CN101182529A - 一种融合基因以及基因工程菌及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种融合基因以及基因工程菌及其制备和应用，该融合基因由霍乱毒素B亚基和三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽融合而成，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该基因工程菌为具有重组质粒pGEX4T－CTB－(gad531－545)3的大肠杆菌BL21，该基因工程菌能编码表达具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的融合蛋白，融合蛋白经纯化制备得到具有活性的融合蛋白疫苗，融合蛋白疫苗能预防和治疗I型糖尿病，也对胰岛炎等疾病有效，因此本发明为I型糖尿病和胰岛炎等自身免疫性疫病的治疗开辟了新的途径，也为患者解除了注射带来的痛苦。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组技术，具体涉及一种融合基因以及基因工程菌及其制备方法，基因工程菌所编码表达的融合蛋白及其蛋白疫苗的应用。
背景技术
I型糖尿病也叫胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，目前普遍认为它是一种具有一定遗传基础、在多种环境因子(如病毒、细菌、药物等)触发下由T细胞介导的器官特异性的自身免疫性疾病(Diabetes，1994，43：613)。口服蛋白质抗原能产生一种特异性的针对该抗原的免疫无反应性，这样的生理现象就是口服耐受(Semin Immunol，2001，13：177)，口服耐受可能是一种潜在的治疗自身免疫疾病的策略。目前胰岛素和谷氨酸脱羧酶(gad65)已成为IDDM免疫干预疗法的主要靶点，而且作为人体自身抗原，胰岛素和谷氨酸脱羧酶对机体无明显毒副作用，通过诱导产生免疫调节性Th2细胞，进而产生大量Th2型细胞因子，抑制Th1细胞克隆活性，阻断Th1型细胞因子的产生，最终对自身免疫性糖尿病和胰岛炎发挥保护作用，从而延缓IDDM的发展或降低其发生率(Nature，1993，366：69；Nat Med，1997，3：793)。研究亦表明霍乱毒素B亚基(CTB)常被作为一种粘膜载体分子通过口服方式诱导产生免疫耐受(Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：10795；Clin Exp Immunol，2003，134：38)，同时大大地降低了自身抗原的口服剂量。这些都暗示CTB偶联自身抗原不仅使应用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具实际应用价值，而且还有潜在的治疗前景(Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：4610)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能编码表达针对I型糖尿病具有治疗作用的生物活性蛋白的融合基因。
本发明还提供一种含有上述融合基因的基因工程菌及其制备方法。
本发明同时提供一种用上述基因工程菌制备的针对I型糖尿病具有治疗作用的生物活性蛋白及其蛋白疫苗的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种融合基因CTB-(gad 531-545)3，该融合基因由霍乱毒素B亚基(CTB)和三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽(gad 531-545)3融合而成，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种基因工程菌，为具有所述的融合基因与载体pGEX4T-1构建的重组质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3的大肠杆菌BL21。
一种制备所述的基因工程菌的方法，设计PCR引物扩增三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽(gad 531-545)3的基因片断，与pBac-CTB质粒(该质粒已经由中国专利号为01144502.5，公告号为CN1157405C，公告日为20040714的“霍乱毒素B亚基的制法”的发明专利所公开，并且在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCC No.0594)进行“三引物PCR”扩增反应，构建得到融合基因CTB-(gad 531-545)3，通过亚克隆入表达质粒pGEX4T-1中，构建成重组质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3，然后转化到宿主菌BL21中，制备得到所述的基因工程菌。
一种融合蛋白，由所述的融合基因编码表达，具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
所述的融合蛋白，由所述的融合基因的霍乱毒素B亚基部分作为编码表达所述的融合蛋白的载体分子，三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽部分作为编码表达所述的融合蛋白的活性部分。
所述的融合蛋白经Sepharose bead纯化后为具有生物学活性的融合蛋白。
一种蛋白疫苗，由所述的融合蛋白经冷冻干燥后，与药学认可的辅料配制成药学上认可的任一种药剂。
所述的药剂为口服液。
