CN1255543C - 转导肽－人胰岛素原融合蛋白的表达与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是将含furin酶切位点的人胰岛素原cDNA克隆到转导肽基因的N或C末端，合成转导肽-人胰岛素原融合蛋白的多核苷酸；同时还涉及利用该多核苷酸构建融合表达的原核表达载体，表达转导肽-人胰岛素原融合蛋白。经过变性纯化后的融合蛋白，在转导肽的引导下，使胰岛素原蛋白高效进入细胞内，如皮肤细胞、肌细胞、肺泡细胞等。在这些非内分泌细胞内的furin酶的作用下，胰岛素原加工成具有天然生理活性的胰岛素，分泌到血液中，起到降低血糖的作用。本发明使糖尿病病人可以通过舌下含服、肺吸入、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等多种方式用药，而无需注射即可达到有效的治疗疾病的目的。

Description

转导肽-人胰岛素原融合蛋白的表达与应用

【技术领域】

本发明属于基因工程领域。更具体的，本发明涉及将含furin酶切位点的人胰岛素原cDNA克隆到转导肽基因的N或C末端序列，合成转导肽-人胰岛素原融合蛋白的多核苷酸；同时还涉及利用该多核苷酸构建融合表达的原核表达载体，表达纯化融合蛋白。

【背景技术】

糖尿病是死亡率仅次于心血管和肿瘤疾病的人类三大疾病之一。胰岛素是治疗糖尿病的特效药物，用于临床治疗已有80年，是临床上用量最大的蛋白质类药物。

随着生物技术的发展，重组人胰岛素已成为目前人用胰岛素的主要来源。丹麦的Novo公司和美国的Eli Lilly公司是目前生产重组人胰岛素的两个主要厂家，分别采用大肠杆菌和酵母两种表达体系生产，前者后处理难但表达量高，后者后处理相对简便但表达量低。大肠杆菌表达体系是以融合蛋白形式表达分泌人胰岛素原，先诱导表达人胰岛素原，将其转变成稳定的S-磺酸型后，经变性复性和二硫键配对，折叠成天然构象的人胰岛素原。人胰岛素原再经胰蛋白酶和羧肽酶B联合作用，去除C-肽得到结晶胰岛素(Owens DR.et al.，Biotechnology of Insulin Therapy.Oxford：Blackwell，1991：24-41；Kemmler，et al，J.Bio.Chem.1971，246：6786)。酵母表达系统可表达分泌人胰岛素原类似物，分泌出来的胰岛素前体已经具有天然的二硫键和正确的N端，因而表达产物不需要再经变性复性，直接通过胰蛋白酶转肽或胰蛋白酶和羧肽酶B处理，得到结晶胰岛素(MarkussenJ.Protein Engineering，1987，1：205和Thim L.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，86：6766)。由上可见，无论原核还是酵母表达系统的表达产物都需要经过复杂的处理才能转化为人胰岛素，用于糖尿病的治疗。

胰岛素目前均采用皮下注射方式给药，皮下注射给药能发挥很好的药效作用。糖尿病是一种必须终生给药的疾病，较严重的病人需要一天两次，甚至三、四次皮下注射给药，副作用明显，造成肌肉萎缩，以致最后无法注射，给病人带来了极大的痛苦。同时针剂用药不方便，易发生事故。在胰岛素问世不久，就不断有关于口服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓等多种给药方法的研究。口服给药系统是最为方便、易于接受的给药系统，但由于胰岛素是一种不稳定的蛋白药物，在胃肠道易于被蛋白酶水解，经胃肠道进入到血液中的胰岛素通过肝脏的首过效应，决定了胰岛素的生物利用度极低。尽管近几年多种新技术的采用，使口服给药系统取得相当进展，但其制备工艺复杂，质量控制难，过程中使用的有机溶剂可能导致胰岛素失活。粘膜给药系统，多以鼻内或口腔喷雾剂的形式出现，这类制剂多以脂质体或微囊为载体，脂质体或微囊的聚集和粒径分布的不均一，使得通过喷雾方式给药的精确定量非常困难。直肠内水解酶活性低，因此直肠给药是一条可能的给药途径，但直肠对胰岛素的吸收十分困难，生物利用度较低。尽管通过使用化学促渗剂的方法可以略微提高药物通过直肠的渗透吸收，但往往给病人带来痛苦。这些方法都有一个明显的共同问题至今未能完满解决，即生物利用度太低，成本太高。另外有些方法还有副作用或者使用不方便。

