JP2001224377A - α１，４−ガラクトース転移酵素およびそれをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミ
ド中のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基
を転移するα１，４−ガラクトース転移酵素、及び同酵
素をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド
及びそれをコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号４６〜３５３で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中のガ
ラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転移す
る酵素活性を有するポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＤＮＡを利
用したポリペプチドの製造、又は診断もしくは治療に有
用なツールに関する。詳しくは、本発明はα１，４−ガ
ラクトース転移酵素及びそれをコードするＤＮＡ、当該
ＤＮＡを含有する組換えベクター、当該ＤＮＡ又は組換
えベクターで形質転換した形質転換細胞、及び、当該形
質転換細胞を用いたGb3/CD77又はグロボ系糖脂質の製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グリコスフィンゴ脂質は、両極性の分子
であり（１；後述の文献番号を示す。以下同じ。）、糖
転移酵素の連続した作用により合成される（２）。ラク
トシルセラミド（以下、「LacCer」と称することがあ
る）に、異なる３種の糖の内の一つが付加されると、３
種の主要な糖脂質系、すなわち、ガングリオシド系（α
2,3-シアル酸）、ラクト／ネオラクト系（β1,4-Ｎ-ア
セチルグルコサミン）、およびグロボ系（α1,4-ガラク
トース）のいずれか１種となる。グリコスフィンゴ脂質
の炭水化物部分の合成に関与する酵素をコードする多く
の遺伝子が今までに単離されているが（３）、グロボ系
糖脂質の合成に特異的な糖転移酵素は、未だ単離されて
いない。

【０００３】グロボ系糖脂質であるグロボトリアオシル
セラミド（以下、「Gb3」と称することがある）は、赤
血球におけるＰ式血液型のＰ^K抗原として特徴付けられ
る（５）。Wielsらによって報告されているように、Gb3
はバーキットリンパ腫関連抗原であり（６）、Gb3の発
現および生物学的重要性について研究されている（７,
８,９）。Gb3はCD77に分類されることから（10）、この
抗原をGb3/CD77と称することとする。

【０００４】Gb3/CD77は、バーキットリンパ腫細胞にお
いて、多量発現していることが報告されている。しかし
ながら、Gb3/CD77は、現在ではＢ細胞上に発現する分化
抗原と考えられており、Ｂ細胞系統の幾つかの悪性腫瘍
においても観察され得る（７）。通常の白血球では、Gb
3/CD77は胚中心の扁桃Ｂ細胞のサブセットにおいて発現
する（９）。興味深いことに、分離してインビトロで培
養した場合、Gb3/CD77を産生するＢリンパ細胞は、急速
にして自発的なアポトーシスを受ける（11）。さらに、
Gb3/CD77抗原を持つバーキットリンパ腫細胞もまた、低
血清濃度の培地、あるいは抗−イムノグロブリンＭ抗体
による架橋により、アポトーシスが容易に誘導される
（12）。

【０００５】また、Gb3/CD77は、重い細胞毒作用を引き
起こす可能性がある（13,14）エシェリヒア・コリ（E.
coli）O157由来のシガ（Shiga）様毒素であるベロ毒素
（VTs）に対するレセプターとして認識されてきてい
る。ベロ毒素のＢ−サブユニットはGb3/CD77に特異的に
結合し、そしてＡ−サブユニットが細胞に取り込まれ、
その結果、28SリボゾーマルRNAが分解され、細胞は死滅
する（15）。また、Ｂ−サブユニットのみでもアポトー
シスを引き起し得る（16）。これらの結果から、Gb3/CD
77はアポトーシスシグナルの媒介において重要な分子で
あることが示されるが、正確なメカニズムについては研
究の余地がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前述のとおり、グロボ
系糖脂質であるGb3/CD77は、LacCerにα1,4-ガラクトー
スが付加されることにより生成することが判明している
が（４）、この反応に特異的な糖転移酵素は単離されて
いない。本発明は、前記反応を触媒するGb3/CD77合成酵
素、すなわちα１，４−ガラクトース転移酵素、及び同
酵素をコードするＤＮＡを単離し、さらにそれらの利用
法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、α１，４−ガ
ラクトース転移酵素をコードするＤＮＡを単離してその
塩基配列を明らかにし、さらにこのＤＮＡが、活性を有
するα１，４−ガラクトース転移酵素を発現することを
確認して、本発明を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、以下の（Ａ）又は
（Ｂ）のポリペプチド（以下、「本発明ポリペプチド」
ともいう）である。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号４６〜３５３で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中のガ
ラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転移す
る酵素活性を有するポリペプチド。

【０００９】本発明ポリペプチドの他の態様は、以下の
（Ａ’）又は（Ｂ’）のポリペプチドである。 （Ａ’）配列番号２のアミノ酸番号２０〜３５３で表さ
れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。 （Ｂ’）アミノ酸配列（Ａ’）において、１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ
酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体
であるラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中
のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転
移する酵素活性を有するポリペプチド。

【００１０】また本発明ポリペプチドの別の態様は、以
下の（Ａ''）又は（Ｂ''）のポリペプチドである。 （Ａ''）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （Ｂ''）アミノ酸配列（Ａ''）において、１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ
酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体
であるラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中
のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転
移する酵素活性を有するポリペプチド。

【００１１】本発明はまた、前記のいずれかのポリペプ
チドをコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮＡ」とも
いう）を提供する。同ＤＮＡとして具体的には、下記
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
６９〜１１９２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。 本発明はまた、前記ＤＮＡにおいて、ガラクトース供与
体から、受容体であるラクトシルセラミド又はガラクト
シルセラミド中のガラクトース残基のＣ４位に、ガラク
トース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡを提供する。

【００１２】本発明はさらに、前記ＤＮＡを含有する組
換えベクターを提供する。また本発明は、前記ＤＮＡ又
は前記組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形
質転換細胞を提供する。

【００１３】さらに本発明は、前記形質転換細胞を好適
な培地で培養して、前記のいずれかのポリペプチドを発
現させ、生成したポリペプチドを採取する工程を少なく
とも含む、前記ポリペプチドの製造方法を提供する。

【００１４】本発明はまた、前記のいずれかのポリペプ
チド又は前記形質転換細胞の培養物とラクトシルセラミ
ドとを接触させ、酵素反応させる工程を少なくとも含
む、Gb3/CD77の製造方法を提供する。

【００１５】本発明はさらに、前記のいずれかのポリペ
プチド又は前記形質転換細胞の培養物とガラクトシルセ
ラミドとを接触させ、酵素反応させる工程を少なくとも
含む、下記式（１）で示される糖脂質の製造方法を提供
する。

【００１６】Galα1→4Gal-Cer（１） （但し、Galはガラクトース残基を、Cerはセラミド残基
を、α1→4はα1-4グリコシド結合を、それぞれ示す。
以下同じ。）

