CN105884901B - 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白 - Google Patents
具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供能显著降低血液中的血糖含量并具持续作用的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的新分子药物结构：rGLP‑12/HSA/GLP‑12。特别是，本发明还提供了利用基因工程技术构建酵母工程菌来表达生产这种重组融合蛋白。该等重组融合蛋白的发明提供了，1)可降低血液中血糖的含量，减体重和用于糖尿病和心血管疾病的治疗；2)可在体内外大大延长胰高糖素类肽的寿命，以达到其在血液中的最大稳定性和可持续作用于血糖控制的长效功能；和3)可利用酵母菌达到低成本规模化生产和制备工艺和技术。
Description
技术领域
本发明是中国专利ZL02142881.6、ZL200410042814.8和ZL200710057571.9的继续申请。本发明涉及基因重组及表达的人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，并涉及单一融合蛋白或不同融合蛋白组合使用的方法。特别涉及利用酵母菌表达生产由人血清白蛋白与胰高糖素类肽形成不同分子结构的重组融合蛋白，作用于2型糖尿病患者高血糖症状的控制，减轻体重的制剂以及心血管疾病的预防和治疗并具持续作用的长效药用功能。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330451、EP361991和于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7中公开。
白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14-20天。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，还可以较高的药物剂量使用，大大减少给药频率，在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果。该项蛋白药物长效化技术平台，新药物分子结构和基因工程生产酵母工程菌菌种和脊椎动物细胞表达株的构建分别在于在林、富岩中国授权发明专利ZL02142881.6、ZL200410042814.8和ZL200710057571.9中获得公开；新长效药物的生产工艺、注射用制 剂配方、口服用制剂配方和生产工艺，已经在富岩、于在林中国授权发明专利ZL200410057313.7、ZL200810089645.1、ZL200910210379.8和中国发明专利申请公布号CN103520706A中分别获得公开，在此引为参考文献。
血糖是当人体血液中的糖含量维持高水平而不能被正常代谢掉，产生的血糖高现象，称为高血糖症，是2型糖尿病患者的典型症状。为控制高血糖，患者为此需要终身用药。就糖尿病病理机制开展的研究发现当葡萄糖经口服后，对胰岛素分泌的促进作用明显高于静脉注射葡萄糖，这种额外的效应被称为“肠促胰素效应”，而后科学家进一步研究证实，这种“肠促胰素效应”所产生的胰岛素占进食后胰岛素总量的50％以上。而2型糖尿病患者口服葡萄糖后，这种肠促胰素作用大大减退。这提示，肠促胰素系统异常可能是2型糖尿病的发病机制之一。研究确认肠促胰素是人体内一种肠源性激素，在进食后，该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。该肠促胰素实际就是由人内源胰高糖素类肽(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)组成，其中GLP-1在2型糖尿病的发生发展中起着更为重要的作用。
GLP-1由胰高血糖素原基因表达，在胰岛α细胞中，胰高血糖素原基因的主要表达产物是胰高血糖素肽。而在肠黏膜的L细胞中，前激素转换酶(PC1)将胰高血糖素原剪切为其羧基端的肽链序列，即GLP-1。GLP-1有2种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)，这两者仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80％的生物活性来自GLP-1(7-36)。GLP-1还具有保护β细胞的作用，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。此外，GLP-1还可作用于胰岛α细胞，强烈地促进胰高血糖素的释放，并作用于胰岛δ细胞，促进生长抑素的分泌，生长抑素又可作为旁分泌激素参与促进胰高血糖素的分泌。研究证明，GLP-1可通过多种机制明显地改善2型糖尿病动物模型或患者的血糖情况，其中促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量的作用尤为显著，这为2型糖尿病的治疗提供了一个非常好的前景。
GLP-1具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用作为一种肠源性激素，GLP-1是在营养物质特别是碳水化合物的刺激下才释放入血的，其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性，Nauck等对10例血糖控制不佳的2型糖尿病患者进行了研究，并在空腹状态下分别给予患者GLP-1或安慰剂，结果显示，患者在输注GLP-1后，其胰岛素和C肽水平显著增加，胰高血糖素水平显著降低，空腹血糖水平在4小时后变为正常。在血糖水 平正常后，虽然仍持续输注GLP-1，患者的胰岛素水平却不会再升高，血糖水平也维持稳定，不再进一步下降。这说明GLP-1具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用，即只有在血糖水平升高的情况下，GLP-1才发挥降糖作用，而在血糖水平正常时，则不会使其进一步降低。GLP-1的这种葡萄糖浓度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障，从而免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。
研究表明GLP-1具有减轻体重的功效。20例2型糖尿病患者在参与研究，接受GLP-1治疗6周后，体重平均减轻了1.9kg。研究者认为，GLP-1是通过多种途径产生降低体重的作用，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空。此外，GLP-1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)，从而使人体产生饱胀感和食欲下降。除此之外，GLP-1还具有许多其他生物学特性及功能，例如，GLP-1可能发挥降脂、降压作用，从而对心血管系统产生保护作用；它还可通过作用于中枢增强学习和记忆功能，保护神经。GLP-1来源于回肠和中枢神经系统的胰高糖素原，它通过刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌和胰岛素生物合成、胰岛增殖、再生和抗凋亡作用以及抑制胰高糖素分泌而控制血糖水平。GLP-1还抑制上消化道运动。