经皮给药是胰岛素一种理想的给药方式，皮肤中的水解酶活性很低，因而可以避免胰岛素的失活。胰岛素经皮给药的主要困难和问题在于：(1)胰岛素相对分子量较大，并且易形成聚集体，皮肤表面的致密角质层(S.C.)结构，使其难以渗入。(2)胰岛素在经过皮肤渗透的过程中，由于皮肤环境的诱导会发生结构的变化，并且在皮肤中滞留。(3)目前发展的新型促渗技术，尽管在很大程度上减小了角质层的传质阻力，但是胰岛素的经皮传递仍是依靠浓差推动的被动扩散实现的，由于药物滞留、浓差极化、药物在油水相分配系数的影响，胰岛素的渗透量仍然较低。

由此可见胰岛素的给药系统除注射方式外，其它给药系统都不成熟。随着医疗事业的发展，临床上对于胰岛素的治疗性能提出了越来越多的要求。那么随着生物技术的发展，有没有可能生产既无需注射又可以模拟胰岛分泌正常生理条件下的胰岛素的产品呢，本发明从以上两个角度进行说明。

胰岛素在正常生理条件下是在胰岛的β细胞中被合成和分泌，随血液循环到达靶组织，通过与其专一膜受体结合表现出生理功能的(Bell GI.Et al.，Nature，1979，282：525)。胰岛素的生物合成过程包括前胰岛素原的mRNA在内质网的内质面被翻译成一条肽链的前胰岛素原，新生的多肽链在信号肽的引导下穿过内质网膜进入内质网腔，同时移去信号肽成为胰岛素原。然后胰岛素原进入高尔基体，经过折叠、二硫键配对和包装进入分泌颗粒，最后由类似胰蛋白酶和羧肽酶B的PC2和PC3专一蛋白水解酶加工成A、B两条链的胰岛素。

目前已经知道，在普通非内分泌动物细胞中表达胰岛素基因，一般只能得到胰岛素原。因为非内分泌细胞的最大问题是缺乏分泌调节途径和将胰岛素原转换为胰岛素的酶(PC2和PC3)，不能切除胰岛素原中的C肽，使之转变为成熟的胰岛素，因此表达出的产物是胰岛素原。但是在具有组成性分泌途径的普通细胞中有一类细胞内蛋白质前体加工酶，如Furin或PACE(Seidah NG，Chretien M.Trend EndocrinolMetabol，1992，3：133)，可识别和切割经组成性分泌途径分泌的蛋白质上Arg/Lys-X-Lys-Arg-样模式序列。使用定点突变技术改造胰岛素基因，将Fruin识别和切割位点引入胰岛素原C肽两端，在普通非内分泌细胞中表达改造后的胰岛素基因，就可生产具有Furin识别位点的成熟胰岛素(Groskrentz DJ，Sliwkowski XM，Gorman CM.J Bio Chem，1994，269：6241)。

蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)(SchwarzeSR，et al.，Science，1999，285：1569-1572.)是一类能自动穿透细胞膜，并能作为载体将其它生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。一般情况下，真核细胞的细胞膜对绝大数蛋白质和长度超过6个氨基酸的多肽均是不可透过的。1988年Green等(Cell.1988，55：1179-1188)报道加入到细胞培养液中的来自爱滋病毒1(HIV-1)的反式激活蛋白TAT能自动地进入培养细胞内，反式激活LTR启动子。随后的研究证实，TAT能自动跨过细胞膜是由于TAT蛋白上位于47-57(YGRKKRRQRRR)位的一段多肽的作用。人工合成的TAT的PTD氨基酸序列(47-57)(简称TAT肽，下同)以及利用化学合成的方法将其它大分子蛋白质连接在它的N-端或C-端，或利用遗传重组的方法构建的由其它大分子蛋白质与TAT肽组成的融合蛋白均能穿透细胞膜进入细胞内，并且发现这种穿透(或转导)作用与培养的细胞种类和培养温度无关(4℃和37℃均能转导)，而进入细胞内的量仅与加在培养液中的融合蛋白质的量有关，且代谢酶抑制剂对该转导过程无任何影响。也就是说，TAT肽所引起的这种转导作用是一种与目前已知的生物大分子进入细胞内的方式，如依赖于受体、转运蛋白或胞吞作用完全不同(Nagahara H，et al，NatureMedicine.1998，4(12)：1449-1452；Xia H，Nature biotechnology.2001，19：640-644)。除TAT肽外，来自果蝇触角足同源异型转录因子ANTP的43-58位的多肽序列(Derossi D，et al.The Journal of Biologicalchemistry.1996，27(30)：18188-18193.)；来自疮疹单病毒DNA结合蛋白VP22的267-300序列(Elliott C，Ohare P.Cell.1997，88：223-233)均具有与TAT肽完全相似的转导功能和转导机制，它们也因此被统称为PTD(Ford K G，et al.Gene Therapy.2001，8：1-4)。1999年Schwarze等第一次在活体的情况下证实了TAT肽的转导功能。将分子量大于120KD由β-半乳糖苷酶和TAT肽序列组成的融合蛋白在活体情况下注射入小鼠腹腔内，4个小时后，在小鼠的所有组织，包括脑部(能穿透血脑屏障)均检测到了β-半乳糖苷酶的活性，而没有TAT序列的对照融合蛋白则检测不到酶的活性。研究结果证实TAT肽奇特的生物功能，它在不破坏细胞膜生物活性的情况下，能将大分子蛋白携带进入细胞内，并使大分子蛋白如酶等维持其原有的生物活性。目前推测这一过程和蛋白转导域中碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的存在有关，这些氨基酸带有强的正电荷，可能通过直接与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖相互作用而介导穿膜过程(Tyagi M.et al.J Bio Chem，2001，276(5)：3254-3261)。转导肽系统被认为是一种很有前途的运载工具，在基础医学研究和临床治疗方面都有着非常广泛的应用前景。

目前应用这一技术已将分子量约15～120kD的数十种融合蛋白导入细胞。通过原核表达系统表达N端为转导肽的融合蛋白，蛋白纯化可以在变性条件下进行，这不但使那些以包涵体形式存在的融合蛋白的纯化过程大大简化，更重要的是经过变性的蛋白，由原来的天然构象变成相对灵活的链状结构，摆脱了空间构象的限制，具备更高的能量，从而使得转导效率大大提高(Nagahara H.et al.，Nat Med，1998，4：1449-1452)。当融合蛋白转入细胞后，在伴侣分子作用下重新折叠，恢复天然构象，而使目的蛋白发挥其生物学活性，与其共价连接的蛋白转导域不会影响细胞的正常结构或功能。另外细胞内转导肽介导的外源分子导入的速度极快，一般15min内即可以完成，且每个细胞内的蛋白浓度近乎相同。由此，既可以控制细胞内的蛋白浓度，又能精确的控制作用时间，通常20～200umol/L的终浓度即可产生生物学表型(Dowdy SF et al.Methods，2001，24：247-256)。因此，与将蛋白引入细胞的传统方法如微注射、穿孔蛋白及脂质体法等相比，转导肽介导的蛋白转导有着显著的优越性。目前还没有将转导肽与人胰岛素融合方面的研究报道。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明克服目前使用的重组人胰岛素的缺点，提供一种转导肽技术和非内分泌型细胞加工人胰岛素的技术结合的技术，具体提供一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白的多核苷酸及其相对应的融合蛋白，使糖尿病病人可以通过舌下含服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等多种方式用药，而无需注射即可达到有效的治疗疾病的目的。

[技术方案]

本发明的目的之一是提供一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白的多核苷酸，其含有选自下列组的序列：

(a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)(a)或(b)的序列的变体序列，其中含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；

(d)与(a)或(b)的序列有至少约75％同一性的序列；

(e)与(a)或(b)的序列有至少约90％同一性的序列；

(f)(a)或(b)的序列的简并变体；和

(g)以上序列的互补序列。

该多核苷酸的序列是将带有furin酶切位点的人胰岛素原基因序列克隆到转导肽的N或C末端的序列。

其中人胰岛素原基因序列是根据大肠杆菌偏爱密码子设计并化学合成的序列。转导肽序列为人免疫缺陷病毒基因编码的反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蝇同源异型转录因子ANTP、和单纯包疹病毒I型VP22转录因子的PTD，用于转导人胰岛素并扩展到使用PTD的一切类似物序列。

