（Ｇ６ｓｅｃ１と呼ぶ）およびｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスを用いて生産・精製した分泌型酵素（Ｇ６ｓｅｃ２と呼ぶ）用いて活性測定を行った結果、いずれもβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示した。ＬＮｎＴを基質とした時の生産物への転換効率は、Ｇ６ｓｅｃ１を用いた時が９．８５％、Ｇ６ｓｅｃ２を用いた時が１１．２％であった。Ｇ６ｓｅｃ１またはＧ６ｓｅｃ２を用いて基質特異性の検討を行った結果を第１表に示す（第１表実験１）。表には、２−アミノベンゼン化ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を示した。一方、ｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルス（コントロールウイルス）を用いて調製したサンプルには活性は検出されなかった。
【０４３２】
また、実施例８の（６）で示した方法を用いて再度精製酵素（Ｇ６ｓｅｃ２）を調製し、再度基質特異性の検討を行った結果を第１表に合わせて示す（第１表実験２）。ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清３０ｍｌから精製酵素（２８０μｌ）を調製し、その４μｌを用いてアッセイを行った。表には、２−アミノベンゼン化ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を示した。ＬＮｎＴを基質とした時の生産物への転換効率は２６．２％であった。
【０４３３】
【表１】
Figure 0004995398
【０４３４】
この結果、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（２ＬＮ、３ＬＮ、４ＬＮ、および５ＬＮ）もＧ６ポリペプチドの基質となることが判明した。短いポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（２ＬＮ、３ＬＮ）は、長いポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（４ＬＮ、５ＬＮ）に比較して、Ｇ６ポリペプチドの基質になりやすいことも明らかになった。また、硫酸基が付加したポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖であるＬ２Ｌ２もＧ６ポリペプチドの基質となることが判明した。
【０４３５】
Ｇ６ｓｅｃ１またはＧ６ｓｅｃ２が吸着した抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲル（酵素を溶出する前のゲル）を酵素として用いた場合も、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が検出された。酵素としては、上記のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性測定に使用した溶出液に相当する量のゲルを使用した。ＬＮｎＴを基質としたときの転換効率は、Ｇ６ｓｅｃ１吸着ゲルを使用した際には６．６４％、Ｇ６ｓｅｃ１吸着ゲルを使用した際には２０．２％であった。
【０４３６】
この結果は、ゲルに酵素を吸着した状態でも糖鎖合成が可能なことを示している。一方、ｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルス（コントロールウイルス）を用いて同様に調製したゲルには活性は検出されなかった。
【０４３７】
一方、Ｇ６ｓｅｃ１およびＧ６ｓｅｃ２は、ＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は示さなかった。β１，３−ガラクトース転移酵素活性測定は、常法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１２４９９−１２５０７（１９９９）〕に準じて行った。２０μｌのアッセイ溶液〔１４ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、７５μｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−Ｇａｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１１ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、８８ｐｍｏｌ／ｌ 糖鎖基質、上記精製酵素〕中で３７℃、１６時間反応した。使用した酵素量は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定に使用した量と同じである。基質としては、２−アミノベンゼン化したＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（以下、ＧｌｃＮＡｃ−２ＬＮと略記する）を使用した。該糖鎖は、２−アミノベンゼン化したＬＮ３をβ−ガラクトシダーゼ処理して末端のガラクトース残基を除去することによって作製した。具体的には、約６０ｎｍｏｌの２−アミノベンゼン化したＬＮ３に対し、１００ミリユニットのβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製）を加え、３７℃で１６時間反応後、１００℃で５分間の熱処理によりβ−ガラクトシダーゼを失活させることにより調製した。
【０４３８】
以上の結果より、昆虫細胞で分泌発現させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ６ポリペプチド（Ｇ６ｓｅｃ１またはＧ６ｓｅｃ２）は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するがβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は有さないことが示された。この結果から、Ｇ６ポリペプチドがβ１，３−ガラクトース転移酵素ではなくβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることが再度確認された。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｇ６は、ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として昆虫細胞で分泌生産可能で、生産された融合タンパク質は抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることが示された。生産した融合タンパク質は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖などの糖鎖の合成に使用できることが示された。
Ｎａｍａｌｗａ細胞で生産させた場合に比較して、昆虫細胞で生産させた場合は、酵素の生産量が高いことが明らかになった。
【０４３９】
（２）ピリジルアミノ化オリゴ糖を基質として用いた活性測定
３０μｌのアッセイ溶液〔１５０ｍｍｏｌ／ｌカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、０．４％Ｔｒｉｒｏｎ ＣＦ−５４、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、５０μｍｏｌ／ｌ ピリジルアミノ化糖鎖基質、精製酵素溶液（Ｇ６ｓｅｃ２）〕中で３７℃、１４．５時間反応後、生産物をＨＰＬＣにより検出した。精製酵素（Ｇ６ｓｅｃ２）は、実施例８の（６）で示した方法に従って取得した。ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ６ｓｅｃ２由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清３０ｍｌから精製酵素（２８０μｌ）を調製し、その５μｌを用いてアッセイを行った。基質としては、ＬｎＮＴ、ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮＴと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩ，Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮＦＰ−ＩＩと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩＩ，Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮＦＰ−ＩＩＩと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ Ｖ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ；以下ＬＮＦＰ−Ｖと略記する）、およびラクト−Ｎ−ダイフコヘキサオースＩＩ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｄｉｆｕｃｏｈｅｘａｏｓｅ ＩＩ，Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ；以下ＬＮＤＦＨ−ＩＩと略記する）（いずれもＯｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、アミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９（１９９０）〕に従って行った。
【０４４０】
それぞれの基質について、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＬＣで解析しＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応が終了したアッセイ溶液は、１００℃で５分間処理後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取得し、その一部（５μｌ）をＨＰＬＣに供した。
【０４４１】
ＨＰＬＣは、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー）を使用し、溶出液として０．０２ｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度５０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行った。
生成物の検出・定量は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光社製）を用いて行った（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）。
ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第２表に示した。
【０４４２】
【表２】
Figure 0004995398
【０４４３】
ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は１２．８％であった。ＬＮｎＴはＧ６ポリペプチド（Ｇ６ｓｅｃ２）の良い基質となるが、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、およびＬＮＦＰ−Ｖは、ほとんど基質にならないことが明らかになった。また、ＬＮＴ中の非還元末端から２番目に存在するＧｌｃＮＡｃ残基にフコースがα１、４結合で付加したオリゴ糖であるＬＮＦＰ−ＩＩやＬＮＤＦＨ−ＩＩは、Ｇ６ポリペプチドの基質にならないことも明らかになった。
【０４４４】
（３）無標識オリゴ糖を基質として用いた活性測定
糖転移酵素反応は以下のようにして行った。４０μｌのアッセイ溶液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌ 糖鎖基質、精製酵素溶液（Ｇ６ｓｅｃ２）〕中で３７℃、１６時間反応した。次いで、１００℃で５分間処理後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を取得し、その一部をＨＰＡＥ／ＰＡＤ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｏｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＤＩＯＮＥＸ社製）を用いて解析した。具体的方法は常法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１−１６２（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）〕に準じて行った。
【０４４５】
精製酵素（Ｇ６ｓｅｃ２）としては、上記（２）で取得した酵素を１０μｌ使用した。基質としては、無標識のオリゴ糖〔ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）およびＬＮｎＴ〕を用いた。
それぞれの基質について、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＡＥ／ＰＡＤを用いて解析、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。生成物の同定は、スタンダード糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。スタンダード糖鎖としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを使用した。
【０４４６】
ＬＮｎＴを基質とした時の生産物への転換効率は０．４８％、ラクトースを基質とした時の生産物への転換効率は０．３０％であった。ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とすると、ラクトースを基質とした時の相対活性は６２．５％となる。以上の結果、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ６）は、ＬＮｎＴに加えてラクトースも良い基質とすることが判明した。
【０４４７】
（４）糖脂質を基質として用いた活性測定