高血糖可引起微血管病变，使患者的微循环有不同程度的异常。随着病程的延长和治疗不及时会促使微血管病变的加重和发展，使患者致盲、致残。微血管病变主要表现在视网膜、肾、心肌、神经组织及足趾，使患者身受病痛折磨。
然而，要将GLP-1应用于临床也面临着问题，那就是人体自身产生的GLP-1极易被体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)的降解，其血浆半衰期不足2分钟，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效，这大大限制了GLP-1的临床应用。为解决这一难题，学者们已经提出两种方案，一是开发GLP-1类似物，让其既保有GLP-1的功效，又能抵抗血液中生物酶的降解，并由此形成一些每天给药的GLP-1类似的药物；串联的GLP-1也可以延长GLP-1的血液半衰期。二是开发小分子DPP-IV抑制剂化合物，使体内自身分泌的GLP-1不被降解。目前，这两方面研究都已经取得了一定的进展。
利拉鲁肽(Liraglutide)由诺和诺德制药集团公司研发，作为一种新型长效GLP-1类似物，与人GLP-1具有97％的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能促进胰岛β细胞增生和分化，明显保护并改善胰岛β细胞功能。与人GLP-1分子结构相比有两处差别，首先氨基酸肽链中C16脂肪酸链在第26位上通过谷氨酸连接到赖氨酸上。其次，在第34位上的赖氨酸被精氨酸所替代，以确保C16侧链只能结合在第26位 上。脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血夜中与白蛋白可逆性地结合，使利拉鲁肽的作用时间延长，且增强对DPP-4酶降解的抵抗，脂肪酸侧链还可以使利拉鲁肽分子在注射部位自交联成七聚体，从而延缓其自皮下吸引，使其作用时间可长达接近24小时，每天注射一次并且可在任意时间注射，与进餐无关。同时利拉鲁肽应用简单方便，1天1次即可提供24h血糖控制，且低血糖发生风险小，成为了治疗2型糖尿病的新型药物。追求长效和高效的GLP-1多肽治疗药物是研究者的方向。
本发明人使用发明人具有发明专利权的重组人血清白蛋白融合蛋白技术在完成将人粒细胞刺激因子、白介素、干扰素α2a、干扰素α2b、促红素、HGH等20余个治疗用蛋白质多肽直接连接到人血清白蛋白氨基酸肽链的C端后，又将2个GLP-1多肽(7-36)串联后直接连接到人血清白蛋白的C-端肽链，以及将2个GLP-1多肽(7-36)串联后直接连接到人血清白蛋白的N-端肽链，然后分别在毕赤酵母菌中表达，获得了在高给药剂量下，可达到1周给药1次的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白。GLP-1的氨基酸序列是未发生氨基酸替换的天然序列。
其后，美国人类基因组学公司(HGSI)公开了其所研发的Albugon，后称Albiglutide也是将2个人GLP-1蛋白质的第7-36个氨基酸肽链串联，但其中的第8位氨基酸Ala，因为是与第7位His-Ala连接是DPP-IV酶切的喜好位点，因此，就将第8位的Ala变更为Gly(第34位则与诺和诺德的利拉鲁肽修改K为R氨基酸不同，仍然维持天然的氨基酸K)后直接连接和融合在N端人血清白蛋白，进一步在S.ceravinia酵母菌中表达得到重组人胰高糖素类肽2/血清白蛋白融合蛋白。随后该新药由英国GSK制药集团公司收购，开展和完成了临床试验I-III期研究。该新药的临床上使用剂量达50mg/针，每周给药1次，远优于诺和诺德公司市场上销售中的利拉鲁肽(每天注射给药1次)。至本发明提交日，GSK公司已经获得欧洲药监局和美国药监局批准上市销售。基于Albiglutide是2型糖尿病患者的终身用药，该融合蛋白药物的上市销售，显示出重组人血清白蛋白融合蛋白作为药物使用，特别是作为长效药临床应用，是没有免疫原性担忧问题了，仅是持续重组人血清白蛋白融合蛋白在临床上的治疗疗效是否符合临床治疗需求。高剂量GLP-1融合蛋白的使用也再次证明体内血液中过量的GLP-1不会产生低血糖现象，患者用药的安全性表现非常好。
据此，本发明是在发明人已经完成的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽2融合蛋白(2个GLP-1多肽串联后插入到人血清白蛋白氨基酸肽链的C端后所形成的融合蛋 白)和重组人胰高糖素类肽2/血清白蛋白融合蛋白(2个GLP-1多肽串联后插入到人血清白蛋白氨基酸肽链的N端，所形成的融合蛋白)的酵母菌工程菌构建和动物药效学评价工作的基础上，继续围绕着延长GLP-1多肽的血液半衰期，减少临床注射用药的剂量为研发方向，以发明人拥有的重组人血清白蛋白融合蛋白药物长效化技术平台依托，在人血清白蛋白的N端和C端同时各将2个GLP-1多肽串联后的多肽无缝连接融合，获得了一个意想不到的更为优秀的，生物活性更好的长效化胰高糖素类肽融合蛋白分子结构。该融合蛋白可以以更低药物剂量，获得更好、更长效的高血糖降低的临床要求。新发明的蛋白质分子结构，在体内外的生物活性和动物实验显示其比类似的GLP-1药物(如诺和诺德的利拉鲁肽)的每天给药，可大大延长到每7天或每14天给药一次。也比、GSK的Albiglutide的每周给药1次，给药剂量为50mg，可以达到，使用剂量在10mg左右，就可达到7天给药1次，或较高剂量给药后，可以达到14天给药1次，将为患者带来显著的益处。这个发明将可极大地有利于2型糖尿病患者的血糖控制，特别是2型糖尿病患者使用GLP-1类药物是需要终身用药的时，面临的问题(长期、点击量给药可能产生的抗体的问题)。
本发明获得了一个远优于现有技术和现有研发中的GLP-1类似物药物的分子结构和用途。本发明的研究结果还表明多种重组人血清白蛋白融合蛋白中的治疗用蛋白质(功能性)都可以使用这个技术，将2个治疗性蛋白质串联后，分别或同时融合在人血清白蛋白的两端，来获得较单一治疗用蛋白质分子与人血清白蛋白融合有更好的临床上药用治疗效果。当通过给药方式将重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白导入体内(皮下注射、静脉灌注)进入血液中，胰高糖素类肽融合蛋白可将血糖含量给予控制，可显著降低血液中的血糖含量，达到缓解和治疗2型糖尿病患者的高血糖症。