【００１７】本発明において、ガラクトース供与体か
ら、受容体であるラクトシルセラミド又はガラクトシル
セラミド中のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトー
ス残基を転移する反応を触媒する酵素を、「α１，４−
ガラクトース転移酵素」という。また、ガラクトース供
与体から、受容体であるラクトシルセラミド又はガラク
トシルセラミド中のガラクトース残基のＣ４位に、ガラ
クトース残基を転移する反応を触媒する酵素活性を、
「α１，４−ガラクトース転移酵素活性」という。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】＜１＞本発明ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリ
ペプチドである。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号４６〜３５３で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中のガ
ラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転移す
る酵素活性を有するポリペプチド。

【００２０】上記ポリペプチドは、後述するように、α
１，４−ガラクトース転移酵素の触媒ドメインを少なく
とも含むポリペプチドである。α１，４−ガラクトース
転移酵素は、Ｎ末端から順に細胞質ドメイン、膜貫通ド
メイン及び触媒ドメインを有している。前記（Ａ’）又
は（Ｂ’）で示されるポリペプチドは、少なくとも膜貫
通ドメイン及び触媒ドメインを含むポリペプチドであ
る。また、前記（Ａ''）又は（Ｂ''）で示されるポリペ
プチドは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン及び触媒ド
メインを含むポリペプチドである。これらのポリペプチ
ドはいずれも、本発明ポリペプチドに含まれる。

【００２１】本発明ポリペプチドのアミノ酸配列の一例
を、配列番号２に示す。配列番号２において、アミノ酸
番号１〜１９が細胞質ドメイン、アミノ酸番号２０〜４
５が膜貫通ドメイン、アミノ酸番号４６〜３５３が触媒
ドメインである。

【００２２】上記ポリペプチドの中でも、（Ａ）、
（Ａ’）及び（Ａ''）のポリペプチドが好ましく、
（Ａ’）及び（Ａ''）がより好ましく、（Ａ''）が特に
好ましい。しかし、α１，４−ガラクトース転移酵素活
性を有する限り、いずれのポリペプチドであってもよ
い。

【００２３】なお本明細書中において、「１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ
酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体
であるラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中
のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転
移する酵素活性を有するポリペプチド」とは、ガラクト
ース供与体から、受容体であるラクトシルセラミド又は
ガラクトシルセラミド中のガラクトース残基のＣ４位
に、ガラクトース残基を転移する活性（α１，４−ガラ
クトース転移酵素活性）を実質的に害さない１もしくは
数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有し
ていてもよいことを示す。

【００２４】すなわち、天然に存在するポリペプチドに
は、それをコードするＤＮＡの多形や変異の他、生成後
のポリペプチドの細胞内および精製中の修飾反応などに
よってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿
入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわら
ず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、
生物学的活性を示すものがあることが知られている。こ
のように構造的に若干の差違があってもその機能につい
ては大きな違いが認められないものも、本発明ポリペプ
チドに包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配
列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、こ
の場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可
能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）の
アミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換
したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持する
ことが知られている(Science,224,1431(1984))。また、
ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド
領域を有していることが知られている。例えば、細胞外
に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチド
や、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などが
これにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、また
は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。こ
のようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存
在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプ
チドであり、本発明ポリペプチドに包含されるものであ
る。

【００２５】なお本明細書における「数個のアミノ酸」
とは、本発明酵素の活性が失われない程度の変異を起こ
してもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸
残基からなるポリペプチドの場合、２〜２０程度、好ま
しくは２〜１０、より好ましくは２〜５以下の数を示
す。

【００２６】α１，４−ガラクトース転移酵素活性は、
公知の方法（４）によって測定できる。具体的には、後
記実施例に示すように、UDP-ガラクトース（UDP-Gal）
を供与体として用い、LacCerへのガラクトースの転移反
応を利用した測定方法を用いることによって測定でき
る。よって当業者であれば、α１，４−ガラクトース転
移酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さ
ない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転
位を容易に選択することができる。

【００２７】本発明ポリペプチドは、ヒトメラノーマ細
胞株からのα１，４−ガラクトース転移酵素cDNAの単
離、及び同cDNAのマウスの線維芽細胞における発現によ
り、同定され、性質及び構造が明らかとなったものであ
る。本発明ポリペプチドは、後述の本発明ＤＮＡを適当
な細胞で発現させることにより、取得することができ
る。また、化学合成等により製造されたポリペプチド
も、当然に本発明ポリペプチドに包含される。本発明Ｄ
ＮＡを用いた本発明ポリペプチドの製造方法については
後述する。

【００２８】なお本発明ポリペプチドは、必ずしも単独
のポリペプチドでなくてもよく、必要により融合タンパ
ク質の一部となっていてもよい。例えば、本発明ポリペ
プチドのポリペプチドと他のポリペプチド、例えばプロ
テインＡ、を含む融合ポリペプチドが例示される。

【００２９】本発明ポリペプチドは、ガラクトース供与
体から、受容体であるラクトシルセラミド又はガラクト
シルセラミド中のガラクトース残基のＣ４位に、ガラク
トース残基を転移する酵素活性を有する限り、ポリペプ
チドのみからなるものであってもよいし、糖鎖等を有し
ていてもよい。

【００３０】＜２＞本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡは、前記の本発明ポリペプチドをコードす
るＤＮＡである。同ＤＮＡとして具体的には、下記
（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡが
挙げられる。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号４６〜３５３で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中のガ
ラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転移す
る酵素活性を有するポリペプチド。

【００３１】この中でも、（Ａ）のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡが好ましい。上記ＤＮＡは、少なくともα
１，４−ガラクトース転移酵素の触媒ドメインを含むポ
リペプチドをコードするＤＮＡであるが、本発明ＤＮＡ
は、加えて膜貫通ドメインを含むポリペプチド、又は、
さらに細胞質ドメインを含むポリペプチドをコードする
ＤＮＡも含む。

【００３２】上記（Ａ）のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡとして具体的には、例えば配列番号１において塩基
番号２６９〜１１９２で表される塩基配列を含むＤＮＡ
が例示される。また、膜貫通ドメインを含むポリペプチ
ドをコードするＤＮＡとして具体的には、例えば配列番
号１において塩基番号１９１〜１１９２で表される塩基
配列を含むＤＮＡが例示される。さらに、細胞質ドメイ
ンを含むポリペプチドをコードするＤＮＡとして具体的
には、例えば配列番号１において塩基番号１３４〜１１
９２で表される塩基配列を含むＤＮＡが例示される。

【００３３】なお、配列番号１の塩基配列を有するＤＮ
Ａは、もともとはヒト由来のものであるが、本発明ＤＮ
Ａの由来は限定されず、遺伝子工学的手法や化学合成等
により製造されたＤＮＡも当然に包含される。

【００３４】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列を有するDNAも本発明DNAに包含されることは、当業
者であれば容易に理解されるところである。また、本発
明DNAには、本発明DNAに相補的なDNA又はRNAも包含され
る。さらに本発明DNAは、本発明ポリペプチドをコード
するコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖
およびこれと相補的な塩基配列を有するDNA鎖またはRNA
鎖からなる二本鎖であってもよい。