既知の方法〔ＦＥＢＳ，４６２，２８９（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３５０７（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）〕に準じて、糖脂質を基質としてＧ６ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定した。具体的には２０μｌの反応溶液〔１５０ｍｍｏｌ／ｌカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、４８０μｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、０．４％Ｔｒｉｒｏｎ ＣＦ−５４、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、２５０μｍｏｌ／ｌ糖脂質、精製酵素（Ｇ６ｓｅｃ２）〕中で３７℃、１６時間反応した。精製酵素（Ｇ６ｓｅｃ２）としては、上記（２）で取得した酵素を１０μｌ使用した。糖脂質としては、ラクトシルセラミド（ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、パラグロボシド（ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）、ガラクトシルセラミド（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）（タイプＩ）、およびガラクトシルセラミド（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）（タイプＩＩ）を使用した。パラグロボシドは東京医科歯科大学櫛泰典先生より入手した。それ以外の糖脂質はＳＩＧＭＡ社より購入した。反応終了後、０．１ｍｏｌ／ｌ ＫＣｌを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌＫＣｌで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に該上清を通し、上清中の糖脂質をカートリッジに吸着させた。１０ｍｌのＨＰＬＣ用純水にて２回カートリッジを洗浄後、５ｍｌのメタノールで吸着した糖脂質を溶出した。真空乾燥機にて溶出液を１０μｌ程度まで濃縮後、該濃縮液をＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にプロットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）＝６５：３５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。ＴＬＣプレートの上端から５ｍｍの所まで展開し、プレートを乾燥後、バイオ・イメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）を用いて糖脂質に取り込まれた放射線の量を測定した。
【０４４８】
ＦＬＡＧ融合型Ｇ６ポリペプチド（Ｇ６ｓｅｃ２）は、ラクトシルセラミドおよびパラグロボシドを基質にすることが判明した。ラクトシルセラミドおよびパラグロボシドを基質とした時の生産物への転換効率は、それぞれ５．３９％と２５．２％であった。ラクトシルセラミドを基質として用いた時のＧ６ポリペプチドの活性を１００％とすると、パラグロボシドを基質として用いた時の活性は４６８％であった。
一方、Ｇ６ポリペプチド（Ｇ６ｓｅｃ２）は、ガラクトシルセラミド（タイプＩ）およびガラクトシルセラミド（タイプＩＩ）に対しては活性を示さなかった。
【０４４９】
以上の結果から、Ｇ６ポリペプチドは、ラクトシルセラミドおよびパラグロボシドをよい基質とするβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることが明らかになった。実施例７の（２）の結果と比較することにより、分泌型Ｇ６（Ｇ６ｓｅｃ２）では、ラクトシルセラミドよりパラグロボシドを基質としやすくなったことがわかる。既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であるβ３ＧｎＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパラグロボシドを基質とすることが示されているが、ラクトシルセラミドを基質とした場合の活性は低い〔Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，１１２３（１９９９）〕。したがって、Ｇ６ポリペプチドはβ３ＧｎＴとは基質特異性が異なるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素と考えられる。
【０４５０】
また、Ｇ６ポリペプチドとＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素を併用することで、例えば、ラクトシルセラミドからパラグロボシド、パラグロボシドからネオラクトヘキサオシルセラミド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、またはラクトシルセラミドからネオラクトヘキサオシルセラミドを合成することができる。
【０４５１】
(実施例１０) Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したヒト培養細胞における糖脂質の合成
実施例６の（１）で作製したｐＡＭｏ−Ｇ６を導入したＮａｍａｌｗａ細胞（１０８個）、ベクターｐＡＭｏを導入したＮａｍａｌｗａ細胞（１０８個）、およびプラスミドを導入していないＮａｍａｌｗａ細胞から中性糖脂質を抽出し、イムノ−ＴＬＣ（Ｉｍｍｕｎｏ−ＴＬＣ）法を用いて、糖鎖の非遠元末端にＮ−アセチルラクトサミン構造を有する糖脂質の組成と発現量について比較した。方法は、既知の方法〔秀純社 細胞工学別冊 グライコバイオロジー実験プロトコール、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３，２３２（１９９４）〕に従った。抗体としては、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン構造を認識できるモノクローナル抗体〔抗Ｎ−アセチルラクトサミン抗体１Ｂ２−１Ｂ７：Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．，３０３，１２５（１９９３）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４，４１２９（１９９６）、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２２，６０７（１９８８）〕抗体を使用した。
【０４５２】
１０７個分の中性糖脂質をＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にスポットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）＝６０：３５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。スタンダード糖脂質として、オルシノール染色の場合にはグルコシルセラミド（２μｇ；以下、ＧｌｃＣｅｒと略記する場合がある。）、ラクトシルセラミド（２μｇ；以下、ＬａｃＣｅｒと略記する場合がある。）、ラクトトリアオシルセラミド（０．５μｇ；以下、Ｌｃ３Ｃｅｒと略記する場合がある。）、およびパラグロボシド（０．５μｇ；以下、ｎＬｃ４Ｃｅｒと略記する場合がある。）を、免疫染色の場合にはパラグロボシド（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）およびネオラクトヘキサオシルセラミド（以下、ｎＬｃ６Ｃｅｒと略記する場合がある。）をスポットした。スタンダード糖脂質以外は同じプレートを２枚作製し、１枚はオルシノール染色、１枚は免疫染色に用いた。
【０４５３】
展開後のプレートをイソプロパノール：水（０．２％ＣａＣｌ２含む）：メタノール＝４０：２０：７の組成からなる溶液に２０秒間浸した。次いで、プレートにＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）とｇｌａｓｓ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ（ＡＴＴＯ社製）を被せ、ＴＬＣ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｔｔｅｒ（ＡＴＴＯ社製）を用いて、プレート上の糖脂質をＰＶＤＦ膜に移した。使用した条件は、１８０℃、レベル８、４５秒間である。該ＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルク、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶液中に１時間浸した後、抗Ｎ−アセチルラクトサミン抗体１Ｂ２−１Ｂ７（ハイブリドーマの培養上清）を１００分の１量含む５％スキムミルク、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶液中に２時間浸した。該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、ホースラディシュ ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体（０．４μｇ／ｍｌ：Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を含む５％スキムミルク、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶液中に１時間浸した。該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、ＥＣＬシステム（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて抗体が結合した糖脂質を検出した。
【０４５４】
オルシノール染色の結果を第４図のＡ、免疫染色の結果を第４図のＢに示す。第４図Ａのレーン１は、スタンダード糖脂質（ＧｌｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒ、Ｌｃ３Ｃｅｒ、ｎＬｃ４Ｃｅｒ）を展開したものであり、レーン２は、プラスミドを導入していないＮａｍａｌｗａ細胞、レーン３は、ベクターｐＡＭｏを導入したＮａｍａｌｗａ細胞、レーン４は、ｐＡＭｏ−Ｇ６を導入したＮａｍａｌｗａ細胞（レーン４）それぞれから中性糖脂質を抽出し、ＴＬＣプレートに展開後、オルシノール染色を行った結果を示している。第４図Ｂのレーン１は、スタンダード糖脂質（ｎＬｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ６Ｃｅｒ）を展開したものであり、レーン２は、プラスミドを導入していないＮａｍａｌｗａ細胞、レーン３は、ベクターｐＡＭｏを導入したＮａｍａｌｗａ細胞、レーン４は、ｐＡＭｏ−Ｇ６を導入したＮａｍａｌｗａ細胞（レーン４）それぞれから中性糖脂質を抽出し、ＴＬＣプレートに展開後、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルラクトサミン構造を認識できる抗体（抗Ｎ−アセチルラクトサミン抗体１Ｂ２）を用いた抗体染色を行った結果を示している。Ｂの矢印は、ｐＡＭｏ−Ｇ６を導入したＮａｍａｌｗａ細胞で発現が増加した糖脂質（ｎＬｃ４ＣｅｒとｎＬｃ６Ｃｅｒ）の位置を示している。
【０４５５】
Ｇ６ポリペプチドを発現するＮａｍａｌｗａ細胞では、ベクターを導入したＮａｍａｌｗａ細胞やプラスミドを導入していないＮａｍａｌｗａ細胞に比較して、糖鎖の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミン構造を有する糖脂質であるパラグロボシド（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）およびネオラクトヘキサオシルセラミド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド：図中においてｎＬｃ６Ｃｅｒと略記した）の量が増加していることが明らかになった（第４図のＢ）。ベクターを導入したＮａｍａｌｗａ細胞とプラスミドを導入していないＮａｍａｌｗａ細胞の間では差は見られなかった（第４図のＢ）。
【０４５６】
以上の結果および実施例９の結果から、Ｇ６ポリペプチドは細胞内においてＮ−アセチルラクトサミン構造を有する糖脂質の合成に関与していることが明らかになった。実施例９に示したように、Ｇ６ポリペプチドはラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）を基質としてラクトトリアオシルセラミド（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）を合成できる。適当なβ１，４−ガラクトース転移酵素を発現する細胞（例えばＮａｍａｌｗａ細胞）においては、Ｇ６ポリペプチドによって合成されたラクトトリアオシルセラミドは、該β１，４−ガラクトース転移酵素によってさらにガラクトースがβ１，４結合で付加されることにより、パラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）に変換されると考えられる。以上の結果は、Ｇ６ポリペプチドを適当な細胞（ラクトシルセラミドやパラグロボシドなどのＧ６ポリペプチドの基質となる糖脂質を発現している細胞）で発現させることによって、基質となる糖脂質糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にＮ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付加した糖脂質が合成可能であることを示している。また、細胞が適当なβ１，４−ガラクトース転移酵素を発現する場合は、基質となる糖脂質糖鎖の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミン構造またはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付加した糖脂質を合成可能であることを示している。
【０４５７】
