CN103923207B - 一种fgf-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种FGF-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用。本发明成纤维细胞生长因子-21突变体的氨基酸序列为SEQ？ID？NO：2所示，其编码基因序列为SEQ？ID？NO：1所示。本发明在获得了FGF-21突变体基因后，在宿主细胞中高效可溶性地表达了FGF-21突变体蛋白，经过一系列的蛋白纯化步骤获得了FGF-21突变体蛋白。动物学试验结果表明，本发明的FGF-21突变体能够更加有效降低非酒精性脂肪肝模型动物体内的血脂水平，改善肝脏内脂肪堆积且能显著改善肝脏功能。本发明的FGF-21突变体可用于制备非酒精性脂肪肝药物。

Description

一种FGF-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用

技术领域

本发明涉及成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)基因突变，涉及FGF-21突变体蛋白的制备，还涉及该FGF-21突变体在制备治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用，属于成纤维细胞生长因子-21突变蛋白领域。

背景技术

近年来，随着人们的生活水平不断提高，饮食习惯逐渐发生不合理的改变，非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)的发生率日渐增高，约在10％-20％左右。近年来总结NAFLD的转归发现，50％发展为肝纤维化，15％发展为肝硬化，3％发展为肝衰竭或者需要进行肝移植。而NAFLD又与目前所共认的糖尿病，高血压，高脂血症，腹型肥胖等代谢综合征(MS)共同伴随。NAFLD发病机制尚不清楚，目前大多数学者认为肝脏脂肪累积、胰岛素抵抗起关键作用，反过来，肝脏脂肪变性又加重胰岛素抵抗。因此，有学者认为肥胖特别是中心性肥胖和胰岛素抵抗是发生NAFLD的危险因素。

成纤维细胞生长因子-21(fibroblastgrowthfactor21，FGF-21)是近期发现的体内又一个代谢调节因子，属于成纤维细胞生长因子家族，其特异性作用于肝脏、脂肪、胰岛细胞且不依赖于胰岛素有效安全地调节血糖血脂的能力深得研究人员青睐。最新流行病学研究表明，FGF-21与非酒精性脂肪肝(NAFLD)密切相关，在健康受试者和NAFLD受试者中，血清FGF-21水平不仅与身高体重比(BMI)呈正相关，并与长时禁食相关。Li等的研究表明，NAFLD患者的血清FGF-21水平显著高于健康人，并与肝脏甘油三酯水平相关。除此之外，本实验室在动物模型中发现FGF-21可以有效改善胰岛素抵抗，降低血清胰岛素浓度，显著降低血清中甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白的含量，显示其具有治疗NAFLD的潜能，近期美国礼莱公司针对FGF-21的临床结果也同样显示其显著的降脂效果，更进一步说明FGF-21有望成为治疗非酒精性脂肪肝的新型药物。

发明内容

本发明的目的之一是提供成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)突变体及其编码基因；

本发明的目的之二是提供含有成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)突变体基因的重组原核表达载体，以及含有该重组原核表达载体的宿主细胞；

本发明的目的之三是提供制备上述成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)突变体的方法；

本发明的目的之四是将该成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)突变体应用于制备成治疗非酒精性脂肪肝的药物或药物组合物。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种FGF-21突变体，其分子量约为20ku，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示；编码该FGF-21突变体的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。

获得本发明所述的FGF-21突变体的方法，包括如下步骤：从正常人肝脏中提取RNA，并以此为模板逆转录获得编码FGF-21的基因，以此为模板，通过overlapPCR获得FGF-21突变体基因，将所获得的FGF-21突变体基因连接到原核表达载体中；将所述重组原核表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达、纯化。

含有FGF-21突变体核苷酸序列的重组原核表达载体以及含有该重组原核表达载体的宿主细胞也包括在本发明的保护范围之内。优选的，可以将FGF-21突变体核苷酸序列与携带分子伴侣的原核表达载体相连接。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)。

本发明还提供了一种制备FGF-21突变体的方法，包括：将携带FGF-21突变体核苷酸序列的重组原核表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达FGF-21突变体融合蛋白，分离纯化FGF-21突变体融合蛋白，利用SUMO蛋白酶切除与FGF-21突变体融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。

优选的，所述的原核表达载体为pSUMO(Cat.No.1005，1006，LifeSensors)，所述的宿主细胞为TransB(DE3)(北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD811)；所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)；其中，所述的纯化包括：将融合蛋白进行树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐；纯化的融合蛋白酶切后进行树脂亲和层析，即得。