【００３５】本発明ＤＮＡは、後述する発現クローニン
グ法によって得られたものであるが、本発明ＤＮＡの塩
基配列が明らかになったので、同塩基配列に基づいて作
製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲに
よってヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または
染色体ＤＮＡから、あるいは前記塩基配列にもとづいて
作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリ
ダイゼーションによりcDNAライブラリーまたは染色体Ｄ
ＮＡライブラリーから、単離することもできる。

【００３６】尚、染色体ＤＮＡから本発明ＤＮＡを得た
場合には、イントロンを含むことが予想されるが、その
ようなイントロンを含むＤＮＡであっても、本発明ＤＮ
Ａに包含される。

【００３７】本発明ＤＮＡは、ガラクトース供与体か
ら、受容体であるラクトシルセラミド又はガラクトシル
セラミド中のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトー
ス残基を転移する酵素活性を有するポリペプチドをコー
ドする限り、配列番号１の塩基配列、又は配列番号１に
おいて塩基番号２６９〜１２９２からなる塩基配列、塩
基番号１９１〜１２９２からなる塩基配列、もしくは塩
基番号１３４〜１２９２からなる塩基配列に相補的な塩
基配列又は該塩基配列の一部を有するプローブと、スト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであ
ってもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambroo
k, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manua
l, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」と
して具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mM
ＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100
μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイ
ズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、5
0℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件
が挙げられる。

【００３８】本発明ＤＮＡを導入した形質転換細胞を好
適な培地で培養して、本発明ＤＮＡがコードする本発明
ポリペプチドを発現させ、生成したポリペプチドを採取
することにより、本発明ポリペプチドを製造することが
できる。生成した本発明ポリペプチドは、形質転換細胞
の培養物（形質転換細胞と培地を含むもの）から採取で
きるが、本発明ポリペプチドが形質転換細胞の細胞質中
又は膜画分に生成、蓄積する場合は形質転換細胞から、
また、培地中に蓄積する場合は、培地から、採取する。
さらに、本発明ポリペプチドが発現した細胞を利用する
場合は、形質転換細胞又はその処理物をそのまま、又は
適当な固相に結合し、もしくはゲルに包括させ、固定化
して、利用することができる。すなわち、「形質転換細
胞」の用語には、形質転換細胞そのもののみならず、そ
の抽出物も含まれる。

【００３９】本発明ＤＮＡを宿主細胞に導入するには、
例えば、本発明ＤＮＡを適当なベクターに組み込んで組
換えベクターを作製し、この組換えベクターを用いて本
発明ＤＮＡを宿主細胞に導入すればよい。ベクターとし
ては、発現ベクターが好ましい。

【００４０】宿主細胞は、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮ
Ａを組み込んだ組換えベクターの機能を発揮できる限り
において特に限定されず、動物細胞、植物細胞、微生物
細胞（菌体）が包含され、エシェリヒア・コリ等の原核
細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が具体的に例示され
る。エシェリヒア・コリなどの原核細胞を用いた際は、
本発明ＤＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖
の付加が起こらないため、糖鎖が付加されていない本発
明ポリペプチドを得ることが可能であり、また、哺乳類
細胞等の真核細胞を用いた場合は、本発明ＤＮＡの発現
によって生じるポリペプチドに糖鎖が付加しうるため、
糖鎖を含むポリペプチドの形態で得ることも可能であ
る。

【００４１】本発明ＤＮＡを導入する宿主細胞としてよ
り具体的には、例えばマウスの線維芽細胞であるＬ細胞
が挙げられる。また、ベクターとして具体的には、pCDM
8、pcDNA3発現ベクター（いずれもインビトロジェン(In
vitrogen)社）等が挙げられる。培地や培養条件は、用
いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。

【００４２】本発明ＤＮＡは、直接発現させてもよい
し、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現
させてもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させて
もよいし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよ
い。

【００４３】本発明ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法と
しては、例えば、DEAE-デキストラン法（DEAE-dextran
method）（18）を用いてトランスフェクションを行う方
法がある。

【００４４】培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、公知のポリペプチドの抽出、精製方法によって行う
ことができる。なお培養物には、培地および当該培地中
で培養された細胞が包含される。

【００４５】本発明ポリペプチドの抽出方法として具体
的には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモ
ジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショッ
ク法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤
抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げら
れる。

【００４６】本発明ＤＮＡとして、前記（Ａ''）のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡをＬ細胞で発現させると、
本発明ポリペプチドは細胞の膜画分に局在する。また、
本発明ＤＮＡを、本発明ポリペプチド又は一部を欠く本
発明ポリペプチドと他のポリペプチドとの融合タンパク
質として、可溶性の形態で発現させると、同融合タンパ
ク質は細胞質中に局在し得る。また、本発明ＤＮＡを、
本発明ポリペプチド又は一部を欠く本発明ポリペプチド
と分泌シグナルとの融合タンパク質として発現させる
と、培地中に分泌し得る。尚、一部を欠く本発明ポリペ
プチドをコードするＤＮＡは、そのように設計されたプ
ライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ヒト由来mR
NAもしくはcDNAライブラリー、または染色体ＤＮＡから
単離することができる。

【００４７】細胞又は培地から抽出される本発明ポリペ
プチドの精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモ
ニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分
離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作
が挙げられる。

【００４８】精製されたポリペプチドのアミノ酸配列、
作用、基質特異性等を分析することによって、本発明ポ
リペプチドの製造が確認できる。

【００４９】＜３＞本発明ポリペプチド及び本発明ＤＮ
Ａの利用 本発明ポリペプチドは、グロボ系糖脂質の合成に利用す
ることができる。例えば、本発明ポリペプチド又は本発
明ＤＮＡが導入された形質転換細胞の培養物と、ラクト
シルセラミドとを接触させ、酵素反応させることによ
り、Gb3/CD77を製造することができる。また、本発明ポ
リペプチド又は本発明ＤＮＡが導入された形質転換細胞
の培養物とガラクトシルセラミドとを接触させ、酵素反
応させることにより、下記式（１）で示される糖脂質を
製造することができる。

【００５０】Galα1→4Gal-Cer（１） ここで、本発明ポリペプチドが形質転換細胞の細胞質中
又は膜画分に生成、蓄積する場合は形質転換細胞を、培
地中に蓄積する場合は培地を接触させればよい。また、
本発明ポリペプチドが発現した細胞を利用する場合は、
形質転換細胞又はその抽出物をそのまま、又は固定化し
たものを接触させてもよい。「形質転換細胞」の用語に
は、形質転換細胞そのもののみならず、その抽出物も含
まれる。

【００５１】また、本発明ポリペプチドは、糖タンパク
質中の糖鎖に含まれるラクトシルセラミド又はガラクト
シルセラミド中のガラクトース残基のＣ４位に、特異的
にガラクトース残基を付加することができる。さらに、
本発明ポリペプチドは、糖鎖の選択的合成に利用するこ
とができる。