以上の結果は、Ｇ６ポリペプチドは細胞内においてラクトシルセラミドβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素として働き、ネオラクト系糖脂質やラクト系糖脂質の合成に関与していることを示している。また、ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素と共同して働くことにより、Ｇ６ポリペプチドは細胞内においてネオラクトヘキサオシルセラミドなどのポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を有する糖脂質の合成にも関与していると考えられる。
【０４５８】
既知の酵素（β３ＧｎＴ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてラクトシルセラミドに対して弱いβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことが示されているが、実際に細胞内でラクトシルセラミドを基質としうるかについては示されていない。
【０４５９】
(実施例１１) Ｇ６遺伝子の転写産物の各種細胞における発現量の検討
Ｇ６遺伝子の転写産物の定量は、常法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平６−１８１７５９〕に従って定量的ＰＣＲ法により行った。
遺伝子の発現量を補正するためのβ−アクチン転写産物の定量も同様に定量的ＰＣＲ法により行った。
【０４６０】
（１）各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
細胞株としては、大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０１、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ−１５、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＷｉＤＲ、ＬＳ１８０）、肺癌細胞株（ＡＯＩ、ＥＢＣ−１、ＰＣ−１、Ａ５４９、ＡＢＣ−１、ＥＨＨＡ−９、ＨＡＬ８、ＨＡＬ２４、ＬＸ−１、ＰＣ−７、ＰＣ−９、ＰＣ−１２、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＴＭＫ１、ＨＳＣ４３）、神経芽細胞腫（ＮＡＧＡＩ、ＮＢ−９、ＳＣＣＨ−２６、ＩＭＲ３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、グリオブラストーマ細胞株（Ａ１７２、ＫＧ−１−Ｃ、ＹＫＧ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１、Ｕ−１１８−ＭＧ、Ｇ１−１）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２）、前立腺癌細胞株ＰＣ−３、肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、赤白血病細胞種Ｋ５６２、顆粒球／単球系細胞株（ＨＬ−６０、Ｕ−９３７、Ｕ２６６）、Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ、Ｂ細胞株（Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１、Ｎａｍａｌｗａ、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、ＮＡＬＬ−１、Ｒａｊｉ）を用いた。Ｊｕｒｋａｔは愛知癌センターより入手した。ＫＡＴＯＩＩＩおよびＰＣ−９は免疫生物研究所より入手した。それ以外の細胞はＪａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）ｃｅｌｌ ｂａｎｋ〔インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｈｓ．ｇｏ．ｊｐ／〕または、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手できる。
【０４６１】
また、健康な成人の末梢血よりナイコメッド・ファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ）社製のキットであるＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭを用いて多形核白血球と単核球を分離取得した。取得した単核球は常法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０，７０６（１９８３）〕に従ってさらに単球およびリンパ球に分離して取得した。
各細胞の全ＲＮＡは常怯〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７７）〕に従って調製した。全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（ＳＵＰＥＲＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ＢＲＬ社製）を用いて行った。細胞株については５μｇの全ＲＮＡから、抹消由来血球細胞については１μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍および１０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した。
【０４６２】
（２）ヒト各種組織由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
ヒト各種臓器由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、上記（１）と同様にして一本鎖ｃＤＮＡを合成した。１μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、水で２４０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。ｍＲＮＡとしては、以下の３５種の臓器由来のｍＲＮＡを使用した。１副腎、２脳、３尾状核、４海馬、５黒質、６視床、７腎、８膵臓、９脳下垂体、１０小腸、１１骨髄、１２扁桃体、１３小脳、１４脳梁、１５胎児脳、１６胎児腎、１７胎児肝臓、１８胎児肺、１９心臓、２０肝臓、２１肺、２２リンパ節、２３乳腺、２４胎盤、２５前立腺、２６唾液腺、２７骨格筋、２８脊髄、２９脾臓、３０胃、３１精巣、３２胸腺、３３甲状腺、３４気管、３５子宮。
また、ヒト大腸組織から全ＲＮＡを調製し、上記（１）の細胞株と同様にして、全ＲＮＡ５μｇを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０４６３】
（３）定量的ＰＣＲ用のスタンダードおよび内部コントロールの調製
実施例３の（５）で造成したｐＢＳ−Ｇ６を用いて、スタンダードおよび内部コントロールの造成を行った〔下記（ａ）、（ｂ）参照〕。
β−アクチンの転写産物の定量は既報〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平６−１８１７５９〕と同様に行った。β−アクチン転写産物の定量においては、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれスタンダードおよび内部コントロールとして用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平６−１８１７５９〕。各プラスミドが完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
【０４６４】
（ａ）Ｇ６転写産物定量用スタンダードの調製
実施例３の（５）で造成したｐＢＳ−Ｇ６を、Ｇ６ｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換したものを定量用のスタンダードとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ｂ）Ｇ６転写産物定量用内部コントロールの調製
ｐＢＳ−Ｇ６を制限酵素ＭｓｃＩとＢｇｌＩＩで切断後、該直鎖状ＤＮＡをセルフライゲーションさせることにより、Ｇ６ｃＤＮＡ中の２４３ｂｐを欠失したｐＢＳ−Ｇ６ｄを造成した。ｐＢＳ−Ｇ６ｄをＧ６ｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換したものを定量用の内部コントロールとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
【０４６５】
（４）定量的ＰＣＲ法を用いたＧ６遺伝子の転写産物の定量
上記（１）および（２）で調製した細胞株および正常組織由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲ法であるＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ用プライマーとしては、Ｇ６転写物検出用には配列番号２５で表される塩基配列を有するＣＢ５１３と配列番号２８で表される塩基配列を有するＣＢ５１５を使用した。βアクチン転写物検出用には配列番号２９で表される塩基配列を有するＣＢ５３と配列番号３０で表される塩基配列を有するＣＢ５４を使用した。また、（３）で作製したスタンダードと内部コントロールを鋳型として同様にＰＣＲを行うことにより検量線を作製した。
【０４６６】
上記一本鎖ｃＤＮＡ １０μｌおよび内部コントロール用プラスミド１０μｌ（１ｆｇ）を含む５０μｌの反応溶液〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ遺伝子特異的プライマー〕に、ＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を添加してＰＣＲを行った。内部コントロール用プラスミドの量、あるいはスタンダード用プラスミドの量は組織ごと、細胞ごとに適宣変えて定量を行った。
【０４６７】
ＰＣＲは、以下の条件で行った。
Ｇ６転写産物定量の際は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４２サイクル行った。
βアクチン転写産物定量の際は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、２４サイクル行った。
ＰＣＲ後の溶液のうち１０μｌを１％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、写真を撮影した。写真をＮＩＨイメージシステムによりスキャニングすることにより増幅した断片の染色の強さを測定し、増幅量とした。より正確な転写産物の定量を行なうために、ＰＣＲのサイクル数を変えて同様のＰＣＲを行った。スタンダードおよび内部コントロールの量はＰＣＲのサイクル数に応じて変化させた。
【０４６８】
細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡのかわりに上記（３）で調製したスタンダードを０．１２５ｆｇ、０．２５ｆｇ、０．５ｆｇ、１ｆｇ、２ｆｇ、４ｆｇ用いてＰＣＲを行い、増幅断片の増幅量を測定し、ｃＤＮＡの量と断片の増幅量をプロットして検量線を作成した。
【０４６９】
上記Ｇ６転写産物定量用プライマーを用いた場合は、Ｇ６転写産物およびＧ６のスタンダードからは４５８ｂｐのＤＮＡ断片が、Ｇ６の内部コントロールからは２１５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅する（第５図写真）。
【０４７０】
上記β−アクチン転写産物定量用プライマーを用いた場合は、β−アクチン転写産物およびβ−アクチンのスタンダードからは６４９ｂｐのＤＮＡ断片が、β−アクチンの内部コントロールからは４３９ｂｐのＤＮＡ断片が増幅する（第５図写真）。
【０４７１】
Ｇ６転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として、第５図ヒストグラムおよび第３−１表および第３−２表に示した。
【表３】
Figure 0004995398
Figure 0004995398
【０４７２】
Ｇ６転写産物は調べた３６種のヒト組織のほとんどで発現していた（第５図）。発現量は組織により異なり、小脳、下垂体、気管、肺、大腸、胎盤、精巣などの組織で比較的多く発現していた。また、ヒト末梢血より分離した単球およびリンパ球細胞でもＧ６転写産物が発現していた。
【０４７３】
細胞株においては、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５、肺癌細胞株（ＥＢＣ１、ＨＡＬ８、ＬＸ−１、ＰＣ−７、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＭＫＮ７、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ７４、ＨＳＣ４３）、神経芽細胞腫細胞株（ＮＢ９、ＳＣＣＨ−２６、ＩＭＲ３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、グリオブラストーマ細胞株（Ｕ２５１）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１）、Ｂ細胞株（ＮＡＬＬ−１）で比較的多く発現していた（第３−１表，第３−２表）。
【０４７４】
(実施例１２) Ｇ６ポリペプチドをコードする染色体遺伝子の構造解析
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。従って、本発明のＧ６ｃＤＮＡの配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のＧ６ポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子（Ｇ６染色体遺伝子と呼ぶ）を同定し、その構造を明らかにできる可能性がある。Ｇ６ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造を決定することができる。
【０４７５】
