CN105828833A

CN105828833A - 突变的成纤维细胞生长因子（fgf）1及使用方法

Info

Publication number: CN105828833A
Application number: CN201480070201.7A
Authority: CN
Inventors: 徐在明; M·道恩斯; R·M·埃文斯; A·阿特金斯; R·于
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2016-08-03
Also published as: AU2014340241B2; WO2015061361A1; US9925241B2; AU2014340241A1; AU2019200266A1; CA2928135A1; US20190192630A1; MX2016005101A; SG11201603134XA; EP3060238A1; EP3060238A4; JP2016535087A; JP6621752B2; US20180193418A1; US20150111821A1

Abstract

本公开内容提供了FGF1突变蛋白，例如，具有N?末端缺失、点突变或其组合的那些，其可降低哺乳动物中的血糖。这类突变的FGF1蛋白可以是嵌合蛋白的一部分，所述嵌合蛋白包含β?Klotho结合蛋白、FGFR1c?结合蛋白、β?Klotho结合蛋白和FGFR1c?结合蛋白、来自FGF19或FGF21的C?末端区域。在一些实例中，突变的FGF1具有降低的促有丝分裂活性。还提供了编码这类蛋白的核酸分子，和包含这类核酸的载体和细胞。还提供了使用所公开的分子用于降低血糖水平的方法。

Description

突变的成纤维细胞生长因子（FGF）1及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年10月21日提交的美国临时申请No.61/893,766、于2014年3月7日提交的美国临时申请No.61/949,945、于2014年4月4日提交的美国临时申请No.61/975,530、于2014年6月30日提交的美国临时申请No.62/019,185、于2014年9月4日提交的美国临时申请No.62/046,038的优先权，所述申请都以引用的形式纳入本文。

政府资助的声明

本发明是在美国国立卫生研究院、美国国立人类基因组研究所授予的基金号DK057978、DK090962、HL088093、HL105278和ES010337的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本申请提供了突变的FGF1蛋白、FGFR1c-结合蛋白多聚体、编码所述蛋白的核酸，以及它们的使用方法，例如用于治疗代谢疾病的方法。

背景技术

2型糖尿病和肥胖症是死亡率的主要原因，并且与西方生活方式(其特征在于过量的营养摄入和缺乏锻炼)相关。这些疾病的病理生理学中的核心作用因子(player)是核激素受体(NHR)PPARγ——一种脂肪形成的脂质感受器(lipid sensor)和主调节因子。PPARγ也是噻唑烷二酮(Thiazolidiendione,TZD)类的胰岛素增敏剂(其支配当前口服抗糖尿病药物市场的大的份额)的分子靶标。但是，有很多与TZD的使用相关的副作用，例如，体重增加、肝脏毒性、上呼吸道感染、头痛、背痛、高血糖症、疲劳、鼻窦炎、腹泻、低血糖症、轻度至中度水肿以及贫血。因此，需要鉴定新的胰岛素增敏剂。

发明内容

本文示出了具有降低或消除的促有丝分裂活性的成纤维细胞生长因子(FGF)1的突变体可用于降低哺乳动物中的血糖。基于这些观察，公开了降低哺乳动物中的血糖(例如，以治疗代谢疾病)的方法。这类FGF1突变体可具有N-末端截短、点突变或其组合，例如以降低天然FGF1蛋白的促有丝分裂活性。这类FGF1突变体可单独或与其他试剂(例如，其他降血糖剂如噻唑烷二酮)联合使用。

在一些实例中，所述FGF1突变体是嵌合蛋白的一部分，例如包含来自FGF19或FGF21的C-末端的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个或至少50个连续的氨基酸的嵌合蛋白。

在一些实例中，所述FGF1突变体是嵌合蛋白的一部分，例如包含选择性结合β-Klotho的蛋白(例如SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145或146)的至少10个、至少20个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少150个、至少180个或至少200个氨基酸(例如20-500、20至250、30至200、35至180、37至90或37至180个氨基酸)的嵌合蛋白。

在一些实例中，所述FGF1突变体是嵌合蛋白的一部分，例如包含选择性结合FGFR1c的蛋白(例如SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167)或其多聚体(例如，二聚体或三聚体)(例如SEQID NO:190)的至少10个、至少20个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少150个、至少180个或至少200个氨基酸(例如20-500、20至250、30至200、35至180、37至90或37至180个氨基酸)的嵌合蛋白。

在一些实例中，所述FGF1突变体是嵌合蛋白的一部分，例如包含选择性结合β-Klotho的蛋白的至少10个、至少20个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少150个、至少180个或至少200个氨基酸(例如20-500、20至250、30至200、35至180、37至90或37至180个氨基酸)，并且包含选择性结合FGFR1c的蛋白的至少10个、至少20个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少150个、至少180个或至少200个氨基酸(例如20-500、20至250、30至200、35至180、37至90或37至180个氨基酸)的嵌合蛋白，例如SEQ ID NO:168、169、170或171。

在一些实例中，嵌合蛋白在所述FGF1突变体与所述FGF19、FGF21、FGFR1c-结合或β-Klotho结合序列之间包含接头。在一些实例中，所公开的方法的使用导致如下中的一种或多种：甘油三酯的降低、胰岛素抵抗的减少、高胰岛素血症的降低、葡萄糖耐受性的增强、哺乳动物中高血糖的降低。

本文提供了突变的FGF1蛋白——其可包含FGF1的N-末端部分的缺失、点突变(例如氨基酸置换、缺失、添加或其组合)、或N-末端缺失和点突变的组合，以及它们用于降低葡萄糖(例如以治疗代谢疾病)的使用方法。在一些实例中，这类突变降低成熟的FGF1(例如，SEQ ID NO:5)的促有丝分裂性(mitogenicity)，例如降低至少20％、至少50％、至少70％或至少90％。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是所述成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的截短形式，其可包含例如至少5个、至少6个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少20个连续的N-末端氨基酸的缺失。在一些实例中，所缺失的N-末端氨基酸中的一个或多个被来自FGF21(或对FGFR4具有低亲和力的任意FGF，包括FGF3、FGF5、FGF7、FGF9和FGF10)的相应的氨基酸——例如，来自FGF21(例如，参见SEQ ID NO:21、219、221、222和223)的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个相应的氨基酸——替换。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是所述成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的突变形式，例如包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸置换(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个置换)，例如在表1中所述的那些中的一个或多个的突变形式。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白同时包含N-末端截短和点突变。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1(例如SEQ ID NO:2或4)的氨基酸5-141的至少120个连续的氨基酸(其在一些实例中可包含1-20个点突变，例如置换、缺失或添加)。

在一些实例中，将本文提供的FGF1突变体用于生成嵌合蛋白，例如FGF1/FGF21、FGF1/FGF19、FGF1/β-Klotho结合蛋白、FGF1/FGFR1c-结合蛋白或FGF1/β-Klotho结合蛋白/FGFR1c-结合蛋白。例如，可将所公开的FGF1突变体的C-末端或N-末端直接或间接地连接到FGF21或FGF19的C-末端片段(例如，分别为SEQ ID NO:86或100)的N-末端上。类似地，可将所公开的FGF1突变体的C-末端直接或间接地连接到β-Klotho结合结构域(例如，SEQ IDNO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146，或SEQ ID NO:168、169、170或171的β-Klotho结合部分)的N-末端上，或可将所公开的FGF1突变体的N-末端直接或间接地连接到β-Klotho结合结构域的C-末端上。此外，可将所公开的FGF1突变体的C-末端直接或间接地连接到FGFR1c-结合结构域(例如SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190)的N-末端上，或可将所公开的FGF1突变体的N-末端直接或间接地连接到FGFR1c-结合结构域的C-末端上。在一些实例中，可将所公开的FGF1突变体的C-末端直接或间接地连接到FGFR1c-结合结构域(例如SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、190，或SEQ ID NO:168、169、170或171 的FGFR1c-结合部分)和β-Klotho结合结构域上，可将所公开的FGF1突变体的N-末端直接或间接地连接到FGFR1c-结合结构域和β-Klotho结合结构域或两者(例如SEQ ID NO:168、169、170或171)的C-末端上。可将这类嵌合蛋白用于降低哺乳动物中的血糖，例如以治疗代谢疾病。

具体的示例性的FGF1突变体蛋白示于SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238中，其可用于产生本文提供的任何嵌合体。具体的示例性的FGF1/FGF21嵌合体示于SEQ ID NOS:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、219、221、222和223中。具体的示例性的FGF1/FGF19嵌合体示于SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、220和224中。具体的示例性的FGF1/β-Klotho结合嵌合体示于图23-25中(以及示于SEQ ID NOS:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186和187中)。具体的示例性的FGF1/FGFR1c结合嵌合体示于图23J和24I中(以及示于SEQ ID NOS:188和189中)。具体的示例性的可与FGF1突变体蛋白的N-末端或C-末端直接或间接连接的β-Klotho结合/FGFR1c结合嵌合体示于SEQ ID NOS:168、169、170和171中。

还提供了FGFR1c-结合蛋白二聚体和多聚体(例如三聚体)以及它们用于治疗代谢疾病的用途。实例示于图25E中(也参见SEQ ID NO:190)。

还提供了编码所公开的突变的FGF1蛋白(其包括嵌合体)和所述FGFR1c结合蛋白的分离的核酸分子。还提供了包含所述核酸分子的载体和细胞。

提供了使用所公开的突变的FGF1蛋白和FGFR1c结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)的方法，例如使用具有至少6个连续的N-末端氨基酸的缺失、至少一个点突变或其组合的突变的成熟FGF1蛋白(例如，以降低或消除促有丝分裂活性)的方法。在一些实例中，所述方法包括给药治疗有效量的所公开的突变的FGF1蛋白或FGFR1c结合蛋白(或编码它们的核酸分子)以降低哺乳动物中的血糖，例如降低至少5％。在一些实例中，所述方法包括给药治疗有效量的所公开的突变的FGF1蛋白或FGFR1c结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)以治疗哺乳动物中的代谢疾病。可用所公开的方法治疗的示例性的代谢疾病包括但不限于：糖尿病(例如2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隐匿性自身免疫糖尿病(LAD)或青少年发病的成人型糖尿病(MODY))、多囊卵巢综合症(PCOS)、代谢综合征(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、血脂障碍(例如，高脂血症)以及心血管疾病(例如，高血压)。在一些实例中，这些疾病中的一种或多种同时用所公开的FGF21突变体治疗。还提供了这样的方法：通过给药治疗有效量的所公开的突变的FGF1蛋白或FGFR1c结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)降低饱腹和空腹血糖(fed andfasting blood glucose)、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、减少食物摄入，或它们的组合。

根据以下参照附图进行的详细描述，本公开内容的上述和其他目的和特征会变得更加清楚。

附图说明

图1示出了示例性的野生型成熟FGF1序列(SEQ ID NO:5)，可对成熟的FGF1进行的N-末端缺失(SEQ ID NO:7、8和9)，对成熟的FGF1进行的点突变(SEQ ID NO:10和11)，以及FGF1的类肝素结合结构域的突变(SEQ ID NO:12和13)。

图2A和图2B是示出了在所示时间(A)用对照载体(PBS，空心符号)、rFGF1(皮下0.5mg/kg、实心符号)或rFGF1^ΔNT(皮下0.5mg/kg，虚线，n＝8-12)治疗的ob/ob小鼠、(B)用对照载体(PBS，空心柱)、 rFGF1(皮下0.5mg/kg、实心柱)或rFGF1^ΔNT(皮下0.5mg/kg，条纹柱)治疗(n＝10)的饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中的血糖水平的图表。图2A表明非-促有丝分裂性的FGF1变体rFGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7)在降低ob/ob糖尿病小鼠中血糖水平方面具有与野生型FGF1等同的功效。图2B表明非-促有丝分裂性的FGF1变体rFGF1^ΔNT在降低高脂肪饮食喂养的肥胖小鼠中的血糖水平方面具有与野生型FGF1等同的功效。在自由进食的小鼠中进行载体(PBS)或rFGF1(0.5mg/kg)的皮下注射。值为平均值±SEM。通过双尾t检验进行统计。*P<0.05、**P<0.01。

图2C是示出了在用对照载体(PBS，空心柱)、rFGF1(皮下0.5mg/kg、实心柱)或rFGF1^ΔNT(皮下0.5mg/kg，条纹柱)治疗(n＝5)后DIO小鼠中的食物摄入的图表。

图3A-3D示出了示例性的野生型成熟FGF1序列(SEQ ID NO:5)可如何被突变以包括增加FGF1的热稳定性的突变(M1、M2和M3缺失，分别为SEQ ID NO:22、28和40)，其可与FGF1N-末端缺失和/或点突变结合(SEQ ID NO:23、24、25、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50和51)。

图4A-4B示出了可由示例性的野生型成熟FGF1序列(SEQ ID NO:5)生成以包括N-末端缺失和/或点突变的额外FGF1突变体序列(SEQ ID NO:52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65和66)。

图5A-5B示出了可由示例性的野生型成熟FGF1序列(SEQ ID NO:5)生成以包括N-末端缺失和/或点突变的额外FGF1突变体序列(SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84)。

图6A-6B示出了FGF21(SEQ ID NO:20)和结合β-klotho的FGF21的C-末端部分(SEQID NO:86)，以及它们如何被连接到本文所述的FGF1突变体以形成FGF1/FGF21嵌合蛋白(SEQ ID NOS:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97和98)。所示的FGF1/FGF21嵌合体还可包含具有更长的葡萄糖降低持续时间的K12V和N95V FGF1非促有丝分裂性突变(或本文公开的其他突变，例如表1中列出的那些)中的一种或多种。

图7A-7B示出了FGF19(SEQ ID NO:99)和结合β-klotho的FGF19的C-末端部分(SEQID NO:100)，以及它们如何被连接到本文所述的FGF1突变体以形成FGF1/FGF19嵌合蛋白(SEQ ID NOS:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和112)。所示的FGF1/FGF19嵌合体还可包括具有更长的葡萄糖降低持续时间的K12V和N95V FGF1非促有丝分裂性突变中的一种或多种。

图8是示出了使用M1至M5肽(分别为SEQ ID NOS:22、28、40、54和212)对细胞内信号传导的作用的数字图像。HEK293细胞是经血清饥饿的，然后用10ng/ml浓度的所指示的肽处理15分钟。用指示的抗体对总的细胞裂解物进行蛋白质印迹。

图9是示出了肽NT1(SEQ ID NO:7)、NT2(SEQ ID NO:8)、或NT3(SEQ ID NO:9)、KN(SEQ ID NO:10)和KLE(SEQ ID NO:11)以及它们影响细胞内信号传导的能力的数字图像。HEK293细胞是经血清饥饿的，然后用10ng/ml浓度的所指示的肽处理15分钟。用所指示的抗体对总的细胞裂解物进行蛋白质印迹。

图10是示出了肽FGF1(SEQ ID NO:5)和NT1(SEQ ID NO:7)以及它们影响细胞内信号传导的能力的数字图像。HEK293细胞是经血清饥饿的，然后用10ng/ml浓度的所指示的肽处理15分钟。用所指示的抗体对总的细胞裂解物进行蛋白质印迹。

图11A和11B是示出了M1、M2和M3在ob/ob小鼠中的降葡萄糖作用。小鼠是正常喂食的5月龄C57BL/6J ob/ob。皮下注射所述肽(0.5mg/kg)。

图12示出了体内降葡萄糖作用与FGFR介导的信号传导相关。小鼠是正常喂食的5月龄C57BL/6J ob/ob。皮下注射肽NT1(SEQ ID NO:7)和NT2(SEQ ID NO:8)(0.5mg/kg)。

图13是示出了体内降葡萄糖作用与FGFR介导的信号传导相关的数字图像。将经血清饥饿的HEK 293细胞用所指示的肽(10ng/ml)处理15min并进行蛋白质印迹。FGF1^ΔNTPrep1和FGF1^ΔNTPrep2是相同的序列，仅仅是该蛋白的独立的制品。

图14是示出了在给药FGF1-KLE(SEQ ID NO:11)或FGF1-KN(SEQ ID NO:10)的单一注射后0-120小时的血糖水平的图表。FGF1-KN突变体保留了降低葡萄糖的能力120小时，而FGF1-KLE不能降低葡萄糖。

图15A比较了由rFGF1(SEQ ID NO:5)和NT1(rFGF1^ΔNT，SEQ ID NO:7)诱导的下游FGFR信号传导的剂量反应。图15B与图2C一样。图15C比较了rFGF1和NT1在降低ob/ob小鼠中的葡萄糖方面的剂量反应。A.示出了在用所示浓度的PBS(载体)、rFGF1^ΔNT或rFGF1治疗15分钟后经血清饥饿的HEK293细胞中的细胞内信号传导的蛋白质印迹。B.在注射对照载体(PBS，空心柱)、rFGF1(皮下0.5mg/kg，实心柱)或rFGF^ΔNT(皮下0.5mg/kg，条纹柱，n＝5)后24小时的时间段内DIO小鼠中的食物摄入。C.在12周龄的ob/ob小鼠中与rFGF1(实心柱)相比的经皮下递送的rFGF1^ΔNT(条纹柱)的降葡萄糖作用的剂量反应(n＝6-12)。***P<0.005。

图16是示出了在给药PBS、NT1(FGF1^ΔNT、SEQ ID NO:7)、NT2(FGF1^ΔNT2、SEQ ID NO:8)或NT3(FGF1^ΔNT3、SEQ ID NO:9)0小时、16小时或24小时后的血糖水平的柱形图。应注意，如果N-末端截短14个氨基酸，降葡萄糖活性显著降低(NT2)。小鼠是正常喂食的5月龄C57BL/6J ob/ob。皮下注射所述肽(0.5mg/kg)。

图17A和17B是示出了NT1(SEQ ID NO:7)不能降低HFD-喂养的aP2-Cre；FGFR1f/f小鼠(突变的FGFR1KO小鼠)中的血糖水平的柱形图。在用NT1治疗(小鼠rFGF1^ΔNT，皮下注射0.5mg/kg，每组n＝5)后8月龄HFD-喂养的野生型FGFR1f/f(对照，空心柱)或脂肪特异性的FGFR1敲除(突变体，R1KO，aP2-Cre；FGFR1f/f、实心柱)小鼠中的血糖水平。值为平均值±SEM。(A)示出了原始血糖水平，(B)示出了归一化为100％的起始葡萄糖水平的数据。

图18A和18B是示出了小鼠rFGF1(SEQ ID NO:4的氨基酸1-15)降低HFD-喂养的aP2-Cre；FGFR1f/f小鼠(FGFR1KO，实心柱)中的血糖水平的柱形图。在用rFGF1治疗(小鼠rFGF1，皮下注射0.5mg/kg，每组n＝5)后8月龄HFD-喂养的野生型(FGFR1f/f，黑色柱)或脂肪特异性的FGFR1敲除(R1KO，aP2-Cre；FGFR1f/f、虚线柱) 小鼠中的血糖水平。值为平均值±SEM。(A)示出了原始血糖水平，(B)示出了归一化为100％的起始葡萄糖水平。小鼠FGF1(SEQ ID NO 4的氨基酸1-15)与人的序列(SEQ ID NO:5)是～96％同源的。

图19是示出了FGF1突变K118E(SEQ ID NO:12)和K118N(SEQ ID NO:13)不能降低DIO小鼠中的血糖水平的柱形图。在PBS(空心柱)、K118E(实心柱)和K118N(阴影柱)处理(皮下注射0.5mg/kg，每组n＝4-8)后7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中的血糖水平。值为平均值±SEM。

图20示出了天然FGF1序列(SEQ ID NO:5)和8个类肝素结合突变体FGF1KKK类似物(SEQ ID NO:113、114、115、116、117、118、119和120)。

图21和22示出了FGF1类肝素结合突变体KKK降低了葡萄糖。

图23-26示出了FGF1突变体/β-Klotho结合嵌合体以及FGFR1c-结合蛋白二聚体的示例性排列。示例性的序列示于SEQ ID NO:172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和190中。尽管示出了FGFR1c-或β-Klotho-结合蛋白的单体或二聚体，但是在一些实例中使用了更大的多聚体，例如三聚体等。此外，通过将β-Klotho结合部分替换为FGFR1c-结合部分可将FGF1突变体/β-Klotho结合嵌合体变成FGF1突变体/FGFR1c-结合嵌合体(例如，如图23J和24I中所示的ΔNT FGF1)。此外，可将FGFR1c-结合部分包括在FGF1突变体/β-Klotho结合嵌合体中(例如，如在FIGS.23K和24J中所示的ΔNT FGF1)。CC2240的序列示于SEQ ID NO:121中，C2987的序列示于SEQ ID NO:148中。

图27示出了包含R35E置换的示例性FGF1突变体序列(SEQ ID NO:191-198)。

图28示出了包含R35V置换的示例性FGF1突变体序列(SEQ ID NO:199-206)。

图29示出了示例性的FGF1突变体序列(SEQ ID NO:207-211)。该游离的半胱氨酸(C117)形成了导致蛋白聚集的分子间二硫键。设计成为缬氨酸的突变以提高稳定性，因此将其与其他点突变结合引入。KKKR是推定的肝素结合残基。KY、KE、KEY、KNY是对与FGF 受体相互作用的残基的点突变的多种组合(K＝K12、E＝E87、Y＝Y94、N＝N95)。

图30A-30E示出了示例性的(A)被突变以增加稳定性的FGF1突变体序列(SEQ IDNO:54、212-218和113)；(B)嵌合体(SEQ ID NO:219-224)；(C)被突变以增加稳定性并降低促有丝分裂性的FGF1突变体序列(SEQ ID NO:225-229)；(D)被突变以增加稳定性并降低促有丝分裂性的FGF1突变体序列(SEQ ID NO:230-233)和(E)被突变以增加稳定性并降低促有丝分裂性的FGF1突变体序列(SEQ ID NO:234-238)。

图31示出FGF1(SEQ ID NO:5)和FGF2(SEQ ID NO:85)的比对，粗体为形成β链的氨基酸，突出了其他相关残基并标出了它们的相互作用。

图32A-32D是示出了FGF1突变对体内血糖降低和进食作用的影响的图表。测试了肽KN(Salk_004，SEQ ID NO:10)、KKK(Salk_010，SEQ ID NO:226)、FGF1(SEQ ID NO:5)、KLE(Salk_011，SEQ ID NO:11)、FGF1^ΔNT(NT1)(SEQ ID NO:7)和FGF1^ΔNTKN(Salk_009，SEQ IDNO:225)。