优选的，对于蛋白纯化，所述的亲和层析树脂为HisTrapTMFFcrudecolum；所述的杂蛋白洗脱液包括：45mmol／L咪唑，500mmol／LNaCl，55mmol／LNa₃PO₄，pH7.4；所述的洗脱液包括：550mmol／L咪唑，500mmol／LNaCl，55mmol／LNa₃PO₄，pH7.4；所述的脱盐采用HiPrepTM26／10Desalting。

pSUMO和大肠杆菌TransB(DE3)都可通过商业途径购买得到。

本发明在获得了FGF-21突变体基因后，与原核表达载体pSUMO重组，导入宿主细胞中，经过一系列的蛋白纯化步骤后获得了FGF-21突变体蛋白，并对纯化后的FGF-21突变体进行活性检测。

本发明所制备的FGF-21突变体是通过MSG模型鼠来检测其治疗NAFLD效果的。动物学试验结果表明，与野生型FGF-21相比，本发明FGF-21突变体能够更加有效降低非酒精性脂肪肝模型动物体内的血脂水平，改善肝脏内脂肪堆积且能显著改善肝脏功能。本发明的FGF-21突变体可作为药物治疗非酒精性脂肪肝。

附图说明

图1FGF-21突变体蛋白纯化

1.蛋白质标准分子量；2.未纯化的FGF-21突变体融合蛋白；3.纯化的FGF-21突变体融合蛋白；4.FGF-21突变体融合蛋白酶切产物；5.纯化的FGF-21突变体蛋白

图2HPLC分析FGF-21突变体蛋白

经过HPLC分析，在大约16min处出现FGF-21突变体蛋白峰，且其纯度可达95％以上。

图31-5周各实验组体重变化

治疗组体重相对于生理盐水组体重显著下降，且从治疗第三周开始，FGF-21突变体治疗组体重较野生型FGF-21治疗组体重下降更多(差异显著)，与正常组无明显差异，与模型组差异极显著。注：n=8，mean±SEM.*P＜0.05，**P＜0.01vs生理盐水组，#P＜0.05，##P＜0.01vs野生型FGF-21。

图4OGTT

口服葡萄糖后30min，生理盐水组小鼠血糖迅速上升至最高达到(14.7±0.49)mmol·L-1，而正常对照组小鼠血糖为(10.7±0.49)mmol·L-1。FGF-21突变体治疗组小鼠血糖上升幅度显著低于生理盐水组为(11.6±0.64)mmol·L-1。此外，FGF-21突变体治疗组血糖下降速度明显快于野生型FGF-21治疗组。注：n=8，mean±SEM.*P＜0.05，**P＜0.01vs生理盐水组。

图5-9停药后，各实验组肝脏脂代谢关键基因表达变化

FGF-21突变体显著降低FAS、ACC1、ACC2基因表达水平，显著升高LDLR、UCP-1基因表达水平，且显著优于野生型FGF-21治疗组。注：n=8，mean±SEM.*P＜0.05，**P＜0.01vs生理盐水组，#P＜0.05，##P＜0.01vs野生型FGF-21。

图10停药后，各实验组肝脏HE染色结果对比

在光学显微镜下，生理盐水组肝细胞肿胀，胞浆可见大量空泡，以肝小叶中央区为重，空泡大小不等，以大为主；FGF-21突变体治疗组肝细胞浆内可见较小的脂肪空泡，数量比较少；野生型FGF-21治疗组肝细胞内可见较小的脂肪空泡，但数量较多。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

说明：本发明中涉及的基因的设计、合成、突变和克隆，原核表达载体的构建，核酸提取及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1FGF-21突变体基因的克隆

1、FGF-21cDNA的获得

Trizol提取人肝脏总RNA，以总RNA为模板，Oligo(dT)15为引物，参照M-MLV反转录酶说明书进行cDNA第一条链合成。

2、PCR方法扩增FGF-21基因

根据FGF-21基因去除信号肽的核苷酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除信号肽的FGF-21基因。利用软件Primer5.0设计FGF-21基因克隆引物(P1和P2)。

循环参数为：95℃预变性5min，95℃30s，56℃30s，72℃45s的顺序，15个循环后，72℃再延伸10min。

3、overlapPCR获得FGF-21突变基因

利用软件Primer5.0设计FGF-21突变引物(P3、P4和P5)。以P3和P4为引物，FGF-21基因为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物1；以P2和P5为引物，FGF-21基因为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物2；以P3和P2为引物，PCR产物1和PCR产物2混合物为模板，进行PCR扩增，获得FGF-21突变基因。