ヒトＧ６ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）とＧｅｎＢａｎｋ〔インターネット上のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からアクセスできる〕に登録されている配列とを比較した結果、登録番号ＡＣ０２５８３３（２０００年５月３０日公開）のヒト染色体ワーキングドラフト配列（１３１７１６ｂｐ）の一部〔６７７５８番目から７２１７６番目の配列からなるアセンブリー配列（ａｓｓｅｍｂｌｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：配列番号３０に示す〕が、Ｇ６ｃＤＮＡの塩基配列と一致することが判明した。解析の結果、配列番号２で表される塩基配列を有するＧ６ｃＤＮＡ配列の１番目から３７２１番目の塩基は、配列番号３０の６５３番目から４３７３番目の塩基と一致した。従って、配列番号２に示したＧ６ｃＤＮＡ部分は１個のエクソンから構成されていることが明らかとなった。配列番号２に示したＧ６ｃＤＮＡ配列の３７０２番目から３７０７番目に存在するＡＡＴＡＡＡからなる配列は、ポリアデニレーションシグナルと考えられた。該エクソンの上流配列（６５４ｂｐ）は、Ｇ６染色体遺伝子のプロモーター領域（転写制御領域を含む）と考えられた。該プロモーター領域（６５４ｂｐ）について、配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｄａｔａｂａｓｅ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１７４９（１９９０）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６，４５５（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０Ｓ，２０９１（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１Ｓ，３１１７（１９９３）〕をもとに作成されたＭｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍを用いて、転写因子の結合配列のコンセンサス配列の存在について解析した結果、該配列はプロモーター領域を有する配列であると判断された。
【０４７６】
登録番号ＡＣ０２５８３３の配列は、ヒトの１番染色体由来であることから、Ｇ６染色体遺伝子はヒトの１番染色体に位置することが判明した。Ｇ６染色体遺伝子の染色体上の位置と構造（プロモーター領域とエクソン領域）は、本発明によってＧ６ｃＤＮＡの構造とコードするポリペプチドの機能が明らかになったことにより、初めて特定できたものである。また、登録番号ＡＣ０２５８３３の配列がβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ６ポリペプチド）をコードするということはこれまでに明らかにはなっていなかった。
【０４７７】
産業上の利用可能性
本発明は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色法、該ポリペプチドを用いたＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該組換え体ベクターを保有する形質転換体を用いたＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる物質のスクリーニング法、該ＤＮＡあるいは該抗体を用いた炎症性疾患や癌（大腸癌、膵臓癌、胃癌など）の診断法、該ＤＮＡ、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質あるいは該ポリペプチドの有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる物質を用いた炎症性疾患や癌（大腸癌、膵臓癌、胃癌など）の治療法を提供することができる。
【０４７８】
「配列表フリーテキスト」
配列番号４−合成ＤＮＡ
配列番号５−合成ＤＮＡ
配列番号６−合成ＤＮＡ
配列番号７−合成ＤＮＡ
配列番号８−合成ＤＮＡ
配列番号９−合成ＤＮＡ
配列番号１０−合成ＤＮＡ
配列番号１１−合成ＤＮＡ
配列番号１２−合成ＤＮＡ
配列番号１３−ＦＬＡＧペプチドのアミノ酸配列
配列番号１４−合成ＤＮＡ
配列番号１５−合成ＤＮＡ
配列番号１６−合成ＤＮＡ
配列番号１７−合成ＤＮＡ
配列番号１８−合成ＤＮＡ
配列番号１９−合成ＤＮＡ
配列番号２０−合成ＤＮＡ
配列番号２１−合成ＤＮＡ
配列番号２２−合成ＤＮＡ
配列番号２３−合成ＤＮＡ
配列番号２４−合成ＤＮＡ
配列番号２５−合成ＤＮＡ
配列番号２６−合成ＤＮＡ
配列番号２８−合成ＤＮＡ
配列番号２９−合成ＤＮＡ
配列番号３１−合成ＤＮＡ
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KIRIN CO., LTD
NARIMATSU HISASHI
<120> Novel Polypeptide
<130> P02-1088
<140> JP 2002-522509
<141> 2001-08-31
<150> JP 2000-265430
<151> 2000-09-01
<160> 32
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 378
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Arg Met Leu Val Ser Gly Arg Arg Val Lys Lys Trp Gln Leu Ile
1 5 10 15
Ile Gln Leu Phe Ala Thr Cys Phe Leu Ala Ser Leu Met Phe Phe Trp
20 25 30
Glu Pro Ile Asp Asn His Ile Val Ser His Met Lys Ser Tyr Ser Tyr
35 40 45
Arg Tyr Leu Ile Asn Ser Tyr Asp Phe Val Asn Asp Thr Leu Ser Leu
50 55 60
Lys His Thr Ser Ala Gly Pro Arg Tyr Gln Tyr Leu Ile Asn His Lys
65 70 75 80
Glu Lys Cys Gln Ala Gln Asp Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Lys Thr
85 90 95
Ala Pro Glu Asn Tyr Asp Arg Arg Ser Gly Ile Arg Arg Thr Trp Gly
100 105 110
Asn Glu Asn Tyr Val Arg Ser Gln Leu Asn Ala Asn Ile Lys Thr Leu
115 120 125
Phe Ala Leu Gly Thr Pro Asn Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu Gln Arg
130 135 140
Lys Leu Ala Trp Glu Asp Gln Arg Tyr Asn Asp Ile Ile Gln Gln Asp
145 150 155 160
Phe Val Asp Ser Phe Tyr Asn Leu Thr Leu Lys Leu Leu Met Gln Phe
165 170 175
Ser Trp Ala Asn Thr Tyr Cys Pro His Ala Lys Phe Leu Met Thr Ala
180 185 190
Asp Asp Asp Ile Phe Ile His Met Pro Asn Leu Ile Glu Tyr Leu Gln
195 200 205
Ser Leu Glu Gln Ile Gly Val Gln Asp Phe Trp Ile Gly Arg Val His
210 215 220
Arg Gly Ala Pro Pro Ile Arg Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Tyr Val Ser
225 230 235 240
Tyr Glu Met Tyr Gln Trp Pro Ala Tyr Pro Asp Tyr Thr Ala Gly Ala
245 250 255
Ala Tyr Val Ile Ser Gly Asp Val Ala Ala Lys Val Tyr Glu Ala Ser
260 265 270
Gln Thr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Ile Asp Asp Val Phe Met Gly Leu
275 280 285
Cys Ala Asn Lys Ile Gly Ile Val Pro Gln Asp His Val Phe Phe Ser
290 295 300
Gly Glu Gly Lys Thr Pro Tyr His Pro Cys Ile Tyr Glu Lys Met Met
305 310 315 320
Thr Ser His Gly His Leu Glu Asp Leu Gln Asp Leu Trp Lys Asn Ala
325 330 335
Thr Asp Pro Lys Val Lys Thr Ile Ser Lys Gly Phe Phe Gly Gln Ile
340 345 350
Tyr Cys Arg Leu Met Lys Ile Ile Leu Leu Cys Lys Ile Ser Tyr Val
355 360 365
Asp Thr Tyr Pro Cys Arg Ala Ala Phe Ile
370 375
<210> 2
<211> 3750
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (135)..(1271)
<400> 2
aagaagactt ccatttttaa tgaccaacat gtattaagat ggacacctac tctacgaaac 60
acgaagttct atggtctcga agaagcccgt gcctgtttaa aactgatcct aactaaaaac 120
agacttgagt ggat atg aga atg ttg gtt agt ggc aga aga gtc aaa aaa 170
Met Arg Met Leu Val Ser Gly Arg Arg Val Lys Lys
1 5 10
tgg cag tta att att cag tta ttt gct act tgt ttt tta gcg agc ctc 218
Trp Gln Leu Ile Ile Gln Leu Phe Ala Thr Cys Phe Leu Ala Ser Leu
15 20 25
atg ttt ttt tgg gaa cca atc gat aat cac att gtg agc cat atg aag 266
Met Phe Phe Trp Glu Pro Ile Asp Asn His Ile Val Ser His Met Lys
30 35 40
tca tat tct tac aga tac ctc ata aat agc tat gac ttt gtg aat gat 314
Ser Tyr Ser Tyr Arg Tyr Leu Ile Asn Ser Tyr Asp Phe Val Asn Asp
45 50 55 60
acc ctg tct ctt aag cac acc tca gcg ggg cct cgc tac caa tac ttg 362
Thr Leu Ser Leu Lys His Thr Ser Ala Gly Pro Arg Tyr Gln Tyr Leu
65 70 75
att aac cac aag gaa aag tgt caa gct caa gac gtc ctc ctt tta ctg 410
Ile Asn His Lys Glu Lys Cys Gln Ala Gln Asp Val Leu Leu Leu Leu
80 85 90
ttt gta aaa act gct cct gaa aac tat gat cga cgt tcc gga att aga 458
Phe Val Lys Thr Ala Pro Glu Asn Tyr Asp Arg Arg Ser Gly Ile Arg
95 100 105
agg acg tgg ggc aat gaa aat tat gtt cgg tct cag ctg aat gcc aac 506
Arg Thr Trp Gly Asn Glu Asn Tyr Val Arg Ser Gln Leu Asn Ala Asn
110 115 120
atc aaa act ctg ttt gcc tta gga act cct aat cca ctg gag gga gaa 554
Ile Lys Thr Leu Phe Ala Leu Gly Thr Pro Asn Pro Leu Glu Gly Glu
125 130 135 140
gaa cta caa aga aaa ctg gct tgg gaa gat caa agg tac aat gat ata 602
Glu Leu Gln Arg Lys Leu Ala Trp Glu Asp Gln Arg Tyr Asn Asp Ile
145 150 155
att cag caa gac ttt gtt gat tct ttc tac aat ctt act ctg aaa tta 650
Ile Gln Gln Asp Phe Val Asp Ser Phe Tyr Asn Leu Thr Leu Lys Leu
160 165 170
ctt atg cag ttc agt tgg gca aat acc tat tgt cca cat gcc aaa ttt 698
Leu Met Gln Phe Ser Trp Ala Asn Thr Tyr Cys Pro His Ala Lys Phe
175 180 185
ctt atg act gct gat gat gac ata ttt att cac atg cca aat ctg att 746
Leu Met Thr Ala Asp Asp Asp Ile Phe Ile His Met Pro Asn Leu Ile
190 195 200
gag tac ctt caa agt tta gaa caa att ggt gtt caa gac ttt tgg att 794
Glu Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Gln Ile Gly Val Gln Asp Phe Trp Ile
205 210 215 220
ggt cgt gtt cat cgt ggt gcc cct ccc att aga gat aaa agc agc aaa 842