图33A-33B是示出了FGF1突变对体内(A)血糖降低和(B)进食作用的影响的柱形图。测试了肽FGF1(SEQ ID NO:5)、Salk_013(SEQ ID NO:31)和Salk_012(SEQ ID NO:79)。

图34A-34B是示出了FGF1突变对体内(A)血糖降低和(B)进食作用的影响的柱形图。测试了肽Salk_014(SEQ ID NO:230)、Salk_024(SEQ ID NO:84)、Salk_025(SEQ ID NO:208)、Salk_026(SEQ ID NO:209)和Salk_023(SEQ ID NO:38)。

图35A-35B是示出了FGF1突变对体内(A)血糖降低和(B)进食作用的影响的柱形图。测试了肽Salk_014(SEQ ID NO:230)、Salk_024(SEQ ID NO:84)、Salk_025(SEQ ID NO:208)和Salk_026(SEQ ID NO:209)以及Salk_023(SEQ ID NO:38)。

图36A-36B是示出了FGF1突变对体内(A)血糖降低和(B)进食作用的影响的柱形图。测试了肽Salk_014(SEQ ID NO:230)和Salk_032(SEQ ID NO:215)。

图37A-37B是示出了FGF1-FGF19嵌合体对体内(A)血糖降低和(B)进食作用的影响的柱形图。测试了肽Salk_014(SEQ ID NO:230)和Salk_019(SEQ ID NO:224)。

图38是示出了FGF1-FGF21嵌合体对体内(A)血糖降低和(B)进食作用的影响的柱形图。测试了肽FGF1(SEQ ID NO:5)、FGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7)、FGF21(SEQ ID 20)和FGF1-FGF21嵌合体(SEQ ID NO:114+SEQ ID NO:86)。

序列表

所述核酸和氨基酸序列是使用在37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。只显示每条核酸序列的一条链，但是应理解任何提及所示链时均包括其互补链。

SEQ ID NO:1和2分别提供了示例性的人FGF1核酸和蛋白序列。来源：GenBank登录号BC032697.1和AAH32697.1。类肝素结合残基是氨基酸127-129和133-134。

SEQ ID NO:3和4分别提供了示例性的小鼠FGF1核酸和蛋白序列。来源：GenBank登录号BC037601.1和AAH37601.1。

SEQ ID NO:5提供了FGF1的示例性的成熟形式(140aa，在本领域中有时也称为FGF1 15-154)。

SEQ ID NO:6提供了具有N-末端缺失的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:7提供了具有N-末端缺失的FGF1的示例性的成熟形式(FGF1^ΔNT(10-140αα))。

SEQ ID NO:8提供了具有N-末端缺失的FGF1的示例性的成熟形式(FGF1^ΔNT2(14-140αα))。

SEQ ID NO:9提供了具有N-末端缺失的FGF1的示例性的成熟形式(FGF1^ΔNT3(12-140αα))。

SEQ ID NO:10提供了具有降低促有丝分裂活性的点突变(K12V、N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:11提供了具有降低促有丝分裂活性的点突变(K12V、L46V、E87V、N95V、P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1 的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:12和13分别提供了在类肝素结合结构域中具有突变(分别为K118N或K118E，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。在一些实例中，这些序列在其N-末端还包含MFNLPPG。与野生型FGF1相比，这类蛋白具有降低的促有丝分裂性。

SEQ ID NO:14-17提供了示例性的突变的FGF1核输出序列。

SEQ ID NO:18提供了SEQ ID NO:6的编码序列。

SEQ ID NO:19和20提供了示例性的人FGF21核酸和蛋白序列。获自GenBank登录号AY359086和AAQ89444.1。FGF21的成熟形式为约氨基酸21-208。

SEQ ID NO:21提供了FGF1的示例性的N-末端截短形式，其中所述4个N-末端氨基酸来自FGF21(SEQ ID NO:20的氨基酸40-43)。

SEQ ID NO:22提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、C117V和P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。来自Xia et al.,PLoS One.7(11):e48210,2012。

SEQ ID NO:23(FGF1(1-140αα)M1a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、N95V、C117V和P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:24(FGF1^ΔNT1(1-140αα)M1)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、C117V和P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:25(FGF1^ΔNT3(1-140αα)M1a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、C117V和P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:26(FGF1^ΔNT1(1-140αα)M1a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、N95V、C117V和P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:27(FGF1^ΔNT3(1-140αα)M1a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、N95V、C117V和P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:28(FGF1(1-140αα)M2)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(L44F、C83T、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。来自Xia et al.,PLoS One.7(11):e48210,2012。

SEQ ID NO:29(FGF1(1-140αα)M2a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(L44F、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:30(FGF1(1-140αα)M2b)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、C83T、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:31(FGF1(1-140αα)M2c)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:32(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(L44F、C83T、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:33(FGF1^ΔNT3(12-140αα)M2)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(L44F、C83T、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:34(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(L44F、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:35(FGF1^ΔNT3(12-140αα)M2a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(L44F、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:36(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2b)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、C83T、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:37(FGF1^ΔNT3(12-140αα)M2b)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、C83T、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:38(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2c)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、C83T、N95V和C117V、F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:39(FGF1^ΔNT3(12-140αα)M2c)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、C83T、N95V和C117V、F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:40(FGF1(1-140αα)M3)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119GΔ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。来自Xia et al.,PLoS One.7(11):e48210,2012.

SEQ ID NO:41(FGF1(1-140αα)M3a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:42(FGF1(1-140αα)M3b)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、M67I、L73V、N95V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:43(FGF1(1-140αα)M3c)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、M67I、L73V、N95V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:44(FGF1^ΔNT1(1-140αα)M3)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:45(FGF1^ΔNT3(1-140αα)M3)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:46(FGF1^ΔNT1(1-140αα)M3a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:47(FGF1^ΔNT3(1-140αα)M3a)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:48(FGF1^ΔNT1(1-140αα)M3b)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(L44F、M67I、L73V、N95V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:49(FGF1^ΔNT3(1-140αα)M3b)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(L44F、M67I、L73V、N95V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:50(FGF1^ΔNT1(1-140αα)M3c)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、M67I、L73V、N95V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:51(FGF1^ΔNT3(1-140αα)M3c)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的点突变(K12V、L44F、M67I、L73V、N95V、V109L、L111I、C117V、A103G、R119G、Δ104-106和Δ120-122，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:52(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V和K118N，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:53(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V和K118E，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:54(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:55(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V、C117V和K118N，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:56(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V、C117V和K118E，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:57(FGF1^ΔNT(10-140αα))提供了具有点突变(K12V和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:58(FGF1^ΔNT2(12-140αα))提供了具有点突变(K12V和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:59(FGF1^ΔNT(10-140αα))提供了具有点突变(K12V，其中编号参考SEQID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:60(FGF1^ΔNT2(12-140αα))提供了具有点突变(K12V，其中编号参考SEQID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:61(FGF1^ΔNT(10-140αα))提供了具有点突变(N95V，其中编号参考SEQID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:62(FGF1^ΔNT2(12-140αα))提供了具有点突变(N95V，其中编号参考SEQID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:63(FGF1^ΔNT(10-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V和K118N，其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:64(FGF1^ΔNT2(12-140αα))提供了具有点突变(K12V、 N95V和K118E，其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:65(FGF1^ΔNT(10-140αα))提供了具有点突变(K118N，其中编号参考SEQID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:66(FGF1^ΔNT2(12-140αα))提供了具有点突变(K118E，其中编号参考SEQID NO:5)的示例性的N-末端截短的FGF1。

SEQ ID NO:67(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K9T和N10T，其中编号参考SEQID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:68(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K9T、N10T和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:69(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K9T、N10T和K118N，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:70(FGF1(1-140αα))提供了具有突变的NLS序列的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:71(FGF1^ΔNT(1-140αα))提供了具有点突变(Q40P和S47I，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:72(FGF1^ΔNT3(1-140αα))提供了具有点突变(Q40P和S47I，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:73(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、Q40P、S47I和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:74(FGF1^ΔNT(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、Q40P、S47I和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:75(FGF1^ΔNT3(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、Q40P、S47I和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:76(FGF1^ΔNT(1-140αα))提供了具有点突变(Q40P、S47I和H93G，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:77(FGF1^ΔNT3(1-140αα))提供了具有点突变(Q40P、S47I和H93G，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:78(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、Q40P、S47I、H93G和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:79(FGF1^ΔNT(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、Q40P、S47I、H93G和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:80(FGF1^ΔNT3(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、Q40P、S47I、H93G和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:81(FGF1^ΔNT(1-140αα))提供了具有点突变(C117P和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:82(FGF1^ΔNT3(1-140αα))提供了具有点突变(C117P和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:83(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(K12V、N95V、C117P和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:84(FGF1(1-140αα))提供了具有点突变(R35E，其中编号参考SEQ IDNO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。这类拮抗剂可用于治疗低血糖症或I型糖尿病。

SEQ ID NO:85提供了FGF2蛋白序列的示例性部分。

SEQ ID NO:86提供了示例性的C-末端FGF21蛋白序列(P¹⁶⁸-S²⁰⁹hFGF21^C-tail)。可将该片段以其N-末端连接至本文提供的任意FGF1突变体的C-末端以产生FGF1/FGF21嵌合体。

SEQ ID NO:87提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体，其包含K12V和N95V FGF1点突变。所述FGF21部分是氨基酸136至177。

SEQ ID NO:88提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(FGF1^ΔNT-FGF21^C-tail)。所述FGF21部分是氨基酸127至168。

SEQ ID NO:89提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(FGF1^ΔNT3-FGF21^C-tail)。所述FGF21部分是氨基酸125至166。

SEQ ID NO:90提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M1-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变K¹²V、C¹¹⁷V和P¹³⁴V。所述FGF21部分是氨基酸127至168。

SEQ ID NO:91提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M1-FGF21 ^C-^tail)。所述FGF1部分包含点突变K¹²V、C¹¹⁷V和P¹³⁴V。所述FGF21部分是氨基酸125至166。

SEQ ID NO:92提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M1-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变K¹²V、C¹¹⁷V和P¹³⁴V。所述FGF21部分是氨基酸136至177。

SEQ ID NO:93提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M2-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变L⁴⁴F、C⁸³T、C¹¹⁷V和F¹³²W。所述FGF21部分是氨基酸127至168。

SEQ ID NO:94提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M2-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变L⁴⁴F、C⁸³T、C¹¹⁷V和F¹³²W。所述FGF21部分是氨基酸125至166。

SEQ ID NO:95提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M2-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变L⁴⁴F、C⁸³T、C¹¹⁷V和F¹³²W。所述FGF21部分是氨基酸136至177。

SEQ ID NO:96提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M3-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含突变L⁴⁴F、M⁶⁷I、L⁷³V、V¹⁰⁹L、L¹¹¹I、C¹¹⁷V、A¹⁰³G、R¹¹⁹G、Δ104-106和Δ120-122。所述FGF21部分是氨基酸121至162。

SEQ ID NO:97提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M3-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含突变L⁴⁴F、M⁶⁷I、L⁷³V、V¹⁰⁹L、L¹¹¹I、C¹¹⁷V、A¹⁰³G、R¹¹⁹G、Δ104-106和Δ120-122。所述FGF21部分是氨基酸119 至160。

SEQ ID NO:98提供了示例性的FGF1/FGF21嵌合体(M3-FGF21 ^C-tail)。所述FGF1部分包含突变L⁴⁴F、M⁶⁷I、L⁷³V、V¹⁰⁹L、L¹¹¹I、C¹¹⁷V、A¹⁰³G、R¹¹⁹G、Δ104-106和Δ120-122。所述FGF21部分是氨基酸130至171。

SEQ ID NO:99提供了示例性的FGF19蛋白序列。FGF19的成熟形式是氨基酸23至216。

SEQ ID NO:100提供了示例性的C-末端FGF19蛋白序列(L¹⁶⁹-K²¹⁶hFGF19C-tail)。可将该片段以其N-末端连接至本文提供的任意FGF1突变体的C-末端以产生FGF1/FGF19嵌合体。

SEQ ID NO:101提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体。所述FGF1部分包含点突变K¹²V和N⁹⁵V。所述FGF19部分是氨基酸136至183。

SEQ ID NO:102提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(FGF1^ΔNT-FGF19^C-tail)。所述FGF19部分是氨基酸127至174。

SEQ ID NO:103提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(FGF1^ΔNT3-FGF19^C-tail)。所述FGF19部分是氨基酸125至172。

SEQ ID NO:104提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M1-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变K¹²V、C¹¹⁷V和P¹³⁴V。所述FGF19部分是氨基酸136至183。

SEQ ID NO:105提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M1-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变K¹²V、C¹¹⁷V和P¹³⁴V。所述FGF19部分是氨基酸127至174。

SEQ ID NO:106提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M1-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变K¹²V、C¹¹⁷V和P¹³⁴V。所述FGF19部分是氨基酸125至172。

SEQ ID NO:107提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M2-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变L⁴⁴F、C⁸³T、C¹¹⁷V和F¹³²W。所述FGF19部分是氨基酸136至183。

SEQ ID NO:108提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M2-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变L⁴⁴F、C⁸³T、C¹¹⁷V和F¹³²W。所述FGF19部分是氨基酸127至174。

SEQ ID NO:109提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M2-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含点突变L⁴⁴F、C⁸³T、C¹¹⁷V和F¹³²W。所述FGF19部分是氨基酸125至172。

SEQ ID NO:110提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M3-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含突变L⁴⁴F、M⁶⁷I、L⁷³V、V¹⁰⁹L、L¹¹¹I、C¹¹⁷V、A¹⁰³G、R¹¹⁹G、Δ^104-106和Δ^120-122。所述FGF19部分是氨基酸130至177。

SEQ ID NO:111提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M3-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含突变L⁴⁴F、M⁶⁷I、L⁷³V、V¹⁰⁹L、L¹¹¹I、C¹¹⁷V、A¹⁰³G、R¹¹⁹G、Δ^104-106和Δ^120-122。所述FGF19部分是氨基酸121至168。

SEQ ID NO:112提供了示例性的FGF1/FGF19嵌合体(M3-FGF19 ^C-tail)。所述FGF1部分包含突变L⁴⁴F、M⁶⁷I、L⁷³V、V¹⁰⁹L、L¹¹¹I、C¹¹⁷V、A¹⁰³G、R¹¹⁹G、Δ^104-106和Δ^120-122。所述FGF19部分是氨基酸119至166。

SEQ ID NO:113提供了具有突变K112D、K113Q、K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:114提供了具有突变K112D、K113Q、C117V、K118V(其中编号参考SEQ IDNO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:115提供了具有N-末端截短和突变K112D、K113Q、K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:116提供了具有N-末端截短和突变K112D、K113Q、K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:117提供了具有N-末端截短和突变K112D、K113Q、C117V、K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:118提供了具有N-末端截短和突变K112D、K113Q、C117V、K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:119提供了具有突变K12V、N95V、K112D、K113Q、 K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:120提供了具有突变K12V、N95V、K112D、K113Q、C117V、K118V(其中编号参考SEQ ID NO:5)的示例性的FGF1类肝素结合KKK突变类似物。

SEQ ID NO:121提供了示例性的β-Klotho结合蛋白二聚体序列(C2240)，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:122提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:123-130提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，每一个均可通过接头连接至SEQ ID NO:122，然后所得的嵌合体可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:131-140提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:141提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，其可通过接头连接至SEQ ID NO:142-143中的任一个，然后所得的嵌合体可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:142提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，其可通过接头连接至SEQ ID NO:141，然后所得的嵌合体可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:143提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，其可通过接头连接至SEQ ID NO:141，然后所得的嵌合体可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:144-146提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:147提供了示例性的β-Klotho结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，其可与自身连接一次或多次以产生FGFR1c多聚体(例如二聚体或三聚体)。

SEQ ID NO:148(C2987)提供了示例性的FGFR1c结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，其可与自身连接一次或多次以产生FGFR1c多聚体，例如二聚体或三聚体。

SEQ ID NO:149-167提供了示例性的FGFR1c结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。此外，每一个均可与自身连接一次或多次以产生FGFR1c多聚体(例如二聚体或三聚体)，或者这些结合蛋白的组合可连接在一起。

SEQ ID NO:168-171提供了示例性的β-Klotho-FGFR1c结合蛋白序列，其可以其N-末端或C-末端直接或间接地连接至本文提供的任意FGF1突变体以产生嵌合蛋白。

SEQ ID NO:172提供了示例性的WT-FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25A中示出。

SEQ ID NO:173提供了示例性的ΔNT FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25B中示出。

SEQ ID NO:174提供了示例性的FGF1KN/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25C中示出。

SEQ ID NO:175提供了示例性的FGF1KKK/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25D中示出。

SEQ ID NO:176提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的WT-FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25F中示出。

SEQ ID NO:177提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的ΔNT FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25G中示出。

SEQ ID NO:178提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的FGF1KN/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25H中示出。

SEQ ID NO:179提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的FGF1KKK/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25I中示出。

SEQ ID NO:180提供了示例性的WT-FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图26A中示出。

SEQ ID NO:181提供了示例性的ΔNT FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图26B中示出。

SEQ ID NO:182提供了示例性的FGF1KN/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图26C中示出。

SEQ ID NO:183提供了示例性的FGF1KKK/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图26D中示出。

SEQ ID NO:184提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的WT-FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图26F中示出。

SEQ ID NO:185提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的dNT FGF1/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图26F中示出。

SEQ ID NO:186提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的FGF1KN/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25H中示出。

SEQ ID NO:187提供了具有两个β-Klotho结合蛋白部分的示例性的FGF1KKK/β-Klotho结合蛋白嵌合体序列(C2240)。这在图25I中示出。

SEQ ID NO:188提供了示例性的ΔNT FGF1/FGFR1c结合蛋白嵌合体序列(C2987)。这在图23J中示出。

SEQ ID NO:189提供了示例性的ΔNT FGF1/FGFR1c结合蛋白嵌合体序列(C2987)。这在图24I中示出。

SEQ ID NO:190提供了示例性的FGFR1c二聚嵌合体序列(C2987)。这在图25E中示出。

SEQ ID NO:191(FGF1(1-140αα)R35E、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(R35E和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:192(FGF1(1-140αα)R35E、C117V、KKK)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(R35E、K112D、K113Q、C117V和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:193(FGF1(1-140αα)R35E、C117V、K12V、N95V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、R35E、N95V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:194(FGF1^ΔNT1(10-140αα)R35E、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(R35E和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:195(FGF1^ΔNTKNKKK(10-140αα))提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K112D、K113Q、K118V、K12V、N95V、C117V和R35E，其中编号参考SEQ IDNO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:196(FGF1KKK(KN)(1-140αα))提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K112D、K113Q、K118V、K12V、N95V、C117V和R35E，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:197(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2KN)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、R35E、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:198(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2KNKKK)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、R35E、C83T、N95V、C117V、K112D、K113Q、K118V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:199(FGF1(1-140αα)R35V、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(R35V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:200(FGF1(1-140αα)R35V、C117V、KKK)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(R35V、K112D、K113Q、C117V和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:201(FGF1(1-140αα)K12V、R35V、N95V、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、R35V、N95V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:202(FGF1^ΔNT1(10-140αα)R35V、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(R35V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:203(FGF1^ΔNTKNKKK(10-140αα))提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K112D、K113Q、K118V、K12V、N95V、C117V和R35V，其中编号参考SEQ IDNO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:204(FGF1KKK(KN)(1-140αα))提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K112D、K113Q、K118V、K12V、N95V、C117V和R35V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:205(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2KN)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、R35V、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:206(FGF1^ΔNT1(10-140αα)M2KNKKK)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L44F、R35V、C83T、N95V、C117V、K112D、K113Q、K118V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:207((FGF1-140αα)C117V、KKKR)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K112D、K113Q、C117V、K118V、R119V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:208((FGF1-140αα)C117V、KY)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、Y94V、C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:209((FGF1-140αα)C117V、KE)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、E87V、C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:210((FGF1-140αα)C117V、KEY)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、E87V、Y94V、C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:211((FGF1-140αα)C117V、KNY)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、Y94V、N95V、C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:212((FGF1-140αα)K12V、L46V、E87V、N95V、C117V、P134V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、L46V、E87V、N95V、C117V、P134V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:213((FGF1-140αα)C117V、K118V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(C117V和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:214((FGF^ΔNT1C10-140αα)K12V、N95V、C83T、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、N95V、C83T和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:215((FGF^ΔNT1C10-140αα)K12V、N95V、C16T、C83S、C117A)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、N95V、C16T、C83S和C117A，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:216(FGF^ΔNT110-140αα)H21Y、L44F、H102Y、F108Y、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(H21Y、L44F、H102Y、F108Y和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:217(FGF^ΔNT110-140αα)K12V、H21Y、L44F、N95V、H102Y、F108Y、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、H21Y、L44F、N95V、H102Y、F108Y和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:218(FGF1 1-140αα)K12V、H21Y、L44F、N95V、H102Y、F108Y、C117V)提供了具有降低促有丝分裂活性和增强热稳定性的突变(K12V、H21Y、L44F、N95V、H102Y、F108Y和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:219(wtFGF1ΔHBS-FGF21C-tail)提供了具有降低肝素结合位点的功能以影响血清半衰期和受体亲和力的突变(K112D、K113Q、K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式，其与一部分FGF21在C-末端(氨基酸136-177)融合以产生结合βklotho-依赖性激动剂(FGF21)和βklotho-独立性激动剂(FGF1)的代谢益处的试剂。

SEQ ID NO:220(wtFGF1ΔHBS–FGF19C-tail)提供了具有降低肝素结合位点的功能以影响血清半衰期和受体亲和力的突变(K112D、K113Q、K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式，其与一部分FGF19在C-末端(氨基酸138-183)融合以产生结合βklotho-依赖性激动剂(FGF19)和βklotho-独立性激动剂(FGF1)的代谢益处的试剂。

SEQ ID NO:221提供了FGF1的示例性的N-末端截短形式，其中16个N-末端氨基酸来自FGF21(SEQ ID NO:20的氨基酸28-43)，并且所述序列包含C117V突变。

SEQ ID NO:222提供了FGF1的示例性的N-末端截短形式，其中4个N-末端氨基酸来自FGF21(SEQ ID NO:20的氨基酸40-43)，并且所述序列包含C117V突变。