【００５２】現在まで、多くのβ1,3-ガラクトース転移
酵素及びβ1,4-ガラクトース転移酵素が同定されている
が（27〜30）、本発明のα1,4-ガラクトース転移酵素を
コードする遺伝子は、今までに単離された最初にして唯
一のα1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子である。また、
線虫（C. elegans）またはショウジョウバエ（Drosophi
la melanogaster）の遺伝子のデータベースにおいて、
多くのβ1,3-ガラクトース転移酵素及びβ1,4-ガラクト
ース転移酵素関連遺伝子が同定されているのにも関わら
ず、α1,4-ガラクトース転移酵素遺伝子は検出されてい
ない。これらの事実から、α1,4-ガラクトース転移酵素
は、他のガラクトシル転移酵素よりも比較的に遅れて進
化したこと、また、Gb3を通して合成されたグロボ系糖
脂質は、他の系の糖脂質と比較して、より精密な役割を
果たしていることを示唆している可能性がある。

【００５３】また、Gb3/CD77は、通常のレセプターとは
異なるようである。なぜなら、細胞質ドメインを有して
いなくても、正常な細胞および悪性腫瘍細胞両方におい
て、様々なアポトーシスシグナルを媒介することができ
るからである（16, 31）。インビトロにおいて観察され
る、CD77⁺ BC B細胞の急速な死滅は、内因性のリガンド
分子がGb3/CD77と相互作用して、未成熟Ｂ細胞の生理的
選択をもたらすことを示唆する（11, 32）。さらに、CD
77⁺細胞のアポトーシスを引き起こすベロ毒素のＢサブ
ユニットは、Gb3/CD77関連細胞質分子の研究を強く推進
させる（16）。これらのリガンドおよびGb3/CD77に関連
するシグナルトランスデューサーは、Ｂ細胞の選択、お
よびエシェリヒア・コリO157感染によって引き起こされ
る溶血性尿毒症症候群の発症についての更なる理解に貢
献するであろう。特に、腎不全、溶血および神経学的症
状など、本症候群の組織特異性が、本発明のGb3/CD77合
成酵素であるα1,4-ガラクトース転移酵素の遺伝子操作
により、明かにされることが期待される。

【００５４】さらに、Gb3/CD77およびガングリオシドGM
3は、HIV-1表面糖タンパク質gp120とグリコスフィンゴ
脂質ミクロドメインとの間のCD4誘導相互作用におけ
る、１型ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）の侵入に対す
る選択的補助因子として機能する可能性があることが、
最近報告されている（33, 34）。もし、そのとおりであ
れば、Gb3/CD77は、バクテリア性毒素のみならずウイル
スに対するレセプターである可能性があり、また、Gb3/
CD77発現調節は、HIV-1に対するウイルス感染の治療方
法における、鍵となるターゲットとなる可能性もある。

【００５５】また、腎臓におけるGb3/CD77の発現は、溶
血性尿毒症症候群（HUS）の発症に関与していると考え
られている。さらに、ファブリー病は、腎臓、心臓、脳
及び血管等にGb3/CD77が蓄積する疾患であることが知ら
れている。以上のことから、本発明ポリペプチド及び本
発明ＤＮＡ、ならびに本発明のGb3/CD77又は糖脂質の製
造方法は、このようなGb3/CD77の異常発現による疾患の
治療用ツール、診断用ツール、あるいは研究手段として
利用され得る。

【００５６】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００５７】

【実施例１】α１，４−ガラクトース転移酵素（α1,4G
al-T）cDNAの単離 ＜１＞ヒトメラノーマ細胞株のcDNAライブラリーの調製
及びα1,4Gal-T cDNAのクローニング ヒトメラノーマ細胞株（SK-MEL-37）から、公知の方法
（17）により、ポリ（Ａ⁺）ＲＮＡを調製し、cDNAを合
成した。これをベクタープラスミドpCDM8（インビトロ
ジェン社）に挿入することによりcDNAライブラリーを構
築した。このcDNAライブラリーは、５×１０⁶個の独立
したコロニーを含んでいる。ライブラリーの構築には、
エシェリヒア・コリ（E. coli）MC1061/P3株（18）を用
いた。前記SK-MEL-37株はGb3/CD77の表面発現を欠いて
おり、α1,4Gal-Tを非常に高く発現することから、この
細胞株から作製されたcDNAライブラリーは、良好なcDNA
ライブラリーとなる。

【００５８】上記のcDNAライブラリーのプラスミドを、
DEAE−デキストラン法（18）によって、pdl3027（ポリ
オーマＴ遺伝子を含む。ニューヨーク大学のC. Basilic
o博士の好意により提供された）と共にＬ細胞に導入し
た。Ｌ細胞はα1,4Gal-T活性を有しておらず、また、Gb
3/CD77も発現しないが、大量のLacCerを発現する（1
9）。Ｌ細胞のこれらの特徴により、α1,4Gal-T cDNAク
ローニングにおける、良好な宿主導入細胞となり得る。
前記Ｌ細胞は、マウス線維芽細胞であり、スローン−ケ
タリング（Sloan-Kettering）癌センターのＡ．Ｐ．ア
ルビノ（Albino）博士により恵与された。同細胞は７．
５％ウシ胎仔血清(FCS)を含むダルベッコ改変イーグル
最少培地（DMEM）にて培養した。

【００５９】ＤＮＡの導入の４８時間後、導入された細
胞を分離し、抗Gb3/CD77抗体である、ラットモノクロー
ナル抗体（mAb）38.13（６）と共に、氷冷下で４５分間
インキュベートした。細胞を洗浄後、文献（17）に記載
されるように、ウサギ抗−ラットIgM（ザイメド(ZYMED)
社）でコートされたディッシュに固定した。選別された
細胞からHirtエキス調製により、プラスミドＤＮＡを回
収した。このＤＮＡでE. coli MC1061/P3を形質転換し
た。形質転換株からプラスミドＤＮＡを回収した。以上
の操作を、５回繰り返し行った。最終的に得られた形質
転換株からプラスミドを回収し、Ｌ細胞のマイクロスケ
ールのトランスフェクション、及び導入株におけるGb3/
CD77の細胞表面発現を、文献（19）に記載されているよ
うに、フローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン
社）により分析した。その際、一次抗体としてmAbs38.1
3又はTU-1（23）を、二次抗体としてFITC-結合ウサギ抗
−ラットIgG又は抗−マウスIgM（ザイメド社）を用い
た。その結果、陽性反応を示す２個のクローンを単離す
ることができた。後述の通り、この２個のクローンは本
質的に同一であることから、そのうちの１つをpVTR1と
命名し、分析を続けることとした。

【００６０】図１に、プラスミドpVTR1、およびコント
ロールとして、インサートが挿入されていないプラスミ
ドpCDM8を、上述した方法で導入したＬ細胞のフローサ
イトメトリーの結果を示す。pVTR1が導入された細胞は
明らかにGb3/CD77を発現しているが、pCDM8のみが導入
されたＬ細胞は発現していないことが明かである。こう
して、pVTR1に挿入されているα1,4Gal-Tは、Gb3/CD77
の合成に関与していることが明かにされた。