Gly Arg Val His Arg Gly Ala Pro Pro Ile Arg Asp Lys Ser Ser Lys
225 230 235
tac tac gtg tcc tat gaa atg tac cag tgg cca gct tac cct gac tac 890
Tyr Tyr Val Ser Tyr Glu Met Tyr Gln Trp Pro Ala Tyr Pro Asp Tyr
240 245 250
aca gcc gga gct gcc tat gta atc tcc ggt gat gta gct gcc aaa gtc 938
Thr Ala Gly Ala Ala Tyr Val Ile Ser Gly Asp Val Ala Ala Lys Val
255 260 265
tat gag gca tca cag aca cta aat tca agt ctt tac ata gac gat gtg 986
Tyr Glu Ala Ser Gln Thr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Ile Asp Asp Val
270 275 280
ttc atg ggc ctc tgt gcc aat aaa ata ggg ata gta ccg cag gac cat 1034
Phe Met Gly Leu Cys Ala Asn Lys Ile Gly Ile Val Pro Gln Asp His
285 290 295 300
gtg ttt ttt tct gga gag ggt aaa act cct tat cat ccc tgc atc tat 1082
Val Phe Phe Ser Gly Glu Gly Lys Thr Pro Tyr His Pro Cys Ile Tyr
05 310 315
gaa aaa atg atg aca tct cat gga cac tta gaa gat ctc cag gac ctt 1130
Glu Lys Met Met Thr Ser His Gly His Leu Glu Asp Leu Gln Asp Leu
320 325 330
tgg aag aat gct aca gat cct aaa gta aaa acc att tcc aaa ggt ttt 1178
Trp Lys Asn Ala Thr Asp Pro Lys Val Lys Thr Ile Ser Lys Gly Phe
335 340 345
ttt ggt caa ata tac tgc aga tta atg aag ata att ctc ctt tgt aaa 1226
Phe Gly Gln Ile Tyr Cys Arg Leu Met Lys Ile Ile Leu Leu Cys Lys
350 355 360
att agc tat gtg gac aca tac cct tgt agg gct gcg ttt atc taa 1271
Ile Ser Tyr Val Asp Thr Tyr Pro Cys Arg Ala Ala Phe Ile
365 370 375
tagtacttga atgttgtatg ttttcactgt cactgagtca aacctggatg aaaaaaacct 1331
ttaaatgttc gtctataccc taagtaaaat gaggacgaaa gacaaatatt ttgaaagcct 1391
agtccatcag aatgtttctt tgattctaga agctgtttaa tatcacttat ctacttcatt 1451
gcctaagttc atttcaaaga atttgtattt agaaaaggtt tatattatta gtgaaaacaa 1511
aactaaaggg aagttcaagt tctcatgtaa tgccacatat atacttgagg tgtagagatg 1571
ttattaagaa gttttgatgt tagaataatt gcttttggaa aataccaaat gaacgtacag 1631
tacaacattt caaggaaatg aatatattgt tagaccaggt aagcaagttt atttttgtta 1691
aagagcactt ggtggaggta gtaggggcag ggaaaggtca gcataggaga gaaagttcat 1751
gaatctggta aaacagtctc ttgttcttaa gaggagatgt agaaaaatgt gtacaatgtt 1811
attataaaca gacaaatcac gtcttaccac atccatgtag ctactggtgt tagagtcatt 1871
aaaatacctt tttttgcatc ttttttcaaa gtttaatgtg aacttttaga aaagtgatta 1931
atgttgccct aatactttat atgtttttaa tggatttttt tttaagtatt agaaaatgac 1991
acataacacg ggcagctggt tgctcatagg gtccttctct agggagaaac cattgttaat 2051
tcaaataagc tgattttaat gacgttttca actggttttt aaatattcaa tattggtctg 2111
tgtttaagtt tgttatttga atgtaattta catagaggaa tataataatg gagagacttc 2171
aaatggaaag acagaacatt acaagcctaa tgtctccata attttataaa atgaaatctt 2231
agtgtctaaa tccttgtact gattactaaa attaacccac tcctccccaa caaggtctta 2291
taaaccacag cactttgttc caagttcaga gttttaaatt gagagcatta aacatcaaag 2351
ttataatatc taaaacaatt tatttttcat caataactgt cagaggtgat ctttattttc 2411
taaatatttc aaacttgaaa acagagtaaa aaagtgatag aaaagttgcc agtttggggt 2471
taaagcattt ttaaagctgc atgttccttg taatcaaaga gatgtgtctg agatctaata 2531
gagtaagtta catttatttt acaaagcagg ataaaaatgt ggctataata cacactacct 2591
cccttcacta cagaaagaac taggtggtgt ctactgctag ggagattata tgaaggccaa 2651
aataatgact tcagcaagag tgactgaact cactctaagg cctttgactg cagaggcacc 2711
tgttagggaa aatcagatgt ctcatataat aaggtgatgt cggaaacacg caaaacaaaa 2771
cgaaaaaaga tttctcagta tacacaactg aatgatgata cttacaattt ttagcaggta 2831
gctttttaat gtttacagaa attttaattt ttttctattt tgaaatttga ggcttgttta 2891
cattgcttag ataatttaga atttttaact aatgtcaaaa ctacagtgtc aaacattcta 2951
ggttgtagtt actttcagag tagatacagg gttttagatc attacagttt aagttttctg 3011
accaattaaa aaaacataga gaacaaaagc atatttgacc aagcaacaag cttataatta 3071
atttttatta gttgattgat taatgatgta ttgccttttg cccatatata ccctgtgtat 3131
ctatacttgg aagtgtttaa ggttgccatt ggttgaaaac ataagtgtct ctggccatca 3191
aagtgatctt gtttacagca gtgcttttgt gaaacaatta tttatttgct gaaagagctc 3251
ttctgaactg tgtcctttta atttttgctt agaatagaat ggaacaagtt taaatttcaa 3311
ggaaatatga aggcacttcc tttttttcta agaaggaagt tgctagatga ttccttcatc 3371
acacttactt aaagtactga gaagagtatc tgtaaataaa agggttccaa ccttttaaaa 3431
aagaaggaaa aaactttttg gtgctccagt gtagggctat ctttttaaaa aatgtcaaca 3491
aagggaaaat taactatcag cttggatggt cacttgaata gaagatggtt atacacagtg 3551
ttattgttaa aattttttta ccttttggtt ggtttgcatc ttttttccat attgttaatt 3611
ttataccaaa atgttaaata tttgtattac ttgaattttg ctcttgtatg gcaaaataat 3671
tagtgagttt aaaaaaaatc tatagtttcc aataaacaac tgaaaaatta aaaaaaaaaa 3731
aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3750
<210> 3
<211> 738
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(738)
<400> 3
c tac gag cga cgt tct gcc atc aga aag acg tgg ggc aac gag aat tac 49
Tyr Glu Arg Arg Ser Ala Ile Arg Lys Thr Trp Gly Asn Glu Asn Tyr
1 5 10 15
gtc cag tct cag ctc aac gcc aac atc aaa att ctg ttc gcg tta gga 97
Val Gln Ser Gln Leu Asn Ala Asn Ile Lys Ile Leu Phe Ala Leu Gly
20 25 30
act cct cat cca ctg aag gga aaa gag ctg caa aaa aga ctg att tgg 145
Thr Pro His Pro Leu Lys Gly Lys Glu Leu Gln Lys Arg Leu Ile Trp
35 40 45
gaa gat caa gtg tac cac gac ata att cag caa gat ttc act gat tct 193
Glu Asp Gln Val Tyr His Asp Ile Ile Gln Gln Asp Phe Thr Asp Ser
50 55 60
ttc cac aat ctt act ttt aaa ttt ctt ctt cag ttc ggc tgg gca aac 241
Phe His Asn Leu Thr Phe Lys Phe Leu Leu Gln Phe Gly Trp Ala Asn
65 70 75 80
acc ttt tgc cca cat gcc aga ttc ctg atg act gct gat gat gac ata 289
Thr Phe Cys Pro His Ala Arg Phe Leu Met Thr Ala Asp Asp Asp Ile
85 90 95
ttt atc cac atg cca aat ctc att gaa tac ctt caa ggg ctg gag cag 337
Phe Ile His Met Pro Asn Leu Ile Glu Tyr Leu Gln Gly Leu Glu Gln
100 105 110
gtt gga gtt cga gac ttt tgg att ggt cac gtt cac cga ggg ggc cct 385
Val Gly Val Arg Asp Phe Trp Ile Gly His Val His Arg Gly Gly Pro
115 120 125
cct gtt aga gac aaa agt agc aag tac tat gtt ccc tat gaa atg tac 433
Pro Val Arg Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Tyr Val Pro Tyr Glu Met Tyr
130 135 140
aag tgg cca gcc tac cct gac tat acc gcc ggt gct gcc tat gtc gtc 481
Lys Trp Pro Ala Tyr Pro Asp Tyr Thr Ala Gly Ala Ala Tyr Val Val
145 150 155 160
tcc aac gat gta gct gcc aaa atc tat gag gca tca cag acg ctg aat 529
Ser Asn Asp Val Ala Ala Lys Ile Tyr Glu Ala Ser Gln Thr Leu Asn
165 170 175
tcc agc atg tac ata gac gat gtg ttc atg ggc ctc tgc gcc aat aaa 577
Ser Ser Met Tyr Ile Asp Asp Val Phe Met Gly Leu Cys Ala Asn Lys
180 185 190
gtg ggg gtc gtg cca cag gac cat gta ttt ttc tct ggg gaa ggg aag 625
Val Gly Val Val Pro Gln Asp His Val Phe Phe Ser Gly Glu Gly Lys
195 200 205
att cct tac cat ccc tgc atc tat gaa aag atg ata acg tct cat gga 673
Ile Pro Tyr His Pro Cys Ile Tyr Glu Lys Met Ile Thr Ser His Gly
210 215 220