SEQ ID NO:223(wtFGF1-FGF21C-tail)提供了FGF1的示例性的成熟形式，其与一部分FGF21在C-末端(氨基酸136-177)融合以产生结合βklotho-依赖性激动剂(FGF21)和βklotho-独立性激动剂(FGF1)的代谢益处的试剂。

SEQ ID NO:224(wtFGF1-FGF19C-tail)提供了FGF1的示例性的成熟形式，其与一部分FGF19在C-末端(氨基酸138-183)融合以产生结合βklotho-依赖性激动剂(FGF19)和βklotho-独立性激动剂(FGF1)的代谢益处的试剂。

SEQ ID NO:225((FGF^ΔNT1C10-140αα)K12V、N95V、C117V)提供了具有降低促有丝分裂性和增强FGF1的稳定性的突变(K12V、N95V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:226((FGF1KKK 1-140αα)K112D、K113Q、K118V)提供了具有降低促有丝分裂性和增强FGF1的稳定性的突变(K112D、K113Q和K118V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:227((FGF1 1-140αα)K12V、Q40P、S47I、H93G、N95V)提供了具有降低促有丝分裂性和增强FGF1的热稳定性的突变(K12V、Q40P、S47I、H93G和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:228((FGF^ΔNT10-140αα)K12V、Q40P、S47I、H93G、N95V)提供了具有降低促有丝分裂性和增强FGF1的热稳定性的突变(K12V、Q40P、S47I、H93G和N95V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:229((FGF1 1-140αα)M2KN K12V、L44F、C83T、N95V、C117V、F132W)提供了具有降低促有丝分裂性而不增强FGF1的热稳定性的突变(K12V、L44F、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:230((FGF1 1-140αα)C117V)提供了具有通过消除可形成二硫键桥接的聚集蛋白的游离半胱氨酸来改善FGF1稳定性的突变(C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:231((FGF1 1-140αα)KKK(KN)K112D、K113Q、K118V、K12V、N95V、C117V)提供了具有降低促有丝分裂性和类肝素结合以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(K112D、K113Q、K118V、K12V、N95V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:232((FGF1 10-140αα)M2KN K12V、L44F、C83T、N95V、C117V、F132W)提供了具有降低促有丝分裂性和降低FGF1蛋白聚集的可能性而不影响热稳定性的突变(K12V、L44F、C83T、N95V、C117V和F132W，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

SEQ ID NO:233((FGF1 1-140αα)R35E、C117V)提供了具有调控受体结合亲和力/特异性以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(R35E和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:234((FGF1 1-140αα)KY K12V、Y94V、C117V)提供了具有调控受体结合亲和力/特异性以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(K12V、Y94V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:235((FGF1 1-140αα)KE K12V、E87V、C117V)提供了具有调控受体结合亲和力/特异性以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(K12V、E87V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:236((FGF1 1-140αα)KKKR K112D、K113Q、C117V、K118V、R119V)提供了具有减少类肝素结合亲和力/特异性以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(K112D、K113Q、C117V、K118V和R119V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:237((FGF1 1-140αα)KN R35E、K12V、N95V、C117V) 提供了具有调控受体结合亲和力/特异性以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(R35E、K12V、N95V和C117V，其中编号参考SEQ ID NO:5)的FGF1的示例性的成熟形式。

SEQ ID NO:238((FGF1 10-140αα)KN R35E、C117V)提供了具有调控受体结合亲和力/特异性以及降低FGF1蛋白聚集的可能性的突变(R35E和C117V，其中编号参考SEQ IDNO:5)的FGF1的示例性的N-末端截短形式。

具体实施方式

提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实践本公开内容。除非上下文中另有明确说明，单数形式“一”、“一个”和“所述”是指一个或多于一个。例如，术语“包含一个细胞”包括单个或多个细胞，并被认为等同于短语“包含至少一个细胞”。除非上下文中另有明确说明，术语“或”是指所述可选要素中的单个要素或两个或更多个要素的组合。本文使用的“包含”意指“包括”。因此，“包含A或B”意指“包括A、B，或A和B”，而不排除其他要素。本文提到的登录号的日期是至少早在2013年10月21日就获得的序列。本文引用的所有的文献和登录号都以引用的方式纳入本文。

除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管在实施或测试本公开内容时可使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料，但以下描述了适当的方法和材料。所述材料、方法和实例仅是举例说明，并不意欲进行限制。

为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：

给药：通过任何有效途径提供或给予受试者试剂(例如，本文公开的突变的FGF1蛋白)。给药的示例性途径包括，但不限于，口服、注射(例如皮下、肌内、真皮内、腹膜内、静脉内和瘤内)、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。

β-Klotho结合结构域或蛋白：选择性地结合β-Klotho(例如，人β-Klotho，OMIM61135，登录号NP_783864.1)，但不结合其他蛋白的肽序列。β-Klotho是FGF21活性的辅因子。这类结合结构域可包含一个或多个单体(其中所述单体可以是相同的或不同的β-Klotho结合蛋白)，从而产生多聚体(例如二聚体)。在具体的实例中，这类结构域/蛋白不是抗体。示例性的β-Klotho结合蛋白记载于SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145146和168-171，以及美国专利No.8,372,952、美国公开No.2013/0197191和Smith etal.,PLoS One 8:e61432,2013中，所有都以引用的方式纳入本文。

当解离常数(KD)为至少约1x10^-7M、至少约1.5x10^-7、至少约2x10^-7、至少约2.5x10^-7、至少约3x10^-7、至少约至少约5x10^-7M、至少约1x10^-8M、至少约5x10^-8、至少约1x10^-9、至少约5x10^-9、至少约1x10^-10或至少约5x10^-10M时，β-Klotho结合蛋白“特异性结合”β-Klotho。在一个实施方案中，通过使用所述β-Klotho结合蛋白和β-Klotho进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量K_D。在另一个实例中，使用ELISA测定法来测量K_D。

C-末端部分：包含开始于或接近于蛋白的C-末端残基的一段连续氨基酸的蛋白序列的区域。蛋白的C-末端部分可由一段连续的氨基酸(例如，多个氨基酸残基)来限定。

嵌合蛋白：包含全长第一蛋白(例如，FGF1)序列的至少一部分和全长第二蛋白(例如，FGF19、FGF21、β-Klotho结合蛋白或FGF1Rc-结合蛋白)序列的至少一部分的蛋白，其中所述第一和第二蛋白是不同的。嵌合多肽也涵盖包含衍生自同一多肽的两个或更多个非连续部分的多肽。可例如使用接头将所述两个不同的肽直接或间接地连接。

糖尿病：一组代谢疾病，其中受试者具有高血糖，因为胰腺不产生足够的胰岛素或因为细胞不响应于所产生的胰岛素。1型糖尿病由身体不能产生胰岛素而引起。该形式也已被称为“胰岛素依赖性糖尿病”(IDDM)或“青少年糖尿病”。2型糖尿病由胰岛素抵抗而引起，其是一种其中细胞不能适当地使用胰岛素的病症，有时与绝对的胰岛素缺乏结合。该形式也已被称为“非胰岛素依赖性糖尿病”(NIDDM)或“成年型糖尿病”。认为机体组织对胰岛素的有缺陷的响应涉及胰岛素受体。糖尿病以复发性或持久性高血糖为表征，并且在一些实例中通过证明如下中的任一种来诊断：

a.空腹血糖水平≥7.0mmol/l(126mg/dl)；

b.如在葡萄糖耐量试验中75g口服葡萄糖负荷2小时后血糖≥11.1mmol/l(200mg/dL)；

c.高血糖和随机血糖≥11.1mmol/l(200mg/dl)的症状；

d.糖化血红蛋白(Hb A1C)≥6.5％。

有效量或治疗有效量：试剂(例如本文公开的突变的FGF1蛋白(或编码其的核酸)的量，即足以预防、治疗(包括预防)、降低和/或改善任何疾患或疾病的症状和/或潜在病因的量。在一个实施方案中，“有效量”是足以降低或消除疾病(例如糖尿病(例如II型糖尿病))的症状的量，例如通过降低血糖。

成纤维细胞生长因子1(FGF1)：OMIM 13220。包含FGF1核酸分子和蛋白。与FGF受体结合并且也被称为酸性FGF的蛋白。FGF1序列是公众可获得的，例如从序列数据库获得(例如，登录号NP_00791和NP_034327提供了示例性的FGF1蛋白序列，同时登录号NM_000800和NM_010197提供了示例性的FGF1核酸序列)。本领域普通技术人员可鉴定额外的FGF1核酸和蛋白序列，包括FGF1变体。

天然FGF1序列的具体实例提供于SEQ ID NO:1-5中。天然FGF1序列是不包含改变蛋白正常活性(例如SEQ ID NO:2、4或SEQ ID NO:5的活性)的突变的序列。突变的FGF1是具有不同或改变的生物活性(例如降低的促有丝分裂性)的FGF1变体(例如，SEQ ID NO:1-5中任一个的变体，例如具有与SEQ ID NO:1-5中任一个至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但不是天然/野生型序列的变体)。在一个实例中，这类变体包含N-末端截短、至少一个点突变(例如表1中所示的那些中的一个或多个)、或其组合，例如降低FGF1的促有丝分裂性的改变。突变的FGF1蛋白包含FGF1嵌合体(例如，FGF1/FGF19嵌合体)。具体的示例性的FGF1突变蛋白示于SEQ ID NO:6-13、6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238中。

成纤维细胞生长因子19(FGF19)：OMIM 603891。包括FGF19核酸分子和蛋白。FGF19调节胆汁酸合成并对葡萄糖和脂质代谢具有影响。FGF19序列是公众可获得的，例如从序列数据库(例如，登录号NP_005108.1和AAQ88669.1提供了示例性的FGF19蛋白序列，同时登录号AY358302.1和NM_005117.2提供了示例性的FGF19核酸序列)。本领域普通技术人员可鉴定额外的FGF19核酸和蛋白序列，包括FGF19变体。

成纤维细胞生长因子21(FGF21)：OMIM 609436。包括FGF21核酸分子和蛋白。FGF21刺激脂肪细胞中更新的血糖。FGF21序列是公众可获得的,例如从序列数据库(例如，登录号AAQ89444.1、NP_061986和AAH49592.1提供了示例性的FGF21蛋白序列，同时登录号AY359086.1和BC049592提供了示例性的FGF21核酸序列)。本领域普通技术人员可鉴定额外的FGF21核酸和蛋白序列，包括FGF21变体。

成纤维细胞生长因子受体1c(FGFR1c)结合结构域或蛋白：选择性地结合FGFR1c(例如人FGFR1c，例如GeneBank登录号NP_001167536.1或NP_056934.2)，但不与其他蛋白结合的肽序列。FGFR1c是FGF21活性的辅因子。这类结合结构域可包含一个或更多个单体(其中所述单体可以是相同的或不同的序列)，从而产生多聚体(例如二聚体)。在具体的实例中，这类结构域/蛋白不是抗体。示例性的FGFR1c-结合蛋白可记载于SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167以及168、169、170和171的部分、或其多聚体例如SEQ ID NO:190，以及美国专利No.8,372,952、美国公开No.2013/0197191和Smith et al.、PLoS One 8:e61432,2013，所有都以引入的方式纳入本文。因此，提及FGFR1c-结合蛋白多聚体，包含使用与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167和190中的一个或多个具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的两个或更多个肽制备的蛋白。

当解离常数(K_D)为至少约1x10^-7M、至少约1.5x10^-7、至少约2x10^-7、至少约2.5x10^-7、至少约3x10^-7、至少约至少约5x10^-7M、至少约1x10^-8M、至少约5x10^-8、至少约1x10^-9、至少约5x10^-9、至少约1x10^-10或至少约5x10^-10M时，FGFR1c结合蛋白“特异性结合”FGFR1c。在一个实施方案中，通过使用所述FGFR1c-结合蛋白和FGFR1c进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量K_D。在另一个实例中，使用ELISA测定法测量K_D。

成纤维细胞生长因子受体1c(FGFR1c)：也称为FGFR1同种型2。包含FGFR1c核酸和蛋白。FGFR1c和β-Klotho可与FGF21缔合以形成信号传导复合物。FGFR1c序列是公众可获得的，例如从序列数据库(例如，登录号NP_001167536.1和NP_056934.2提供了示例性的FGFR1c蛋白序列)。本领域普通技术人员可鉴定额外的FGFR1c核酸和蛋白序列，包括FGFR1c变体。

成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)：OMIM 134935。包含FGFR4核酸和蛋白。FGFR4可与一些FGF蛋白结合，包括FGF1。FGFR4序列是公众可获得的，例如从序列数据库(例如，登录号NM_002011和AAB25788.1提供了示例性的FGFR4蛋白序列，同时登录号NM_002002和L03840.1提供了示例性的FGFR4核酸序列)。本领域普通技术人员可鉴定额外的FGFR4核酸和蛋白序列，包括FGFR4变体。

宿主细胞：在其中载体可被繁殖并且其DNA可被表达的细胞。所述细胞可以是原核的或真核的。所述术语也包括所述受试宿主细胞的任意子代。应理解，所有的子代都不可能与亲本细胞相同，因为可能存在在复制过程中发生的突变。但是，当使用术语“宿主细胞”时，包括这类子代。因此，宿主细胞可以是转基因的，即它们包含已经被引入到该细胞中的核酸分子，例如编码本文公开的突变的FGF1蛋白的核酸分子。

分离的：“分离的”生物组分(例如突变的FGF1蛋白或核酸分子)已经基本上从所述组分天然存在于其中的生物体细胞中的其他生物组分(例如其他染色体的和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白)中分离、产生或纯化。已经被“分离的”核酸分子和蛋白因此包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括核酸分子和通过在宿主细胞中重组表达而制备的蛋白，以及化学合成的核酸。纯化的或分离的细胞、蛋白或核酸分子可以是至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的纯度。

接头(linker)：部分或一组部分，其连接(join)或连结(connect)两个或更多个离散分离的肽或蛋白(例如单体结构域)，例如以产生嵌合蛋白。在一个实例中，接头是基本上直链的部分。可用于产生本文提供的嵌合蛋白的示例性的接头包括但不限于：肽、核酸分子、肽核酸以及任选置换的具有在碳主链中纳入的一个或多个氧原子的亚烷基部分。接头可以是天然序列、其变体或合成序列的一部分。接头可包括天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或两者的组合。在一个实例中，接头由至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸(例如5至10个、5至20个或5至50个氨基酸)组成。在一个实例中，所述接头是多聚丙氨酸。

哺乳动物：该术语包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类和兽类受试者(例如猫、狗、牛和猪)以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。

代谢疾患/疾病：由正常的哺乳动物代谢过程的破坏引起的疾病或疾患。包括代谢综合症。

实例包括但不限于：(1)葡萄糖利用紊乱及其相关后遗症，包括糖尿病(I型和2型)、妊娠期糖尿病、高血糖症、胰岛素抵抗、异常葡萄糖代谢、"前驱糖尿病”(空腹血糖受损(IFG)或糖耐量降低(IGT))，以及其他与高血糖病症相关或由其引起的生理疾患，包括例如组织病理学变化(例如胰脏β细胞破坏)；(2)血脂障碍及其后遗症，例如，动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、脑血管疾病等；(3)其他病症，其可能与代谢综合症相关，例如肥胖症和体重增加(包括其共病态(co-morbid)病症，例如但不限于非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和多囊卵巢综合症(PCOS))，并且也包括血栓形成、凝固性过高状态和前血栓形成状态(动脉和静脉)、高血压、心血管疾病、中风和心力衰竭；(4)涉及炎性反应的疾患或病症，包括动脉粥样硬化、慢性炎性肠道疾病(例如，克罗恩疾病和溃疡性结肠炎)、哮喘、红斑狼疮、关节炎或其他炎性风湿病；(5)细胞循环或细胞分化过程中的疾患，例如脂肪细胞肿瘤、脂肪癌(lipomatous carcinomas)，包括例如脂肪肉瘤、实体瘤和肿瘤(neoplasm)；(6)中枢和周围神经系统的神经退行性疾病和/或脱髓鞘疾病，和/或包括神经炎性过程的神经系统疾病，和/或其他外周神经病，包括阿尔茨海默氏病、多发性硬化、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病和Guillian-Barre综合征；(7)皮肤病和皮肤学病症和/或伤口愈合过程中的疾患，包括红斑鳞状皮肤病；和(8)其他疾患例如X综合征、骨关节炎和急性呼吸窘迫综合症。其他实例记载于WO 2014/085365(以引用的方式纳入本文)中。

在具体的实例中，所述代谢疾病包括如下的中一种或多种(例如至少2种或至少3种)：糖尿病(例如2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隐匿性自身免疫糖尿病(LAD)或青少年发病的成人型糖尿病(MODY))、多囊卵巢综合症(PCOS)、代谢综合征(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、血脂障碍(例如，高脂血症)以及心血管疾病(例如，高血压)。

N-末端部分：包含开始于或接近于蛋白的N-末端残基的一段连续氨基酸的蛋白序列区域。蛋白的N-末端部分可由一段连续的氨基酸(例如，多个氨基酸残基)来限定。

可操作地连接：当将第一核酸序列与第二核酸序列置于功能性关系中时，所述第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列(例如，突变的FGF1编码序列)的转录或表达，那么所述启动子与所述编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在同一阅读框中连接两个蛋白编码区。

可药用的载体:可用于本发明的可药用的载体是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)记载了本文公开的适用于所公开的FGF1蛋白和FGFR1c-结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)的药物递送的组合物和制剂。

通常，载体的性质将取决于所采用的给药的具体方式。例如，肠胃外制剂通常包括含有可药用的和生理上可接受的液体(例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖、甘油等)作为载体的可注射液体。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载体可包括，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体以外，待给药的药物组合物可包含少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂或者乳化剂、防腐剂以及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇单月桂酸酯。

启动子：指导核酸转录的一系列核酸调控序列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况中的TATA元件。启动子也任选地包括远端的增强子元件或抑制子元件，其位置可距离转录起始位点多达数千个碱基对。

重组体：重组的核酸分子是具有不是天然存在的序列(例如，突变的FGF1蛋白或嵌合蛋白)或具有通过人工组合两个原本分离的序列片段而制得的序列的核酸分子。该人工组合可通过常规方法(例如化学合成)或通过人工操作分离的核酸片段(例如通过遗传工程技术)来完成。类似地，重组蛋白是通过重组核酸分子编码的蛋白。类似地，重组细胞或转基因细胞是包含重组核酸分子并表达重组蛋白的细胞。

氨基酸序列的序列同一性：氨基酸(或核苷酸)序列间的相似性是以序列间的相似性表示，也被称为序列同一性。序列同一性通常是根据百分比同一性(或相似性或同源性)来量度；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法时，多肽的同源物或变体将会具有相对较高的序列同一性程度。

比对用于比较的序列的方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881,1988；和Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988。Altschul et al.,Nature Genet.6:119,1994提出了对序列比对方法和同源性计算的详细见解。

NCBI的基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)可以从几个来源获得，所述来源包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。如何使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上的NCBI网站中获得。

本文公开的突变的FGF1蛋白和编码序列的同源物和变体的特征通常在于具有至少约80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，所述序列同一性是使用NCBI Blast 2.0(gapped blastp设置为默认参数)在与所述氨基酸序列的全长比对上计算的。对于多于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，利用被设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵(空位存在罚分为11，每个残基的空位罚分为1)使用Blast 2序列函数。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应利用被设置为默认参数的PAM30矩阵(开放空位9、延伸空位1罚分)使用Blast 2序列函数进行比对。当通过该方法评估时，与参照序列具有更高相似性的蛋白会显示出增加的百分比同一性，例如至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当比较非完整的序列的序列同一性时，同源物和变体一般会在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80％的序列同一性，并且根据它们与参照序列的相似性，可具有至少85％或至少90％或至少95％的序列同一性。用于在这类短窗口中确定序列同一性的方法可在互联网上的NCBI网站中获得。本本领域技术人员会理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能在所提供的范围外获得极其显著的同源物。

因此，本文公开的FGF1蛋白可与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但不是SEQ ID NO:5(其在一些实例中具有表1和2中所示的突变或截短中的一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。此外，示例性的突变的FGF1蛋白与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238，以及在图23-26中示意性地示出的这类序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187或188的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)，并且保留降低体内血糖水平的能力。

类似地，在一些实例中，示例性的突变的FGF1编码序列与SEQ ID NO:18具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。

类似地，在一些实例中，可用于本文公开的突变FGF1嵌合体的示例性β-Klotho结合结构域序列与SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146或SEQ ID NO: 168、169、170或171的β-Klotho结合部分具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

类似地，在一些实例中，可用于本文公开的突变FGF1嵌合体的示例性FGFR1c结合序列与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或SEQ ID NO:168、169、170、171的FGFR1c-结合部分、或多聚体例如SEQ ID NO:190具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

受试者：任何哺乳动物，例如待成为特定治疗的受体的人类、非人灵长类动物、猪、绵羊、牛、狗、猫、啮齿类动物等，所述治疗例如使用本文提供的突变FGF1蛋白或嵌合体(或相应的核酸分子)的治疗。在两个非限制性的实例中，受试者是人类受试者或小鼠受试者。在一些实例中，所述受试者患有一种或多种代谢疾病，例如糖尿病(例如2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隐匿性自身免疫糖尿病(LAD)或青少年发病的成人型糖尿病(MODY))、多囊卵巢综合症(PCOS)、代谢综合征(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、血脂障碍(例如，高脂血症)以及心血管疾病(例如，高血压)或其组合。在一些实例中，所述受试者具有升高的血糖。

转导的和转化的：当病毒或载体将核酸转移到细胞中时，其“转导”细胞。当DNA通过细胞——通过将核酸整合到细胞基因组中或通过游离型复制——得到稳定复制时，则所述细胞被转导到细胞中的核酸“转化”或“转染”。

转染的很多方法都是本领域技术人员已知的，例如，化学方法(例如，磷酸钙转染)、物理方法(例如，电穿孔、显微注射、粒子轰击)、融合(例如，脂质体)、受体介导的胞吞作用(例如，DNA-蛋白复合物、病毒包膜/衣壳-DNA复合物)以及通过病毒(例如重组病毒)的生物学感染{Wolff,J.A.,ed,Gene Therapeutics,Birkhauser,Boston,USA(1994)}。在逆转录病毒感染的情况中，所感染的逆转录病毒颗粒被靶细胞吸收，导致所述逆转录病毒RNA基因组的逆转录以及所得的前病毒向细胞DNA中的整合。

