CN105348380B - 犬成纤维细胞生长因子21及其在治疗犬内分泌疾病中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了犬成纤维细胞生长因子21及其在治疗犬内分泌疾病中的用途。本发明犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21)的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示,其编码基因序列为SEQ ID NO:1所示。本发明以犬肝脏细胞核酸为模板,PCR扩增出cFGF21基因,在大肠杆菌Rossetta(DE3)中获得高效可溶性表达的cFGF21。动物学试验结果表明,本发明cFGF21能够有效降低动物体内的血糖水平,此外,本发明cFGF21在降低血糖水平方面还具有药效持续时间长的优点。本发明cFGF21可作为药物治疗犬糖尿病,肥胖,代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。
Description
技术领域
本发明涉及犬成纤维细胞生长因子及其制备方法,本发明还涉及该犬成纤维细胞生长因子在制备治疗犬内分泌疾病药物中的用途,属于犬成纤维细胞生长因子领域。
背景技术
随着宠物犬饲养量的上升,肥胖及老龄犬数量的增多,随之而来犬的代谢性、老年性疾病,如糖尿病及其并发症的发病率呈逐渐增加的趋势。在小动物临床诊疗中,糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是犬最常见的代谢内分泌疾病之一。主要发生于中、老龄犬,并且患病率正在逐年升高。犬通常在7-9岁时开始发病,其发病率为0.1%-0.6%,雌犬是雄犬的3倍,多于发情后发病,多见于基斯犬、小型髯犬、小型狮子犬、腊肠犬、西摩族犬等犬种。
糖尿病患犬的诊断与治疗和人糖尿病大体相同,但对犬糖尿病发病机制及治疗的研究远远没有跟上人糖尿病研究的步伐。据统计,中国约有1.5亿只宠物狗,糖尿病狗约为70万只。目前犬类糖尿病治疗药物主要有磺酰脲类和胰岛素,对肥胖和高血脂症还没有专门的药物。这些治疗糖尿病的药物对肥胖和高血脂症没有治疗作用,而且降糖持续时间短,通常只能维持2个小时左右,一天内需要多次给药。此外,用于治疗犬糖尿病的常用胰岛素主要是人或猪胰岛素,与犬代谢系统的相容性较差。因此,临床上迫切需要研制适合于犬类专用、具有长效作用,同时能降脂、减肥的降糖药物。
人成纤维细胞生长因子21( Fibroblast growth factor21,FGF21) 是最新发现的与糖脂代谢有关的因子。FGF21可以特异性调节鼠3T3-Ll 脂肪细胞和人脂肪细胞对葡萄糖的摄取;FGF21可以改善胰岛素抵抗,保护胰岛细胞的存活;FGF21能促进脂肪组织中的葡萄糖吸收,减少脂肪堆积,并可在过氧化物酶体增生物激活受体PPAR调节下,可以作为肝脏中稳定的脂类调节剂,避免脂肪肝的发生。因此有国外学者预言,FGF21有望替代胰岛素成为治疗糖尿病的一代新药。
犬FGF21与人FGF21核苷酸同源性为82.15%,氨基酸同源性为86.81%,因此,犬FGF21同样也具有调节血糖血脂的能力。本实验室在动物模型中发现犬FGF21可以升高血清胰岛素浓度,显著降低血糖,显示其具有治疗犬糖尿病及犬内分泌疾病的潜能。
发明内容:
本发明的目的之一是提供犬成纤维细胞生长因子21及其编码基因;
本发明目的之二是提供含有犬成纤维细胞生长因子21基因的原核表达载体或质粒以及含有该原核表达载体的宿主细胞。
本发明目的之三是将该犬成纤维细胞生长因子21应用于制备成治疗犬糖尿病及犬内分泌疾病的药物或药物组合物。
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的:
一种犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21),其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示;编码该犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21)的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
获得本发明所述的cFGF21的方法,包括如下步骤:从正常犬肝脏中提取RNA,并以此为模板逆转录获得编码cFGF21 的基因,以此为模板,通过PCR获得cFGF21基因,将所获得的cFGF21基因连接到原核表达载体中;将所述重组原核表达载体转化适当的宿主细胞,并进行诱导表达、纯化。
含有cFGF21核苷酸序列的重组原核表达载体以及含有该重组原核表达载体的宿主细胞也包括在本发明的保护范围之内。优选的,可以将cFGF21核苷酸序列与携带分子伴侣的原核表达载体相连接。其中,所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)。