重组人血清白蛋白融合蛋白形成长效重组蛋白药物的技术是发明人的平台专利技术。它是将传统治疗性蛋白质的基因与人血清白蛋白基因利用基因工程技术，将其相连、重组，白蛋白修饰，并在酵母菌内表达生产，从而获得长效重组蛋白基因药物。于在林自1993年起就开始对这一系统进行研究，并形成了多项研究结果。本专利技术表达重组蛋白药物由于不含有外源连接蛋白(Linker)，而可直接作为临床治疗用药，而不产生抗体反应，在已有的动物试验和临床试验(数千人次)中证明了这一点。这是一个具有自主知识产权的新长效蛋白质药物研发技术平台。新药物分子结构发明专利ZL021428816《对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组 融合蛋白》(人主要各种血细胞刺激因子、生长激素、生长因子、白介素等)、ZL2004100428148《长效的人干扰素类似物》(已知干扰素种类)、和ZL200710057571.9《对多种皮肤细胞修复具长效性的人血清白蛋白重组融合蛋白》(重要的各种皮肤细胞生长因子)等已分别获得中国和美国发明专利(US7,244,833、US7,442,371、US7,572,437、US8,084,021和US8,603,973)的正式授权。
发明内容
发明者通过研究和多次反复试验，在发明人已经完成的治疗用蛋白质基因无缝连接在人血清白蛋白基因的C端，形成多种长效化的治疗用重组人血清白蛋白融合蛋白的基础发明后(包括重组人血清白蛋白与人血细胞刺激生成因子、人生长因子、生长激素、皮肤细胞生长因子、GLP-1融合蛋白等)，又完成构建在人血清白蛋白基因N端无缝连接治疗用蛋白质基因，构建长效化重组人血清白蛋白融合蛋白(人干扰素、人GLP-1)，其是与美国HGSI的Albugon(Albiglutide)，重组人胰高糖素类肽2/人血清白蛋白融合蛋白(rGLP-12/HSA)的分子结构完全相同的基础上，进一步研发和动物实验完成本发明，首次新构建了在人血清白蛋白的N端和C端同时含有治疗用蛋白质药物分子。由4个GLP-1多肽和人血清白蛋白形成的1个新的胰高糖素类肽融合蛋白新药物分子结构，并获得意想不到的药物作用新功能。这个新一代的GLP-1类似物新药分子结构的特点是，在人血清白蛋白基因的N端和C端分别各有由2个GLP-1多肽基因正向串联在一起形成融合基因。由此完成的融合蛋白新基因，经分子克隆技术插入到毕赤酵母菌的基因组序列中，由此构建了能表达重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP12)的毕赤酵母基因工程菌。该酵母工程菌经大规模高密度发酵验证可稳定持续地表达生产该等融合蛋白。经规模化发酵，重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白分泌到无机盐培养基中，经发明人研发的技术分离纯化技术获得符合制药要求的原料药(原液)。初步纯化的原料药在动物的体内实验证明了含有4个GLP-1多肽的重组人血清白蛋白多肽融合后，这个自然界中没有，一个全新人工发明的融合蛋白分子结构，可显著显示降低动物体内血液中的血糖含量，并比仅在人血清白蛋白的C端或N端含有2个GLP-1多肽串联的重组人血清白蛋白融合蛋白的生物活性要有显著增强和更长的血液半衰期，可望达到每7-14天给药1次，维持体内稳定的血糖浓度。实验还发现该新分子结构融合蛋白具有与比治疗性蛋白单体更强的摩尔生物活性。而更适用于临床上用于2型糖尿病患者疾病的治疗或为单纯减肥目要求目的用途，由此完成了本发明。
本发明所涉及的人胰高糖素类肽(GLP-1)，包括但不局限于，GLP-1(氨基酸序列7-36)、GLP-1(氨基酸序列7-37)、单分子GLP-1试验显示不如双分子GLP-1串联后稳定和也不影响与GLP-1特异受体结合的能力。同时，GLP-1蛋白质多肽中的氨基酸替换，发生此等氨基酸替换的也可达到为了增强GLP-1生物活性、为了延长其在血液半衰期、为了增强GLP-1多肽与细胞GLP-1受体结合强度的目的。发生氨基酸修饰或改变所形成的各种GLP-1分子结构，通称为“GLP-1类似物”，均可以与人血清白蛋白形成融合蛋白。下面就GLP-1类似物的特性分别简述如下：
1、人胰高糖素类肽(GLP-1)：GLP-1是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，其生理能有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。完整的全长氨基酸序列的GLP-1不适合用作开展各种研究工作和获得临床药物，而其N端的7-36氨基酸是GLP-1生物活性部分。因此，药物研发确定集中在这30个氨基酸序列。
2、人胰高糖素类肽(GLP-1)类似物：在GLP-1蛋白质的氨基酸全长肽链中，仅氨基酸第7-36或7-37氨基酸肽链区域才具有控制人体血糖的调节作用。因此这个区间的氨基酸短肽链被用于开发和形成多种药用产品。可形成药用的GLP-1的7-37片段，称为GLP-1类似物。同时该区域的氨基酸肽链是可以根据不同临床药用目的来设计个别氨基酸的替换、删除和增加，或者个别氨基酸可与不同的化合物连接，达到不同的药物设计目的。特别是研究表明GLP-1多肽中的第8位氨基酸由Gly来替换Ala时，这样的GLP-1类似物与人体细胞上的GLP-1受体结合效果最好，由此形成了以后多种GLP-1类似物的原型药物分子结构的氨基酸序列。初期形成的药物有百时美施贵宝和阿斯利康的百泌达(艾塞那肽)和Bydureon(艾塞那肽)，以及赛诺菲的Lyxumia(利西拉肽)，都是每天给药或需要静脉滴注给药来达到治疗目的。半衰期一般2min-4小时不等。其后诺和诺德开发成功了利拉鲁肽就是与人GLP-1分子结构(7-36)相比有两处差别，首先氨基酸肽链中C16脂肪酸链在第26位上通过谷氨酸连接到赖氨酸K上。其次，在第34位上的赖氨酸K被精氨酸R所替代，以确保C16侧链只能结合在第26位上。脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血夜中与白蛋白可逆性地结合，使利拉鲁肽的作用时间延长，且增强对DPP-4酶降解的抵抗，脂肪酸侧链还可以使利拉鲁肽分子在注射部位自交联成七聚体，从而延缓其自皮下吸引，使其作用时间可长达接近24小时。
3、GLP-1类似物融合蛋白：美国Eli Lilly(礼来)制药集团司研发的dulaglutide是2个GLP-1多肽串联后与人Fc抗体片段形成融合蛋白，目前正在开展临床试验III期研究中，该融合蛋白达到每周给药1次，除血糖获得控制外，体重也获得显著控制，而对照药甘精胰岛素组体重均有所增加。
4、人血清白蛋白C-端直接融合2个串联的GLP-1多肽所形成的融合蛋白：本发明人将2个GLP-1多肽以串联的方式直接经基因工程技术无缝连接到人血清白蛋白氨基酸肽链的C末端，而形成的重组人血清白蛋白/GLP-12融合蛋白。在这个分子结构中与发明人的其它重组人血清白蛋白融合蛋白的较高相同，人血清白蛋白的氨基酸肽链这的氨基酸没有任何改变，与天然状态完全一致，GLP-1的7-36氨基酸序列中也仅是第8个氨基酸给予替换，由Gly替换了Ala。并且将这两个GLP-1类似物直接串联。由此形成了重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽2融合蛋白。