cac tca caa gac cta cag gac ctc tgg gtg gag gcc aca gat cct aaa 721
His Ser Gln Asp Leu Gln Asp Leu Trp Val Glu Ala Thr Asp Pro Lys
225 230 235 240
gtg aag gac att tcg aa 738
Val Lys Asp Ile Ser
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 4
catcacagac actaaattca agtc 14
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 5
gcagtatatt tgaccaaaaa aacc 14
<210> 6
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 6
ctttagagca c 11
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 7
ctctaaag 8
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 8
ggggtaccat agatgcaggg atgataagg 29
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 9
ggggtaccga cttgaattta gtgtctgtga tg 32
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 10
ggggtaccat ctgtagcatt cttccaaagg 30
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 11
ggaattcccc tactctacga aacacgaagt tc 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 12
ggaattccct ttcgtcctca ttttacttag gg 32
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> commercially available amino acid sequence
<400> 13
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 14
agcttgccgc caccatgcat tttcaagtgc agattttca 39
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 15
gcttcctgct aatcagtgcc tcagtcataa tgtcacgtg 39
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 16
gagattacaa ggacgacgat gacaaggcct acgtag 36
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 17
gaagctgaaa atctgcactt gaaaatgcat ggtggcggca 40
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 18
atctccacgt gacattatga ctgaggcact gattagcag 39
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 19
gtacctacgt aggccttgtc atcgtcgtcc ttgta 35
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 20
cgcggatcct ccccacggtc cgtggaccag 30
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 21
atagtttagc ggccgcggaa gggctcagca gcgtcg 36
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 22
cgggatccga taatcacatt gtgagccata tg 32
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 23
gctctagatg acagtgaaaa catacaacat tc 32
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 24
cgggatccat tgtgagccat atgaagtcat at 32
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 25
tcttatgact gctgatgatg acat 24
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 26
gatcatcgcg aga 13
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 27
agcttctcgc gat 13
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 28
ctttaggatc tgtagcattc ttcc 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 29
gatatcgccg cgctcgtcgt cgac 24
<210> 30
<211> 4419
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(652)
<220>
<221> exon
<222> (653)..(4373)
<220>
<221> CDS
<222> (787)..(1923)
<400> 30
ttaaaaaaaa agaaaaaaga agtcttactc ttattcctgc cttgtctggg gcaagcctta 60
atggattttt actgctgtga attttctttt cattgaagat tttgccttga tctatgtatc 120
tgctttcatc ctgaccatat tcaagtcagt atattcatga atgtacctgt ttgtgaaatt 180
tgaacttaag tatacacgat tatagccgtt tgggaagctt tttttttttt ttttttaaga 240
gtaggagtag aaaaaggtct ctgtactctg aatgggaaga cagtgtaaag caattttttc 300
ccttttcctg tcctccttta aaaaaaataa acagccgtat gcctctgcta agtactaact 360
acctcatcac cttttgtgca gacagggcag gttacatttg gttttaagga attaggaata 420
tgtttctttc cagcacctta gtaacccacg cgattgtgat tcttttctct tcttgactgt 480
gataggtggc atggaatatt cacatgggag agccgcatga ggccgcccac cacgcttcct 540
gaaggatgcc cgtgtggaag aattttgacg tgccagtgtc ctcgttctac agggtgttcc 600
attcttccgc aatctcagaa aaatgggact aaaagaaact attttgtaaa ataagaagac 660
ttccattttt aatgaccaac atgtattaag atggacacct actctacgaa acacgaagtt 720
ctatggtctc gaagaagccc gtgcctgttt aaaactgatc ctaactaaaa acagacttga 780
gtggat atg aga atg ttg gtt agt ggc aga aga gtc aaa aaa tgg cag 828
Met Arg Met Leu Val Ser Gly Arg Arg Val Lys Lys Trp Gln
1 5 10
tta att att cag tta ttt gct act tgt ttt tta gcg agc ctc atg ttt 876
Leu Ile Ile Gln Leu Phe Ala Thr Cys Phe Leu Ala Ser Leu Met Phe
15 20 25 30
ttt tgg gaa cca atc gat aat cac att gtg agc cat atg aag tca tat 924
Phe Trp Glu Pro Ile Asp Asn His Ile Val Ser His Met Lys Ser Tyr
35 40 45
tct tac aga tac ctc ata aat agc tat gac ttt gtg aat gat acc ctg 972
Ser Tyr Arg Tyr Leu Ile Asn Ser Tyr Asp Phe Val Asn Asp Thr Leu
50 55 60
tct ctt aag cac acc tca gcg ggg cct cgc tac caa tac ttg att aac 1020
Ser Leu Lys His Thr Ser Ala Gly Pro Arg Tyr Gln Tyr Leu Ile Asn
65 70 75
cac aag gaa aag tgt caa gct caa gac gtc ctc ctt tta ctg ttt gta 1068
His Lys Glu Lys Cys Gln Ala Gln Asp Val Leu Leu Leu Leu Phe Val
80 85 90
aaa act gct cct gaa aac tat gat cga cgt tcc gga att aga agg acg 1116
Lys Thr Ala Pro Glu Asn Tyr Asp Arg Arg Ser Gly Ile Arg Arg Thr
95 100 105 110
tgg ggc aat gaa aat tat gtt cgg tct cag ctg aat gcc aac atc aaa 1164
Trp Gly Asn Glu Asn Tyr Val Arg Ser Gln Leu Asn Ala Asn Ile Lys
115 120 125
act ctg ttt gcc tta gga act cct aat cca ctg gag gga gaa gaa cta 1212
Thr Leu Phe Ala Leu Gly Thr Pro Asn Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu
30 135 140
caa aga aaa ctg gct tgg gaa gat caa agg tac aat gat ata att cag 1260
Gln Arg Lys Leu Ala Trp Glu Asp Gln Arg Tyr Asn Asp Ile Ile Gln
145 150 155
caa gac ttt gtt gat tct ttc tac aat ctt act ctg aaa tta ctt atg 1308
Gln Asp Phe Val Asp Ser Phe Tyr Asn Leu Thr Leu Lys Leu Leu Met
160 165 170
cag ttc agt tgg gca aat acc tat tgt cca cat gcc aaa ttt ctt atg 1356
Gln Phe Ser Trp Ala Asn Thr Tyr Cys Pro His Ala Lys Phe Leu Met
175 180 185 190
act gct gat gat gac ata ttt att cac atg cca aat ctg att gag tac 1404
Thr Ala Asp Asp Asp Ile Phe Ile His Met Pro Asn Leu Ile Glu Tyr
195 200 205
ctt caa agt tta gaa caa att ggt gtt caa gac ttt tgg att ggt cgt 1452
Leu Gln Ser Leu Glu Gln Ile Gly Val Gln Asp Phe Trp Ile Gly Arg
210 215 220
gtt cat cgt ggt gcc cct ccc att aga gat aaa agc agc aaa tac tac 1500
Val His Arg Gly Ala Pro Pro Ile Arg Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Tyr
225 230 235
gtg tcc tat gaa atg tac cag tgg cca gct tac cct gac tac aca gcc 1548
Val Ser Tyr Glu Met Tyr Gln Trp Pro Ala Tyr Pro Asp Tyr Thr Ala
240 245 250
gga gct gcc tat gta atc tcc ggt gat gta gct gcc aaa gtc tat gag 1596
Gly Ala Ala Tyr Val Ile Ser Gly Asp Val Ala Ala Lys Val Tyr Glu
255 260 265 270
gca tca cag aca cta aat tca agt ctt tac ata gac gat gtg ttc atg 1644
Ala Ser Gln Thr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Ile Asp Asp Val Phe Met
275 280 285
ggc ctc tgt gcc aat aaa ata ggg ata gta ccg cag gac cat gtg ttt 1692
Gly Leu Cys Ala Asn Lys Ile Gly Ile Val Pro Gln Asp His Val Phe
290 295 300