口服液的用法为每周2～20次，每次用量为活性成份10μg～10000μg。
具体地说本发明通过下述步骤实现：
(1)构建三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位基因片断：根据已报道的gad分子中人和鼠完全相同的抗原表位531-545肽段序列(Immunogenetics，2000，51：538)并结合大肠杆菌表达系统的密码子偏好性设计2条引物P-gad-F和P-gad-R。通过“自身引物-模板”的PCR方法获得三拷贝的同向(gad 531-545)3的串联体。
P-gad-F<SEQ ID NO.3>：5’ggctctccggttatcaaagctcgtatgatggaat3’；
P-gad-R<SEQ ID NO.4>：5’agagccaaccatggtagtaccgtattccatcata3’。
(2)构建融合基因CTB-(gad 531-545)3：设计3条引物P-F、P-I和P-R，其中引物P-F和CTB基因的5末端互补，中间引物P-I5’端和CTB基因3’末端编码序列互补(去除CTB基因的原有终止密码子)，3’端和(gad 531-545)3基因片断的5’末端互补，引物P-R与(gad 531-545)3基因片断的3’端互补(含终止密码子)，以pBac-CTB质粒和上述步骤(1)所得(gad 531-545)3基因片断为模板，进行“三引物PCR”扩增，获得大小约为534bp左右的上述的融合基因CTB-(gad 531-545)3，融合基因序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
P-F<SEQ ID NO.5>：5’cgggatccatgattaaattaaaatttgg3’；
P-I<SEQ ID NO.6>：
5’ttgccgcaattagtatggcaaatggccccggccccccggttatcaaagctcgtatgat3’；
P-R<SEQ ID NO.7>：5’gggaattcttaaaccatggtagtaccgta3’。
(3)构建含有融合基因的表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3：将PCR获得的目的片段(CTB-(gad 531-545)3)经BamH I和EcoR I双酶切后，连接在同样被BamH I和EcoR I双酶切的载体pGEX4T-1上，转化大肠杆菌DH5a，酶切和PCR构建含融合基因的表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3，其构造见图1。
(4)制备含表达质粒的基因工程菌：将表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过杂交筛选，筛选出含该重组质粒的阳性克隆即获得基因工程菌。
(5)表达纯化CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合蛋白：基因工程菌经IPTG诱导表达，离心收集菌体，重悬超声破菌离心收集沉淀。用含1％Triton的PBS缓冲液将包含体洗涤3次，将沉淀溶解于8mol/L尿素的0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH9.3)中，使用稀释复性的方法复性目的蛋白，离心弃去沉淀收集上清。将复性的蛋白过Sepharosebead纯化，经Hitrap Desahing脱盐处理后用超滤浓缩管浓缩，此时该蛋白带有GST纯化标签，经凝血酶切割去除GST标签后得到目的蛋白CTB-(gad 531-545)3；取样进行SDS-PAGE和Wersten印迹分析：从图2和图3所示结果可以看出，CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合基因在大肠杆菌中的表达产物为20KD左右，与预测大小一致；对表达产物进行免疫活性鉴定，结果表明表达产物具有很强的免疫活性，通过CTB标准品可以计算得出表达量达到10mg每升细菌培养液，实现了高效表达。
(6)制备融合蛋白口服疫苗：表达纯化的CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合蛋白，经过过滤、离心、冷冻干燥后，以来源于玉米淀粉的低聚糖填充料配制成口服疫苗。
与现有技术相比，本发明的优点在于由霍乱毒素B亚基(CTB)和三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽(gad 531-545)3融合而成的融合基因，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该融合基因通过大肠杆菌BL21能高效表达CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合蛋白，其表达系统的产率较高；且大肠杆菌表达系统稳定，后期蛋白纯化变复性条件成熟，应用十分广泛；经纯化的融合蛋白经检验具有生物学活性，可以制备成为融合蛋白疫苗，融合蛋白疫苗能预防和治疗I型糖尿病，也对胰岛炎等疾病有效，因此本发明为I型糖尿病和胰岛炎等自身免疫性疫病的治疗开辟了新的途径，也为患者解除了注射带来的痛苦。
附图说明