本发明的另一个目的是提供一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白，其含有选自下列组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO.1的多核苷酸编码的氨基酸序列；

(c)与SEQ ID NO.1的多核苷酸编码的序列有至少约70％同一性的序列；和

(d)与SEQ ID NO.1的多核苷酸编码的序列有至少约90％同一性的序列。

其中所述的融合蛋白，其特征在于含有转导肽及带有furin酶切位点的人胰岛素原。

本发明还提供一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白表达载体，其特征在于含有包含可操作地与表达控制序列连接的SEQ ID NO.1的多核苷酸。

本发明还提供一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白表达及分泌的方法，其特征在于以下步骤实现：

(a)转导肽-人胰岛素原基因的设计与合成；

(b)含转导肽-人胰岛素原DNA片段的表达质粒的构建；

(c)含转导肽-人胰岛素原DNA片段的融合蛋白的表达。

所述的表达方法，它采用GST融合蛋白、His融合蛋白或温度诱导型融合蛋白的方式表达。

所述的表达载体转化或转染的宿主细胞，可以是大肠杆菌细胞或酵母细胞或昆虫细胞或哺乳动物细胞。

本发明还提供一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白用于降血糖的应用，其可以通过舌下含服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等多种方式用药。

所述的应用，包括给患者施用治疗有效量的本发明的多肽或其衍生物、聚合物、串联体或环化结构、本发明的抗体或其抗原结合片断或本发明的组合物。

施用可以通过任何适合的方法进行，包括通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、皮内、滴眼、喷鼻、吸入、肛门、阴道、局部和口服途径进行的施用。

[有益效果]

本发明通过原核表达系统表达的转导肽-人胰岛素原融合蛋白，可以高效通过各种细胞和组织，在胞内的分子伴侣和折叠酶的作用下，经过折叠、二硫键配对，恢复天然构象。而且含有furin识别位点的人胰岛素原，可以在非内分泌细胞中加工成具有天然胰岛素生理活性的胰岛素，因此给药途径可以包括舌下含服、肺吸入、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等多种方式。

同时，本发明是通过原核表达转导肽-人胰岛素原融合蛋白，经蛋白纯化，不需对表达产物进行蛋白复性或胰蛋白酶和羧肽酶B处理，即可得到用于舌下含服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等方式给药的治疗糖尿病的蛋白质药物，因此相应的在生产成本及时间上有很大的优势。

【附图说明】

本说明书包括四幅附图，其中：

附图1是本发明转导肽-人胰岛素原基因的示意图；其中附图1所标记B代表B链，A代表A链，C代表C链，箭头为furin的酶切位点；

附图2是本发明pGEX-Pins表达产物的SDS PAGE电泳图；其中：1、诱导前的菌，2、3、4、5、IPTG诱导的转化菌，6、蛋白分子Marker；

附图3是本发明pBV-Pins表达产物的SDS PAGE电泳图；其中1、2、IPTG诱导的转化菌，3、诱导前的菌，4、蛋白分子Marker；

附图4是本发明pGEX-Pins和pBV-Pins表达产物的Westernblotting；其中：1、pGEX-Pins；2、pBV-Pins。

【具体实施方式】

实施例1 TAT肽-人胰岛素原基因的设计与合成

根据已知的胰岛素的A、B、C链氨基酸序列和大肠杆菌偏爱的氨基酸密码子设计人胰岛素原基因序列，并根据Furin识别的氨基酸序列进行基因突变，在胰岛素的N端添加一段TAT肽。TAT肽-人胰岛素原基因序列由上海博亚公司合成，全长369bp，SEQ ID NO.1，基因构建在pDM-18克隆载体中，基因两端分别为5’BamHI和3’EcoRI或5’EcoRI和3’BamHI的酶切位点，示意图见附图1。

实施例2 含TAT肽-人胰岛素原DNA片段的表达质粒的构建

质粒的提取、PCR、限制性内切酶反应、琼脂糖电泳、酶切片段的回收、DNA的连接和转化等方法均参照Maniatis实验手册介绍的方法略作修改进行(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis F.Molecular Cloning：Alaboratory Manual，2nded，New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。