循环参数为：94℃预变性5min，94℃30s，58℃40s，72℃50s的顺序，12个循环后，72℃再延伸10min。

表1克隆FGF-21突变体基因的引物

4、FGF-21突变基因克隆至pMD18-Tsimple

将上述3中获得的FGF-21突变基因克隆至pMD18-Tsimplevector(购自大连TaKaRa公司，货号D103A)中，转化大肠杆菌，37℃倒置过夜培养筛选阳性克隆，并测序。

实施例2FGF-21突变体的制备及活性检测

1、FGF-21突变体基因原核表达载体的构建

将实施例1回收后的FGF-21突变体目的片段与原核表达载体pSUMO(Cat.No.1005，1006，LifeSensors)连接，经过酶切鉴定后，构建得到重组质粒pSUMO-mutFGF-21。

2、FGF-21突变体蛋白的制备

(1)FGF-21突变体蛋白诱导表达

将含有正确序列的重组质粒pSUMO-mutFGF-21转化至表达菌株TransB(DE3)(北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD811)。转化后的单菌落接种至5mL含氨苄青霉素(50mg／mL)的LB培养基中，37℃培养10h，以1∶100接种于500mL含氨苄青霉素(50mg／mL)的LB培养基中，37℃培养2h，A600=0.3-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol／L进行诱导，诱导3h后收获菌体进行超声波破碎后离心，分别取上清和沉淀进行12％SDS-PAGE电泳分析。菌体经超声波破碎后离心，可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的90％以上。

(2)FGF-21突变体蛋白纯化

菌体经超声波破碎后离心，上清液经HisTrapTMFFcrudecolum亲和层析，用杂蛋白洗脱液(45mmol／L咪唑，500mmol／LNaCl，55mmol／LNa3PO4，pH7.4)洗去杂蛋白后，用洗脱液(550mmol／L咪唑，500mmol／LNaCl，55mmol／LNa3PO4，pH7.4)洗脱FGF-21突变体融合蛋白，收集洗脱的峰。FGF-21突变体融合蛋白经HiPrepTM26／10Desalting脱盐后，收集脱盐峰。收集的FGF-21突变体融合蛋白加入SUMO蛋白酶和终浓度2mmol／L的DTT，4℃过夜切割，再经HisTrapTMFFcrudecolum收集紫外吸收峰，12％SDS-PAGE电泳检测(图1)。经过HPLC分析，FGF-21突变体蛋白的纯度可达95％以上，如图2所示。

3、FGF-21突变体蛋白活性的鉴定

新生昆明小鼠(动物合格证号：SCXK(京)2012-0001)于出生两天起，皮下注射L-谷氨酸钠4g·kg-1，连续21天后断乳，按雌雄分笼饲养。定期记录体重，观察体型变化。选用4月龄雄性MSG小鼠进行葡萄糖耐量(OGTT)实验。根据其结果，选择具有明显胰岛素抵抗动物，并参考体重随机分为3组，分别为生理盐水组，野生型FGF-21治疗组和FGF-21突变体治疗组；同时设置正常老鼠组作为对照；每组8只。注射组注射剂量为1mg／kg／d，腹腔连续注射5周。生理盐水组和正常组注射等剂量生理盐水。每周检测一次体重，结果如图3，治疗组体重相对于生理盐水组体重显著下降，且从治疗第三周开始，FGF-21突变体治疗组体重较野生型FGF-21治疗组体重下降更多(差异显著)，与正常组无明显差异，与模型组差异极显著。

连续给药5周后，停止给药，OGTT(口服葡萄糖耐量试验)检测各组糖耐量水平，结果如图4。从结果中可以看出，口服葡萄糖后30min，生理盐水组小鼠血糖迅速上升至最高达到(14.7±0.49)mmol·L-1，而正常对照组小鼠血糖为(10.7±0.49)mmol·L-1，表明生理盐水组小鼠存在一定程度的胰岛素抵抗，而FGF-21突变体治疗组小鼠血糖上升幅度显著低于生理盐水组为(11.6±0.64)mmol·L-1。此外，FGF-21突变体治疗组血糖下降速度明显快于野生型FGF-21治疗组。结果表明，FGF-21突变体治疗组小鼠胰岛素抵抗程度得到显著改善。