【００６１】＜２＞導入細胞からの糖脂質の抽出および
Gb3/CD77の同定 上述した導入細胞から、文献（21）に記載されるように
して糖脂質を抽出した。すなわち、導入細胞から、クロ
ロホルム／メタノールを、2:1、1:1、1:2の順に用い
て、約400μｌの密集した細胞（packed cells）から、
糖脂質を抽出した。

【００６２】この抽出した糖脂質について、高性能TLC
プレート（メルク（MERK）社、Darmstadt）、及び、溶
媒としてクロロホルム：メタノール：0.22% CaCl₂（60:
35:8）を用いて、薄層クロマトグラフィー（TLC）を行
った。バンドの検出は、オルシノール噴霧によって行っ
た。基準として、ウシ脳ガングリオシド混合物（和光純
薬工業(株)、東京）、ヒト赤血球由来中性糖脂質、Gb3
（シグマ社）を用いた。

【００６３】その結果、導入細胞から抽出されたグリコ
スフィンゴ脂質は、TLCにおいて明確なGb3バンドを示し
ているが、pCDM8のみを導入した細胞では、Gb3バンドが
全く示されないことが明かとなった（図２Ａ）。これ
は、前記pVTR1中のcDNAが、α1,4Gal-T遺伝子に由来し
ていることを示している。

【００６４】次に、Gb3/CD77の同定を行うため、TLC免
疫染色を行った。文献（21）に記載されているように、
アルミニウム塗布シリカプレート（メルク社）を用い
て、TLCを行った。TLCの後、前記プレートは、文献（2
2）に記載されるように、PVDF膜にブロットした。この
膜を、ブロッキング後、mAb38.13と共にインキュベート
し、抗体の結合は、ＡＢＣキット（ベクターラボラトリ
ース社、Burlingame、CA）、およびコニカイムノステイ
ニング HRP-1000（コニカ社、東京）により検出した。
このTLC免疫染色により、前記cDNA導入細胞の抽出物に
のみ、Gb3の強いバンドが表われることが明かとなった
（図２Ｂ）。

【００６５】＜３＞α1,4Gal-T遺伝子の塩基配列解析 上記のようにしてGb3/CD77を発現すると決定されたcDNA
クローンについて、PRISMダイターミネーターサイクル
シークエンシングキット、およびモデル310ＤＮＡシー
クエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を用い
て、塩基配列を決定したところ、この２個のクローンは
本質的には同一であることが判明した。したがって、こ
れらの内の１つを、続く分析に用いることとし、ｐＶＴ
Ｒ１と命名した。ｐＶＴＲ１中のcDNAの塩基配列を、配
列番号１に示す。また、この塩基配列によってコードさ
れ得るアミノ酸配列を、配列番号１及び２に示す。

【００６６】開始コドンは、コサックのコンセンサスイ
ニシエーション配列（24, 25）に類似した配列中に含ま
れている。このオープン・リーディング・フレームか
ら、分子量40,498Daの353アミノ酸タンパク質が予想さ
れる。

【００６７】これらの配列について、インターネットプ
ログラムBLAST（National Center for Biotechnology I
nformation）を用いてホモロジー検索を行ったが、これ
らの配列と高い相同性を有するcDNAまたはタンパク質
は、データーベース中に検索されなかった。

【００６８】さらに、ソフトウエアーGENETYX-MAC バー
ジョン8.0（ソフトウエアーディベロプメント社）を用
いて、アミノ酸配列およびハイドロパシー分析（35）を
行ったところ（図３）、２６個のアミノ酸配列を有する
単一の疎水性部位が、アミノ末端近傍に存在しているこ
とが判明した（アミノ酸番号20〜45）。この推測上の単
一のアンカー配列によって、１９残基が細胞質中に、３
０８アミノ酸残基がゴルジルーメン中に配置されると考
えられる。

【００６９】また、２箇所の潜在的なＮ−グリコシル化
部位の存在が示唆された（配列番号２のアミノ酸番号１
２１〜１２３、及び２０３〜２０５）。さらに、比較的
高い頻度（１０／３１）で、プロリンが膜貫通部位のＣ
側に認められた。

【００７０】

【実施例２】α1,4Gal-Tの性質および製造 ＜１＞α1,4Gal-Tの酵素活性 実施例１で得られたα1,4Gal-T遺伝子が導入されたＬ細
胞から、膜画分を文献（19）に従って調製した。得られ
た膜画分について、α1,4Gal-T活性を、文献（４）に従
って測定した。反応液の組成は、50μlの容量におい
て、50mMカコジル酸ナトリウム-HCl（pH6.0）、10mM Mg
Cl₂、5mM ガラクトノラクトン（シグマ社）、0.3% Trit
on X-100（シグマ社）、0.4mM LacCer、2.9mMフォスフ
ァチジルグリセロール（シグマ社）、0.2mM UDP-Gal
（シグマ社）、UDP-[¹⁴C]Gal（2.5×10 ⁵dpm）（NEN
社）、50μgタンパク質を含む膜画分、である。タンパ
ク質の濃度は、ローリー法（20）によって決定した。前
記反応による生成物は、C_18Sep-Pakカートリッジ（ウォ
ーターズ（Waters）社、Milford、MA）により単離し、
薄層クロマトグラフィー（TLC）およびバイオ−イメー
ジアナライザー BAS2000（富士フィルム社）を用いたオ
ートラジオグラフにより分析した。結果を図４Ａに示
す。

【００７１】その結果、pVTR1/CDM8を導入したＬ細胞
は、LacCerを受容体として用いた場合、高いGb3合成酵
素活性（7,012ユニット、pmol/h/mgタンパク質）を示し
た。一方、コントロールとして、pCDM8のみを導入した
Ｌ細胞についても同様に測定を行ったが、完全に陰性で
あった。従って、pVTR1のα1,4Gal-T cDNAは、α1,4-Ga
l-T活性およびGb3/CD77の表面発現を決定しており、Gb3
/CD77合成酵素をコードしていることを示している。

【００７２】他の可能性のある受容体に対する酵素活性
についても実験を行った（図４Ｂ）。LacCerおよびガラ
クトシルセラミド以外の受容体では、実質的な［¹⁴Ｃ］
ガラクトースの取り込みは見られなかった（図４Ｂ）。
これら２つの基質におけるKm値は、54.5μM（LacCer）
および132μM（ガラクトシルセラミド）である。Ｐ式血
液型におけるＰ１抗原もまた、パラグロボシド（ＰＧ）
にα1,4ガラクトース転移することによって形成される
が、この酵素は、Ｐ１抗原の合成に関与していないこと
が確かめられた（図４Ｂ）。