转基因：由载体提供的外源基因。在一个实例中，转基因包括突变的FGF1编码序列(其可以是嵌合体的一部分)。

载体：引入到宿主细胞中，从而产生经转化的宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许其在所述宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包括一个或多个突变的FGF1编码序列(其可以是嵌合体的一部分)和/或可选择的标记基因和本领域中已知的其他遗传元件。载体可转导、转化或感染细胞，从而导致该细胞表达除了细胞中的天然核酸和/或蛋白以外的核酸和/或蛋白。载体任选地包括帮助实现核酸进入细胞的物质，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白包衣等。

概述

本文提供了可包含N-末端缺失、一个或多个点突变(例如氨基酸置换、缺失、添加或其组合)、或N-末端缺失和点突变的组合的突变的FGF1蛋白。这类突变的FGF1蛋白可以是嵌合蛋白的一部分，例如图21或19的C-末端部分(例如，分别为SEQ ID NO:86或100)、β-Klotho结合蛋白(例如，SEQ ID NO:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186和187)、或FGFR1c结合蛋白(例如，参见SEQ ID NO:188和189)、或β-Klotho结合蛋白和FGFR1c结合蛋白(例如，与SEQ ID NO:168、169、170或171中的任一个直接或间接地连接)。因此，当在本文提及突变的FGF1蛋白时，所述提及也包括提及突变的FGF1/FGF21、突变的FGF1/FGF19嵌合体、突变的FGF1/β-Klotho结合嵌合体、突变的FGF1/FGF1Rc结合嵌合体，或突变的FGF1/β-Klotho结合/FGF1Rc结合嵌合体。

还提供了使用FGF1突变蛋白或FGF1Rc-结合蛋白多聚体(或它们的编码序列)降低葡萄糖(例如，以治疗代谢疾病)的方法。在一些实例中，所述方法包括将治疗有效量的突变的成熟FGF21蛋白或FGF1Rc-结合蛋白多聚体、或编码所述突变的成熟FGF21蛋白或FGF1Rc-结合蛋白多聚体的核酸或者包含所述核酸分子的载体给予哺乳动物，从而降低血糖、治疗所述一种或多种代谢疾病、或其组合。可用所公开的方法治疗的示例性的代谢疾病包括但不限于：2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、多囊卵巢综合症(PCOS)、代谢综合征(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、血脂障碍(例如，高脂血症)以及心血管疾病(例如，高血压)、隐匿性自身免疫糖尿病(LAD)或青少年发病的成人型糖尿病(MODY)。

在一些实例中，FGF1中的突变降低成熟的野生型FGF1(例如，SEQ ID NO:5)的促有丝分裂性，例如降低至少20％、至少50％、至少75％或至少90％。例如，与没有修饰的FGF1蛋白(例如，天然的或野生型的FGF1蛋白)相比，突变的FGF1可被突变以降低对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。测量促有丝分裂性的方法是本领域中已知的。在一些实例中，使用实施例2中提供的方法。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是所述成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的截短形式，其可包含例如至少5个、至少6个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少20个连续的N-末端氨基酸(例如，成熟FGF1的N-末端的5至10、5至13、13、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸)的缺失。在一些实例中，与野生型的成熟FGF1蛋白相比，这类N-末端缺失的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。

在一些实例中，所缺失的N-末端氨基酸中的一个或多个被来自FGF21(例如，参见SEQ ID NO:20)的相应的氨基酸(例如，来自FGF21的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸，例如，来自FGF21的1-5、1-4、2-4、4-6、4-9、3-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个相应的氨基酸)替换。在N-末端缺失具有4个来自FGF21的相应N-末端氨基酸的FGF1突变蛋白的实例示于SEQ ID NO:21和222中。在N-末端缺失具有16个来自FGF21的N-末端氨基酸的FGF1突变蛋白的实例示于SEQ ID NO:221中。本领域技术人员会理解，可使用除了FGF21之外的其他FGF的氨基酸，包括对FGFR4具有低亲和力的那些，包括FGF3、FGF5、FGF7、FGF9和FGF10。FGF1的N-末端残基包含FGFR4结合位点，并且FGFR4信号传导与促有丝分裂活性相关。相比之下，FGF21对FGFR4具有低亲和力。因此，用来自FGF21的那些对FGF1 的FGFR4结合残基的替换可用于降低所得的FGF1突变蛋白的促有丝分裂性。

在一些实例中，FGF1中的突变增加了成熟或截短的FGF1(例如SEQ ID NO:5)的热稳定性，例如与天然FGF1相比，增加至少20％、至少50％、至少75％或至少90％。可用于增加所述突变的FGF1的热稳定性的示例性突变包括但不限于如下中的一种或更多种：K12V、C117V、C117P、C117T、C117S、C117A和P134V(称为M1突变)，L44F、C83T、C83S、C83A C83V、C117V、C117P、C117T、C117S、C117A和F132W(称为M2突变)，以及L44F、M67I、L73V、V109L、L111I、C117V、C117P、C117T、C117S、C117A、A103G、R119G、R119V、Δ104-106和Δ120-122(称为M3缺失)，其中编号参考SEQ ID NO:5(例如，参见Xia et al.,PLoS One.7:e48210,2012)。例如，与没有修饰的FGF1蛋白(例如，SEQ ID NO:5)相比，突变的FGF1可被突变以增加所述蛋白的热稳定性。测量热稳定性的方法是本领域中已知的。在一个实例中，使用Xiaet al.,PLoS One.7:e48210,2012中提供的方法。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的突变形式，例如包含至少1个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个氨基酸置换(例如，1-20、1-10、4-8、5-25、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37个氨基酸置换(例如表1中所示的那些))的成熟蛋白的突变形式。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包括一个或多个氨基酸的缺失，例如1-10、4-8、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸缺失的缺失。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包括氨基酸置换和缺失的组合，例如至少1个置换和至少1个缺失，例如1-10个置换和1-10个缺失。

示例性的突变示于下表1中，氨基酸引用SEQ ID NO:2或5。本领域技术人员会理解可单独或结合使用这些突变(例如，这些氨基酸置换/缺失中的1-20、1-10、4-8、5-25、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个)。此外，这类突变FGF1蛋白是嵌合蛋白的一部分，例如与FGF19、FGF21、选择性结合β-Klotho的蛋白或选择性结合FGFR1c的蛋白。

表1：示例性的FGF1突变

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置处的一个或多个的突变：K9、K10、K12、L14、Y15、C16、H21、R35、Q40、L44、L46、S47、E49、Y55、M67、L73、C83、L86、E87、H93、Y94、N95、H102、A103、E104、K105、N106、F108、V109、L111、K112、K113、C117、K118、R119、G120、P121、R122、F132、L133、P134、L135，例如K9、K10、K12、K112、K113中的一个或多个的突变，例如这些位置中的1-5、2-5、3-6、3-8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或所有42个。在一个实例中，K9和K10被DQ(如在突变的核定位序列中)替换或被来自FGF21(或不结合FGFR4的其他FGF)的等同的残基替换(其中编号参考SEQ ID NO:5)。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置中的1、2、3或4个位置处的突变：Y15、E87、Y94和N95(其中编号参考SEQ ID NO:5)，例如Y15F、Y15A、Y15V、E87V、E87A、E87S、E87T、N95V、N95A、N95S、N95T、Y94V、Y94F和Y94A中的一个或多个(例如这些突变中的1、2、3或4个)。例如，E87或N95可被不荷电的氨基酸替换。此外，Y15和Y94可被破坏疏水相互作用的氨基酸替换。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在Y15、E87、Y94和N95 的两侧上(例如L14、C16、H93和T96中的一个或多个)的突变，例如在这些位置中的1、2、3或4个位置处的突变。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置处的突变：Y15、C16、E87、H93、Y94和N95(其中编号参考SEQ ID NO:5)，例如Y15F、Y15A、Y15V、E87V、E87A、E87S、E87T、H93A、N95V、N95A、N95S、N95T、Y94V、Y94F和Y94A中的一个或多个(例如这些突变中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置中的一个或多个位置处的突变：C16、C83和C117(其中编号参考SEQ ID NO:5)，例如C16V、C16A、C16T、C16S、C83T、C83S、C83A C83V、C117V、C117P、C117T、C117S和C117A中的一个或多个(例如这些突变中的1、2或3个)。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置中的仅一个或两个位置处的突变：E87、Y94和N95(其中编号参考SEQ ID NO:5)，例如E87V、E87A、E87S、E87T、Y94V、Y94F、Y94A、N95V、N95A、N95S和N95T中的一个或多个。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置中的1、2或3个位置处的突变：K12、C83和C117(其中编号参考SEQ ID NO:5)，例如K12V、K12C、C83T、C83S、C83A、C83V、C117V、C117P、C117T、C117S和C117A中的一个或多个(例如这些突变中的1、2或3个，例如K12V、C83T和C117V)。

图31示出了可在FGF1中被突变以改变其活性的位置的具体实例。例如，与FGF1受体相互作用的残基包括Y15、E87、Y94和N95。因此，在一些实例中，这些位置中的1、2、3或4个被突变，例如，在SEQ ID NO:5中第87和/或95位的氨基酸可被改变为V、A、S或T。在一些实例中，在SEQ ID NO:5中第15和/或95位的氨基酸可被改变为V、A或F。在一些实例中，可进行这些改变的组合。

图31也示出了FGF1的K12被预测位于受体的界面。因此，SEQ ID NO:5的K12可被突变，例如突变成V或C。图31也示出了氨基酸K112、K113和K118是所述肝素结合位点的部分，并因此可被突变，例如突变为E、Q、N、V或D，例如位置K118处为N、E或V，位置K112和K113处为D、E或Q。图31也示出了SEQ ID NO:5的氨基酸R35与FGF受体的D2结构域形成盐桥，并因此可被突变，例如突变为E或V。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含如下中的一个或多个：K12V、L46V、R35E、R35V、E87V、N95V、K118N、K118E、C117V和P134V(其中编号参考SEQ ID NO:5)。在一些实例中，所述点突变包含将氨基酸序列ILFLPLPV(SEQ ID NO:2和4的氨基酸145-152)替换为AAALPLPV(SEQ ID NO:14)、ILALPLPV(SEQ ID NO:15)、ILFAPLPV(SEQ ID NO:16)或ILFLPAPA(SEQ ID NO:17)。在一些实例中，这类具有一个或多个点突变的FGF1蛋白与野生型的成熟FGF1蛋白相比具有降低的促有丝分裂活性。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含R35E(其中编号参考SEQ ID NO:5)。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1(例如SEQ ID NO:2或4)的氨基酸5-141的至少120个连续氨基酸(其在一些实例中还可包含N-末端氨基酸1-20的缺失和/或点突变，例如置换、缺失或添加)。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1的氨基酸5-141的至少120个或至少130个连续氨基酸，例如来自SEQ ID NO:2或4的氨基酸5-141的至少120个连续氨基酸，或来自SEQ ID NO:5的至少120个连续氨基酸。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白同时包含N-末端截短和点突变。具体的示例性的FGF1突变蛋白示于SEQ ID NOS:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238中。在一些实例中，所述FGF1突变体包含N-末端缺失，但保留N-末端位置处的甲硫氨酸。在一些实例中，所述FGF1突变体的长度为120-140或125-140个氨基酸。

在一些实例中，所述FGF1突变蛋白是嵌合蛋白的一部分。例如，所述突变的FGF1蛋白的一端可被直接或间接地连接到FGF19或FGF21的末端，例如FGF19或FGF21的C-末端区域。在一些实例中，所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的N-末端，所述FGF19或FGF21部分为该嵌合体的C-末端。但是，这可以颠倒，以使得所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的C-末端，所述FGF19或FGF21部分为该嵌合体的N-末端。例如，FGF19或FGF21的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个或至少60个C-末端氨基酸(例如，C-末端60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、35、30、25、20、15或10个氨基酸)可以是所述嵌合体的一部分。可使用的FGF21和FGF19的C-末端片段的实例分别示于SEQ IDNO:86和100中。在一些实例中，所述突变的FGF1和FGF21或FGF19部分通过使用接头(例如由至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸组成的接头)而被间接地连接。在一些实例中，所述接头为多聚丙氨酸。

在一些实例中，所述FGF1突变蛋白是具有β-Klotho结合蛋白的嵌合蛋白的一部分。例如，所述突变的FGF1突变蛋白的一端可被直接或间接地连接到β-Klotho结合蛋白的末端(例如，参见图23-26)。在一些实例中，所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的N-末端，所述β-Klotho结合蛋白部分为该嵌合体的C-末端(例如，分别参见图23B-23D、23G-23I和25B-25D、25G-25I)。但是，这可以颠倒，以使所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的C-末端，所述β-Klotho结合蛋白部分为该嵌合体的N-末端(例如，分别参见图24B-24D、24F-24H和26B-26D、26F-26H)。可使用的β-Klotho结合蛋白的实例分别示于SEQ IDNO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145和146以及SEQ ID NO:168、169、170和171的β-Klotho结合部分中。在一些实例中，所述突变的FGF1和β-Klotho结合蛋白部分通过使用接头(例如由至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸组成的接头)而被间接地连接。在一些实例中，所述接头为多聚丙氨酸。

在一些实例中，所述FGF1突变蛋白是具有FGFR1c-结合蛋白的嵌合蛋白的一部分。例如，所述突变的FGF1突变蛋白的一端可被直接或间接地连接到FGFR1c-结合蛋白的末端。在一些实例中，所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的N-末端，所述FGFR1c-结合蛋白部分为该嵌合体的C-末端(例如，参见图23J)。但是，这可以颠倒，以使得所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的C-末端，所述FGFR1c-结合蛋白部分为该嵌合体的N-末端(例如，参见图24I)。可使用的FGFR1c-结合蛋白的实例分别示于SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166和167以及168、169、170和171的FGFR1c-结合部分中。在一些实例中，所述突变的FGF1和FGFR1c-结合蛋白部分通过使用接头(例如由至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸组成的接头)而被间接地连接。在一些实例中，所述接头为多聚丙氨酸。

在一些实例中，所述FGF1突变蛋白是具有以任何顺序存在的FGFR1c-结合蛋白和β-Klotho-结合蛋白的嵌合蛋白的一部分。例如，所述突变的FGF1突变蛋白的一端可被直接或间接地连接到FGFR1c-结合/β-Klotho-结合或β-Klotho-结合/FGFR1c-结合的嵌合蛋白的末端。在一些实例中，所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的N-末端，所述FGFR1c-结合/β-Klotho-结合或β-Klotho-结合/FGFR1c-结合的嵌合蛋白部分为该嵌合体的C-末端(例如，参见图23K)。但是，这可以颠倒，以使得所述嵌合体的突变的FGF1部分位于该嵌合体的C-末端，所述FGFR1c-结合/β-Klotho-结合或β-Klotho-结合/FGFR1c-结合的嵌合蛋白部分为该嵌合体的N-末端(例如，参见图24J)。在一个实例中，所述FGFR1c-结合/β-Klotho-结合或β-Klotho-结合/FGFR1c-结合的嵌合蛋白是SEQ ID NO:168、169、170和171中所示的那些中的任一个。在一些实例中，所述突变的FGF1和FGFR1c-结合/β-Klotho结合或β-Klotho-结合/FGFR1c-结合的嵌合蛋白部分是通过使用接头 (例如由至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸组成的接头)而被间接地连接。在一些实例中，所述接头为多聚丙氨酸。

在一些实例中，所述FGF1突变蛋白或包含这些的嵌合体包含与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238的至少80％的序列同一性。因此，所述FGF1突变蛋白可与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(但是不是天然的FGF1序列，例如SEQ ID NO:5)。在一些实例中，所述FGF1突变蛋白包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238，或由其组成。本公开内容涵盖所公开的FGF1突变蛋白的变体，例如具有1-8、2-10、1-5、1-6或5-10个突变(例如保守性氨基酸置换)的SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238。

在一些实例中，突变的FGF1/FGF21嵌合蛋白包含与SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、219、221、222或223的至少80％的序列同一性。因此，所述突变的FGF1/FGF21嵌合蛋白可与SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、219、221、222或223具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实例中，所述突变的FGF1/FGF21嵌合蛋白包含SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、219、221、222或223，或由其组成。本公开内容涵盖所公开的突变的FGF1/FGF21嵌合蛋白的变体，例如具有1-8个突变(例如保守性氨基酸置换)的SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、219、221、222或223。

在一些实例中，突变的FGF1/FGF19嵌合蛋白包含与SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、220或224的至少80％的序列同一性。因此，所述突变的FGF1/FGF19嵌合蛋白可与SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、220或224具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实例中，所述突变的FGF1/FGF19嵌合蛋白包含SEQ ID NOS:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、220或224中任一个，或由其组成。本公开内容涵盖所公开的突变的FGF1/FGF19嵌合蛋白FGF1突变蛋白的变体，例如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(例如保守性氨基酸置换)的SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、220或224。

在一些实例中，突变的FGF1/β-Klotho-结合蛋白嵌合体包含与SEQ ID NO:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186或187至少80％的序列同一性。因此，所述突变的FGF1/β-Klotho嵌合蛋白可与SEQ ID NO:1173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186或187具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实例中，所述突变的FGF1/β-Klotho嵌合蛋白包含SEQ ID NO:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186或187，或由其组成。本公开内容涵盖所公开的突变的FGF1/β-Klotho嵌合蛋白的变体，例如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(例如保守性氨基酸置换)的SEQ ID NO:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186或187。

在一些实例中，突变的FGF1/FGF1Rc-结合蛋白嵌合体包含与SEQ ID NO:188-189中任一个的至少80％的序列同一性。因此，所述突变的FGF1/FGF1Rc嵌合蛋白可与SEQ IDNO:188或189具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实例中，所述突变的FGF1/FGF1Rc嵌合蛋白包含SEQ ID NO:188-189中的任一个，或由其组成。本公开内容涵盖所公开的突变的FGF1/FGF1Rc嵌合蛋白的变体，例如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变(例如保守性氨基酸置换)的SEQ ID NO:188或189。

在一个实例中，所述嵌合体的FGFR1c-结合/β-Klotho-结合或β-Klotho-结合/FGFR1c-结合的蛋白部分包含与SEQ ID NO:168、169、170或171的至少80％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:168、169、170或171的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

在一个实例中，FGFR1c-结合蛋白多聚体包含与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169或170的FGFR1c-结合部分的至少80％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169或170的FGFR1c部分的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一个实例中，FGFR1c-结合蛋白二聚体包含与SEQ ID NO:190的至少80％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:190的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

还提供了编码所公开的突变FGF1蛋白和嵌合体的分离的核酸分子，例如编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、 201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性(但不是天然的FGF1序列)的蛋白的核酸分子。一个示例性的编码序列示于SEQ ID NO:18中；因此，本公开内容提供了与SEQ ID NO:18中任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。还提供了包含这类核酸分子的载体和细胞。例如，这类核酸分子可在宿主细胞(例如，细菌细胞或酵母细胞，例如大肠杆菌(E.coli))中表达，从而允许突变的FGF1蛋白的表达。所得的突变FGF1蛋白可从所述细胞中纯化。

提供了使用所公开的突变的FGF1蛋白和嵌合体(或编码它们的核酸分子)以及所述FGFR1c-结合蛋白多聚体的方法。如在本文所讨论的，所述突变的成熟FGF1蛋白可包含至少6个连续的N-末端氨基酸的缺失、至少一个点突变，或其组合。例如，这类方法包括给药治疗有效量(例如至少0.01、至少0.1mg/kg或至少0.5mg/kg)的所公开的突变FGF1蛋白或包含所述突变FGF1突变蛋白的嵌合蛋白、或FGFR1c-结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)，以降低哺乳动物中的血糖，例如降低至少5％、至少10％、至少25％或至少50％，例如与无突变的FGF1突变蛋白或FGFR1c-结合蛋白多聚体的给药(例如PBS的给药)相比。

在一个实例中，所述方法是降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、降低甘油三酯、减少胰岛素抵抗、降低高胰岛素血症、增强葡萄糖耐受性、降低高血糖、降低食物摄入或其组合的方法。这类方法可包括给药治疗有效量(例如至少0.5mg/kg)的所公开的突变的FGF1蛋白或包含所述突变的FGF1突变蛋白的嵌合蛋白、或FGFR1c-结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)以降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、降低食物摄入或其组合。

在一个实例中，所述方法是治疗哺乳动物中的代谢疾病(例如代谢综合症、糖尿病或肥胖症)的方法。这类方法可包括给药治疗有效量(例如至少0.5mg/kg)的所公开的突变的FGF1蛋白或包含所述突变的FGF1突变蛋白的嵌合蛋白、或FGFR1c-结合蛋白多聚体(或编码它们的核酸分子)以治疗所述代谢疾病。

在一些实例中，所述哺乳动物(例如人类、猫或狗)患有糖尿病。给药的方法是常规的，并且可包括皮下、腹膜内、肌内或静脉内注射。

在一些实例中，使用本文公开的FGF1突变体或包括突变的FGF1突变蛋白的嵌合蛋白或FGFR1c-结合蛋白多聚体不会导致(或显著减低，例如降低至少20％、至少50％、至少75％或至少90％)使用噻唑烷二酮(TZD)治疗胰岛素增敏剂所观察到的不利副作用(包括体重增加、增加的肝脂肪变性和骨折)(例如，对骨矿物质密度、小梁骨构造和骨皮质厚度的影响降低)。