以EcoRI和BamHI完全酶切表达载体pGEX-4T-1(PharmaciaBiotech公司)和pBV220(北京预防医学科学院构建)，回收载体片段；用EcoRI和BamHI双酶切pDM-Pins质粒得到TAT肽-人胰岛素原，回收369bp的基因片段；将pGEX-4T-1和pBV220载体酶切片段和TAT肽-人胰岛素原片段连接，构建重组表达载体pGEX-Pins和pBV-Pins。经BamH-EcoRI双酶切pGEX-Pins和pBV-Pins，产生了预期的369bp片段，同时对插入的基因进行测序，酶切鉴定与DNA序列分析结果表明，克隆到各质粒中的DNA片段序列与编码阅读框正确。

实施例3 含TAT肽-人胰岛素原DNA片段的GST融合蛋白的表达

将重组表达质粒pGEX-Pins转化大肠杆菌TG1、JM109、DH5α和BL21(DE3)(购自北京天为时代公司)。接种单菌落于LB/氨苄青霉素(100mg/L)培养液，37℃培养过夜。取上述过夜菌2％接种于新鲜的LB/氨苄青霉素培养液，37℃培养2～3h至A600为0.4～0.6，然后用0.1mmo/L IPTG 37℃诱导培养6h。取样测A600，离心收集菌体，按每份培养液(A600＝0.1)的菌体加10μl水及等体积2×SDSPAGE上样缓冲液的比例悬浮样品，煮沸5min后，取15μl通过SDSPAGE鉴定表达产物。菌体裂解液的SDS PAGE结果表明，在分子量为40kD处呈现明显的诱导表达条带(附图2)，大小分别与相应的融合表达产物的理论值相符。

收集表达菌，按每份培养液(A600＝0.1)的菌体加10ul PBS的比例悬浮后超声破菌，15000r/min(4℃)离心15min，沉淀与上清以等同体积的PBS悬浮，然后分别取适量上清液和沉淀悬浮液加入等体积的2×SDS PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取15μl上样进行SDSPAGE分析，以确定表达产物的溶解性。对表达产物的溶解性分析结果表明，融合蛋白有80％以上存在于菌体裂解液的可溶性部分。

实施例4含TAT肽-人胰岛素原DNA片段的温度诱导型融合蛋白的表达

将重组表达质粒p BV-Pins转化大肠杆菌TG1、JM109、DH5α和BL21(DE3)。接种单菌落于LB/氨苄青霉素(100mg/L)培养液，37℃培养过夜。取上述过夜菌2％接种于新鲜的LB/氨苄青霉素培养液，30℃培养3～4h至A600为0.4～0.6，然后升高温度至42℃诱导培养6h。取样测A600，离心收集菌体，按每份培养液(A600＝0.1)的菌体加10μl水及等体积2X SDS PAGE上样缓冲液的比例悬浮样品，煮沸5min后，取15μl通过SDS PAGE鉴定表达产物。菌体裂解液的SDS PAGE结果表明，在分子量为13kD处呈现明显的诱导表达条带(附图3)，大小分别与相应的融合表达产物的理论值相符，密度扫描揭示约占细菌总蛋白的24％。

在42℃温度的诱导下，pBV-Pins转化菌的表达产物为PTD的融合蛋白，该蛋白全长147个氨基酸，推测分子量约为13kD，收集表达菌，按每份培养液(A600＝0.1)的菌体加10μl PBS的比例悬浮后超声破菌，15000r/min(4℃)离心15min，沉淀与上清以等同体积的PBS悬浮，然后分别取适量上清液和沉淀悬浮液加入等体积的2×SDS PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取15μl上样进行SDS PAGE分析，以确定表达产物的溶解性。对表达产物的溶解性分析结果表明，表达产物以包含体形式存在于细菌中。

实施例5表达产物的免疫印迹鉴定

pGEX-Pins和pBV-Pins的表达产物经12％的SDS PAGE电泳后，用半干式电转仪将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，再通过与HRP标记的抗胰岛素抗体的反应，二氨基联苯胺(DAB)显色即可分析表达产物的抗原性。