图1为是含CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合基因的表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3(图注说明：GST：谷光甘肽转移酶编码序列BamH I、EcoRI：限制性酶切位点；CTB-(gad 531-545)3：CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合基因；Ampicillin：氨苄青霉素基因；pBR322-origin：pBR322复制起始点；lacI、lacZ-a：β-半乳糖苷酶基因I和Z-a；lac-promoter：β-半乳糖苷酶基因启动子；tac-promoter：由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子)；
图2为是表达产物的SDS-PAGE分析图谱，其中：M：标准蛋白质分子量Marker(97.4，66.2，43，31，20.1，14.4KDa)；1：重组质粒未诱导的菌体总蛋白；2：1mMIPTG诱导表达菌体总蛋白；3：菌体裂解液沉淀；4：菌体裂解液上清；5：菌体裂解液上清经纯化后洗脱液；6：酶切去除GST后的目的融合蛋白(约20KDa)；
图3为是表达产物的Wersten分析，其中1：纯化后目的蛋白CTB-(gad 531-545)3；2：不含目的蛋白的阴性对照；
图4为是NOD小鼠口服疫苗后的病理切片分析，其中A表示正常的胰岛没有出现淋巴细胞浸润的现象，B表示口服融合蛋白疫苗的小鼠胰岛出现2级炎症浸润，C、D分别表示对照组中口服不含该融合蛋白的小鼠胰岛炎症浸润程度达到3和4级。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
构建三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位基因片断：
根据已报道的gad分子中人和鼠完全相同的抗原表位531-545肽段序列(Immunogenetics，2000，51：538)并结合大肠杆菌表达系统的密码子偏好性设计2条引物P-gad-F和P-gad-R。通过“自身引物-模板”的PCR方法获得三拷贝的同向GAD531-545的串联体。PCR反应体系中两引物互为引物-模板；
具体反应条件如下：94℃30秒，25℃60秒，72℃30秒，10个循环，然后94℃45秒，45℃60秒，72℃90秒，25个循环，最后72℃延伸10分钟。纯化所得PCR产物备用；
构建融合基因CTB-(gad 531-545)3：
设计3条引物P-F、P-I和P-R，其中引物P-F和CTB基因的5’末端互补，中间引物P-I 5’端与CTB基因3’末端编码序列互补(去除CTB基因的原有终止密码子)，3’端与(gad 531-545)3基因片断的5’末端互补，引物P-R与(gad 531-545)3基因片断的3’端互补(含终止密码子)，以与CTB基因的片段pBac-CTB质粒与实施例1所得(gad 531-545)3基因片断为模板，进行“三引物PCR”扩增，获得大小约为534bp左右的融合基因CTB-(gad 531-545)3；
具体PCR反应条件为：94℃45秒，56℃60秒，72℃90秒，30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经自动测序确认碱基序列正确后备用。
实施例2
构建含有融合基因的表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3：
将实施例1获得融合基因CTB-(gad 531-545)3经BamH I和EcoR I双酶切后，连接在同样被BamH I和EcoR I双酶切的载体pGEX4T-1上，转化大肠杆菌DH5a，酶切和PCR构建含融合基因的表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3，其构造见图1；
制备含表达质粒的基因工程菌：
将表达质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过杂交筛选，筛选出含该重组质粒的阳性克隆即获得基因工程菌。
实施例3
表达纯化的CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合蛋白：
基因工程菌经IPTG诱导表达，离心收集菌体，重悬超声破菌离心收集沉淀。用含1％Triton的PBS缓冲液将包含体洗涤3次，将沉淀溶解于8mol/L尿素的0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH9.3)中，使用稀释复性的方法复性目的蛋白，离心弃去沉淀收集上清。将复性的蛋白过Sepharose bead纯化，经Hitrap Desahing脱盐处理后用超滤浓缩管浓缩，此时该蛋白带有GST纯化标签，经凝血酶切割去除GST标签后得目的蛋白CTB-(gad531-545)3，取样进行SDS-PAGE和Wersten印迹分析。从图2和图3所示结果可以看出，CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合基因在大肠杆菌中的表达产物为20KD左右，与预测大小一致。对表达产物进行免疫活性鉴定，结果表明表达产物具有很强的免疫活性，通过CTB标准品可以计算得出表达量达到10mg每升细菌培养液，实现了高效表达。
实施例4
制备融合蛋白口服疫苗：
表达纯化的CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合蛋白，经过过滤、离心、冷冻干燥后，与来源于玉米淀粉的低聚糖填充料配制成融合蛋白口服疫苗。
实施例5
融合蛋白口服疫苗对抑制NOD小鼠胰岛炎实验：
将4周龄的NOD雌鼠分成两组，实验组：口服含有20μg活性成份的融合蛋白的疫苗；对照组：口服等体积的不含该融合蛋白的安慰剂，从5周龄开始给药，每周3-4次，持续到10周龄。10周龄鼠用来做胰腺组织病理切片观察(每组各5只)，每个胰腺组织样品置于10％福尔马林溶液固定后经过脱水、透明、浸蜡、切片(5μm)、粘片、脱蜡，HE(苏木素-伊红)染色、封片。镜检时采用双盲方式以半定量法对小鼠胰岛组织炎性浸润程度进行判定。