5、人血清白蛋白N-端直接连接2个串联的GLP-1多肽，并且使用人血清白蛋白的分泌肽来分泌成熟的重组胰高糖素类肽2/白蛋白融合蛋白。这个融合蛋白的氨基酸序列与美国HGSI公司的设计Albugon，经GSK公司全资收购后改名为Albiglutide的药物分子结构完全相同。
胰高糖素类肽在人体血液中的半衰期仅有2-5分钟，不利于直接在需要中返回其生物学功能，近年来的研究均是集中于延长达到GLP-1的生物学作用功能。GLP-1的血液半衰期，或者是筛选或合成小分子化合物来特别抑制酶解GLP-1的生物酶的活性，达到使得GLP-1的血液中的半衰期获得延长提高GLP-1的稳定性。将串联的GLP-1肽链分别连接到人血清白蛋白的N端或C端都可以获得GLP-1的长效化，那么任何能获得更长效、可使用更低剂量融合蛋白，而达到更理想的临床治疗目的效果，是本发明的目的。
因此，本发明涉及如下几个方面：
1)重组人血清白蛋白与胰高糖素类肽融合蛋白
本发明提供一种用基因工程方法生产的人血清白蛋白(HSA)和胰高糖素类肽(GLP-1)所形成的融合蛋白，该融合蛋白是由核苷酸编码的HSA和一种GLP-1类似物的双分子、多分子肽链经串联后形成的多重复合结构，然后分别与人血清白蛋白的N端、C端或同时直接连接，连接部位设有或不设有连接肽，连接的长度可以是1-50个氨基酸，也可以是带有GLP-1重复氨基酸序列或是无缝连接形成的融合蛋白，即rGLP-11-n/HSA/GLP-11-n、或rGLP-11-n/HSA或rHSA/GLP-11-n形成的融合蛋白，n＝2至10，即2-10个GLP-1多肽的重复。根据本发明的方法，任何一种GLP-1或其变异体均可与HSA形成一种重组人血清白蛋白融合蛋白。
本发明的GLP-1可以是下列GLP-1类似物蛋白质类别中的任何一员，包括但不局限于，胰岛素、类GLP-1、希拉毒蜥Exendin-3、Exendin-4(rExendin-4)、GLP-1类似物、GLP-1天然氨基酸序列、GLP-1氨基酸序列发生变异、替换、删减、增加、等。
GLP-1可以直接以N末端与HSA的C-末端相连以构成融合蛋白，或可在HSA和GLP-1之间增加一个连接肽(Linker)，以构成融合蛋白：rHSA/L/GLP-12或GLP-12/L/HSA(L＝连接肽)。连接肽长度可为2-100，常用的是10-50个氨基酸，优选的是14-30个氨基酸。连接短肽可以使HSA和GLP-1之间有更大的变化空间并有更好的柔韧性或刚性，或因更大的变化空间使GLP-1与受体的结合更容易些。连接肽的结构可为(G4S)1-n，n可以是2-100。连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，因此，最优选的是在HSA和GLP-1之间不设有连接肽。
融合蛋白可以是分泌型的，其可与特异识别抗人血清白蛋白抗体相结合。融合蛋白也可与特异识别GLP-1的抗体相结合。
融合蛋白的分泌肽可使用人血清白蛋白的分泌肽或其自然界中存在的多肽或是人工合成的具有将融合蛋白分泌到宿主细胞外功能的多肽。
具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链编码一种HSA与人GLP-1类似物所形成的融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)，编码该融合蛋白的核苷酸链中的人血清白蛋白序列与Seq ID No.7有至少90％的序列同源性，优选的该核苷酸链与SeqID No.7有95％的序列同源性。由该核苷酸链编码的成熟肽的氨基酸序列为Seq ID No.8具有至少95％的序列同源性。编码该融合蛋白的核苷酸链中的胰高糖素类肽GLP-1序列与SeqID No.3有至少90％的序列同源性，优选的该核苷酸链与Seq ID No.3有95％的序列同源性。由该核苷酸链编码的蛋白质多肽的氨基酸序列为Seq ID No.4有至少90％的序列同源性，优选的该蛋白质氨基酸序列与Seq ID No.4有95％的序列同源性。其中编码该融合蛋白的核苷酸链中的胰高糖素类肽GLP-1序列，可以是单独的GLP-1肽链，可以是2个GLP-1肽链串联后构成双重复，可以是n个GLP-1肽链的串联重复序列，但是试验表明1个GLP-1和3个或3个以上的GLP-1串联与GLP-1受体相结合的能力都显著比2个GLP-1串联时的结合能力都要低得多。因此优选地是2个GLP-1的串联。串联后的GLP-1多肽链可以是处于人血清白蛋白的N端，也可以是处于人血清白蛋白的C端，优选地是同时在人血清白蛋白的N和C端各有1个串联的GLP-1，并且是直接连接，之间不设有连接肽(Linker)。
与上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指：例如，能编码一种rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白，并在相似的核苷酸序列之间具有至少95％的序列同源性的核苷酸。其包括核苷酸链上每百个核苷酸有5个点突变，并也是编码rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白的核苷酸序列。换句话讲，任何核苷酸链与上述编码rGLP-12/HSA/GLP-12融合 蛋白的核苷酸链具有95％的序列同源性，即，即便有多达5％的核苷酸个体可以被替换、删减或插入等，均与本发明所指的核苷酸序列相同。无论是在核苷酸序列的5’或3’端，或在两端之间的任何位点发生的突变，还是以单体或多体发生的突变均在本发明的范围内。
实践上，任何特指的核酸分子，只要具有90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性，就在本发明的保护范围内。而且由核苷酸序列编码的GLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白也可由常规已知的计算机软件，如Bestfit软件(Wisconsin)序列分析软件包来获得。Bestfit应用区域同源性比较方法(文献：Smith和Waterman，应用数学进展，2：482-489(1981)来寻找两个序列之间最佳的同源序列。当应用该软件或其它任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有95％以上的序列同源性，均视为与本发明所述的序列相同源。