ttt tct gga gag ggt aaa act cct tat cat ccc tgc atc tat gaa aaa 1740
Phe Ser Gly Glu Gly Lys Thr Pro Tyr His Pro Cys Ile Tyr Glu Lys
305 310 315
atg atg aca tct cat gga cac tta gaa gat ctc cag gac ctt tgg aag 1788
Met Met Thr Ser His Gly His Leu Glu Asp Leu Gln Asp Leu Trp Lys
320 325 330
aat gct aca gat cct aaa gta aaa acc att tcc aaa ggt ttt ttt ggt 1836
Asn Ala Thr Asp Pro Lys Val Lys Thr Ile Ser Lys Gly Phe Phe Gly
335 340 345 350
caa ata tac tgc aga tta atg aag ata att ctc ctt tgt aaa att agc 1884
Gln Ile Tyr Cys Arg Leu Met Lys Ile Ile Leu Leu Cys Lys Ile Ser
355 360 365
tat gtg gac aca tac cct tgt agg gct gcg ttt atc taa tagtacttga 1933
Tyr Val Asp Thr Tyr Pro Cys Arg Ala Ala Phe Ile
370 375
atgttgtatg ttttcactgt cactgagtca aacctggatg aaaaaaacct ttaaatgttc 1993
gtctataccc taagtaaaat gaggacgaaa gacaaatatt ttgaaagcct agtccatcag 2053
aatgtttctt tgattctaga agctgtttaa tatcacttat ctacttcatt gcctaagttc 2113
atttcaaaga atttgtattt agaaaaggtt tatattatta gtgaaaacaa aactaaaggg 2173
aagttcaagt tctcatgtaa tgccacatat atacttgagg tgtagagatg ttattaagaa 2233
gttttgatgt tagaataatt gcttttggaa aataccaaat gaacgtacag tacaacattt 2293
caaggaaatg aatatattgt tagaccaggt aagcaagttt atttttgtta aagagcactt 2353
ggtggaggta gtaggggcag ggaaaggtca gcataggaga gaaagttcat gaatctggta 2413
aaacagtctc ttgttcttaa gaggagatgt agaaaaatgt gtacaatgtt attataaaca 2473
gacaaatcac gtcttaccac atccatgtag ctactggtgt tagagtcatt aaaatacctt 2533
tttttgcatc ttttttcaaa gtttaatgtg aacttttaga aaagtgatta atgttgccct 2593
aatactttat atgtttttaa tggatttttt tttaagtatt agaaaatgac acataacacg 2653
ggcagctggt tgctcatagg gtccttctct agggagaaac cattgttaat tcaaataagc 2713
tgattttaat gacgttttca actggttttt aaatattcaa tattggtctg tgtttaagtt 2773
tgttatttga atgtaattta catagaggaa tataataatg gagagacttc aaatggaaag 2833
acagaacatt acaagcctaa tgtctccata attttataaa atgaaatctt agtgtctaaa 2893
tccttgtact gattactaaa attaacccac tcctccccaa caaggtctta taaaccacag 2953
cactttgttc caagttcaga gttttaaatt gagagcatta aacatcaaag ttataatatc 3013
taaaacaatt tatttttcat caataactgt cagaggtgat ctttattttc taaatatttc 3073
aaacttgaaa acagagtaaa aaagtgatag aaaagttgcc agtttggggt taaagcattt 3133
ttaaagctgc atgttccttg taatcaaaga gatgtgtctg agatctaata gagtaagtta 3193
catttatttt acaaagcagg ataaaaatgt ggctataata cacactacct cccttcacta 3253
cagaaagaac taggtggtgt ctactgctag ggagattata tgaaggccaa aataatgact 3313
tcagcaagag tgactgaact cactctaagg cctttgactg cagaggcacc tgttagggaa 3373
aatcagatgt ctcatataat aaggtgatgt cggaaacacg caaaacaaaa cgaaaaaaga 3433
tttctcagta tacacaactg aatgatgata cttacaattt ttagcaggta gctttttaat 3493
gtttacagaa attttaattt ttttctattt tgaaatttga ggcttgttta cattgcttag 3553
ataatttaga atttttaact aatgtcaaaa ctacagtgtc aaacattcta ggttgtagtt 3613
actttcagag tagatacagg gttttagatc attacagttt aagttttctg accaattaaa 3673
aaaacataga gaacaaaagc atatttgacc aagcaacaag cttataatta atttttatta 3733
gttgattgat taatgatgta ttgccttttg cccatatata ccctgtgtat ctatacttgg 3793
aagtgtttaa ggttgccatt ggttgaaaac ataagtgtct ctggccatca aagtgatctt 3853
gtttacagca gtgcttttgt gaaacaatta tttatttgct gaaagagctc ttctgaactg 3913
tgtcctttta atttttgctt agaatagaat ggaacaagtt taaatttcaa ggaaatatga 3973
aggcacttcc tttttttcta agaaggaagt tgctagatga ttccttcatc acacttactt 4033
aaagtactga gaagagtatc tgtaaataaa agggttccaa ccttttaaaa aagaaggaaa 4093
aaactttttg gtgctccagt gtagggctat ctttttaaaa aatgtcaaca aagggaaaat 4153
aaactatcag cttggatggt cacttgaata gaagatggtt atacacagtg ttattgttaa 4213
aattttttta ccttttggtt ggtttgcatc ttttttccat attgttaatt ttataccaaa 4273
atgttaaata tttgtattac ttgaattttg ctcttgtatg gcaaaataat tagtgagttt 4333
aaaaaaaatc tatagtttcc aataaacaac tgaaaaatta tcatgagaag ggtatttaaa 4393
ctttttcatg aacattgctt atataa 4419
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 31
caggaaggaa ggctggaaga gtgc 24
<210> 32
<211> 245
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 32
Tyr Glu Arg Arg Ser Ala Ile Arg Lys Thr Trp Gly Asn Glu Asn Tyr
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Leu Asn Ala Asn Ile Lys Ile Leu Phe Ala Leu Gly
20 25 30
Thr Pro His Pro Leu Lys Gly Lys Glu Leu Gln Lys Arg Leu Ile Trp
35 40 45
Glu Asp Gln Val Tyr His Asp Ile Ile Gln Gln Asp Phe Thr Asp Ser
50 55 60
Phe His Asn Leu Thr Phe Lys Phe Leu Leu Gln Phe Gly Trp Ala Asn
65 70 75 80
Thr Phe Cys Pro His Ala Arg Phe Leu Met Thr Ala Asp Asp Asp Ile
85 90 95
Phe Ile His Met Pro Asn Leu Ile Glu Tyr Leu Gln Gly Leu Glu Gln
100 105 110
Val Gly Val Arg Asp Phe Trp Ile Gly His Val His Arg Gly Gly Pro
115 120 125
Pro Val Arg Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Tyr Val Pro Tyr Glu Met Tyr
130 135 140
Lys Trp Pro Ala Tyr Pro Asp Tyr Thr Ala Gly Ala Ala Tyr Val Val
145 150 155 160
Ser Asn Asp Val Ala Ala Lys Ile Tyr Glu Ala Ser Gln Thr Leu Asn
165 170 175
Ser Ser Met Tyr Ile Asp Asp Val Phe Met Gly Leu Cys Ala Asn Lys
180 185 190
Val Gly Val Val Pro Gln Asp His Val Phe Phe Ser Gly Glu Gly Lys
195 200 205
Ile Pro Tyr His Pro Cys Ile Tyr Glu Lys Met Ile Thr Ser His Gly
210 215 220
His Ser Gln Asp Leu Gln Asp Leu Trp Val Glu Ala Thr Asp Pro Lys
225 230 235 240
Val Lys Asp Ile Ser
245
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図 Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したＨＣＴ−１５細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現量をＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。
【図２】第２図 Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したＨＣＴ−１５細胞を各種糖鎖合成阻害剤で処理した後に、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現量をＦＡＣＳを用いて解析することにより、Ｇ６ポリペプチドが糖タンパク質糖鎖または糖脂質糖鎖の合成に関与しているか検討した結果を示した図である。
【図３】第３図 昆虫細胞で生産させたＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチドを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、銀染色を行った結果を示した図である。Ｂは、昆虫細胞で生産させたＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ６ポリペプチドを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、抗ＦＬＡＧペプチド抗体を用いたウエスタンブロティングを行った結果を示した図である。
【図４】第４図 Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したＮａｍａｌｗａ細胞から中性糖脂質を抽出し、ＴＬＣプレートに展開後、オルシノール染色を行った結果を示した図である。Ｂは、Ｇ６ポリペプチドの発現プラスミドを導入したＮａｍａｌｗａ細胞から中性糖脂質を抽出し、ＴＬＣプレートに展開後、抗Ｎ−アセチルラクトサミン抗体１Ｂ２を用いた抗体染色を行った結果を示した図である。
【図５】第５図 は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ−ＰＣＲ法を用いて、３６種のヒト臓器におけるＧ６転写物およびβ−アクチン転写物の発現量を調べた電気泳動の図である。ヒストグラムは、β−アクチンの発現量を１０００とした時のＧ６転写物の発現量を示したグラフである。

Claims (55)

  1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 配列番号１で表されるアミノ酸配列の３９番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  3. 請求項１または２記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド。
  4. 請求項１または２記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド。