提供了在哺乳动物中降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、降低食物摄入或其组合的方法。这类方法可包括将治疗有效量的本文公开的FGF1突变体和/或FGFR1c-结合蛋白多聚体(包括还包含β-Klotho-结合肽和/或FGFR1c-结合肽的那些)、或编码所述FGF1突变体或多聚体的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给予所述哺乳动物，从而在哺乳动物中降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善肝性脂肪变性、降低一种或多种非-HDL脂质水平、降低食物摄入或其组合。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c-结合蛋白多聚体的给药的情况相比，所述饱腹和空腹血糖在经治疗的受试者中降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c-结合蛋白多聚体的给药的情况相比，胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性在经治疗的受试者中增加至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c-结合蛋白多聚体的给药的情况相比，全身性慢性炎症在经治疗的受试者中降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c结合蛋白多聚体的给药的情况相比，肝性脂肪变性在经治疗的受试者中降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c结合蛋白多聚体的给药的情况相比，一种或多种脂质(例如非-HDL，例如IDL、LDL和/或VLDL)在经治疗的受试者中降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c结合蛋白多聚体的给药的情况相比，使用FGF1突变体和/或FGFR1c结合蛋白多聚体使甘油三酯和/或胆固醇水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些实例中，与缺少FGF1突变体和/或FGFR1c结合蛋白多聚体的给药的情况相比，食物摄入量在经治疗的受试者中降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％(例如在治疗的12个小时内、在24个小时内或在48个小时内，例如在12至24个小时内、在12至36个小时内或在24至48个小时内)。在一些实例中，实现了这些降低的组合。

突变的FGF1蛋白

本公开内容提供了可包含N-末端缺失、一个或多个点突变(例如氨基酸置换、缺失、添加或其组合)、或N-末端缺失和点突变的组合的突变的FGF1蛋白。这类蛋白和相应的编码序列可用于本文公开的方法中。在一些实例中，与成熟的天然FGF1蛋白(例如，SEQ IDNO:5)相比，所公开的FGF1突变蛋白具有降低的促有丝分裂性，例如，降低至少20％、至少50％、至少75％或至少90％。例如，与没有修饰的FGF1蛋白相比，突变的FGF1可被突变以降低对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。测量促有丝分裂性的方法是本领域中已知的。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的截短形式，其可包含例如至少5、至少6、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少20个连续的N-末端氨基酸的缺失。因此，在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的截短形式，例如缺失SEQ ID NO:5中所示的N-末端5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。N-末端截短的FGF1蛋白的实例示于SEQ IDNO: 6、7、8、9、21、24、25、26、27、32、33、34、35、36、37、38、39、44、45、46、47、48、49、50、51、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、71、72、74、75、76、77、79、80、81、82、194、195、197、198、202、203、205、206、214、215、216、217、221、222、225、228、232和238中。在一些实例中，所述FGF1突变体包含N-末端缺失，但保留N-末端位置处的甲硫氨酸。在一些实例中，与野生型的成熟FGF1蛋白相比，这类N-末端缺失的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。

在一些实例中，所缺失的N-末端氨基酸中的一个或多个被来自FGF21(例如，参见SEQ ID NO:20)的相应氨基酸(例如，来自FGF21的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸，例如来自FGF21的1-5、1-4、2-4、4-6、4-9、3-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个相应的氨基酸)替换。在N-末端缺失具有4个来自FGF21的相应N-末端氨基酸的FGF1突变蛋白的实例示于SEQ ID NO:21中。所述FGF1的N-末端残基包含FGFR4结合位点，并且FGFR4信号传导与促有丝分裂活性相关。相比之下，FGF21对FGFR4具有低亲和力。因此，用来自FGF21(或对FGFR4具有低亲和力的另一个FGF，包括FGF3、FGF5、FGF7、FGF9和FGF10)的那些替换FGF1的FGFR4结合残基可用于降低所得的FGF1突变蛋白的促有丝分裂性。

因此，在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1(例如SEQ ID NO:2或4)的氨基酸5-141或5-155的至少120个连续氨基酸(其在一些实例中还可包含N-末端氨基酸1-20的缺失和/或点突变，例如置换、缺失或添加)。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1(例如SEQ ID NO:5)的氨基酸1-140的至少120个连续氨基酸(其在一些实例中还可包含N-末端氨基酸1-20的缺失和/或点突变，例如置换、缺失或添加)。因此，在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1的氨基酸5-141的至少120个连续氨基酸，例如来自SEQ ID NO:2或4的氨基酸5-141的至少120个、至少121个、至少122个、至少123个、至少124个、至少125个、至少126个、至少127个、至少128个、至少129个、至少130个、至少131个、至少132个、至少133个、至少134个、至少135个、至少136个、至少137个、至少138个、至少139个或至少140个连续氨基酸(例如来自SEQ ID NO:2或4的氨基酸5-141的120-130、120-135、130-135、130-140或120-140个连续氨基酸)。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自FGF1的氨基酸5-141的至少120个或至少130个连续氨基酸，例如来自SEQ ID NO:2或4的氨基酸5-141的至少120个连续氨基酸或来自SEQ ID NO:5的至少120个连续氨基酸。因此，在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含来自SEQ ID NO:5的至少120个、至少121个、至少122个、至少123个、至少124个、至少125个、至少126个、至少127个、至少128个、至少129个、至少130个、至少131个、至少132个、至少133个、至少134个、至少135个、至少136个、至少137个、至少138个、至少139个或至少140个连续氨基酸(例如，来自SEQ ID NO:5的120-130、120-135或120-140个连续的氨基酸)。可用于产生突变的FGF1蛋白的来自FGF1的氨基酸5-141的至少120个连续氨基酸的实例包括但不限于SEQ ID NO:5的氨基酸4-140以及SEQ IDNO:6、7、8和9中任一个所示的蛋白序序列。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白是成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:5)的突变形式或成熟蛋白(例如，SEQ ID NO:7、8、9)的N-末端截短，例如含有至少1个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸置换(例如1-20、1-10、4-8、5-12、5-10、5-25、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸置换)的成熟蛋白的突变形式。例如，点突变可被引入到FGF1序列中以降低促有丝分裂性、增加稳定性、降低对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力(相比于没有修饰的天然FGF1蛋白的部分)，或其组合。可被使用的具体的示例性的点突变示于上表1中，并且示例性的组合提供于图1、3A-3D、4A-4B、5A-5B、6A-6B、20和27-30中。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含在以下位置中的一个或多个位置处2的突变(例如置换或缺失)：K9、K10、K12、L14、Y15、C16、H21、R35、Q40、L44、L46、S47、E49、Y55、M67、L73、C83、L86、E87、H93、Y94、N95、H102、A103、E104、K105、N106、F108、 V109、L111、K112、K113、C117、K118、R119、G120、P121、R122、F132、L133、P134、L135，例如K9、K10、K12、K112、K113中的一个或多个的突变，例如这些位置中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或所有42个。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白具有如下中的一个或多个：K9T、K10T、K12V、L14A、Y15F、Y15A、Y15V、C16V、C16A、C16T、C16S、H21Y、R35E、R35V、Q40P、L44F、L46V、S47I、E49Q、E49A、Y55F、Y55S、Y55A、M67I、L73V、C83T、C83S、C83A C83V、E87V、E87A、E87S、E87T、H93G、H93A、Y94V、Y94F、Y94A、N95V、N95A、N95S、N95T、H102Y、A103G、Δ104-106、F108Y、V109L、L111I、K112D、K112E、K112Q、K113Q、K113E、K113D、C117V、C117P、C117T、C117S、C117A、K118N、K118E、K118V、R119G、R119V、R119E、Δ120-122、F132W、L133A、L133S、P134V、L135A、L135S(其中编号参考SEQ ID NO:5)，例如这些突变中的1-5、1-10、2-5、2-10、2-20、5-10、5-40或5-20个，例如这些突变中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含如下中的一个或多个(例如2、3、4、5或6个)：K12V、R35E、R35V、L46V、E87V、N95V、C117V/A、K118N、K118E/V和P134V(其中编号参考SEQ ID NO:5)。在一些实例中，所述点突变包含将氨基酸序列ILFLPLPV(SEQ ID NO:2和4的氨基酸145-152)替换为AAALPLPV(SEQ ID NO:14)、ILALPLPV(SEQ ID NO:15)、ILFAPLPV(SEQ ID NO:16)或ILFLPAPA(SEQ ID NO:17)。在一些实例中，与野生型的成熟FGF1蛋白相比，这类具有一个或多个点突变的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含R35E(其中编号参考SEQ ID NO:5)。包含点突变的FGF1突变蛋白的实例包括但不限于如下中所示的蛋白序列：SEQ ID NO:10、11、12、13、22、23、28、29、30、31、40、41、42、43、42、53、54、55、56、67、68、69、70、73、78、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、191、 192、193、196、199、200、201、204、207、208、209、210、211、212、213、218、226、227、229、230、231、232、233、234、235、236和237。

在一些实例中，FGF1中的突变增加了成熟的或截短的天然FGF1的热稳定性。例如，可在以下位置中的一个或多个处进行突变。可用于增加突变的FGF1的热稳定性的示例性突变包括但不限于如下中的一个或多个：K12、C117、P134、L44、C83、F132、M67、L73、V109、L111、A103、R119、Δ104-106和Δ120-122、Q40、H93、S47，其中编号参考SEQ ID NO:5(例如，参见Xia et al.,PLoS One.7(11):e48210,2012)。在一些实例中，FGF1的热稳定性是通过使用以下突变中的一种或多种而增加：Q40P和S47I或Q40P、S47I和H93G(或这些突变中的任意其他组合)。

在一些实例中，所述FGF1突变蛋白是嵌合蛋白的一部分。例如，本文提供的任何突变的FGF1蛋白可被直接或间接地连接至β-Klotho-结合蛋白、FGFR1c结合蛋白、β-Klotho-结合蛋白和FGFR1c结合蛋白、FGF19或FGF21(例如FGF19或FGF21的C-末端区域)的末端。例如，FGF19或FGF21的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49、至少50个或至少60个C-末端氨基酸(例如C-末端60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、35、30、25、20、15或10个氨基酸)可以是所述嵌合体的一部分。可使用的FGF21和FGF19的C-末端片段的实例分别示于SEQ ID NO:86和100中。可使用的β-Klotho-结合蛋白的实例示于SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145和146中。可使用的FGFR1c-结合蛋白的实例示于SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166和167中。可被直接或间接地连接至突变的FGF1蛋白的β-Klotho-结合/FGFR1c-结合蛋白嵌合体的实例示于SEQ ID NO:168、169、170和171中。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白同时包含N-末端截短和点突变。具体的示例性的FGF1突变蛋白示于SEQ ID NO:6-13、21-84、113-120、191-218和225-238中。在一些实例中，所述FGF1突变蛋白包含与SEQ ID NO:6-13、21-84、113-120、191-218和225-238中任一个的至少80％的序列同一性。因此，所述FGF1突变蛋白可与SEQ ID NO:6-13、21-84、113-120、191-218和225-238中任一个具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实例中，所述FGF1突变蛋白包含SEQ ID NO:6-13、21-84、113-120、191-218和225-238中任一个，或由其组成。本公开内容涵盖所公开的FGF1突变蛋白的变体，例如具有1-20、1-15、1-10、1-8、2-10、1-5、1-6、2-12、3-12、5-12或5-10个突变(例如保守性氨基酸置换)的SEQ ID NO:6-13、21-84、113-120、191-218和225-238中的任一个。这类突变的FGF1蛋白可被用于产生FGF1突变嵌合体。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白在其N-末端具有甲硫氨酸。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白的长度为至少120个氨基酸，例如长度为至少125个、至少130个、至少135个、至少140个、至少145个、至少150个、至少155个、至少160个或至少175个氨基酸，例如长度为120-160、125-160、130-160、150-160、130-200、130-180、130-170或120-160个氨基酸。

可用于产生FGF1突变蛋白的示例性的N-末端截短的FGF1序列和FGF1点突变示于表1和2中(以及在SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、 236、237和238的任一个中提供的那些)。本领域技术人员会理解可将表2中的任意N-末端截短(以及SEQ IDNO:6、7、8、9、21、24、25、26、27、32、33、34、35、36、37、38、39、44、45、46、47、48、49、50、51、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、71、72、74、75、76、77、79、80、81、82、194、195、197、198、202、203、205、206、214、215、216、217、221、222、225、228、232和238的任一个中提供的那些)与表1或表2中的任意FGF1点突变结合，以产生FGF1突变蛋白，并且会理解这类FGF1突变蛋白可被直接使用或被用作突变的FGF1/β-Klotho-结合蛋白嵌合体、突变的FGF1/FGFR1c-结合蛋白嵌合体、突变的FGF1/β-Klotho-结合蛋白/FGFR1c-结合蛋白嵌合体、突变的FGF1/FGF21或突变的FGF1/FGF19嵌合体的一部分。此外，可对表格中所示的序列进行突变，例如本文所讨论的突变中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换，例如保守性氨基酸置换、缺失或添加)。

表2：可用于产生FGF1突变蛋白的示例性的突变

示例性的突变FGF1蛋白提供于SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238中，突变的FGF1/FGF21嵌合体提供于SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、219、221、222和223中，突变的FGF1/FGF19嵌合体提供于SEQ ID NO:101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、220和224中，突变的FGF1/β-Klotho-结合蛋白嵌合体提供于SEQ ID NO:173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186和187中，以及突变的FGF1/FGFR1c-结合蛋白嵌合体提供于SEQ ID NO:188和189中。本领域技术人员会理解可对这些序列进行微小的改变，而不会不利地影响蛋白的功能(例如其降低血糖的能力)。例如，所述突变的FGF1蛋白的变体包括与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(但不是天然的FGF1序列，例如SEQ ID NO:5)的那些，但保留治疗代谢疾病或降低哺乳动物(例如患有II型糖尿病的哺乳动物)中的血糖的能力。因此，保留至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238的变体可用于所公开的方法中。

FGF1

FGF1的成熟形式(例如SEQ ID NO:2或4)可被突变以控制(例如，降低)蛋白的促有丝分裂性(例如通过突变核定位序列(NLS)或硫酸类肝素结合区域或两者)并给蛋白提供降低葡萄糖的能力。也可将影响蛋白的稳定性和受体结合选择性的突变引入到野生型的成熟FGF1序列中。

示例性的全长FGF1蛋白示于SEQ ID NO:2(人类)和4(小鼠)中。在一些实例中，FGF1包括SEQ ID NO:2或4，但没有N-末端的甲硫氨酸(因此得到一个154个氨基酸的FGF1蛋白)。此外，所述FGF1的成熟/活性形式是其中N-末端的一部分(例如，来自SEQ ID NO:2或4的N-末端15、16、20或21个氨基酸)被移除的形式。因此，在一些实例中，所述FGF1的活性形式包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸16-155或22-155(例如，参见SEQ ID NO:5)，或由其组成。在一些实例中，可被突变的FGF1的成熟形式包含SEQ ID NO:5，其在N-末端添加有一个甲硫氨酸(其中这类序列可如本文所述进行突变)。因此，所述突变的成熟FGF1蛋白可包含N-末端截短。

突变可被引入到野生型的FGF1(例如SEQ ID NO:2、4或5)中。在一些实例中，对所述FGF1蛋白进行本文公开的多种类型的突变。尽管以下的突变是由例如在SEQ ID NO:2、4或5中的特定氨基酸注明，本领域技术人员会理解，相应的氨基酸可在任意FGF1序列中被突变。例如，SEQ ID NO:5的Q40对应于SEQ ID NO:2和4的Q55。

在一个实例中，对FGF1(例如SEQ ID NO:2、4或5)的N-末端区域进行突变，例如，缺失SEQ ID NO:2或4的前14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸(例如缺失SEQ ID NO:2或4的至少前14个氨基酸，例如缺失SEQ ID NO:2或4的至少前15个、至少前16个、至少前20个、至少前25个或至少前29个氨基酸)、缺失SEQ ID NO:5的前8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸(例如，参见SEQ ID NO:7、8和9以及图1)。

可对FGF1(例如SEQ ID NO:2、4或5)进行突变以降低其促有丝分裂活性。在一些实例中，与没有突变的天然FGF1蛋白相比，这类突变将促有丝分裂活性降低至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％，或者甚至完全消除可检测的促有丝分裂活性。测量促有丝分裂活性的方法是本领域中已知的，例如在用经突变的FGF1刺激的经血清饥饿的细胞(例如NIH 3T3细胞)中向DNA中的胸苷掺入、四甲基偶氮唑盐(methylthiazoletetrazolium,MTT)测定法(例如通过用突变的FGF1刺激经血清饥饿的细胞24小时，然后测量活细胞)、细胞数目定量或BrdU掺入。在一些实例中，将由Fu et al.,World J.Gastroenterol.10:3590-6,2004；Klingenberg et al.,J.Biol.Chem.274:18081-6,1999；Shen et al.,Protein Expr Purif.81:119-25,2011或Zou et al.,Chin.Med.J.121:424-429,2008提供的测定法用于测量促有丝分裂活性。这类突变的实例包括但不限于K12V、R35E、L46V、E87V、N95V、K12V/N95V(例如，参见SEQ ID NO:10，其在其N-末端也可包含甲硫氨酸)，和Lys12Val/Pro134Val、Lys12Val/Leu46Val/Glu87Val/Asn95Val/Pro134Val(例如，参见SEQ ID NO:11，其在N-末端也可包含甲硫氨酸)(其中编号参考SEQ ID NO:5中所示的序列)。在一些实例中，连续的N-末端残基的一部分(例如SEQ ID NO:5的氨基酸1-9)被移除以产生FGF1的非促有丝分裂的形式。实例示于SEQID NO:9中。

降低类肝素结合亲和力(例如，与没有突变的天然FGF1蛋白相比，例如降低至少10％、至少20％、至少50％或至少75％)的突变也可被用于降低促有丝分裂活性，例如通过将来自旁分泌FGF的类肝素结合残基替换到FGF1中。在一些实例中，通过缺失FGF1的N-末端区域(例如结合FGF4的区域)并用来自FGF21的相应残基替换一些或所有所缺失的氨基酸来降低或消除促有丝分裂性。

也可将突变引入到FGF1的一个或两个核定位位点(NLS1，SEQ ID NO:2的氨基酸24-27和NLS2，SEQ ID NO:4的氨基酸115-128)，例如以降低促有丝分裂性，如与没有突变的天然FGF1蛋白相比。可对FGF1进行的NLS突变的实例包括但不限于：缺失或突变NLS1的所有或一部分(例如缺失或突变赖氨酸)、缺失或突变NLS2中的赖氨酸(例如¹¹⁵KK……¹²⁷KK....)、或其组合(其中编号参考SEQ ID NO:2中所示的序列)。例如，24K、25K、27K、115K、127K或128K中的一个或多个(其中编号参考SEQ ID NO:2中所示的序列)可被突变(例如改变为丙氨酸或缺失)。可对NLS2(KKN…KR)结构域中的类肝素结合位点进行的这类突变的具体实例示于SEQ ID NO:12和13中(分别为K118N或K118E，其中编号参考SEQ ID NO:5)。

可将突变引入到FGF1的磷酸化位点，例如以产生组成型的活性或无活性突变体以影响核信号传导。

在一些实例中，可将突变引入到FGF1核输出序列中，例如以降低细胞核中的FGF1的量并减低其促有丝分裂性——如通过在培养的细胞中的胸苷掺入测定法所测量的(例如，参见Nilsen et al.,J.Biol.Chem.282(36):26245-56,2007)。对所述核输出序列的突变降低了FGF1诱导的增殖(例如，参见Nilsen et al.,J.Biol.Chem.282(36):26245-56,2007)。测量FGF1降解的方法是本领域中已知的，例如在存在或不存在蛋白酶体抑制剂的情况下，测量[³⁵S]甲硫氨酸标记的FGF1或对FGF1的稳态水平进行免疫印迹。在一个实例中，将由Nilsen et al.,J.Biol.Chem.282(36):26245-56,2007或Zakrzewska et al.,J.Biol.Chem.284:25388-403,2009提供的测定法用于测量FGF1降解。

所述FGF1核输出序列包含SEQ ID NO:2和4的氨基酸145-152或SEQ ID NO:5的氨基酸130-137。可进行的FGF1核输出序列突变的实例包括但不限于将序列ILFLPLPV(SEQ IDNO:2和4的氨基酸145-152)改变为AAALPLPV(SEQ ID NO:14)、ILALPLPV(SEQ ID NO:15)、ILFAPLPV(SEQ ID NO:16)或ILFLPAPA(SEQ ID NO:17)。

在一个实例中，可引入突变以提高FGF1的稳定性。在一些实例中，序列NYKKPKL(SEQ ID NO:2的氨基酸22-28)不被改变，并且在一些实例中确保了FGF1的结构完整性并增强了与FGF1受体的相互作用。测量FGF1稳定性的方法是本领域中已知的，例如在1.5M尿素的存在下、在不存在或存在5-倍摩尔过量的肝素的情况下，通过荧光或圆二色性测量FGF1或突变体的变性或通过盐酸胍进行的等温平衡变性。在一个实例中，将由Dubey et al.,J.Mol.Biol.371:256-268,2007提供的测定法用于测量FGF1稳定性。可用于增加蛋白稳定性的突变的实例包括但不限于Q40P、S47I和H93G中的一个或多个(其中编号参考SEQ IDNO:5中所示的序列)。

在一个实例中，引入突变以提高FGF1的热稳定性，例如提高至少10％、至少20％、至少50％或至少75％，如与没有突变的天然FGF1 蛋白相比的(例如，参见Xia et al.,PLoSOne.2012；7(11):e48210和Zakrzewska,J Biol Chem.284:25388-25403,2009)。在一个实例中，引入突变以增加FGF1的蛋白酶抗性(例如，参见Kobielak et al.,Protein PeptLett.21(5):434-43,2014)。可对FGF1进行的其他突变包括Lin et al.,J Biol Chem.271(10):5305-8,1996中提供的那些突变。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白或嵌合体是在一个或多个位置(例如N95)处被聚乙二醇化的(例如，参见Niu et al.,J.Chromatog.1327:66-72,2014中的方法，其以引用的方式纳入本文)。聚乙二醇化由将聚乙二醇基团共价连接至表面残基和/或N-末端氨基组成。已知N95参与受体结合，因此位于经折叠的蛋白的表面。因为对表面暴露的残基的突变会潜在地产生免疫原性序列，聚乙二醇化是一种阻断特定的相互作用的替代方法。聚乙二醇化是参与受体结合和/或蛋白质降解的任何表面暴露的位点的一个选择。聚乙二醇化可“覆盖”功能性氨基酸(例如N95)以及增加血清稳定性。

在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白或嵌合体包含免疫球蛋白FC结构域(例如，参见Czajkowsky et al.,EMBO Mol.Med.4:1015-28,2012，其以引用的方式纳入本文)。抗体的保守性FC片段可被纳入所述突变的FGF1蛋白或嵌合体的N-末端或C-末端，可提高蛋白的稳定性并因此提高血清半衰期。FC结构域也可被用作在蛋白A或蛋白G琼脂糖珠上纯化蛋白的手段。这使得具有肝素结合突变的FGF1突变体更容易被纯化。