GLP-1基因序列可以从不同组织来源的总RNA中用PCR扩增的方法获得，也可以用人工合成全DNA序列的方法来获得。人工合成的基因在其核苷酸编码同一氨基酸是可采用表达系统偏好、喜好的核苷酸编码序列。rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白表达重组酵母菌已保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCCNo.9645；分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris；保藏单位地址：北京中科院微生物所；保藏日期：2014年9月11日。作为本发明中的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白的代表作。
在室温或更高的温度下，HSA和GLP-1形成的融合蛋白与GLP-1单体相比，在同样条件下，具有2倍以上，优选达5倍或10倍或更优选达20倍以上的贮存期和半衰期。
本发明还涉及用白蛋白作为载体，携带治疗性的蛋白质药物，如GLP-1来来在临床上用于血糖控制、心血管、体重控制等疾病或异常的治疗或改善为目的的人，如21型糖尿病患者可用于终身用药来控制高血糖症状、心血管疾病异常患者，以及以控制体重、减轻体重为目的的人。在本发明中，rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白可以用于脊椎动物，优选地是人类，并通过不同途径，包括但不局限于涂抹、喷涂、口服、非经肠胃、腹腔膜内、静脉内、动脉内、皮下、舌下、肌内、肠内、唾液腺、鼻内、PEG化、脂质法，通过吸入、注射、阴道、眼内方法给药。rGLP-12/HSA/GLP-12也可通过局部性释放(如导管或Stent)，包括皮下、脂肪下、关节下及膜内，并可以做成缓释剂。具体地，融合蛋白可通过注射、灌注、口服、涂抹、喷涂给药。
本发明涉及将一个白蛋白分子或其变种或片段与2个GLP-1分子或其变种或片段通过基因工程融合在一起，所形成的融合蛋白较未经融合的GLP-1延长了半衰期。为方便起见，本发明只提及人血清白蛋白(HSA)和GLP-1形成的融合蛋白，但GLP-1的结构类 似物均包括在本发明的范围内。优选地，在1个GLP-1或其变种或片段的C-末端部分与另1个GLP-1的N端连接，然后与HSA或其变种的成熟多肽的N端直接连接融合或与HSA或其变种的成熟多肽的C-末端部分直接连接形成融合蛋白。在融合蛋白与受体结合时所有负效应达最小化。同样具有信号传导、受体结合作用的由GLP-1功能相似、结构相似的GLP-1类似物形成的融合蛋白均包括在本发明中。
本发明中的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白或由其作为原料药(原液)经制剂配方获得的成品均可通过传统方法，包括非经胃肠道(如皮下或肌肉)注射或静脉输注的方式给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。本发明中的融合蛋白rGLP-12/HSA/GLP-12可单独使用，而优选地，可与一种或多种可接受的药物，如甘精胰岛素、赖脯胰岛素或另一种rHSA/GLP-12或HSA或多种rGLP-12/HSA一起成药物制剂的形式使用。所述载体特别是另一种药物必需是相互兼容的且对受体自身不产生有害影响的载体。“可接受的”典型的载体为水和盐水，其应是无菌、无热原也无额外免疫原性的。不同融合蛋白之间，当具有相容性、协同增效性或仅起协助制剂作用时，也可考虑共同使用。
本发明公开的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白可以制剂形式或单元剂量的便捷方式给药，也可经由任何药学领域已知和认可的方法制备，该方法包括将rGLP-12/HSA/GLP-12与具有一种或多种辅助成份的载体、医用辅料结合到一起的步骤。概括地讲，将活性成分和液相载体或组合固相载体、助剂或其它试剂均匀地结合而制备制剂，然后根据需要，将产品成型。
适合于非经胃肠道途径使用的rGLP-12/HSA/GLP-12制剂包含水相或不含水相的无菌注射液，可含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和助溶剂、或增加药物渗透性与平衡剂。含水或不含水的无菌悬浮液包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可贮存于单元剂量或多元剂量的容器中，如密封的安瓿瓶中和小管中，在冰干(冻干法)条件下贮存。使用前加入无菌液态载体，如注射用水，制成临时性注射液和悬浮液。
将rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白送入动物体内后，与rGLP-12/HSA或rHSA/GLP-12相比，rGLP-12/HSA/GLP-12在血液中的半衰期具有长约2倍，优选地是长约4倍，更优选地为长约6倍，再更优选为长约10倍的半衰期。本发明的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白可以与由自然界分离的或重组型的人血清白蛋白共同使用。优选与重组的人血清白蛋白组成具有疗效的剂量和比率。
将rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白送入动物体内后，与rGLP-12/HSA或rHSA/GLP-12相 比，rGLP-12/HSA/GLP-12在获得相同血糖控制作用的给药剂量上具有减少用药剂量的2倍，优选地是减少用药剂量的4倍，更优选地减少用药剂量的6倍，再更优选地减少用药剂量的10倍。
人血清白蛋白的N端和C端同时与GLP-12融合后(rGLP-12/HSA/GLP-12)，构建和表达的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白中的治疗性蛋白质GLP-1要有长的血液半衰期，与Fc抗体片段形成的GLP-1融合蛋白相比，与rHSA/GLP-12融合蛋白或rGLP-12/HSA的单末端融合所形成的融合蛋白相比，也可以显著地以较少的用药剂量获得在血液中，在受体作用部位上可较长的停留时间。较长半衰期也可达到减少药物的使用剂量和使用次数。在制成的产品时贮存条件和运输的要求降低，也可以降低成本。
本发明获得的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白具有与胰高糖素类肽(GLP-1)相同的生物功能，具有这种生物功能是指融合蛋白可在体内与GLP-1受体结合和活化GLP-1受体，并产生生物反应，这种生物反应包括但不局限于刺激机体相关细胞分泌胰岛素、抑制胰高血糖、降低甘油三脂的水平(含量)、增加外周组织对葡萄糖的利用、抑制食欲、抑制生物在胃肠道中的吸收、诱导饱腹感、减轻体重、抑制胰岛细胞凋亡、诱导胰β(bata)细胞增值以及增强胰β细胞的分化，融合蛋白具有长效性。这是本发明的医用和应用价值。
2)用于rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白表达的宿主系统