空腹血糖、空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数，结果见表2。各实验组之间的空腹血糖(FBG)水平比较，无差异(P＞0.05)。生理盐水组与正常对照组相比存在明显的胰岛素抵抗(P＜0.01)；FGF-21突变体治疗组小鼠的空腹胰岛素和稳态胰岛素评价指数均显著低于生理盐水组(P＜0.01)，且显著低于野生型FGF-21治疗组(P＜0.01)，表明FGF-21突变体可明显改善MSG小鼠胰岛素抵抗状态并使之趋于正常水平，且优于野生型FGF-21治疗效果。检测各实验组血脂和转氨酶情况(见表3)。随着体重的显著增加，生理盐水组与正常组相比，小鼠血清TC、TG、LDL-c含量均显著升高(P＜0.01)。与生理盐水组相比，FGF-21突变体治疗组的TG、TC、LDL-c分别降低了68.5％、57.5％、81.9％(P＜0.01)，而HDL-c升高了47.9％(P＜0.01)。以上结果均表明，FGF-21突变体可以显著改善MSG小鼠的高脂血症及高胆固醇血脂，除此之外，FGF-21突变体治疗效果优于野生型FGF-21治疗组(P＜0.05，P＜0.01)。生理盐水组小鼠ALT、AST、ALP均显著高于正常对照组(P＜0.01)，表明生理盐水组小鼠的肝脏功能严重受损。而FGF-21突变体治疗组小鼠的ALT、AST、ALP均显著低于模型对照组(P＜0.01)，除此之外，FGF-21突变体多项指标优于野生型FGF-21治疗组(P＜0.05，P＜0.01)，表明FGF-21突变体可显著改善肝脏功能。

通过Real-timePCR检测各实验组小鼠肝脏脂质代谢关键基因的转录水平(FAS，ACC1，ACC2，LDLR，UCP-1)，结果如图5-9。FGF-21突变体显著降低脂代谢合成相关基因表达水平且明显优于野生型FGF-21治疗组(P＜0.05，P＜0.01)，包括脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)。除此之外，FGF-21突变体还能显著升高低密度脂蛋白受体(LDLR)(P＜0.05，P＜0.01)，并且通过上调解偶联蛋白1(UCP-1)(P＜0.05，P＜0.01)降低能量利用效率。此结果表明，FGF-21突变体可显著降低脂代谢合成关键基因表达水平，减少脂肪的合成；且上调脂肪分解关键基因表达，促进脂肪分解和能量代谢，从而降低了肥胖小鼠肝脏组织中脂肪的积累，恢复肝脏的正常功能。

将实验小鼠肝脏包埋切片做HE染色(图10)。在光学显微镜下，生理盐水组肝细胞肿胀，胞浆可见大量空泡，以肝小叶中央区为重，空泡大小不等，以大为主；FGF-21突变体治疗组肝细胞浆内可见较小的脂肪空泡，数量比较少；野生型FGF-21治疗组肝细胞内可见较小的脂肪空泡，但数量较多，表明FGF-21突变体治疗后，模型鼠肝脏损伤得到很好的修复。

总之，与野生型FGF-21相比，FGF-21突变体治疗后，能更有效地降低非酒精性脂肪肝模型动物体内的血脂水平，改善肝脏内脂肪堆积，且能显著改善肝脏功能。(P＜0.05，P＜0.01)。

表2停药后，各组实验小鼠空腹血糖、血清胰岛素含量及胰岛素抵抗指数

表3停药后，各实验组血清学指标结果对比

Claims (10)

1.一种成纤维细胞生长因子-21突变体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。

2.编码权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。

3.含有权利要求2所述成纤维细胞生长因子-21突变体基因的原核表达载体。

4.含有权利要求3所述原核表达载体的宿主细胞TransB(DE3)。

5.一种制备权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体的方法，包括：将编码成纤维细胞生长因子-21突变体核苷酸序列与原核表达载体相连接，得到重组原核表达载体；载体本身携带分子伴侣小分子泛素样修饰蛋白（SUMO），连接后形成SUMO与成纤维细胞生长因子-21突变体连接而成的融合基因；将该重组原核表达载体转化至宿主细胞TransB(DE3)中；诱导表达成纤维细胞生长因子-21突变体融合蛋白，分离纯化该融合蛋白，利用SUMO蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的原核表达载体为pSUMO；所述的宿主细胞为TransB(DE3)。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的成纤维细胞生长因子-21突变体核苷酸序列为SEQIDNO:1所示；成纤维细胞生长因子-21突变体氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。

8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化包括：成纤维细胞生长因子-21突变体融合蛋白进行树脂亲和层析，依次经过洗涤、洗脱、脱盐；将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，即得。

9.一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，包括：治疗上有效的权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体和药学上可接受的载体或辅料。

10.权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。