免疫印迹分析表明它们能与抗胰岛素抗体产生特异性反应(附图4)。

实施例6 pGEX-Pins表达产物的纯化

pGEX-Pins表达的融合蛋白分子中含有谷胱甘肽硫转移酶(GST)，将由100ml含质粒pGEX-Pins的表达菌培养液离心，得到的菌体悬浮于5ml含10mg/L PMSF和1％Triton X-100的PBS(pH 7.4)中，超声破菌，15000r/min(4℃)离心20min，上清上预先用PBS平衡的谷胱甘肽Separose 4B柱(1ml)，以PBS洗去杂蛋白后，用凝血酶酶切处理，用5ml洗脱液(50mmol/L Tris HCl，pH8.0)洗脱切下的TAT肽-人胰岛素原。

实施例7 pBV-Pins表达产物的纯化

取100ml含质粒pBV-Pins的表达菌培养液离心，得到的菌体悬浮于5ml含10mg/L PMSF和1％ Triton X-100的PBS(pH7.4)中，超声破菌，15000r/min(4℃)离心20min，表达菌经超声裂解获得包含体，以PBSU溶液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，0.5mol/LNaCl，8mol/L尿素)溶解包含体后，进行Separose G-50凝胶层析纯化。

实施例8表达产物的抗原活性测定

根据同时测定胰岛素标准品所建立的公式：

Y＝15369.5-2854.5×lnX(r＝-0.97)

其中Y代表CPM(countper minute)，X代表样本浓度(μIU/ml)，r为相关系数。按样本1∶1稀释时的CPM值计算胰岛素的抗原活性。

放射免疫测定表明，纯化的融合蛋白呈现胰岛素抗原活性。

                             序列表

<110>北京日出东方科技发展责任有限公司

<120>转导肽-人胰岛素原融合蛋白的表达与应用

<160>2

<210>1

<211>369

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ATGTACGGTC GTAAAAAGCG TCGCCAGCGT CGTCGCATGG CTCTGTGGAT GCGCCTCCTG 60

CCGCTGCTGG CGCTTCTGGC TCTCTGGGGC CCAGACCCAG CTGCAGCCTT CGTTAACCAG 120

CACCTGTGCG GCTCTCACCT GGTTGAAGCT CTCTACCTGG TTTGCGGTGA ACGTGGCTTC 180

TTCTACACTC CGAAAACCCG CCGTAAACGT GAGGACCTGC AGGTGGGTCA GGTTGAACTG 240

GGTGGCGGTC CGGGTGCTGG CAGCCTGCAG CCGCTGGCTC TGGAAGGCTC CCGTCGTAAA 300

CGTGGTATCG TTGAACAGTG CTGTACCTCT ATCTGCTCCC TGTACCAGCT GGAGAACTAC 360

TGCAACTGA 369

<210>2

<211>127

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

M Y G R K K R R Q R R R M A L

        5         10        15

W M R L L P L L A L L A L W G

       20         25        30

P D P A A A F V N Q H L C G S

       35         40        45

H L V E A LY L V C G E R G F

       50         55        60

F Y T P K T R R K R E D L Q V

       65         70        75

G Q V E L G G G P G A G S L Q

       80         85        90

P LA L E G S R R K R G I V E

       95        100       105

Q C C T S I C S L Y Q L E N Y

      110        120       125

C N

 127

Claims (9)

1.一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白的多核苷酸，其选自下列组的序列：

(a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)以上序列的完全互补序列。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述的人胰岛素原基因序列是根据大肠杆菌偏爱密码子设计并化学合成的序列。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述的转导肽序列为人免疫缺陷病毒基因编码的反式激活蛋白TAT的PTD序列。

4.一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白，其选自下列组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；

(b)权利要求1的多核苷酸编码的氨基酸序列。

5.一种转导肽-人胰岛素原融合蛋白表达载体，其特征在于含有可操作地与表达控制序列连接的权利要求1所述的多核苷酸。

6.一种如权利要求4所述的转导肽-人胰岛素原融合蛋白的表达及分泌方法，其特征在于由以下步骤实现：

(a)转导肽-人胰岛素原基因的设计与合成；

(b)含转导肽-人胰岛素原DNA片段的表达质粒的构建；

(c)含转导肽-人胰岛素原DNA片段的融合蛋白的表达。

7.根据权利要求6所述的方法，它采用GST融合蛋白、His融合蛋白或温度诱导型融合蛋白的方式表达。

8.权利要求5所述的表达载体转化的大肠杆菌细胞。

9.如权利要求4所述的转导肽-人胰岛素原融合蛋白在制备用于降血糖的非注射给药途径的制剂的应用。

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