本发明中的rGLP-12/HSA/GLP-12核苷酸可利用重组克隆技术引入宿主细胞，以使融合蛋白得以表达。一般来说，宿主细胞经遗传工程(转导或转化或转染)方法将携带有本发明中所提到的各种可能组合的rGLP-12/HSA/GLP-12载体质粒以侵入方式、病毒感染“噬菌体”等形式转入宿主系统中。工程宿主细胞可以在含常规营养物的培养基中培养，并经过适当修改以利于启动子。以适当的操作方式控制选择转化子或扩增编码rGLP-12/HSA/GLP-12的核苷酸链的培养条件，如温度，pH和选择表达细胞。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白的核苷酸。重组载体可以是一个表达载体，可在宿主细胞内由携带的核苷酸编码来表达融合蛋白。形式可为，但不局限于，rGLP-12/HSA/GLP-12、rGLP-12/HSA、rHSA/GLP-12或rGLP-12/L/HSA、rHSA/L/GLP-12(L＝连接肽)。宿主生物体及体细胞包括，但不局限于，脊椎动物(如人、猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等。
编码rGLP-12/HSA/GLP-12的核苷酸是在适当的启动子作用下表达rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白。可利用的适合启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子， 如腺病毒主要的后期启动子；或异源启动子，如CMV启动子和RSV启动子；诱导型启动子可有MMT启动子、热刺激启动子、白蛋白启动子、ApoAI启动子和人球蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶脱氧核苷酶启动子则有疱疹病毒胸腺激酶启动子；反转录病毒LTR启动子包括经修饰后的LTR启动子；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子。也可用天然启动子来控制核苷酸编码表达HSA/GF融合蛋白。
根据本发明，重组细胞具有表达编码rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白核酸序列的能力。重组工程细胞可以持续地或在有或无诱导剂的存在状态下表达rGLP-12/HSA/GLP-12。重组工程细胞形式包括，但不局限于脊椎动物(即人、牛、猪、猴、鼠、兔、鱼、鸡等)昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等细胞。
优选的用于表达rGLP-12/HSA/GLP-12的酵母属宿主包括，但不局限于，酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕氏(赤)酵母属(Phichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉森酵母(Hancenula)、孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属(Schizosaromyces)等。更优选地，宿主系统可为毕氏酵母属巴斯德菌种。具体地讲重组载体质粒可为pPICZ-A、B或C。
根据选用不同的宿主来表达rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白。本发明中表达的蛋白多肽可以是糖基化或非糖基化的。优选地，当在宿主系统中得到表达时，rGLP-12/HSA/GLP-12在脊椎动物细胞如中国仓鼠(CHO)中得到表达的蛋白为糖基化蛋白。当表达在毕氏酵母菌中则为非糖基化或部分糖基化的蛋白。
如上所述，在本发明中提到的白蛋白融合蛋白，优选使用基因工程技术构建来表达。获得融合蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达融合蛋白。特别是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕氏酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。
利用酵母菌表达rGLP-12/HSA/GLP-12的优势在于，酵母菌体系可以产生高质量成熟的融合蛋白，并可以分泌到培养液中而便于纯化。
酵母菌遗传工程的进展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量、蛋白质为可溶性的、正确的折迭和易于大规模生产和纯化。
经由白蛋白天然信号肽，rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白可分泌到酵母菌培养液中。rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白的多肽可由信号肽主导并通过分泌途径而得到加工。白蛋白的前导肽序列可用在酵母菌中，使融合蛋白分泌到酵母菌外。其它分泌肽，如天然的酿 酒酵母的α-因子分泌信号肽，也可用于分泌本发明中的融合蛋白。
优选实例为应用巴斯德酵母菌系统来表达本发明中提及的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白。其优于利用其它表达系统。毕氏酵母菌具有许多高等真核细胞表达系统所具有的优点，例如蛋白质的加工、折迭、转录后的修饰以及如同培养细菌或酿酒酵母一样的易于大规模培养，与其它系统如杆状病毒、脊椎动物细胞培养相比更具有简捷、快速的表达，产量更高。毕氏酵母还有另外一个优势是具有10-100倍高的表达水平。这些特性使得毕氏酵母变成十分有力的蛋白表达系统。
与酿酒酵母菌相比，毕氏酵母菌在对分泌的蛋白质进行糖基化的程度上有着更大的优点。即：毕氏酵母不会有过度糖基化的现象。酿酒酵母和毕氏酵母均有N-连接糖基甘露糖的修饰。然而寡糖化物链加在表达的蛋白上，在毕氏酵母菌中只有8-14个糖基，远短于在酿酒酵母中的50-150甘露糖链。在毕氏酵母菌中连接的糖基化较少发生。酿酒酵母的核心糖基化带有α-1，3连接的末端物，而在毕氏酵母菌中则没有。研究表明由酿酒酵母产生的糖基化蛋白具有较强的抗原反应，而使得这些蛋白不适于用在特别是治疗目的上的使用。当然这也表明减少了用毕氏酵母菌来表达蛋白在糖基化上的担忧。
利用毕氏酵母做为表达系统有许多试剂盒可以使用。如Invitrogen的易选EasySelectTM毕氏酵母表达试盒。表达载体上有一个AOX1启动子可以使外源基因在毕氏酵母中利用甲醇来诱导表达。同时还有一个抗生素Zeocin抗性基因，可做为选择重组子的标记。在本发明中，表达融合蛋白启动子是非常重要的因素。