本发明还提供了一种制备cFGF21的方法,包括:将携带cFGF21核苷酸序列的重组原核表达载体转化至宿主细胞中;诱导表达cFGF21融合蛋白,分离纯化cFGF21融合蛋白,利用SUMO蛋白酶切除与cFGF21融合表达的分子伴侣部分,纯化,即得。
优选的,所述的原核表达载体为pSUMO(Cat. No. 1005, 1006,Life Sensors),所述的宿主细胞为Rossetta(DE3) (上海宝曼生物科技有限公司, 目录号:130558-10);所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO);其中,所述的纯化包括:将融合蛋白进行树脂亲和层析,依次经洗涤、洗脱、脱盐;纯化的融合蛋白酶切后进行树脂亲和层析,即得。
优选的,对于蛋白纯化,所述的亲和层析树脂为Ni·NTA树脂;所述的杂蛋白洗脱液包括:50mmol/L 咪唑,500 mmol/L NaCl,50 m mol/L Tris-HCl,pH8.0;所述的洗脱液包括:500 mmol/L 咪唑,500 mmol/L NaCl,50 m mol/L Tris-HCl,pH8.0;所述的脱盐采用HiPrepTM 26/10 Desalting。
pSUMO和大肠杆菌Rossetta(DE3)都可通过商业途径购买得到。
本发明在获得了cFGF21基因后,与原核表达载体pSUMO重组,导入宿主细胞中,经过一系列的蛋白纯化步骤后获得了cFGF21蛋白,并对纯化后的cFGF21进行活性检测。
本发明所制备的cFGF21是通过糖尿病模型鼠和糖尿病模型犬来检测其治疗糖尿病效果的。动物学试验结果表明,本发明cFGF21能够有效降低糖尿病模型动物的血糖水平,此外,本发明cFGF21在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明的cFGF21可作为药物治疗犬糖尿病,肥胖,代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。
附图说明
图1 pSUMO-cFGF21质粒鉴定
1:λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker 2:pSUMO-cFGF21质粒 3:Not I酶切鉴定 4:PCR鉴定 5:DL 2000 DNA marker
图2 SUMO-cFGF21融合蛋白表达
1:蛋白marker 2:IPTG诱导前 3:IPTG诱导后蛋白表达总量 4:IPTG诱导后可溶性蛋白表达量 5:IPTG诱导后沉淀蛋白表达量
图3 cFGF21蛋白制备
1:蛋白marker 2:cFGF21
图4 HPLC分析cFGF21蛋白纯度
经过HPLC分析,在大约21min处出现cFGF21蛋白峰,且其纯度可达95%以上。
图5 cFGF21刺激后3T3-L1脂肪细胞糖吸收的变化
空细胞糖吸收约27%,10 nmol/L cFGF21刺激后增加至约33%,100 nmol/L cFGF21刺激后增加至约44%,1000 nmol/L cFGF21刺激后增加至约54%。
图6 OGTT
口服葡萄糖后30min,模型组血糖显著上升,且30min后下降比较缓慢,cFGF21治疗组血糖显著低于模型组,并且血糖在60min已降至接近正常鼠血糖。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图7 30天内各组小鼠血糖的变化
模型组血糖始终维持较高的水平,cFGF21治疗3天,血糖较模型组显著下降,治疗6天后血糖维持在较低的水平接近正常组小鼠血糖水平。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图8 小鼠血清胰岛素含量
模型组小鼠血清胰岛素含量显著下降,而cFGF21治疗组血清胰岛素含量相较于模型组得到显著的提高。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图9 糖化血红蛋白水平
注射30天后,模型组糖化血红蛋白含量维持在较高的水平,而cFGF21治疗组糖化血红蛋白水平显著下降。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图10 G6Pase基因的表达量
模型组肝脏内G6Pase表达量显著升高,而cFGF21治疗组小鼠肝脏内G6Pase表达量显著下降。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图11 PCK基因的表达量
模型组肝脏内PCK基因表达量显著升高,而cFGF21治疗组小鼠肝脏内PCK基因表达量显著下降。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图12、13 G6Pase和PCK蛋白的表达量