变体序列

包含表1和2中示出的序列的变体以及SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238的变体的变体FGF1蛋白，可包含一个或多个突变，例如单个插入、单个缺失、单个置换。在一些实例中，所述突变的FGF1蛋白包含1-20个插入、1-20个缺失、1-20个置换，或其任意组合(例如，单个插入连同1-19个置换)。在一些实例中，本公开内容提供了具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变的任何所公开的突变FGF1蛋白的变体。在一些实例中，SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238包含1-8个插入、1-15个缺失、1-10个置换、或其任意组合(例如，1-15、1-4或1-5个氨基酸缺失连同1-10、1-5或1-7个氨基酸置换)。在一些实例中，本公开内容提供了SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、 175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238中任一个具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸改变的变体。在一个实例中，这类变体肽通过使用标准方法例如定点诱变或PCR操作编码肽的核苷酸序列而产生。这类变体也可化学合成。可对SEQ ID NO:190的FGFR1c二聚体进行类似的改变(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变)。

修饰或突变的一种类型包含将氨基酸置换为具有类似生化特性的氨基酸残基，即，保守性置换(例如，1-4、1-8、1-10或1-20个保守性置换)。通常，保守性置换对所得的肽的活性几乎没有影响或没有影响。例如，保守性置换是基本不影响肽降低哺乳动物中的血糖的能力的SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238中的氨基酸置换。丙氨酸扫描可用于鉴定突变FGF1蛋白中的哪些氨基酸残基可耐受氨基酸置换，例如SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238。在一个实例中，当用丙氨酸或其他保守性氨基酸来置换1-4、1-8、1-10或1-20个天然氨基酸时，FGF1或SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238中任一个的降血糖活性被改变不超过25％、例如不超过20％、例如不超过10％。可置换蛋白中的原始氨基酸并且被认为是保守性置换的氨基酸的实例包括：Ser置换Ala；Lys置换Arg；Gln或His置换Asn；Glu置换Asp；Ser置换Cys；Asn置换Gln；Asp置换Glu；Pro置换Gly；Asn或Gln置换His；Leu或Val置换Ile；Ile或Val置换Leu；Arg或Gln置换Lys；Leu或Ile置换Met；Met、Leu或Tyr置换Phe；Thr置换Ser；Ser置换Thr；Tyr置换Trp；Trp或Phe置换Tyr；以及Ile或Leu置换Val。

可通过使用保守性较低的置换进行更实质性的改变，例如，选择其作用存在较显著差异的残基，所述残基的作用是针对维持：(a)置换区域中的多肽主链的结构，例如，折叠片(sheet)或螺旋构象；(b)靶位点处多肽的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。通常被预期产生多肽功能的最大改变的置换是如下的那些，其中：(a)亲水性残基(例如丝氨酸或苏氨酸)置换(或被置换为)疏水性残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或者被置换为)任何其他残基；(c)具有带正电的侧链的残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)置换(或者被置换为)带负电的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸；或(d)具有大的侧链的残基(例如苯丙氨酸)置换(或者被置换为)不具有侧链的残基(例如甘氨酸)。可通过分析所述突变的FGF1蛋白的功能、通过分析所述变体蛋白降低哺乳动物中的血糖的能力评估这些氨基酸置换(或其他缺失或添加)的作用，所述蛋白例如SEQ IDNO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238中任一个。

蛋白的产生

可通过常规手段(例如制备型色谱和免疫学分离)来进行经重组表达的突变FGF1蛋白的分离和纯化。一旦表达，可根据本领域的标准方法(包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法等)来纯化突变的FGF1蛋白(通常参见，R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。本文公开了均质性(homogeneity)为至少约90至95％的基本上纯的组合物，并且98至99％或更高均质性可用于药物目的。

除了重组方法之外，本文公开的突变的FGF1蛋白的也可使用标准肽合成方法全部或部分地构建。在一个实例中，通过缩合更短片段的氨基和羧基末端来合成突变的FGF1蛋白。通过活化羧基末端(例如通过使用偶联剂N,N’-二环己基碳二亚胺)来形成肽键的方法是本领域中公知的。

突变的FGF1和FGFR1c-结合蛋白多聚体的核酸分子和载体

本公开内容涵盖编码突变的FGF1蛋白的核酸分子。基于遗传密码，可以常规地生成编码任何突变的FGF1序列(例如使用表1和2中所示的序列生成的那些)的核酸序列。类似地，可基于本文提供的氨基酸序列使用常规方法生成突变的FGF1/β-Klotho-结合、突变的FGF1/FGFR1c-结合、突变的FGF1/β-Klotho-结合/FGFR1c-结合、突变的FGF1/FGF21或突变的FGF1/FGF19嵌合体。在一些实例中，这类序列被优化用于在宿主细胞(例如，用于表达所述突变的FGF1蛋白的宿主细胞)中表达。也提供了编码FGFR1c-结合蛋白多聚体的核酸分子(例如，编码SEQ ID NO:147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167或190中任一个的多聚体的那些)，以及包含所述核酸的细胞和载体。

在一个实例中，编码突变的FGF1蛋白(或包含所述蛋白的嵌合体)的核酸序列可容易地由本领域技术人员使用本文提供的氨基酸序列和遗传密码产生，所述FGF1蛋白(或包含所述蛋白的嵌合体)与SEQ ID NO:6,7,8,9,10,11,12,13,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,173,174,175,177,178,179,181,182,183,185,186,187,188,189,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237或238具有至少60％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或至少99％的序列同一性。此外，本领域技术人员可容易地构建多种包含功能上等价的核酸(例如序列不同但编码相同的突变的FGF1蛋白序列的核酸)的克隆。在一个实例中，突变的FGF1核酸序列与SEQ ID NO:18具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。

在一个实例中，核酸序列编码使用与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或至少99％的序列同一性的肽序列制备的FGFR1c-结合蛋白多聚体。

核酸分子包括编码突变的FGF1肽的DNA、cDNA和RNA序列。编码序列中的沉默突变由遗传密码的简并性(即，冗余性)导致，由此一种以上的密码子可编码相同的氨基酸残基。因此，例如，亮氨酸可由CTT、CTC、CTA、CTG、TTA或TTG编码；丝氨酸可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC编码；天冬酰胺可由AAT或AAC编码；天冬氨酸可由GAT或GAC编码；半胱氨酸可由TGT或TGC编码；丙氨酸可由GCT、GCC、GCA或GCG编码；谷氨酰胺可由CAA或CAG编码；色氨酸可由TAT或TAC编码；以及异亮氨酸可由ATT、ATC或ATA编码。示出了标准遗传密码的表格可见于多种来源(参见，例如Stryer,1988,Biochemistry,第三版,W.H.5Freeman and Co.,NY)。

特定物种的密码子偏好和密码子用法表可用于改造利用了该特定物种的密码子使用偏好的编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的分离的核酸分子(所述分离的核酸分子为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸分子；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸分子)。例如，本文公开的FGFR1c-结合蛋白多聚体和突变的FGF1蛋白可被设计以具有被特定目的生物体优选使用的密码子。

编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸可通过体外方法克隆或扩增(所述核酸为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸)，所述方法例如多聚酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、可自我维持的序列复制系统(3SR)以及Qβ复制酶扩增系统(QB)。本领域技术人员公知多种克隆方法和体外扩增方法。此外，编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸编码序列可通过克隆技术制备(所述核酸编码序列为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸编码序列；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸编码序列)。合适的克隆和测序技术以及足以指导本领域技术人员进行克隆的说明可见于Sambrook et al.(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring,Harbor,N.Y.,1989,和Ausubel et al.,(1987)in"Current Protocols in Molecular Biology,"John Wiley and Sons,New York,N.Y。

编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸序列可通过任意合适的方法制备(所述核酸序列为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸序列；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸序列)，所述方法包括，例如适当序列的克隆或通过如下的方法进行直接化学合成：例如，Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90-99,1979中的磷酸三酯法；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979中的磷酸二酯法；Beaucage et al.,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981中的二乙基亚磷酰胺法；由Beaucage&Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981记载的固相亚磷酰胺三酯法，该方法例如使用记载于例如Needham-VanDevanter et al.,Nucl.AcidsRes.12:6159-6168,1984中的自动合成仪；以及美国专利No.4,458,066中的固相支持法。化学合成产生单链寡核苷酸。该单链寡核苷酸可通过与互补序列杂交或者通过使用该单链作模板以DNA聚合酶进行聚合而被转化成双链DNA。本领域技术人员会理解尽管DNA的化学合成通常限于约100个碱基的序列，更长的序列可通过较短序列的连接而获得。

在一个实例中，突变的FGF1蛋白是通过将编码所述突变的FGF1蛋白的cDNA插入到载体中而制备(所述突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列制备的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。可进行所述插入以使得所述突变的FGF1蛋白在框中被阅读从而产生该突变的FGF1蛋白。类似的方法可用于FGFR1c-结合蛋白多聚体。

所述突变的FGF1蛋白的核酸编码序列可被插入到表达载体中(所述突变的FGF1蛋白的核酸编码序列为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸编码序列；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸编码序列)，所述表达载体包括但不限于，可被操作以使得能够插入或整合序列并且可在原核生物或真核生物中表达的质粒、病毒或其他载体。宿主可包括微生物、酵母、昆虫、植物和哺乳类生物。在原核生物中表达具有真核序列或病毒序列的DNA序列的方法是本领域中公知的。能够在宿主中表达和复制的具有生物学功能的病毒和质粒DNA是本领域中已知的。所述载体可编码可选择的标记物，例如胸苷激酶基因。类似的方法可用于FGFR1c-结合蛋白多聚体。

编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸序列可被可操作地连接到表达调控序列上(所述核酸序列为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸序列；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸序列)。与FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白编码序列可操作地连接的表达调控序列被连接，以使得在与所述表达调控序列相容的条件下实现所述FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的表达。所述表达调控序列包括但不限于适当的启动子、增强子、转录终止子、位于FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译，以及终止密码子。

在一个实施方案中，载体被用于在酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(P.pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))中表达。已知若干个启动子可用于酵母表达系统中，例如组成型启动子质膜H⁺-ATPase(PMA1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、磷酸甘油酯激酶-1(PGK1)、醇脱氢酶-1(ADH1)和抗多效药物泵(PDR5)。此外，可使用很多诱导型启动子，例如GAL1–10(通过半乳糖诱导)、PHO5(通过低的胞外无机磷酸盐诱导)以及串联热激HSE元件(通过温度升高到37℃诱导)。指导响应于可滴定的诱导剂的可变表达的启动子包括甲硫氨酸应答MET3和MET25启动子以及铜依赖性CUP1启动子。这些启动子中的任意一个可被克隆到多拷贝(2μ)或单拷贝(CEN)质粒中以给出对表达水平的额外控制水平。所述质粒可包括用于在酵母中进行选择的营养标志物(例如URA3、ADE3、HIS1等)以及用于在细菌中增殖的抗生素抗性(AMP)。用于在乳酸克鲁维酵母(K.lactis)中表达的质粒是已知的，例如pKLAC1。因此，在一个实例中，在细菌中扩增后，质粒可通过类似于细菌转化的方法被引入到相应的酵母营养缺陷型中。编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸分子也可被设计以在昆虫细胞中表达(所述核酸分子为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的核酸分子；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些核酸分子)。

FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白可在多种酵母菌株中表达(所述突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。例如，7种抗多效药物转运子(transporter)——YOR1、SNQ2、PDR5、YCF1、PDR10、PDR11和PDR15，连同它们的激活转录因子(activating transcriptionfactor)——PDR1和PDR3,已经在酵母宿主细胞中被同时缺失，赋予了所得菌株对药物的敏感性。也可使用具有改变的质膜脂质组成的酵母菌株，例如在麦角固醇生物合成上有缺陷的erg6突变体。对蛋白水解高度敏感的蛋白可在缺少主要的液泡内肽酶Pep4——其控制其他液泡水解酶的激活——的酵母细胞中表达。如果相应的无效(null)突变体不能存活，则可利用在携带基因的温度敏感性(ts)等位基因的菌株中的异源表达。

也可制备编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的病毒载体(所述病毒载体为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的病毒载体；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些病毒载体)。示例性的病毒载体包括多瘤病毒，SV40，腺病毒，痘苗病毒，腺相关病毒，包括HSV和EBV的疱疹病毒，辛德毕斯病毒，禽类、小鼠和人类来源的α病毒和逆转录病毒。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus)；AcMNPV)载体也是本领域已知的，并且可从商业来源获得。其他合适的载体包括逆转录病毒载体、正痘载体(orthopox vector)、鸟痘载体(avipox vector)、禽痘载体(fowlpox vector)、羊痘载体(capripox vector)、猪痘载体(suipox vector)、腺病毒载体、疱疹病毒载体、α病毒载体、杆状病毒载体、辛德毕斯病毒载体、痘苗病毒载体和脊髓灰质炎病毒载体。具体的示例性的载体是痘病毒载体例如痘苗病毒、禽痘病毒和高度减毒的都，痘苗病毒(MVA)、腺病毒、杆状病毒等。有用的痘病毒包括正痘病毒(orthopox virus)、猪痘病毒、鸟痘病毒和羊痘病毒。正痘病毒包括痘苗病毒、缺肢畸形(ectromelia)病毒和浣熊痘(raccoon pox)病毒。有用的正痘病毒的一个实例是痘苗病毒。鸟痘病毒包括禽痘病毒、金丝雀痘病毒(canary pox)和鸽痘病毒(pigeon pox)。羊痘病毒包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒。在一个实例中，所述猪痘病毒为猪痘病毒(swinepox)。可被使用的其他病毒载体包括其他DNA病毒例如疱疹病毒和腺病毒，以及RNA病毒例如逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。

编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变FGF1蛋白的病毒载体可包括至少一种与编码所述FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变FGF1蛋白的核酸序列可操作地连接的表达调控元件(所述病毒载体为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的病毒载体；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些病毒载体)。所述表达调控元件被插入在载体中以调控和调节所述核酸序列的表达。在这些载体中使用的表达调控元件的实例包括但不限于，lac系统、噬菌体λ的操纵子和启动子区域、酵母启动子，和源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其他操作元件包括但不限于，前导序列、终止密码子、多聚腺苷酸化信号以及在宿主系统中编码所述突变FGF1蛋白的核酸序列的适当转录及随后翻译所必须的任何其他序列。所述表达载体可包含在宿主系统中包含所述核酸序列的表达载体的转移及随后复制所必须的额外元件。这类元件的实例包括但不限于，复制起点和可选择的标记物。本领域技术人员还会理解这类载体可使用常规方法容易地构建(Ausubel et al.,(1987)in"Current Protocols in Molecular Biology,"John Wileyand Sons,New York,N.Y.)并且是市售可得的。

用于制备重组DNA病毒的基本技术是已知的，所述重组DNA病毒包含编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变FGF1蛋白的异源DNA序列(所述异源DNA序列为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的异源DNA序列；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些异源DNA序列)。这类技术包括，例如，供体质粒中所述DNA序列侧翼的病毒DNA序列与存在于亲本病毒中的同源序列之间的同源重组。可例如通过本领域中已知的步骤构建载体，例如通过使用天然存在于或人工插入在亲本病毒载体中以插入异源DNA的独特限制性内切酶位点。

当所述宿主为真核生物时，可使用DNA转染方法例如磷酸钙共沉淀、传统的机械方法例如显微注射、电穿孔、插入包裹在脂质体中的质粒，或病毒载体。也可用编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的多聚核苷酸序列与编码可选择的表型(例如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因)的第二外源DNA分子共转化真核细胞(所述多聚核苷酸序列为，例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的多聚核苷酸序列；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、 109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些多聚核苷酸序列)。另一种方法是使用真核病毒载体(例如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒)瞬时转染或转化真核细胞并表达所述蛋白(参见例如，Eukaryotic Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman ed.,1982)。本领域技术人员会很容易地使用表达系统，例如可用于在细胞(包括高等真核细胞，例如COS、CHO、Hela和骨髓瘤细胞系)中产生突变的FGF1蛋白的质粒和载体。

表达突变的FGF1蛋白或FGFR1c-结合蛋白多聚体的细胞

编码本文公开的突变的FGF1蛋白(或包含突变的FGF1蛋白的嵌合蛋白)或本文公开的FGFR1c-结合蛋白多聚体的核酸分子可用于转化细胞并制备经转化的细胞。因此，公开了这样的细胞，即所述细胞表达FGFR1c-结合蛋白多聚体(例如，使用与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％、至少99％或100％的序列同一性的肽制备的FGFR1c-结合蛋白多聚体)或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。表达本文公开的突变的FGF1蛋白的细胞或表达FGFR1c-结合蛋白多聚体的细胞可以是真核的或原核的。这类细胞的实例包括但不限于，细菌、古细菌、植物、真菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞，例如乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、梭菌属(Clostridium)、酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或毕赤酵母(P.pastoris))、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌属(Neurospora)以及无限增殖化哺乳动物髓样和淋巴样细胞系。

表达突变的FGF1蛋白或FGFR1c-结合蛋白多聚体的细胞是转化的或重组的细胞。这类细胞可包括至少一种编码突变的FGF1蛋白的外源核酸分子(例如，编码使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白的外源核酸分子；或者编码与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、 188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白的那些外源核酸分子)。这类细胞可包括至少一种编码FGFR1c-结合蛋白多聚体的外源核酸分子，例如编码使用两个或多个肽制备的蛋白的外源核酸分子，所述肽与SEQID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。应理解，所有的子代都不可能与亲本细胞相同，因为可能存在复制过程中发生的突变。稳定转染——意指所述外源DNA被持续地维持在所述宿主细胞中——的方法是本领域中已知的。

可通过公知的常规技术进行使用重组DNA对宿主细胞的转化。当所述宿主是原核的(例如大肠杆菌)时候，能够摄入DNA的感受态细胞可使用本领域中公知的方法从细胞(指数生长期后收集并随后通过CaCl₂方法处理)中制备。或者，可使用MgCl₂或RbCl。根据需要也可在形成宿主细胞的原生质体后或通过电穿孔进行转化。用于培养中的哺乳动物细胞的增殖的技术是公知的(参见，Jakoby and Pastan(eds),1979,Cell Culture.Methods inEnzymology,volume 58,Academic Press,Inc.,Harcourt Brace Jovanovich,N.Y.)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、CHO细胞以及WI38、BHK和COS细胞系，但是可使用这样的细胞系，例如被设计以提供高度表达所需的糖基化模式或其他特征的细胞。用于酵母细胞转化的技术(例如聚乙二醇转化、原生质体转化和基因枪)也是本领域中已知的。

包含突变的FGF1分子和/或FGFR1c-结合蛋白多聚体的药物组合物

包含突变的FGF1蛋白或编码这些蛋白的核酸的药物组合物，可与适当的可药用的载体一起配制，这取决于所选择的具体给药方式(所述突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO: 21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。类似地，本公开内容提供了包含一种或多种FGFR1c-结合蛋白多聚体(例如SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167的多聚体，例如SEQ ID NO:190(或与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的序列))的药物组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物基本上由FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1中所示的序列，SEQ ID NO:21-84中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NOS:6-13、21-84、87-98、101-112、173-175、177-179、181-183、185-189和191-238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)(或编码这类蛋白的核酸)和可药用的载体组成。在一些实施方案中，额外的治疗有效试剂不包括在所述组合物中。

在其他实施方案中，所述药物组合物包含FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)(或编码这类蛋白的核酸)和可药用的载体。可包括额外的治疗剂(例如用于治疗糖尿病的试剂)。因此，所述药物组合物可包含治疗有效量的另一种试剂。这类试剂的实例包括但不限于，抗细胞凋亡的物质，例如Nemo-结合结构域，和诱导增殖的化合物，例如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)-6、CDK-4和细胞周期蛋白D1。可使用其他活性试剂，例如抗糖尿病试剂，例如二甲双胍(metformin)、磺酰脲类(例如，格列本脲(glibenclamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、格列美脲(glimepiride))、那格列奈(nateglinide)、瑞格列奈(repaglinide)、噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮(rosiglitazone)和吡格列酮(pioglitazone))、过氧化物酶体增殖剂-激活受体(PPAR)-γ激动剂(例如，C1262570、阿格列扎(aleglitazar)、法格立他扎(farglitazar)、莫格列佐(muraglitazar)、特格列佐(tesaglitazar)和TZD)和PPAR-γ拮抗剂、PPAR-γ/α调节剂(例如KRP 297)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose))、二肽基肽酶(DPP)-IV抑制剂(例如，LAF237、MK-431)、α2-拮抗剂、用于降低血糖的试剂、胆固醇吸收抑制剂、3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂(例如他汀类)、胰岛素和胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类似物(例如唾液素-4(exendin-4))或淀粉不溶素(amylin)。额外的实例包括免疫调节因子例如抗CD3mAb、生长因子例如HGF、VEGF、PDGF、催乳激素和PTHrP。在一些实例中，所述包含突变的FGF1蛋白的药物组合物还可包含治疗有效量的其他FGF，例如FGF21、FGF19或两者，肝素，或其组合。

可用于本公开内容的可药用的载体和赋形剂是常规的。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,The University of the Sciences inPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,第21版(2005)。例如，肠胃外制剂通常包含可注射液体例如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、水性葡萄糖、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载体可包括，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体以外，待给药的药物组合物可包含少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂或者乳化剂、防腐剂以及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇单月桂酸酯。可包括的赋形剂为例如，其他蛋白，例如人血清白蛋白或血浆制品。

在一些实施方案中，FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、 235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)被包括在控释制剂(例如，微胶囊制剂)中。可使用多种类型的生物可降解的和生物相容性的聚合物、方法，并且封装多种合成的化合物、蛋白和核酸的方法已在本领域中充分描述(参见，例如美国专利申请No.2007/0148074；2007/0092575；和2006/0246139；美国专利No.4,522,811；5,753,234；和7,081,489；PCT公开No.WO/2006/052285；Benita,Microencapsulation:Methods and Industrial Applications,第二版,CRC Press,2006)。