【００７３】

【実施例３】各組織におけるα1,4Gal-T遺伝子の発現解
析 マルチプルチョイスノーザンブロットメンブラン（オリ
ジーンテクノロジーズ社、Rockville、MA）、および文
献（18）に記載されるように［³²P］dCTPでラベルされ
たpVTR1のcDNAプローブによって、文献（19）に記載さ
れるようにノーザンブロットハイブリダイゼーションを
行った。また同様に、コントロールとして、同一のメン
ブランおよびラベルされたβ−アクチンcDNAプローブを
用いて、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーションを行ったメンブランについて、バ
イオイメージアナライザーBAS2000（富士フィルム社）
を用いて、その発現レベルを測定した。尚、α1,4Gal-T
遺伝子のmRNAの発現レベルは、コントロールの値で補正
した後、比較することにより測定した。

【００７４】上記ノーザンブロット分析により、様々な
ヒト組織におけるα1,4Gal-T遺伝子のmRNAは、調べられ
た組織において、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、精巣および
胎盤において高い発現レベルを示すことが明かになった
（図５）。

【００７５】

【実施例４】pVTR1プラスミドの細胞への安定的導入 安定的導入細胞を調製するため、pVTR1プラスミドおよ
びpSV2neoプラスミドを、リポフェクションキット（Lip
ofection kit）（東洋紡績株式会社）を用いて、Ｌ細胞
に共導入（co-transfection）させた。導入細胞を選別
するため、細胞は、FCS（7.5％）および抗生物質G418
（300μｇ／ｍｌ）を含むDMEMにて培養した。尚、G418
は、neo遺伝子にコードされる3'-O-アミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼによって不活性化される。

【００７６】上記プラスミドが導入されたG418耐性細胞
は、限界希釈法によりクローニングした。また、pSV2ne
o単独で導入されたクローンは、コントロールとして調
製した。これらの細胞を、mAb38.13と共にインキュベー
トし、続いて、FITC結合ウサギ抗-ラットIgGと反応さ
せ、前記と同様の方法でフローサイトメトリーをおこな
った。その結果、pVTR1およびpSV2neoが安定的に導入さ
れた細胞（L-VTR1）は、明らかにGb3/CD77を強く発現し
ていることが示されたが、pSV2neoが単独で安定的に導
入された細胞（L-neo）では、発現が認められなかった
（図６）。

【００７７】

【実施例５】導入細胞のベロ毒素に対する反応 ＜１＞ＭＴＴアッセイ 前記L-VTR1およびL-neoのベロ毒素に対する反応を比較
するため、48ウェルプレート（1×10⁴細胞／ウェル）
で、ベロ毒素（VT1またはVT2）の存在下で培養した細胞
を用いて、MTTアッセイを行った。このアッセイは、３
連のサンプルで行った。細胞増殖を定量するため、MTT
（シグマ社）5mg/mlを含む50μlのPBSを、各ウェルに加
えた。

【００７８】37℃、５時間のインキュベーションの後、
上清を取り除き、0.1% NP40および4mM HClを含む、100
μlのｎ−プロピルアルコールを加えた。発色反応は、
オートマティックプレートリーダー IMMUNO-MINI NJ-23
00（日本インターメッド社、東京、日本）を用いて、62
0nmのリファレンスフィルターにより、590nmで定量し
た。

【００７９】その結果、ベロ毒素を含む培地におけるL-
VTR1は、ベロ毒素非添加培地と比較して、顕著な増殖抑
制を示したが、L-neoでは、ベロ毒素の影響は見られな
かった（図７）。様々な濃度のベロ毒素に晒した後のL-
VTR1およびL-neoに対するMTTアッセイにより、0.01ng/m
lの濃度であっても、L-VTR1は顕著な増殖抑制を示した
が、L-neoでは抑制されないことが明かとなった（図
８）。

【００８０】＜２＞ＤＮＡ断片化アッセイ ベロ毒素（VT）処理したL-VTR1の死滅に対するメカニズ
ムを確かめるため、ＤＮＡ断片化アッセイを行った。L-
VTR1を、VT2（200ng/ml）の存在下で培養した。２４時
間後、細胞を回収し、ペレットを100μlのリシスバッフ
ァー（10mM Tris-HCl pH7.4、10mM EDTA、および0.5% Tr
iton X-100）で、10分、４℃で溶解させた。遠心分離し
た後、上清を回収し、2μlのRNAse（10mg/ml）および2
μlのプロティナーゼＫ（10mg/ml）を加えた。37℃、１
時間のインキュベーション後、断片化されたＤＮＡを、
２−プロパノールで沈殿させた。TEAバッファー中、0.2
μg/mlのエチジウムブロマイドを含む2%アガロースゲル
で、1.5×10⁶個の細胞から得られたＤＮＡを用いて、電
気泳動を行った。

【００８１】L-VTR1から抽出した細胞質ＤＮＡのアガロ
ースゲル電気泳動により、アポトーシスの特徴である明
確なＤＮＡ断片化のパターンを表していた（図９）。対
照的に、L-neoサンプルはラダー型を示さなかった。従
って、本cDNAによって生じるGb3/CD77は、ベロ毒素に対
する機能的な受容体として働くことが確かめられた。

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【００８９】

【発明の効果】本発明により、α１，４−ガラクトース
転移酵素及びそれをコードするＤＮＡが提供される。同
酵素は、Gb3/CD77等のグロボ系糖脂質の製造に利用する
ことができる。また、前記ＤＮＡは、前記酵素の製造、
あるいはGb3/CD77の異常発現による疾患の治療・診断用
ツール、あるいは研究手段として有用である。また、O1
57感染、ベロ毒素が関連する疾患の治療、診断等に利用
できる可能性もある。