  5. β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項３または４記載のポリペプチド。
  6. β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項３〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  7. ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質が、ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）である請求項６記載のポリペプチド。
  8. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項６または７に記載のポリペプチド。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する糖鎖合成剤。
  10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  11. 配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
  12. 配列番号２で表される塩基配列の１３５〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
  13. 配列番号２で表される塩基配列の２４９〜１２６８番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
  14. 請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  15. β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガ
    ラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項１４に記載のＤＮＡ。
  16. β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項１４または１５記載のＤＮＡ。
  17. ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質が、ラクトシルセラミドまたはパラグロボシドである請求項１６記載のＤＮＡ。
  18. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である請求項１６または１７記載のＤＮＡ。
  19. 請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡ。
  20. 請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組込んで得られる組換え体ベクター。
  21. 請求項２０に記載の組換え体ベクターを保有するヒト個体を除く形質転換体。
  22. 形質転換体が微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群より選ばれる形質
    転換体である、請求項２１記載の形質転換体。
  23. 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、請求項２２記載の形質転
    換体。
  24. 動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞からなる群より選ばれる動物細胞である、請求項２２記載の形質転換体。
  25. 植物細胞が、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、大豆、アブラナ、アルファルファ、イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、または亜麻の植物細胞からなる群より選ばれる植物細胞である、請求項２２記載の形質転換体。
  26. 昆虫細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群より選ばれる昆虫細胞である、請求項２２記載の形質転換体。
  27. 形質転換体が、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である形質転換体である、請求項２１記載の形質転換体。
  28. 請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ，該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
  29. 請求項２７記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法。
  30. 蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項２９記載の製造法。
  31. 請求項２７記載のトランスジェニック植物を栽培し、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
  32. 請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系により請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
  33. 請求項９記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
    （ａ）該酵素源、
    （ｂ）ｉ）ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｖ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
    （ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  34. 請求項９記載の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
    （ａ）該酵素源、
    （ｂ）ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトース転移酵素、
    （ｃ）ｉ）ラクトシルセラミド（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）またはパラグロボシド（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｖ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質、およびｖ）請求項３２または３３記載の方法により得られる糖鎖または複合糖質からなる群より選ばれる受容基質、
    （ｄ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルラクトサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、
    および
    （ｅ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された反応産物を生成、蓄積させ、該水性媒体中より該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
  35. 請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の形質転換体を用い、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ネオラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖からなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成、蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  36. 請求項２７記載の非ヒトトランスジェニック動物を用い、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミド、ラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ネオラクト系糖脂質（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−セラミドを骨格として有する糖脂質）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造
    を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖からなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成、蓄積させ、該個体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  37. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の製造法。
  38. 蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項３６記載の製造法。
  39. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡが有する塩基配列の連続した２４〜１２０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体であるオリゴヌクレオチド。
  40. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または請求項３９記載のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション法により、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
  41. 請求項３９記載のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
  42. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ、または請求項３９記載のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション法により、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出する方法。
  43. 請求項３９記載のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出する方法。
  44. 請求項３９記載のオリゴヌクレオチドを用い、請求項１〜８記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
  45. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
  46. 請求項４５記載の抗体を用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
  47. 請求項４５記載の抗体を用い、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを検出することを特徴とする免疫組織染色法。
  48. 請求項４５記載の抗体を含有する免疫組織染色剤。
  49. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させ、被験試料による該ポリペプチドが有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の変動を測定することを特徴とする、該ポリペプチドが有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
  50. β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項４９記載のスクリーニング法。
  51. β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ；Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有す
    るオリゴ糖、およびｉｉｉ）ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項４９または５０記載のスクリーニング法。
  52. ガラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質が、ラクトシルセラミドまたはパラグロボシドである請求項５１記載のスクリーニング法。
  53. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカンおよびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項５１または５２記載のスクリーニング法。
  54. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、パラグロボシドを認識する抗体、またはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体およびレクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を用い、パラグロボシドまたはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を定量することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
  55. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、請求項４５記載の抗体を用い、該ポリペプチドを定量することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
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