模型组肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著升高,而cFGF21治疗组小鼠肝脏内G6Pase和PCK蛋白表达量显著下降。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图14 胰腺HE染色以及免疫组化结果
模型组小鼠胰腺胰岛破坏比较严重,分泌胰岛素的量显著降低,而cFGF21治疗组小鼠胰岛相较于模型组得到显著的改善。
图15 糖尿病犬血糖的变化
注射12天内,模型组犬的血糖始终维持在较高的水平,而相较于模型组,cFGF21治疗组2天后,犬的血糖显著下降,治疗4天后血糖维持在较低的水平,接近正常组犬的血糖。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图16 糖尿病犬血清胰岛素水平
模型组犬血清胰岛素含量显著下降,而cFGF21治疗组血清胰岛素含量相较于模型组得到显著的提高。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图17 糖尿病犬G6Pase基因的表达量
模型组犬肝脏内G6Pase基因表达量显著升高,而cFGF21治疗组犬肝脏内G6Pase基因表达量显著下降。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
图18 糖尿病犬PCK基因的表达量
模型组犬肝脏内PCK基因表达量显著升高,而cFGF21治疗组犬肝脏内PCK基因表达量显著下降。*p<0.05, **p<0.01,与模型组相比;#p<0.05, ##p<0.01,与正常组相比。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
说明:本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆,原核表达载体的构建,核酸提取及序列分析及鉴定,以及表达产物的分离和纯化等操作步骤,可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 cFGF21基因的克隆
根据cFGF21基因去除信号肽的氨基酸序列,设计引物,通过互补延伸的方法获得去除信号肽的cFGF21基因。利用在线软件Primer5.0设计cFGF21引物。
以提取的正常犬肝总RNA为模板,Oligo(dT)18为引物,参照M-MLV反转录酶M-MLVRT说明书进行cDNA第一条链合成,反应体系和具体操作分别如下:
70℃水浴5min,冰上放置5min,依次加入:
37 ℃水浴2 h,70 ℃水浴15 min,取2 µL用于PCR扩增反应。采用常规PCR方法扩增cFGF21成熟多肽cDNA,PCR反应(50 µL体系)如下:
其中,引物P1和P2的具体序列如下:
P1上游引物:5′- GGGTCTCTAGGT GCACATCCGATCCCTGACTCCA-3′;
BsaI
P2 下游引物:5′- GCGGCCGC TTAGGAAGCATAGCTGGGACT-3′;
NotI
混匀后进行PCR扩增。循环参数为:94℃预变性4 min,94℃ 50 sec,55℃ 1 min,72℃ 1 min的顺序,20个循环后,72 ℃再延伸10 min。最终得到全长的cFGF21基因。
实施例2 犬成纤维细胞生长因子21的表达和制备
1、cFGF21基因原核表达载体的构建
将实施例1回收后的cFGF21目的片段与原核表达载体pSUMO连接,连接反应体系(10 µL)如下:
共10 µL体系,混匀,16 ℃连接过夜。经过酶切鉴定后,构建得到重组质粒pSUMO-cFGF21。
2、cFGF21蛋白的获得
(1)诱导表达
将含有正确序列的重组质粒pSUMO-cFGF21转化至表达菌株Rossetta(DE3) (上海宝曼生物科技有限公司, 目录号:130558-10)。转化后的单菌落分别接种至5 mL含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB培养基中,37℃培养10 h,以1:100接种于500 mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中,37℃培养2 h,A600=0.3-0.6时,加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L进行诱导, 诱导3 h后收获菌体进行超声破碎后离心,分别取上清和沉淀进行15%SDS-PAGE电泳分析。菌体经超声破碎后离心,可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的70%以上。
(2)蛋白质纯化