【００９０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 生化学工業株式会社 古川 鋼一 <120> α１，４−ガラクトース転移酵素およびそれをコードするＤＮＡ <130> P-7040 <140> <141> 2000-02-14 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００９１】 <210> 1 <211> 1975 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (134)..(1192) <400> 1 aaggtcggct gctgagccag ggcgtgtctc ccggaggcct gtgggctgcc aggatcccca 60 cctctctgca atgggctgcc caggctgacc agccggttcc tgctggaagc tcctggtctg 120 atctggggat acc atg tcc aag ccc ccc gac ctc ctg ctg cgg ctg ctc 169 Met Ser Lys Pro Pro Asp Leu Leu Leu Arg Leu Leu 1 5 10 cgg ggc gcc cca agg cag cgg gtc tgc acc ctg ttc atc atc ggc ttc 217 Arg Gly Ala Pro Arg Gln Arg Val Cys Thr Leu Phe Ile Ile Gly Phe 15 20 25 aag ttc acg ttt ttc gtc tcc atc atg atc tac tgg cac gtt gtg gga 265 Lys Phe Thr Phe Phe Val Ser Ile Met Ile Tyr Trp His Val Val Gly 30 35 40 gag ccc aag gag aaa ggg cag ctc tat aac ctg cca gca gag atc ccc 313 Glu Pro Lys Glu Lys Gly Gln Leu Tyr Asn Leu Pro Ala Glu Ile Pro 45 50 55 60 tgc ccc acc ttg aca ccc ccc acc cca ccc tcc cac ggc ccc act cca 361 Cys Pro Thr Leu Thr Pro Pro Thr Pro Pro Ser His Gly Pro Thr Pro 65 70 75 ggc aac atc ttc ttc ctg gag act tca gac cgg acc aac ccc aac ttc 409 Gly Asn Ile Phe Phe Leu Glu Thr Ser Asp Arg Thr Asn Pro Asn Phe 80 85 90 ctg ttc atg tgc tcg gtg gag tcg gcc gcc aga act cac ccc gaa tcc 457 Leu Phe Met Cys Ser Val Glu Ser Ala Ala Arg Thr His Pro Glu Ser 95 100 105 cac gtg ctg gtc ctg atg aaa ggg ctt ccg ggt ggc aac gcc tct ctg 505 His Val Leu Val Leu Met Lys Gly Leu Pro Gly Gly Asn Ala Ser Leu 110 115 120 ccc cgg cac ctg ggc atc tca ctt ctg agc tgc ttc ccg aat gtc cag 553 Pro Arg His Leu Gly Ile Ser Leu Leu Ser Cys Phe Pro Asn Val Gln 125 130 135 140 atg ctc ccg ctg gac ctg cgg gag ctg ttc cgg gac aca ccc ctg gcc 601 Met Leu Pro Leu Asp Leu Arg Glu Leu Phe Arg Asp Thr Pro Leu Ala 145 150 155 gac tgg tac gcg gcc gtg cag ggg cgc tgg gag ccc tac ctg ctg ccc 649 Asp Trp Tyr Ala Ala Val Gln Gly Arg Trp Glu Pro Tyr Leu Leu Pro 160 165 170 gtg ctc tcc gac gcc tcc agg atc gca ctc atg tgg aag ttc ggc ggc 697 Val Leu Ser Asp Ala Ser Arg Ile Ala Leu Met Trp Lys Phe Gly Gly 175 180 185 atc tac ctg gac acg gac ttc att gtt ctc aag aac ctg cgg aac ctg 745 Ile Tyr Leu Asp Thr Asp Phe Ile Val Leu Lys Asn Leu Arg Asn Leu 190 195 200 acc aac gtg ctg ggc acc cag tcc cgc tac gtc ctc aac ggc gcg ttc 793 Thr Asn Val Leu Gly Thr Gln Ser Arg Tyr Val Leu Asn Gly Ala Phe 205 210 215 220 ctg gcc ttc gag cgc cgg cac gag ttc atg gcg ctg tgc atg cgg gac 841 Leu Ala Phe Glu Arg Arg His Glu Phe Met Ala Leu Cys Met Arg Asp 225 230 235 ttc gtg gac cac tac aac ggc tgg atc tgg ggt cac cag ggc ccg cag 889 Phe Val Asp His Tyr Asn Gly Trp Ile Trp Gly His Gln Gly Pro Gln 240 245 250 ctg ctc acg cgg gtc ttc aag aag tgg tgt tcc atc cgc agc ctg gcc 937 Leu Leu Thr Arg Val Phe Lys Lys Trp Cys Ser Ile Arg Ser Leu Ala 255 260 265 gag agc cgc gcc tgc cgc ggc gtc acc acc ctg ccc cct gag gcc ttc 985 Glu Ser Arg Ala Cys Arg Gly Val Thr Thr Leu Pro Pro Glu Ala Phe 270 275 280 tac ccc atc ccc tgg cag gac tgg aag aag tac ttt gag gac atc aac 1033 Tyr Pro Ile Pro Trp Gln Asp Trp Lys Lys Tyr Phe Glu Asp Ile Asn 285 290 295 300 ccg gag gag ctg ccg cgg ctg ctc agt gcc acc tat gct gtc cac gtg 1081 Pro Glu Glu Leu Pro Arg Leu Leu Ser Ala Thr Tyr Ala Val His Val 305 310 315 tgg aac aag aag agc cag ggc acg cgg ttc gag gcc acg tcc agg gca 1129 Trp Asn Lys Lys Ser Gln Gly Thr Arg Phe Glu Ala Thr Ser Arg Ala 320 325 330 ctg ctg gcc cag ctg cat gcc cgc tac tgc ccc acg acg cac gag gcc 1177 Leu Leu Ala Gln Leu His Ala Arg Tyr Cys Pro Thr Thr His Glu Ala 335 340 345 atg aaa atg tac ttg tgaggggccc gccaggtcac ctccccaacc tgctcctgat 1232 Met Lys Met Tyr Leu 350 ggggcactgg gccgcccttc ccggggaggc aagattgagg gcccgggaga gggaggcccg 1292 agctgccacc gggcttaggc aggctgttga ggagctgtgg gagcaggccc agtgggaggc 1352 tgtggacacc ccgaggacag tgtcctgtct cgaggcaggg ctgacacatg gtgccatagc 1412 cagcggaggg cgctcagtga gtgccccggg ccttctagac aacaggcagg aaggatgaac 1472 ctcagggcac ccccaggtgg tgcggaaagc caggcagttg ggacagaggt gcccacgagg 1532 gcagaggccg gtgctaaggg gatggggaag aagggacaag attcccagag aggagaggag 1592 gctgttggta ggaaagtggc agggctgggg gagacccagc cccaagggtc cggggcggag 1652 gatgctttgt tcttttctgg ttttggttcc tctttcgcgg ggggtggggg aggtcaacag 1712 ggactgagtg gggcagaggc ccagaagtgc cagcctgggg agccgtttgg gggcagcccc 1772 ttctgcccac cccatccttc ttcctctcca gagatgccag gggggcgtgt atgctctgcc 1832 ccttccctca gacaggggct gggtggggag gctctttagg ctcaggagaa gcattttaaa 1892 gaaaccccca ccctgccgcc cgcattataa acacaggaga ataatcaata gaataaaagt 1952 gaccgactgt caaaaaaaaa aaa 1975 <210> 2 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Lys Pro Pro Asp Leu Leu Leu Arg Leu Leu Arg Gly Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gln Arg Val Cys Thr Leu Phe Ile Ile Gly Phe Lys Phe Thr Phe 20 25 30 Phe Val Ser Ile Met Ile Tyr Trp His Val Val Gly Glu Pro Lys Glu 35 40 45 Lys Gly Gln Leu Tyr Asn Leu Pro Ala Glu Ile Pro Cys Pro Thr Leu 50 55 60 Thr Pro Pro Thr Pro Pro Ser His Gly Pro Thr Pro Gly Asn Ile Phe 65 70 75 80 Phe Leu Glu Thr Ser Asp Arg Thr Asn Pro Asn Phe Leu Phe Met Cys 85 90 95 Ser Val Glu Ser Ala Ala Arg Thr His Pro Glu Ser His Val Leu Val 100 105 110 Leu Met Lys Gly Leu Pro Gly Gly Asn Ala Ser Leu Pro Arg His Leu 115 120 125 Gly Ile Ser Leu Leu Ser Cys Phe Pro Asn Val Gln Met Leu Pro Leu 130 135 140 Asp Leu Arg Glu Leu Phe Arg Asp Thr Pro Leu Ala Asp Trp Tyr Ala 145 150 155 160 Ala Val Gln Gly Arg Trp Glu Pro Tyr Leu Leu Pro Val Leu Ser Asp 165 170 175 Ala Ser Arg Ile Ala Leu Met Trp Lys Phe Gly Gly Ile Tyr Leu Asp 180 185 190 Thr Asp Phe Ile Val Leu Lys Asn Leu Arg Asn Leu Thr Asn Val Leu 195 200 205 Gly Thr Gln Ser Arg Tyr Val Leu Asn Gly Ala Phe Leu Ala Phe Glu 210 215 220 Arg Arg His Glu Phe Met Ala Leu Cys Met Arg Asp Phe Val Asp His 225 230 235 240 Tyr Asn Gly Trp Ile Trp Gly His Gln Gly Pro Gln Leu Leu Thr Arg 245 250 255 Val Phe Lys Lys Trp Cys Ser Ile Arg Ser Leu Ala Glu Ser Arg Ala 260 265 270 Cys Arg Gly Val Thr Thr Leu Pro Pro Glu Ala Phe Tyr Pro Ile Pro 275 280 285 Trp Gln Asp Trp Lys Lys Tyr Phe Glu Asp Ile Asn Pro Glu Glu Leu 290 295 300 Pro Arg Leu Leu Ser Ala Thr Tyr Ala Val His Val Trp Asn Lys Lys 305 310 315 320 Ser Gln Gly Thr Arg Phe Glu Ala Thr Ser Arg Ala Leu Leu Ala Gln 325 330 335 Leu His Ala Arg Tyr Cys Pro Thr Thr His Glu Ala Met Lys Met Tyr 340 345 350 Leu