在毕氏酵母系统中，AOX1基因启动子是十分强劲的启动子。特别是在毕氏酵母菌中，在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1具有在细胞中产生合成大量的乙醇氧化酶(AOX1)的活性。AOX1基因的表达受到紧密控制并由甲醇诱导而达到极高的水平。典型地当用甲醇做为唯一碳源时，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的产物就达30％。AOX1基因已分离得到。AOX1基因启动子也用于本发明的载体质粒中用以驱动编码目的基因的外源蛋白的表达(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性，其在甲醇中的生长速度比AOX1基因慢。这种缓慢的生长状态，可以分离到Mut+(AOX1)株。除了AOX1基因启动子外，酵母菌中的其它启动子也可用于驱动HSA/GF融合蛋白。这些启动子包括，但不局限于PGK1、GAPDH、Gal1、Cal10、Cyc1、PH05、TRP1、ADH1或ADH2基因启动子。
表达质粒也可同时用于细菌宿主，如大肠肝菌DH5α(Gibcol/BRL)和酵母宿主中。抗生素Zeocin、组氨酸缺陷型培养基作为选择标记已应用在本发明的各实施例中。
表达载体含有编码HSA或HSA/GF融合蛋白的核苷酸，按Invitrogen试剂盒所描述的方法转化酵母菌。经过抗性选择出转化的酵母菌菌落。这些细胞可表达HSA/GF融合蛋白，当接种于适当的培养液中时，分析这些酵母菌表达分泌融合蛋白于培养基中的能力。蛋白质的收获可在细胞连续培养中进行。或在批量培养结束后一并收获，本发明所述的融合蛋白经培养的酵母菌表达后，以能维持蛋白活性和药效活性的蛋白提纯方法来加以分离纯化。
在此还需提及的是，其它表达系统也可用于本发明的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白的表达，包括，但不局限于，细菌、枯草杆菌(B.Subtitis)、酿酒酵母、克鲁维酵母菌属、汉森酵母、念珠菌属、孢圆酵母属、裂殖酵母属、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschumikowia)、红冬孢属(Rhodosporidium)、无色担子孢子属(Leucosporiduum)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolcus)、拟内孢霉属(Endomyucopsis)、动物、植物和昆虫细胞等。
3)rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白的分离纯化
本发明也提供了利用酵母菌来更有效地及节省费用地生产制造重组的rGLP-12/HSA/GLP-12融合蛋白。本发明也以实施例的方式提供和公开了表达这种新创造的长效GLP-1类似物融合蛋白的毕赤酵母工程菌的吨级规模化发酵工艺和融合蛋白分离纯化的方法。这种技术也可用于融合蛋白的生产和制备符合临床用药标准的3种不同药物分子结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白，药物分子结构分别为：rGLP-12/HSA、rHSA/GLP-12或/和rGLP-12/HSA/GLP-12。
附图说明
附图1.重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)在N端的人工合成带有人血清白蛋白(HSA)分泌肽直接连接串联的2个人胰高糖素类肽(GLP-12)(重复氨基酸7-36，8Gly)的DNA核苷酸序列，以及其与人血清白蛋白成熟肽的N端直接连接的正向测序结果图。图中重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白新药物分子结构GLP-12/HSA/GLP-12的基因5’端(氨基酸序列N端的基因DNA序列)测序结果图。该端DNA序列包括了人血清白蛋白分泌肽(Nt63-134)直接与串联的2个GLP-1基因序列(Nt135-314)连接后再与人血清白蛋白成熟肽的N端(Nt315-)直接连接。DNA序列中以HindIII限制性内切酶(Nt57-62)为新药物分子结构基因序列克隆起始位点。
附图2.重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)在人血清白蛋白成熟肽C端直接连接串联的2个人胰高糖素类肽(GLP-12)(重复氨基酸7-36，8Gly)以及2个重复终止子密码(TGATAA)的DNA核苷酸序列的正向测序结果图。该正向DNA片段中还带有用于克隆和基因拼接用的限制性内切酶位点(HSA的C末端含有的Bsu 36I和Xho I)。
附图3.重组人血清白蛋白以及3种不同药物分子结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白结构示意图。(A)：rHSA；(B)：rGLP-12/HSA；(C)：rHSA/GLP-12；(D)：rGLP-12/HSA/GLP-12。
附图4.条带M：蛋白质标准分子量、条带A：酵母工程菌表达的重组人血清白蛋白(rHSA)，分子量～66kD；条带B：酵母工程菌表达的人血清白蛋白C端与串联的胰高糖素类肽形成的重组融合蛋白(rHSA/GLP-12)，分子量～73kD；条带C：酵母工程菌表达的人血清白蛋白N端与串联的胰高糖素类肽形成的重组融合蛋白(rGLP-12/HSA)，分子量～73kD；条带D：酵母工程菌表达的人血清白蛋白的N端和C端各有1个串联的胰高糖素类肽形成的重组融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)，分子量～79kD。
附图5.以鼠抗人血清白蛋白单克隆特异抗体(Sigma公司Cat：A6648)所做的蛋白质免疫印迹实验；条带分别对应附图4的描述。
附图6.以鼠抗人胰高糖素类肽(7-36aa)单克隆特异抗体[美国Abcam公司Cat：Anti-hGLP-1antibody[EPR4042](ab111125)]所做的蛋白质免疫印迹实验。条带分别对应附4的描述。可以确认条带A仅是人血清白蛋白，其不含有GLP-1多肽成分。
附图7.以3种不同分子结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白在相同剂量条件下对大鼠胰岛瘤细胞株，RIN-5F细胞细胞的生物活性测定值，表明各种分子结构重组胰高糖素类肽融合蛋白均具有刺激细胞生成cAMP的功能，并且在人血清白蛋白的N端和C端同时含有串联的GLP-1的分子结构融合蛋白的生物活性更高(意味着可稀释倍数更高)，显示同剂量下GLP-1的刺激产生cAMP的生物活性更高。
附图8.重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白影响鼠血糖浓度的测定结果图。图中的A：rHSA阴性对照组；B：注射给药rGLP-12/HSA(N端连接串联的GLP-1)；C：注射给药rHSA/GLP-12(C端连接串联的GLP-1)；D：注射给药rGLP-12/HSA/GLP-12组(人血清白蛋白的两端均连接串联的GLP-1)。