在其他实施方案中，FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。纳米分散系统和用于产生这类纳米分散体的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，美国专利No.6,780,324；美国专利公开No.2009/0175953。例如，纳米分散系统包括具有生物活性的试剂和分散试剂(例如聚合物、共聚物或低分子量表面活性剂)。示例性的聚合物或共聚物包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(D,L-乳酸)(PLA)、聚(D,L-乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚(乙二醇)。示例性的低分子量表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、氯化十六烷基吡啶、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯及其组合。在一个实例中，所述纳米分散系统包括PVP和ODP或其变体(例如80/20w/w)。在一些实例中，所述纳米分散体是使用溶剂蒸发方法制备，参见，例如Kanaze et al.,Drug Dev.Indus.Pharm.36:292-301,2010；Kanaze et al.,J.Appl.Polymer Sci.102:460-471,2006。关于核酸的给药，一种给药核酸的方法为用质粒DNA直接治疗，例如用哺乳动物表达质粒。如上所述，编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)的核苷酸序列可被置于启动子的调控下以增加蛋白表白。

很多类型的释放递送系统是可用的和已知的。实例包括基于聚合物的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊记载于例如例如美国专利No.5,075,109中。递送系统也包括非聚合物系统，例如脂质包括甾醇例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸，或中性脂肪例如单-、双-和三-甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用传统粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合的植入物等。具体的实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码该蛋白的多聚核苷酸以在基质中的形式被包含于其中，例如记载于美国专利No.4,452,775；4,667,014；4,748,034；5,239,660和6,218,371中的那些；和(b)扩散系统，其中活性组分以受控的速率从聚合物渗透，例如在美国专利No.3,832,253和3,854,480中所记载的。此外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中的一些被改造为适于植入。

长期缓释植入物的使用可能特别适于慢性病症(例如糖尿病)的治疗。本文使用的长期释放意指构建和排列所述植入物以递送治疗水平的活性组分至少30天，优选60天。长期缓释植入物是本领域技术人员公知的并包括上述释放系统中的一些。这些系统已经被记载用于与核酸一起使用(参见美国专利No.6,218,371)。对于体内使用，核酸和肽优选地对降解(例如通过核酸内切酶和核酸外切酶的降解)具有相对的抗性。因此，可使用对所公开的突变的FGF1蛋白的修饰，例如包含C-末端酰胺。

药物组合物的剂型可通过所选的给药方式确定。例如，除了可注射的液体之外，还可使用局部制剂、吸入制剂、口服制剂和栓剂。局部制剂可包括眼药水、软膏、喷雾剂、贴剂等。吸入制剂可以是液体(例如溶液或悬液)并包括烟雾剂(mist)、喷雾剂等。口服制剂可以是液体(例如，糖浆剂、溶液或悬液)或是固体(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊)。栓剂也可以是固体、凝胶或是悬液的形式。对于固体组合物，常规的非毒性固体载体可包括药物级的甘露醇、乳糖、纤维素、淀粉或硬脂酸镁。制备这些剂型的实际方法是公已知的，或对本领域技术人员会是显而易见的。

包含FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)的药物组合物可以被配制为单一剂型，适于精确剂量的单次给药。在一个非限制性的实例中，单一剂量包含约1mg至约1g FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)，例如约10mg至约100mg、约50mg至约500mg、约100mg至约900mg、约250mg至约750mg，或约400mg至约600mg。在其他实例中，治疗有效量的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)为约0.01mg/kg至约50mg/kg，例如约0.5mg/kg至约25mg/kg，或约1mg/kg至约10mg/kg。在其他实例中，治疗有效量的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)为约1mg/kg至约5mg/kg，例如约2mg/kg。在一个具体的实例中，治疗有效量的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)包括约1mg/kg至约10mg/kg，例如约2mg/kg。

使用突变的FGF1或FGFR1c-结合蛋白多聚体的治疗

所公开的FGFR1c-结合蛋白多聚体(例如，使用两个或更多个肽制备的蛋白，所述肽与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)和突变的FGF1蛋白和嵌合体(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码所述蛋白的核酸可被给药至受试者，例如以治疗代谢疾病，例如通过降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、降低食物摄入，或其组合。

本公开内容的组合物包含FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)(或编码这些分子的核酸)，所述组合物可通过任意方式(包括口服、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、真皮内、鞘内、皮下、经由吸入或经由栓剂)给药至人类或其他动物。在一个非限制性的实例中，所述组合物经注射给予。在一些实例中，可使用组合物的位点特异性给药，例如通过将FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)(或编码这些分子的核酸)给药至胰腺组织(例如通过使用泵或通过在胰腺位点处植入缓慢释放形式)。考虑到病例的具体情况(例如，受试者、疾病、所涉及的疾病状态、具体的治疗以及所述治疗是否是预防性的)，主治医师会选择具体的给药方式和剂量方案。治疗可包括在几天到几月或甚至几年的时期内每日、每日多次、或少于每日(例如每周或每月等)剂量。例如，治疗有效量的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)可以在一个疗程中以单一剂量、每日两次剂量、每周剂量或若干次剂量(例如每日剂量)给药。在一个具体的非限制性实例中，治疗包括每日一次剂量或每日两次剂量。

所给予的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ IDNO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)的量可取决于被治疗的受试者、痛苦的严重程度、给药的方式，并且最好交给处方医师来判断。在这些范围内，待给药的制剂会包含一定量的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白，其量可以在被治疗的受试者中有效实现所需效果。治疗有效量的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)可以是治疗糖尿病或降低血糖水平(例如，相对于不给药所述突变的FGF1或FGFR1c结合蛋白多聚体，降低至少5％、至少 10％或至少20％)所必须的所述突变的FGF1或FGFR1c-结合蛋白多聚体或编码这些分子的核酸的量。

当病毒载体被用于给药编码FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸时(所述突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)，接受者可接受的所述组合物中每种重组病毒的剂量范围为约10⁵至约10¹⁰个噬斑形成单位/mg哺乳动物，但是也可给药更低或更高的剂量。用于将组合物给药至哺乳动物的方法的实例包括但不限于，将细胞离体暴露给所述病毒，或将所述组合物注射到患病组织中，或静脉内、皮下、真皮内或肌内给药所述病毒。或者，所述重组的病毒载体或重组载体的组合可在可药用的载体中通过直接注射到胰腺中而局部给药。

通常，携带待给药的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)的核酸序列的重组病毒载体的量是基于病毒颗粒的滴度。待给药的示例性的范围是10⁵至10¹⁰个病毒颗粒/哺乳动物(例如人)。

在一些实例中，将FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码所述FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸，与一种或多种其他试剂(例如可用于治疗糖尿病或胰岛素抵抗的那些)组合(例如依次、同时(simultaneously)或同时(contemporaneously))给药。

抗糖尿病试剂通常被分成6类：双胍类(例如二甲双胍)；噻唑烷二酮类(包括罗格列酮格列美脲)、利格列酮(rivoglitazone)、曲格列酮(troglitazone))；磺酰脲类；碳水化合物吸收抑制剂；脂肪酸氧化酶抑制剂和抗脂解药物(anti-lipolytic drug)；和减肥药。这些试剂中的任一个也均可用于本文公开的方法中。所述抗糖尿病试剂包括在Diabetes Care,22(4):623-634中公开的那些试剂。可用的一类抗糖尿病试剂是磺酰脲类，其被认为增加胰岛素的分泌、降低肝葡萄糖生成以及增加胰岛素受体敏感性。另一类抗糖尿病试剂使用双胍抗高血糖药物，其降低肝葡萄糖生成和小肠吸收，并增加外周葡萄糖摄入和利用，而不诱导高胰岛素血症。

在一些实例中，FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)可与有效剂量的抗糖尿病试剂(例如双胍类、噻唑烷二酮类或肠降血糖素)和/或降脂化合物(例如他汀类或贝特类(fibrate))组合给药。术语“组合给药”或“共给药”是指同时或依次给药活性试剂。FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ IDNO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与 SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码所述FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸的给药也可与生活方式的改善(例如增加身体活动、低脂饮食、低糖饮食以及戒烟)组合。

可与所公开的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白组合使用的额外试剂包括但不限于，抗细胞凋亡的物质，例如Nemo-结合结构域，和诱导增殖的化合物，例如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)-6、CDK-4和细胞周期蛋白D1。可使用其他活性剂，例如抗糖尿病试剂，例如二甲双胍、磺酰脲类(例如，格列本脲、甲苯磺丁脲、格列美脲)、那格列奈、瑞格列奈、噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮和吡格列酮)、过氧化物酶体增殖剂-激活受体(PPAR)-γ激动剂(例如C1262570)和拮抗剂、PPAR-γ/α调节剂(例如KRP 297)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖、伏格列波糖)、二肽基肽酶(DPP)-IV抑制剂(例如，LAF237、MK-431)、α2-拮抗剂、用于降低血糖的试剂、胆固醇吸收抑制剂、3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂(例如他汀类)、胰岛素和胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类似物(例如唾液素-4)或淀粉不溶素。在一些实施方案中，所述试剂是免疫调节因子例如抗CD3mAb、生长因子例如HGF、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生化生长因子(PDGF)、催乳激素或甲状旁腺激素相关蛋白 (PTHrP)。在一个实例中，所述突变的FGF1蛋白与如下组合给药：治疗有效量的另一种FGF(例如FGF21、FGF19或两者)，肝素，或其组合。

在一些实施方案中，提供了在受试者中治疗糖尿病或前驱糖尿病的方法，所述方法是通过将治疗有效量的包含FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码所述FGFR1c结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白的核酸的组合物给药至所述受试者而进行。所述受试者可患有I型糖尿病或II型糖尿病。所述受试者可以是任何哺乳动物受试者，包括人类受试者和兽医受试者，例如猫和狗。所述受试者可以是儿童或成人。所述受试者也可被给予胰岛素。所述方法可包括测量血糖水平。

在一些实例中，所述方法包括选择患有糖尿病(例如I型或II型糖尿病)的受试者、或处于患糖尿病的风险中的受试者(例如患有前驱糖尿病的受试者)。这些受试者可被选择用于使用如下进行的治疗：所公开的FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者具有与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、 13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码它们的核酸分子。

在一些实例中，可通过以下方式临床诊断患有糖尿病的受试者：空腹血糖(FPG)浓度大于或等于7.0mmol/L(126mg/dL)、或在使用75g负荷的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)约2小时后的血糖浓度大于或等于11.1mmol/L(200mg/dL)、或在具有高血糖症典型症状或高血糖危象的患者中，随机血糖浓度大于或等于11.1mmol/L(200mg/dL)、或HbA1c水平大于或等于6.5％。在其他实例中，可通过受损的葡萄糖耐受性(IGT)诊断患有前驱糖尿病的受试者。大于或等于140mg/dL并小于200mg/dL(7.8-11.0mM)的OGTT两小时血糖浓度、或大于或等于100mg/dL并小于125mg/dL(5.6–6.9mmol/L)的空腹血糖(FPG)浓度、或大于或等于5.7％并小于6.4％(5.7–6.4％)的HbA1c水平被认为是IGT，并表明受试者患有前驱糖尿病。额外的信息可见于Standards of Medical Care in Diabetes—2010(美国糖尿病协会,DiabetesCare 33:S11-61,2010)。

在一些实例中，用所公开的组合物和方法治疗的受试者的HbA1C大于6.5％或大于7％。

在一些实例中，治疗糖尿病包括如下中的一种或多种：增加葡萄糖耐受性(例如，相对于不给药FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1，例如增加至少5％、至少10％、至少20％、或至少50％)，降低胰岛素抵抗(例如降低血糖水平、降低血浆胰岛素水平、或其组合，例如相对于不给药FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1，例如降低至少5％、至少10％、至少20％、或至少50％)，降低血清甘油三酯(例如相对于不给药FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1，例如降低至少10％、至少20％、或至少50％)，降低游离脂肪酸水平(例如相对于不给药FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1，例如降低至少5％、至少10％、至少20％、或至少50％)，以及降低受试者中的HbA1c水平(例如相对于不给药FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1，例如降低至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％或至少5％)。在一些实施方案中，所公开的方法包括测量受试者中的葡萄糖耐受性、胰岛素抵抗、血糖水平、血浆胰岛素水平、血清甘油三酯、游离脂肪酸和/或HbA1c水平。

在一些实例中，FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码它们的核酸分子的给药，通过降低HbA1C(例如降低至少0.5％、至少1％或至少1.5％，例如降低0.5％至0.8％、0.5％至1％、1至1.5％或 0.5％至2％)治疗代谢疾病，例如糖尿病(例如II型糖尿病)或前驱糖尿病。在一些实例中，HbA1C的目标是小于约6.5％，例如约4-6％、4–6.4％,或4-6.2％。在一些实例中，所述目标水平在约26周内、约40周内或约52周内实现。测量HbA1C的方法是常规的，并且本公开内容不限于特定的方法。示例性的方法包括HPLC、免疫测定法和硼酸盐亲和色谱法。

在一些实例中，FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白(例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)或编码它们的核酸的给药，通过增加葡萄糖耐受性(例如，通过降低受试者中的血糖水平，例如OGTT或FPG中的两小时血糖水平)治疗糖尿病或前驱糖尿病。在一些实例中，所述方法包括与对照(例如不给药如下中的任一个：胰岛素、FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白或编码它们的核酸分子)相比，降低血糖至少5％(例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或更多)，所述突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。在具体的实例中，测定相对于受试者的起始血糖水平(例如，在使用FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白或编码它们的核酸分子进行治疗之前)的血糖水平的降低，所述突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白。在其他实例中，降低受试者的血糖水平包括血糖从起点(例如大于约126mg/dL的FPG或大于约200mg/dL的OGTT两小时血糖)降低到目标水平(例如，小于126mg/dL的FPG或小于200mg/dL的OGTT两小时血糖)。在其他实例中，目标FPG可小于100mg/dL。在其他实例中，目标OGTT两小时血糖可小于140mg/dL。测量受试者中(例如受试者的血液样品中)的血糖水平的方法是常规的。

在其他实施方案中，所公开的方法包括将一种或多种糖尿病的指标(indicator)(例如，葡萄糖耐受性、甘油三酯水平、游离脂肪酸水平或HbA1c水平)与对照(例如不给药如下中的任一个：胰岛素、FGFR1c-结合蛋白多聚体或突变的FGF1蛋白或编码它们的核酸)进行比较，其中与对照(如上所述)相比具体指标的增加或降低指示对糖尿病的有效治疗，(突变的FGF1蛋白为，例如，使用表1和2中所示的序列，SEQ ID NO:21-84、113-120和191-238中任一个的序列生成的蛋白；或者与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238具有至少90％、至少95％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的蛋白)。所述对照可以是与受试者中的糖尿病指标进行比较的任意合适的对照。在一些实施方案中，所述对照是获自健康的受试者(例如未患糖尿病的受试者)的样品。在一些实施方案中，所述对照是历史对照或标准参考值或值的范围(例如，之前测试的对照样品，例如一组患有糖尿病的受试者或一组来自未患糖尿病的受试者的样品)。在其他实例中，所述对照是参考值，例如从本领域技术人员使用的正常个体的群体中获得的标准值。类似于对照群体，可将来自所述受试者的样品的值与平均参考值或与参考值的范围(例如，参照组中的最高值和最低值或95％的置信区间)进行比较。在其他实例中，与在交叉研究中用治疗化合物治疗的受试者(受试者组)相比，所述对照是用安慰剂(placebo)处理的相同的受试者(受试者组)。在其他实例中，所述对照为治疗之前的受试者(受试者组)。

通过以下非限制性的实施例对本公开内容进行说明。

实施例1

突变的FGF1蛋白的制备

可使用已知的方法制备突变的FGF1蛋白(例如，参见Xia et al.,PLoS One.7(11):e48210,2012)。下文提供了实例。

简而言之，可将编码FGF1突变蛋白(例如，SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237和238中的任一个)的核酸序列融合在肠激酶(EK)识别序列(Asp₄Lys)的下游，该识别序列的前面是柔性的20个氨基酸的接头(衍生自pBAC-3的S-标签序列)和N-末端(His)₆标签。所得的表达的融合蛋白使用该(His)₆标签用于有效纯化并随后可通过EK消化处理以产生所述突变的FGF1蛋白。

所述突变的FGF1蛋白可在用异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷诱导后从大肠杆菌宿主中表达。所表达的蛋白可利用在Ni-次氮基三乙酸(NTA) 亲和树脂上连续柱色谱法并随后通过ToyoPearl HW-40S分子筛色谱法而进行纯化。经纯化的蛋白可用EK消化以去除N-末端(His)₆标签、20个氨基酸接头和(Asp₄Lys)EK识别序列。利用随后的第二Ni-NTA色谱法步骤以移出所释放的N-末端突变FGF1蛋白(连同任意未经切割的融合蛋白)。可使用平衡至50mMNa₂PO₄、100mM NaCl、10mM(NH₄)₂SO₄、0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、5mM L-甲硫氨酸、pH6.5(“PBX”缓冲液)的HiLoad Superdex75分子筛色谱法进行最后的纯化；可将L-甲硫氨酸包括在PBX缓冲液中以限制反应性巯基(thiol)的氧化以及其他潜在的氧化降解。

在一些实施例中，不使用肠激酶，而是可使用肝素亲和色谱法制备和纯化FGF1突变蛋白(例如包括N-末端甲硫氨酸的突变蛋白)。

对于贮藏和使用，可将经纯化的FGF1蛋白通过0.22μm的滤器进行无菌过滤，用N₂吹扫，迅速冷冻于干冰中并在使用之前贮藏在-80℃中。可通过考马斯亮蓝和Silver StainPlus(BIO-RAD Laboratories,Inc.,Hercules CA)染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估所述突变的FGF1蛋白的纯度。突变的FGF1蛋白可在缺少肝素的情况下制备。在静脉推注之前，可将肝素或PBS添加到所述蛋白中。

实施例2

N-末端截短的FGF1降低ob/ob小鼠中的血糖

本发明人已经证明将成熟的rFGF1给药至ob/ob小鼠中可降低血糖并且与使用噻唑烷二酮类所观察到的那些结果相比，减少了不利作用。

为了将rFGF1的促有丝分裂作用与其降血糖活性分开，生成了缺少N-末端前24个残基的FGF1配体(rFGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7))。基于FGF1-FGFR复合物的晶体结构，预测所述截短可降低FGF1对所选择的FGFR(包括FGFR4)的结合亲和力，并因此降低配体的促有丝分裂性。

动物

将小鼠安放在12-小时光/12-小时-暗循环的温控环境中，并根据符合美国法律的管理规程来使用。雄性ob/ob小鼠(B6.V-Lep^ob/J，Jackson实验室)和雄性C57BL/6J小鼠任意接受标准或高脂肪饮食(MI实验室啮齿类饮食5001,Harlan Teklad；高脂肪(60％)饮食F3282, Bio-Serv)和酸化的水。基于C57BL/6J背景的STZ-诱导的糖尿病小鼠购自Jackson实验室。按照所描述的，注射0.1mg/ml的小鼠FGF1(Prospec,Ness Ziona,Israel)、人FGF1(Prospec,Ness Ziona,Israel)、小鼠FGF2(Prospec,Ness Ziona,Israel)、小鼠FGF9(Prospec,Ness Ziona,Israel)和小鼠FGF10(R&D systems)的PBS溶液。

血清分析

在自由进食状态或在过夜禁食后通过尾部放血来收集血液。根据制造商的说明使用酶比色法测量游离脂肪酸(Wako)、甘油三酯(Thermo)和胆固醇(Thermo)。使用UltraSensitive Insulin ELISA试剂盒(Crystal Chem)测量血清胰岛素水平。使用Milliplex^TMMAP和Bio-Plex Pro^TM试剂盒(Millipore and Bio-Rad)测量血浆脂肪细胞激素(adipokine)和细胞因子水平。

代谢研究

在过夜(o/n)禁食后进行葡萄糖耐量试验(GTT)。用1g葡萄糖/kg体重腹膜内注射小鼠，并使用OneTouch Ultra血糖仪(Lifescan Inc)在0、15、30、60和120分钟时监测血糖。在3h禁食后进行胰岛素耐量试验(ITT)。用2U胰岛素/kg体重腹膜内注射小鼠(Humulin R；Eli Lilly)，并使用OneTouch Ultra血糖仪(Lifescan Inc)在0、15、30、60和90分钟时监测血糖。在综合实验动物监测系统(Columbus Instruments)中进行实时代谢分析。连续6天6夜测定CO₂产生、O₂消耗、RQ(碳水化合物和脂肪氧化的相对比值)以及步行计数，在记录数据之前自适应至少24h。使用EchoMRI-100^TM(Echo Medical Systems,LLC)进行总的身体组成分析。

FGF和FGFR蛋白的纯化

使人FGF1(M1至D155；SEQ ID NO:2)和N-末端截短的人FGF1(FGF1^ΔNT；K25至D155；SEQ ID NO:7)在大肠杆菌细胞中表达并通过肝素亲和色谱法、离子交换色谱法和分子筛色谱法从可溶性细菌细胞裂解物级分中纯化。使人FGFR1c(D142至R365)、FGFR2b(A140至E369),FGFR2c(N149至E368)、FGFR3c(D147至E365)和FGFR4(Q144至D355)的最小配体结合结构域在体外从细菌包涵体中重折叠并通过公开的方案进行纯化。

小鼠任意接受标准饮食(ob/ob和db/db小鼠)或高脂肪饮食(C57/BL6小鼠,60％脂肪,F3282,Bio-Serv)和酸化的水。在使用特定的递送途径和剂量注射重组的FGF1或rFGF1^ΔNT(溶于PBS中,Prospec,Israel)后，在自由进食状态或在过夜禁食后监测血糖水平。分别在过夜和5小时禁食后进行葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。注射葡萄糖(1g/kg，腹膜内)或胰岛素(0.5U胰岛素n/kg，腹膜内)并监测血糖。对在自由进食状态或在过夜禁食后通过尾部放血收集的血液进行血清分析。

值得注意的是，rFGF1^ΔNT的肠胃外递送将血糖水平降低至与rFGF1在遗传性的和饮食诱导的糖尿病小鼠模型中的程度相同的程度(图2A和2B)。rFGF1^ΔNT也保留了使用rFGF1所观察到的进食抑制作用(图2C)。因此，外源的rFGF1对生理的合成作用(例如，葡萄糖的体内稳定和进食行为)不同于并独立于其作为生长因子和促细胞分裂剂的传统作用。