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌ細胞のGb3/CD77発現を示すフローサイトメ
トリーを示す図。左はpCDM8、右はpVTR1/CDM8を導入し
たＬ細胞。太線は、mAb38.13及びFITC結合ウサギ抗−ラ
ットIgG（二次抗体）による染色の結果を、細線は、二
次抗体単独による染色の結果を示す（コントロール）。

【図２】 α1,4Gal-T遺伝子の一過的導入細胞から抽出
した糖脂質のTLCを示す図。 Ａ：pCDM8（VC）又はpVTR1/CDM8（TF）を導入したＬ細
胞から抽出した糖脂質のTLC。RBCは、ヒトＢ赤血球細胞
から抽出した中性糖脂質。 Ｂ：mAb38.13によるGb3/CD77のTLC免疫染色。

【図３】 本発明ポリペプチドのハイドロパシーを示す
図。

【図４】 pVTR1の一過的導入細胞の抽出物におけるα
1,4 Gal-T活性を示す図。 Ａ：LacCerを受容体として用いたα1,4 Gal-T活性。 Ｂ：種々の受容体に対するα1,4 Gal-T活性。PGは、パ
ラグロボシド。

【図５】 α1,4Gal-T遺伝子のノーザンブロッティング
の結果を示す図。Ａ：上段は、pVTR1に由来の³²P-ラベ
ル化プローブによるハイブリダイゼーションの結果を、
下段は上段と同一の膜について、コントロールとしてβ
−アクチンcDNAプローブによるハイブリダイゼーション
の結果を示す。 Ｂ：種々のヒト組織におけるα1,4Gal-T遺伝子のｍＲＮ
Ａの発現レベルの比較を示す図。縦軸は、コントロール
により調整した後の心臓における値に対する百分率を示
す。

【図６】 安定的導入細胞のフローサイトメトリー。左
はpSV2neo、右はpVTR1及びpSV2neoを導入した細胞。細
線は、mAb38.13及びFITC結合ウサギ抗−ラットIgG（二
次抗体）による染色の結果を、太線は二次抗体単独によ
る染色の結果を示す（コントロール）。

【図７】 L-neoおよびL-VTR1のMTTアッセイの結果を示
す図。左はL-neo、右はL-VTR1。

【図８】 細胞増殖におけるベロ毒素の投与効果を示す
図。

【図９】 ＤＮＡ断片化アッセイの結果を示す電気泳動
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ａ (72)発明者 福本 敏 長崎県西彼杵郡長与町三根郷53−131−５ −52 (72)発明者 古川 圭子 愛知県名古屋市北区名城３丁目１−５ 名 城住宅５−402 (72)発明者 岡島 徹也 愛知県名古屋市守山区町南14−25 (72)発明者 古川 鋼一 愛知県名古屋市北区名城３丁目１−５ 名 城住宅５−402 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 BA10 CA04 DA02 EA04 GA12 HA01 4B050 CC03 DD07 LL01 LL03 LL05 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA16 4B065 AA91X AA99Y AB01 BA02 CA29 CA44

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチ
   ド。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号４６〜３５３で表され
   るアミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
   アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
   列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
   るラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中のガ
   ラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転移す
   る酵素活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 以下の（Ａ’）又は（Ｂ’）のポリペプ
   チド。 （Ａ’）配列番号２のアミノ酸番号２０〜３５３で表さ
   れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。 （Ｂ’）アミノ酸配列（Ａ’）において、１もしくは数
   個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ
   酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体
   であるラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中
   のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転
   移する酵素活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 以下の（Ａ''）又は（Ｂ''）のポリペプ
   チド。 （Ａ''）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （Ｂ''）アミノ酸配列（Ａ''）において、１もしくは数
   個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ
   酸配列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体
   であるラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中
   のガラクトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転
   移する酵素活性を有するポリペプチド。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項４記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２
   ６９〜１１９２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
   に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
   るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   するＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ガラクトース供与体から、受容体である
   ラクトシルセラミド又はガラクトシルセラミド中のガラ
   クトース残基のＣ４位に、ガラクトース残基を転移する
   酵素活性を有するポリペプチドをコードする請求項５記
   載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項４〜６のいずれか一項に記載のＤ
   ＮＡを含有する組換えベクター。
8. 【請求項８】 請求項４〜６のいずれか一項に記載のＤ
   ＮＡ、又は請求項７記載の組換えベクターを宿主細胞に
   導入して得られる形質転換細胞。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換細胞を好適な
   培地で培養して請求項１〜３のいずれか１項に記載のポ
   リペプチドを発現させ、生成したポリペプチドを採取す
   る工程を少なくとも含む、前記ポリペプチドの製造方
   法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    ポリペプチド又は請求項８記載の形質転換細胞の培養物
    とラクトシルセラミドとを接触させ、酵素反応させる工
    程を少なくとも含む、Gb3/CD77の製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    ポリペプチド又は請求項７記載の形質転換細胞の培養物
    とガラクトシルセラミドとを接触させ、酵素反応させる
    工程を少なくとも含む、下記式（１）で示される糖脂質
    の製造方法。 Galα1→4Gal-Cer（１） （但し、Galはガラクトース残基を、Cerはセラミド残基
    を、α1→4はα1-4グリコシド結合を、それぞれ示
    す。）