按照上述的融合蛋白表达的最优条件,扩大培养体积,诱导表达后收集菌体,破碎后离心收集上清,先进行DEAE Sepharose FF纯化,用25mmol/L Tris-HCl,0.25mol/LNaCl,pH8.0进行洗脱。收集吸脱峰组分,进行Ni·NTA树脂亲和层析,用缓冲液50 m mol/LTris-HCl,pH 8.0,0.5 mol/L NaCl,10m mol/L咪唑 平衡Ni·NTA树脂,将裂解液引流到平衡好的树脂柱中,上样完毕后用缓冲液50 m mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.5 mol/L NaCl,50m mol/L咪唑进行洗涤。最后,以缓冲液50m mol/L Tris-HCl,pH 8.0,0.5 mol/L NaCl,500m mol/L咪唑进行目的蛋白的洗脱。收集各洗脱峰,并进行SDS-PAGE检测。经过HPLC分析,cFGF21蛋白的纯度可达95%以上。
实施例3 犬成纤维细胞生长因子21的活性试验
1、cFGF21蛋白细胞水平活性检测
3T3-L1脂肪细胞(购自ATCC,货号:CL-173)饥饿12 h,用细胞培养基稀释纯化好的cFGF21蛋白,使其终浓度为10、100、1000 nmol/L,以每孔1 ml的量将不同浓度的稀释液加入到已分化成熟的脂肪细胞中。每个浓度至少设3个重复孔。
葡萄糖浓度的检测:上述处理分别孵育细胞24 h后,取上清培养基2 μL放入200 μL的葡萄糖检测液中测定葡萄糖的含量。每个浓度至少重复3次,37 ℃反应5~10分钟后,在500 nm波长下测OD值。细胞的葡萄糖消耗率计算方法如下,并运用统计学分析实验结果。
计算培养液中残留的葡萄糖浓度,公式为:
葡萄糖浓度(mmol/L)=OD样品/OD标准×5.55 mmol/L
计算细胞对葡萄糖的消耗率,公式为:
细胞葡萄糖消耗率(%)=[(C空白葡萄糖-C给药葡萄糖)/ C空白葡萄糖] ×100 %。
用不同浓度的cFGF21蛋白处理脂肪细胞24h后,经微量化的GOD-POD法葡萄糖检测试剂盒检测培养基中葡萄糖含量,统计学分析结果显示,用cFGF21蛋白处理的细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加,与未经任何处理的对照组相比,残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少。结果显示,空细胞糖吸收约27%,10 nmol/L cFGF21刺激后增加至约33%,100 nmol/L cFGF21刺激后增加至约44%,1000 nmol/L cFGF21刺激后增加至约54%。结果表明,cFGF21能显著促进细胞的葡萄糖吸收水平,并呈剂量依赖性。说明cFGF21具有调节细胞葡萄糖代谢的作用。
2、cFGF21蛋白的体内活性试验
(1)糖尿病小鼠模型检测cFGF21蛋白活性
C57BL/6J小鼠(长春亿斯实验动物技术有限责任公司,动物质量合格证号SCXK(吉)-2011-0004)随机分为2组,每组8只。同时设置正常老鼠组作为对照,8只。通过皮下给药方式,阴性对照组注射PBS缓冲液;cFGF21组以1 mg/kg/d剂量注射蛋白,连续注射30天。实验开始于上午8点(此时模型动物血糖为一天内较高值),实验过程中自由饮食。
利用STZ(80mg/kg)诱导获得糖尿病小鼠,血糖持续高于13.8mmol/L的小鼠被认为是糖尿病小鼠。
模型对照组:糖尿病小鼠每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液,单次注射体积为0.15mL;
cFGF21组:糖尿病鼠每天上午8:00左右皮下注射cFGF21(溶剂为PBS缓冲液),单次注射剂量为1 mg/kg/d cFGF21(以总蛋白计),单次注射体积为0.15mL;
正常对照组:健康小鼠每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液,单次注射体积为0.15mL。
每3天检测一次各组小鼠血糖,结果显示,cFGF21治疗3天,血糖较模型组显著下降,治疗6天后血糖维持在较低的水平接近正常组小鼠血糖水平;持续给药30天后,OGTT检测各组小鼠的糖耐受水平,结果显示,口服葡萄糖后30min,模型组血糖显著上升,且30min后下降比较缓慢,cFGF21治疗组血糖显著低于模型组,并且血糖在60min已降至接近正常鼠血糖。结果表明,cFGF21治疗后,小鼠的葡萄糖耐受得到显著的改善。模型组血清胰岛素水平较正常组显著下降,cFGF21治疗后,血清胰岛素含量较模型组得到显著的提高。模型组糖化血红蛋白水平较正常组显著上升,cFGF21治疗后,糖化血红蛋白较模型组得到显著的降低。通过实时荧光定量PCR和western检测肝脏G6Pase和PCK表达量,结果显示,模型组小鼠G6Pase和PCK表达量较正常组显著上升;cFGF21治疗后,小鼠G6Pase和PCK表达量较模型组显著下降。此外,HE染色和免疫组化评价胰岛的损伤情况。结果显示,模型组小鼠胰岛损伤严重,分泌胰岛素的量显著下降;cFGF21治疗,胰岛的损伤情况得到显著的改善,分泌胰岛素的量显著提高。
(2)糖尿病犬模型检测cFGF21蛋白活性
为进一步确定cFGF21的降糖效果,以糖尿病犬为模型动物验证其活性。1-2岁的狗(10kg左右)由本实验室饲养。用STZ诱导建立犬糖尿病模型,空腹血糖持续高于11.1mmol/L的犬血清胰岛素水平较正常犬显著降低。因此,空腹血糖持续高于11.1mmol/L的犬被选取作为糖尿病模型。实验狗分成3组(模型对照组,cFGF21组和正常对照组),每组3只。分别进行如下平行处理:
模型对照组:糖尿病犬每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液,单次注射体积为5.0 mL;
cFGF21组:糖尿病犬每天上午8:00左右皮下注射cFGF21(溶剂为PBS缓冲液),单次注射剂量为0.5 mg/kg/d cFGF21(以总蛋白计),单次注射体积为5.0 mL;
正常对照组:健康犬每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液,单次注射体积为5.0mL。
持续给药12天,每2天检测一次各组犬的血糖,结果显示,cFGF21治疗2天,血糖较模型组显著下降,治疗4天后血糖维持在较低的水平接近正常组犬血糖水平;模型组血清胰岛素水平较正常组显著下降,cFGF21治疗后,血清胰岛素含量较模型组得到显著的提高。通过实时荧光定量PCR检测肝脏G6Pase和PCK表达量,结果显示,模型组犬G6Pase和PCK表达量较正常组显著上升;cFGF21治疗后,G6Pase和PCK表达量较模型组显著下降。
Claims (9)
1.一种犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21),其特征在于:其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
2.编码权利要求1所述犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21)的基因,其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
3.含有权利要求2所述cFGF21基因的原核表达载体,即pSUMO。
4.含有权利要求3所述原核表达载体的宿主细胞,即Rossetta(DE3)。
5.一种制备权利要求1所述的cFGF21的方法,包括:将编码该cFGF21核苷酸序列与分子伴侣核苷酸序列相融合,得到融合基因;将融合基因可操作的与原核表达载体相连接,得到重组表达载体;将该重组表达载体转化至宿主细胞中;诱导表达cFGF21,分离纯化cFGF21,利用蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分,纯化,即得。
6.按照权利要求5所述的方法,其特征在于:所述的分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白,即SUMO。
7.按照权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的纯化包括:将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析,依次经过洗涤、洗脱、脱盐。
8.一种治疗犬内分泌疾病的药物组合物,包括:治疗上有效的权利要求1所述的犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21)和药学上可接受的载体或辅料。
9.权利要求1所述的犬成纤维细胞生长因子21(cFGF21)在制备治疗犬糖尿病药物中的用途。
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CN104736557A (zh) * | 2012-06-07 | 2015-06-24 | 纽约大学 | 嵌合成纤维细胞生长因子21蛋白及其使用方法 |
CN104394882A (zh) * | 2012-06-11 | 2015-03-04 | 伊莱利利公司 | 成纤维细胞生长因子21蛋白 |
CN104667261A (zh) * | 2013-11-26 | 2015-06-03 | 温州医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子21在预防治疗动脉粥样硬化及相关疾病中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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FGF-21 as a novel metabolic regulator;Alexei Kharitonenkov等;《The Journal of Clinical Investigation》;20050630;第115卷(第6期);第1627-1635页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN105348380A (zh) | 2016-02-24 |
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