如图4所示，正常的胰岛没有出现淋巴细胞浸润的现象(图4A)，口服融合蛋白的小鼠胰岛出现2级炎症浸润(图4B)，而对照组中口服不含该融合蛋白的小鼠胰岛炎症浸润程度达到3～4级(图4C，D)。统计分析表明，与对照组相比，口服融合蛋白的实验组在炎症浸润程度上有显著性的降低(实验组胰岛炎分值VS.对照组胰岛炎分值＝1.5±0.4VS.3.4±0.2，P＜0.0001)，这些结果表明口服家蚕表达的CTB-INS融合蛋白在NOD小鼠中能显著抑制其胰岛炎的发生。
实施例6
融合蛋白口服疫苗降低NOD小鼠糖尿病发病率实验：
为评价在NOD小鼠中长期口服CTB-INS融合蛋白对治疗糖尿病的效果，实验组和对照组实验动物需连续每日口服20μg活性成份的融合蛋白的疫苗，日服30周以上，从10周龄起，每周对各组小鼠进行监测，方法是每周使用半定量尿糖试纸检测尿糖含量，对于尿糖阳性的小鼠，从小鼠尾巴采血1～2滴，用Roche公司乐康全II血糖仪检测血糖，如果连续两周小鼠血糖＞16.7mmol/L，即判定小鼠患糖尿病。
结果表明，口服实验早期实验组和对照组小鼠的饮食和体重都没有显著性差异；实验后期小鼠陆续患病，出现体重减轻和饮食增加的现象。在35周龄时，口服不含融合蛋白的对照组小鼠糖尿病患病率达93％(n＝12)，而口服融合蛋白的实验组小鼠发病率仅为53％(n＝15)。尽管实验结果表明口服含融合蛋白疫苗并不能完全治疗NOD小鼠糖尿病的发生，但其发病率显著低于对照组，能很好地延缓糖尿病症状的加剧。这些结果表明，口服家蚕表达的CTB-INS融合蛋白可能是治疗糖尿病的有效途径。
序列表
<110>宁波大学
<120>CTB与三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位融合基因、其蛋白质及其应用
<160>7
<170>PatentIn vetsion 3.1
<210>1
<211>534
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(533)
<400>1
atg att aaa tta aaa ttt ggt gtt ttt ttt aca gtt tta cta tct 45
Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser
1 5 10 15
tca gca tat gca cat gga aca cct caa aat att act gat ttg tgt 90
Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys
20 25 30
gca gaa tac cac aac aca caa ata cat acg cta aat gat aag ata 135
Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile
35 40 45
ttt tcg tat aca gaa tct cta gct gga aaa aga gag atg gct atc 180
Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile
50 55 60
att act ttt aag aat ggt gca act ttt caa gta gaa gta cca ggt 225
Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly
65 70 75
agt caa cat ata gat tca caa aaa aaa gcg att gaa agg atg aag 270
Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys
80 85 90
gat acc ctg agg att gca tat ctt act gaa gct aaa gtc gaa aag 315
Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys
95 100 105
tta tgt gta tgg aat aat aaa acg cct cat gcg att gcc gca att 360
Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile
110 115 120
agt atg gca aat ggc ccc ggc ccc ccg gtt atc aaa gct cgt atg 405
Ser Met Ala Asn Gly Pro Gly Pro Pro Val Ile Lys Ala Arg Met
125 130 135
atg gaa tac ggt act acc atg gtt ggc tct ccg gtt atc aaa gct 450
Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val Gly Ser Pro Val Ile Lys Ala
140 145 150
cgt atg atg gaa tac ggt act acc atg gtt ggc tct ccg gtt atc 495
Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val Gly Ser Pro Val Ile
155 160 165
aaa gct cgt atg atg gaa tac ggt act acc atg gtt taa 534
Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val
170 175
<211>177
<212>PRT
<213>Artificial
<400>2
Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu
20 25 30
Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr
35 40 45
Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys
50 55 60
Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp
65 70 75 80
Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala
85 90 95
Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys
100 105 110
Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Pro Gly Pro
115 120 125
Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val Gly
130 135 140
Ser pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met Val
145 150 155 160
Gly Ser Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met
165 170 175
Val
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<400>3
ggctctccgg ttatcaaagc tcgtatgatg gaat 34
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<400>4
agagccaacc atggtagtac cgtattccat cata 34
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
<400>5
cgggatccat gattaaatta aaatttgg 28
<210>6
<211>58
<212>DNA
<213>Artificial
<400>6
ttgccgcaat tagtatggca aatggccccg gccccccggt tatcaaagct cgtatgat 58
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<400>7
gggaattctt aaaccatggt agtaccgta 29
Claims (8)
1.一种融合基因，其特征在于该融合基因由霍乱毒素B亚基和三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽(gad 531-545)3融合而成，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述的融合基因的基因工程菌，其特征在于：为具有所述的融合基因与载体pGEX4T-1构建的重组质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3的大肠杆菌BL21。
3.一种制备权利要求2所述的基因工程菌的方法，其特征在于设计PCR引物扩增三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽(gad 531-545)3的基因片断，与CTB基因的片段pBac-CTB质粒进行“三引物PCR”扩增反应，构建得到融合基因CTB-(gad 531-545)3，通过亚克隆入表达质粒pGEX4T-1中，构建成重组质粒pGEX4T-CTB-(gad 531-545)3，然后转化到宿主菌BL21中，制备得到所述的基因工程菌。
4.一种利用权利要求2所述的基因工程菌制备的融合蛋白，其特征在于由所述的融合基因编码表达，具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合基因的霍乱毒素B亚基部分作为编码表达所述的融合蛋白的载体分子，三拷贝谷氨酸脱羧酶抗原表位肽部分作为编码表达所述的融合蛋白的活性部分。
6.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白经Sepharose bead纯化后为具有生物学活性的融合蛋白。
7.一种利用权利要求6所述的融合蛋白制备的蛋白疫苗，其特征在于由所述的融合蛋白经冷冻干燥后，与药学认可的辅料配制成药学上认可的任一种药剂。
8.如权利要求7所述的蛋白疫苗，其特征在于所述的药剂为口服液。
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2007
- 2007-11-27 CN CNA2007101570534A patent/CN101182529A/zh active Pending
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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Open date: 20080521 |