实施例3

FGF1突变蛋白降低糖尿病小鼠中的血糖水平

如实施例2中所述测试表3中所示的FGF1突变体。

如表3所示，可从FGF1中缺失最高达12个N-末端氨基酸而不显著影响活性，而缺少14个N-末端氨基酸的FGF1突变体不能降低糖尿病小鼠中的葡萄糖。增加FGF1热稳定性的突变通常会被很好地耐受，但是降葡萄糖活性在具有高稳定性的突变体中丢失。此外，推定的硫酸类肝素结合位点的突变对FGF1的降葡萄糖作用具有最小的影响。值得注意的是，N-末端缺失和选择的稳定化突变的作用表现出累加性。

实施例4

使用FGF1突变体对细胞内信号传导的影响

如实施例1中所述生成肽M1、M2、M3、M4和M5(分别参见SEQ ID NO:22、28、40、54和212)；KN(SEQ ID NO:10)、KLE(SEQ ID NO:11)和FGF1(SEQ ID NO:5)。制备NT截短、肽NT1(SEQ ID NO:7)、NT2(SEQ ID NO:8)和NT3(SEQ ID NO:9)而不进行His标签和肠激酶切割，并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。用经血清饥饿的HEK293细胞孵育肽(10ng/ml)15分钟。使用特异性针对pAkt、Akt、pERK和ERK的抗体对总的细胞裂解物进行蛋白质印迹。

如图8所示，类似于使用M5类似物所见的，热稳定的M3类似物显示出降低的ERK信号传导，这与在ob/ob小鼠中所见的降低的降葡萄糖活性相关。

如图9所示，FGF1的9(NT1)或11(NT3)N-末端残基的缺失不显著影响FGFR下游信号传导，而13(NT2)残基的缺失严重损害ERK磷酸化。点突变K12V、N95V的引入降低ERK磷酸化，而纳入额外的突变L46V、E87V和P134V完全消除了ERK信号传导。

如图10所示，来自FGF1的N-末端的9个氨基酸的缺失(NT1,FGF1^ΔNT)引起FGFR信号传导降低～100倍，如在下游ERK和AKT途径中降低的磷酸化中所示的。

实施例5

使用FGF1突变体对血糖的影响

如实施例4中所述生成肽M1、M2、M3(分别参见SEQ ID NO:22、28和40)，FGF1(SEQID NO:5)，NT1(SEQ ID NO:7)和NT2(SEQ ID NO:8)。将肽(0.5mg/kg)或PBS(对照)皮下(SQ)注射到5月龄(5mo old)正常喂食的C57BL/6J ob/ob小鼠中。随后测定血糖水平。

如图11A和11B所示，肽M1和M2以及野生型FGF1降低葡萄糖。因此，可设计这样的FGF1类似物，其具有增强的热稳定性、改善的药物代谢动力学性质，同时仍具有对降低血糖的所需作用。因此，本文提供的FGF2/FGF1嵌合体的FGF1部分可包括这些突变(例如，K12V、C117V、P134V、L44F、C83T和132W中的一个或多个)。

如图12所示，肽FGF1^ΔNT(NT1)显著降低葡萄糖，而FGF1^ΔNT2(NT2)丧失了其显著降低葡萄糖的能力。因此，FGF1可以是N-末端截短的(例如前9个氨基酸，但不多于13个氨基酸)，同时仍具有对降低血糖的所需作用。因此，本文提供的FGF2/FGF1嵌合体的FGF1部分可包括这样的截短。

实施例6

葡萄糖降低与FGF1信号传导相关

如实施例4中所述生成肽FGF1(SEQ ID NO:5)、FGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7)和NT2(SEQID NO:8)。将肽(10ng/ml)与经血清饥饿的HEK293细胞孵育15分钟。使用特异性针对pAkt、Akt、pERK和ERK的抗体对总的细胞裂解物进行蛋白质印迹。

如图13所示，使用FGF1和缺少N-末端9个氨基酸的FGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7)的两种独立制品时可看到下游信号传导效应物ERK和AKT的相似的活化。相比之下，额外的4个N-末端氨基酸的缺失显著降低了ERK和AKT磷酸化。这些体外FGFR介导的信号传导结果与在图12中所观察到的体内降葡萄糖作用相关，支持了这样的假说——降葡萄糖活性是通过FGF受体介导。

实施例7

使用FGF1突变体对血糖的影响

如实施例1中所述生成FGF1-KLE(SEQ ID NO:11)或FGF1-KN(SEQ ID NO:10)。将肽(0.5mg/kg)或PBS(对照)皮下注射到5月龄正常喂食的C57BL/6J ob/ob小鼠中。随后在0-120个小时连续测定血糖水平。

如图14所示，FGF1-KN突变体保留降低葡萄糖的能力120小时，尽管其促有丝分裂活性显著降低。相比之下，无促有丝分裂性的FGF1-KLE不能降低葡萄糖。这些结果表明所述促有丝分裂性和降低葡萄糖活性可通过靶向突变来独立地影响。因此，本文提供的FGF2/FGF1嵌合体的FGF1部分可包括KN突变体中的突变(例如，K12V和N95V中的一个或多个)以降低其促有丝分裂性，而不显著损害其降低血糖水平的能力。

实施例8

使用FGF1突变体对血糖的剂量-反应作用

如实施例4中所述生成肽rFGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7)和rFGF1(SEQ ID NO:5)(使用N-末端甲硫氨酸生成并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化)。将肽(0.016-10ng/ml)或PBS与经血清饥饿的HEK293细胞孵育15分钟。使用特异性针对pFRS2α、pAkt、Akt、pERK和ERK的抗体对总的细胞裂解物进行蛋白质印迹。将肽(0.5mg/kg)皮下注射到高脂肪饮食(HFD)喂养的饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中或12周龄正常喂食的C57BL/6J ob/ob小鼠(0-0.5mg/kg)中。随后测定血糖水平。

如图15A所示，FGF1的9个N-末端氨基酸的缺失显著降低了FGFR下游信号传导，包括ERK和AKT的磷酸化。FGFR底物FRS2a的剂量依赖性磷酸化确认了FGF1和FGF1^ΔNT都能够活化FGF受体。

如图15B所示，与仅接受PBS的小鼠相比，在接受rFGF1或rFGF1^ΔNT后DIO小鼠中的食物摄入显著降低。rFGF1和rFGF1^ΔNT之间在暂时降低食物摄入程度上的相似性进一步支持了这样的结论——两个蛋白均通过经由FGF受体的信号传导实现它们的体内降葡萄糖作用。

如图15C所示，观察到ob/ob小鼠中rFGF1和rFGF1^ΔNT(NT1)的降葡萄糖作用的基本相同的剂量-反应曲线。考虑到rFGF1^ΔNT的促有丝分裂性的显著降低，这些结果证明了FGF1的降葡萄糖活性和促有丝分裂活性是可以分开的。

实施例9

N-末端FGF1截短对血糖水平的影响

如实施例4中所述，生成肽NT1(SEQ ID NO:7)、NT2(SEQ ID NO:8)和NT3(SEQ IDNO:9)。将肽(0.5mg/kg)皮下注射到5月龄正常喂食的C57BL/6J ob/ob小鼠中，或将肽(0-0.5mg/kg)皮下注射到12周龄正常喂食的ob/ob小鼠中。随后测定血糖水平(0小时、16小时或24小时)。

如图16所示，如果N-末端截短14个氨基酸，降葡萄糖活性显著降低(NT2)。因此，FGF1可以是N-末端截短的(例如前9、10或11个氨基酸)，而维持对降低血糖的所需作用。因此，本文提供的FGF1突变体可包括这样的截短。

在另一实验中，将NT1(SEQ ID NO:7)(0.5mg/kg)皮下注射到8月龄HFD-喂养的野生型小鼠(FGFR1f/f,空心柱)或脂肪特异性的FGFR1敲除小鼠(R1KO,aP2-Cre；FGFR1f/f,实心柱)中。随后测定血糖水平(0小时、12小时或24小时)。

如图17A和17B所示，rFGF1^ΔNT(NT1)(SEQ ID NO:7)降低HFD-喂养的野生型小鼠(对照)中的血糖水平，但对FGFR1KO(突变体)小鼠没有影响。图17A报告了血糖的改变，而图17B报告了归一化为100％的起始葡萄糖水平的数据。这些结果证明FGFR1在脂肪组织中的表达是rFGF1^ΔNT介导的葡萄糖降低所必需的。

如图18A和18B所示，小鼠rFGF1(SEQ ID NO:4的氨基酸1-15)降低HFD-喂养的野生型小鼠(FGFR1f/f,空心柱)中的血糖水平，但对aP2-Cre；FGFR1f/f(FGFR1KO,斑点柱)小鼠没有影响。图17A报告了血糖的改变，而图17B报告了归一化为100％的起始葡萄糖水平的数据。这些结果证明FGFR1在脂肪组织中的表达是rFGF1介导的葡萄糖降低所必需的。

实施例10

FGF1点突变对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽K118E(SEQ ID NO:13)、K118N(SEQ ID NO:12)、FGF1(SEQID NO:5)和KKK(SEQ ID NO:114)，同时使用N-末端甲硫氨酸表达FGF1^ΔNT(NT1)(SEQ ID NO:7)并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至120小时)。这些小鼠是饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠。

如图19所示，单个赖氨酸的突变，K118突变为Asn(K118N(SEQ ID NO:12))或Glu(K118E(SEQ ID NO:13))足以消除在DIO小鼠中的降葡萄糖活性。

如图21和22所示，突变所选择的FGF1的肝素结合位点中涉及的氨基酸，即氨基酸K112、K113和K118，导致可降低ob/ob小鼠中血糖水平的突变的FGF1序列。因此，本文提供的FGF1突变体可包含K112、K113和K118中所有3个位置处的突变，例如K112D、K113Q和K118V置换。但是，尽管K118到疏水残基缬氨酸的突变是被耐受的，但包含电荷逆转的突变(K118E)或到极性残基(K118N)的突变是不被耐受的。

实施例11

FGF1点突变对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽KN(SEQ ID NO:10)、KKK(Salk_010,SEQ ID NO:226)、FGF1(SEQ ID NO:5)和KLE(Salk_011,SEQ ID NO:11)，同时使用N-末端甲硫氨酸表达FGF1^ΔNT(NT1)(SEQ ID NO:7)和FGF1^ΔNTKN(Salk_009,SEQ ID NO:225)并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至120小时)。

如图32A和32B中所示，将突变K12V和N95V与N-末端残基的缺失组合导致可降低ob/ob小鼠中血糖水平的突变的FGF1序列(SEQ ID NO:225)。所组合的K12V N95V的突变与稳定化突变Q40P S47I H93G(SEQ ID NO:11)也降低ob/ob小鼠中的血糖水平。使用所选择的FGF1类似物观察到食物摄入的暂时降低(图32C和32D)。此外，SEQ ID NO:225的单一注射能够将低葡萄糖水平维持7天以上。

实施例12

FGF1点突变对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽FGF1(SEQ ID NO:5)和Salk_013(SEQ ID NO:31)，同时使用N-末端甲硫氨酸表达Salk_012(SEQ ID NO:79)并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至96小时)。

如图33A中所示，将突变K12V N95V与稳定化突变Q40P S47I H93G以及N-末端残基的缺失组合获得了可降低ob/ob小鼠中血糖水平的突变的FGF1序列(Salk_012)。所组合的K12V N95V的突变与稳定化突变L44F、C83T、C117V和F132W(Salk_013)也降低ob/ob小鼠中的血糖水平。Salk_012和Salk_013对食物摄入具有最小的影响(图33B)。

实施例13

FGF1点突变对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽Salk_014(SEQ ID NO:230)、Salk_024(SEQ ID NO:84)、Salk_025(SEQ ID NO:208)和Salk_026(SEQ ID NO:209)，同时使用N-末端甲硫氨酸表达Salk_023(SEQ ID NO:38)并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至72小时)。

如图34A所示，具有单独的或与其他突变组合的稳定化点突变C117V的FGF1将ob/ob小鼠中的血糖降低72个小时以上。观察到在注射后24小时内对食物摄入的多种暂时作用(图34B)。

实施例14

FGF1点突变对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽Salk_014(SEQ ID NO:230)、Salk_022(SEQ ID NO:119)和Salk_027(SEQ ID NO:207)。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至24小时)。

如图35A所示，具有单独的或与其他影响与硫酸类肝素蛋白聚糖(HSPG)结合的能力的突变组合的稳定化点突变C117V的FGF1降低ob/ob小鼠中的血糖。纳入影响HSPG结合的突变的类似物丧失了对食物摄入的暂时抑制(图35B)。

实施例15

FGF1点突变对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽Salk_014(SEQ ID NO:230)，同时使用N-末端甲硫氨酸表达Salk_032(SEQ ID NO:215)并使用肝素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至24小时)。

如图36A中所示，K12V N95V突变、稳定化半胱氨酸突变C12T、C83S C117V以及N-末端残基的缺失可被组合起来以生成能够显著降低血糖水平的FGF类似物，而对进食仅有很小的影响(FIG.36B)，表明这些作用可被区分。

实施例16

FGF1-FGF19嵌合蛋白对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽Salk_014(SEQ ID NO:230)和Salk_019(SEQ ID NO:224。将肽(Salk_014；0.5mg/kg,Salk_019；所示的剂量)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至24小时)。

如图37A和37B所示，通过将FGF19的β-klotho结合结构域(SEQ ID NO:100)融合至FGF1的C-末端而生成的嵌合蛋白(SEQ ID NO:224)不能影响血糖或抑制食物摄入，即使以5倍更高的浓度(和0.5mg/kg相比的2.5mg/kg)。考虑到由FGF1和FGF21的β-klotho结合区域构成的嵌合蛋白具有降低血糖的活性，这些结果表明该类似物正被靶向至不影响血糖水平的FGFR4-β-klotho受体复合物。

实施例17

FGF1-FGF21嵌合蛋白对血糖降低的影响

如实施例1中所述生成肽FGF1(SEQ ID NO:5)、FGF1^ΔNT(SEQ ID NO:7)、FGF21(SEQID 20)和FGF1-FGF21嵌合体(其中，所述FGF1部分包含K112D、K113Q和K118V突变，因此，所述嵌合体是SEQ ID NO:114+SEQ ID NO:8)。将肽(0.5mg/kg)或PBS皮下注射到7月龄HFD-喂养的C57BL/6J小鼠中。随后测定血糖水平(0至48小时)。

如图38所示，与野生型FGF1和FGF1^ΔNT相比，野生型FGF21微弱地降低葡萄糖。相比之下，由融合至FGF21的β-klotho结合区域的突变FGF1(FGF1-FGF21^C-tail)构建的嵌合蛋白可有效降低血糖。

考虑到本公开内容的原理可以应用于许多可能的实施方案，应当理解举例说明的实施方案仅是本公开内容的实例，不应该被认为是对本发明范围的限制。更确切地说，本发明的范围由以下权利要求界定。因此本发明人要求保护处于这些权利要求书所限定的范围和精神内的全部发明。

Claims

1.一种降低哺乳动物中的血糖的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的突变的成熟成纤维细胞生长因子(FGF)1蛋白、或编码所述突变的FGF1蛋白的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给药至所述哺乳动物，从而降低血糖，

其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含：

至少6个连续的N-末端氨基酸的缺失；

至少一个点突变；

或其组合。

2.一种治疗哺乳动物中的代谢疾病的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的突变的成熟成纤维细胞生长因子(FGF)1蛋白、或编码所述突变的FGF1蛋白的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给药至所述哺乳动物，从而治疗所述代谢疾病，

其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含：

至少6个连续的N-末端氨基酸的缺失；

至少一个点突变；

或其组合。

3.一种降低哺乳动物中的血糖的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1c-结合蛋白、或编码所述FGFR1c-结合蛋白的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给药至哺乳动物，从而降低血糖，

其中所述FGFR1c-结合蛋白包含FGFR1c-结合蛋白的多聚体。

4.一种治疗哺乳动物中的代谢疾病的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1c-结合蛋白、或编码所述FGFR1c-结合蛋白的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给药至哺乳动物，从而治疗所述代谢疾病，

其中所述FGFR1c-结合蛋白包含FGFR1c-结合蛋白的多聚体。

5.权利要求2或4的方法，其中所述代谢疾病是2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、多囊卵巢综合症(PCOS)、代谢综合征(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、高脂血症、高血压、隐匿性自身免疫糖尿病(LAD)或青少年发病的成人型糖尿病(MODY)。

6.一种降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、减少食物摄入，或它们的组合的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的突变的成熟FGF1蛋白、或编码所述突变的FGF1蛋白的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给药至哺乳动物，从而降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性、减少食物摄入，或它们的组合，

其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含：

至少6个连续的N-末端氨基酸的缺失；

至少一个点突变；

或其组合。

7.一种降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性，或它们的组合的方法，所述方法包括：

将治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1c-结合蛋白、或编码所述突变的FGFR1c-结合蛋白的核酸分子或包含所述核酸分子的载体给药至哺乳动物，从而降低饱腹和空腹血糖、改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性、降低全身性慢性炎症、改善哺乳动物中的肝性脂肪变性，或它们的组合，

其中所述FGFR1c-结合蛋白包含FGFR1c-结合蛋白的多聚体。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述蛋白的治疗有效量为至少0.5mg/kg。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述给药是皮下、腹膜内、肌内或静脉内。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述哺乳动物是猫或狗。

11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人类。

12.权利要求1至2、5至6或8至11中任一项的方法，其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个连续的N-末端氨基酸的缺失，其中与野生型成熟的FGF1蛋白相比，所述突变的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。

13.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11或12中任一项的方法，其中所述至少一个点突变包含位于如下中的一个或多个处的突变：K9、K10、K12、L14、Y15、C16、H21、R35、Q40、L44、L46、S47、E49、Y55、M67、L73、C83、L86、E87、H93、Y94、N95、H102、A103、E104、K105、N106、F108、V109、L111、K112、K113、C117、K118、R119、G120、P121、R122、F132、L133、P134、L135，其中所述编号参考SEQ ID NO:5中所示的序列，并且其中与野生型成熟的FGF1蛋白相比，所述突变的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。

14.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11或12中任一项的方法，其中所述至少一个点突变包含表1中所示的突变中的一个或多个，其中与野生型成熟的FGF1蛋白相比，所述突变的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。

15.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14中任一项的方法，其中所述至少一个点突变包含位于K112、K113和K118处的突变(其中所述编号参考SEQ ID NO:5)。

16.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14或15中任一项的方法，其中所述至少一个点突变包含将氨基酸序列ILFLPLPV(SEQ ID NO:2和4的氨基酸145-152)替换为AAALPLPV(SEQ ID NO:14)、ILALPLPV(SEQ ID NO:15)、ILFAPLPV(SEQ ID NO:16)或ILFLPAPA(SEQ IDNO:17)，其中与野生型成熟的FGF1蛋白相比，所述突变的FGF1蛋白具有降低的促有丝分裂活性。

17.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15或16中任一项的方法，其中至少6个连续的N-末端氨基酸的缺失还包含将所缺失的N-末端氨基酸中的至少一个用来自FGF21的相应氨基酸替换。

18.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17中任一项的方法，其中野生型的成熟FGF1蛋白包含SEQ ID NO:5。

19.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一项的方法，其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、173-175、177-179、181-183、185-189和191-238的至少95％的序列同一性。

20.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一项的方法，其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、113、114、115、116、117、118、119、120、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238，或由其组成。

21.权利要求1、2、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一项的方法，其中所述突变的成熟FGF1蛋白是嵌合蛋白的一部分，所述嵌合蛋白还包含(i)FGF21的C-末端区域、(ii)FGF19的C-末端区域、(iii)β-Klotho结合蛋白、(iv)FGFR1c-结合蛋白或(v)FGFR1c-结合蛋白和β-Klotho结合蛋白。

22.权利要求21的方法，其中所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO:87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188或189。

23.权利要求3至4或6的方法，其中所述FGFR1c-结合蛋白包含多聚体，其中所述多聚体中的至少一个单体包含与SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190的至少90％的序列同一性。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述方法还包括给药额外的治疗化合物。

25.权利要求24的方法，其中所述额外的治疗化合物是α-糖苷酶抑制剂、淀粉不溶素激动剂、二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂、格列奈类药物、磺酰脲类或过氧化物酶体增殖剂-激活受体(PPAR)-γ激动剂。

26.权利要求25的方法，其中所述PPAR-γ激动剂是噻唑烷二酮(TZD)、阿格列扎、法格立他扎、莫格列佐或特格列佐。

27.权利要求26的方法，其中所述TZD是吡格列酮、罗格列酮、利格列酮或曲格列酮。

28.一种分离的突变的成熟成纤维细胞生长因子(FGF)1蛋白，其包含与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238的至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。

29.权利要求28的分离的突变的成熟FGF1蛋白，其中所述突变的成熟FGF1蛋白包含SEQID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173、174、175、177、178、179、181、182、183、185、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237或238，或由其组成。

30.权利要求28-29中任一项的分离的蛋白，其中所述N-末端氨基酸是甲硫氨酸。

31.权利要求28-30中任一项的分离的蛋白，其中与没有修饰的FGF1蛋白相比，所述蛋白被修饰以降低对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。

32.权利要求28-30中任一项的分离的蛋白，其中所述蛋白包含嵌合蛋白的一部分，所述嵌合蛋白还包含(i)FGF21的C-末端区域、(ii)FGF19的C-末端区域、(iii)β-Klotho结合蛋白、(iv)FGFR1c-结合蛋白或(v)FGFR1c-结合蛋白和β-Klotho结合蛋白。

33.权利要求32的分离的蛋白，其中(i)所述FGF21的C-末端区域由SEQ ID NO:86组成，(ii)所述FGF19的C-末端区域由SEQ ID NO:100组成，(iii)所述β-Klotho结合蛋白包含SEQID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145或146，或(iv)FGFR1c-结合蛋白包含SEQ ID NO:147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167或190。

34.权利要求28-31中任一项的分离的蛋白，其中所述蛋白的长度为120-140个氨基酸。

35.权利要求32-33中任一项的分离的蛋白，其中所述蛋白的长度为140-200、140至350、200至250或140至400个氨基酸。

36.一种编码权利要求28-35中任一项的分离的蛋白的分离的核酸。

37.一种包含权利要求36的分离的核酸的核酸载体。

38.一种包含权利要求37的载体的宿主细胞。

39.权利要求38的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞或酵母细胞。

40.权利要求39的宿主细胞，其中所述细菌为大肠杆菌(E.coli)。