附图9.各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白经皮下注射后在动物血浆中药代动力学分析和半衰期计算结果。
附图10.各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白融合蛋白减肥效果比较。
附图11.各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白在鼠体内诱导胰岛素生成的考察结果。
具体实施方式
实施例1：分子克隆技术简述
常规分子克隆技术包括DNA、RNA的提取，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA片段的连接，限制性内切酶酶切反应均参照文献(Maniatis，et al.，“分子克隆实验手册”冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1982)。质粒DNA的纯化，DNA片段的回收等均采用商品纯化柱制备。DNA聚合酶链反应(PCR)(参照文献Saikiet al.，科学，230：1350，1985)所用的酶及反应所需的PCR仪均为Perkin Elmer产品。并参照厂家操作程序。DNA测序和DNA扩增所需用的寡聚核苷酸引物由专门机构完成。转受态大肠杆菌由GIBCO/BRL公司购得。本发明所使用的酵母菌菌种X33和pPICZ-A酵母菌克隆载体质粒均购自Invitrogen公司。重组酵母菌克隆载体DNA转化酵母菌是由电脉冲方式进行，并参照厂家(Bio-Rad)的操作程序。
实施例2：人血清白蛋白(HSA)基因表达及载体质粒的构建
使用发明人在其发明专利ZL02142881.6、ZL200410042814.8和ZL200410057313.7中所描述的HSA克隆方法和试验结果。GenBank检索编号AY728024的HSA序列，用于本发明中的HSA基因序列与细胞生长因子基因序列发生基因重组融合蛋白的。使用AY728024序列编码HSA，可使得融合蛋白获得在酵母菌中的意想不到的高效表达。表达质粒(见中国专利ZL02142881.6)也可用于本发明的实施例中。pYZ-HSA的重组人血清白蛋白表达载体质粒DNA结构也在中国发明专利ZL02142881.6图2中公开，并用于构建本发明公开的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的各种分子结构表达载体基础质粒。本发明使用的人血清白蛋白核苷酸序列为Seq No.1，其分泌肽和成熟肽的完整氨基酸序列为Seq No.2。
实施例3：人GLP-1串联双基因片段的合成和重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽2融合蛋白表达载体质粒的构建
发明人先以GLP-1野生型氨基酸序列7-36肽段为标准合成GLP-1基因序列，并与人血清白蛋白基因融合，获得各种GLP-1融合蛋白开展了生物活性验证。其后又以美国HGSI的Albugon中的GLP-1类似物氨基酸序列为标准，采用DNA序列全合成法来人工合成人GLP-1(7-36，Ala8Gly)双重复序列为Seq No.3，对应的氨基酸序列为Seq No.4。将合 成的GLP-12的N端设有Bsu36I内切酶位点达到无缝连接与人血清白蛋白的C端点直接连接：
Seq No.3：
5’-GCTTA-CATGGTGAAGGTACTTTTACTTCAGATGTTTCTTCTTACTTGGAAGGTCAAG CTGCTAAGGAATTTATTGCTTGGTTGGTTAAGGGTAGACACGGAGAGGGCACCTTCACAAGCGACGTCTCCTCGTA TCTTGAGGGCCAGGCCGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTCGTGAAAGGACGTTGATAA
5’端序列是人血清白蛋白C末端核苷酸序列编码最后4个氨基酸。下划线为GLP-1(7-36，Gly8)双重复核苷酸序列。发明人特意设计了双终止子TGA/TAA。同时5’端置有Bsu36I、3’端置有XhoI和EcoRI限制性内切酶克隆用位点(以点下划线示之)。则，串联GLP-1双重复氨基酸序列列在Seq No.4：
ALGL-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-。
如此，我们将该片段直接基因融合到人血清白蛋白的C末端(ALGL-)，而形成了重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽2融合蛋白(rHsA/GLP-12)。
实施例4：重组人胰高糖素类肽2/白蛋白融合蛋白(rGLP-12/HsA)表达载体质粒的构建
为了将GLP-12连接在HSA的N端，构建发明人进一步合成了含有人血清白蛋白分泌肽直接连接GLP-1双重复的氨基酸序列(人血清白蛋白分泌肽核苷酸序列以黑体字示之)和人GLP-1双重复DNA序列直接连接(以下划点状线视之；重复序列以下划双线示之)，人工合成完整全DNA序列。为克隆和亚克隆基因工程编辑方便，在人工合成的人血清白蛋白氨基酸序列中含有的内切酶位点，在5’端设计了Hind III(下划线，克隆用位点)，3’端则采用人血清白蛋白DNA序列中原有的AleI(下划线)，组成人工合成DNA序列的一部分。限制性内切酶的识别位点DNA序列和人工合成全序列如下：
Seq No.5：
5′-CATAAGCTT TGCACACAAGAGTGAGGTTGC-3′
Seq No.6：
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR DAHKSEV
下划点线前是人血清白蛋白的分泌肽的氨基酸序列，单下划点线为第一个GLP-1多肽氨基酸序列，双下划线则是第2个GLP-1多肽的氨基酸序列，其C端与人血清白蛋白成熟肽的N端-DAHKSEV直接连接。
人工合成该DNA片段的方法为常规的基因克隆技术，人工分段合成DNA核苷酸链，然后相互组合加PCR方法，合成长链DNA片段的路线和方法已经在本发明人的ZL200710057571.9中的图1所公开。最终的PCR的产物经扩增后克隆入pBlue载体质粒中，经DNA双向序列测定和分析，证明其DNA序列与设计的DNA理论序列相同(附图1)。
借助pBlue载体人工合成的全DNA的PCR产物插入到TA克隆位点，其位点的左右都含有1个EcoRI限制性内切酶位点。因此，将HindIII和EcoRI双酶切后获得的DNA片段(长约320bp)插入到也经HindIII和EcoRI双酶切后的pPICZA-a载体质粒中(以a表示该质粒DNA(pPICZ-A)中原有的AleI限制性内切酶位点(位于质粒DNA的72-81nt位置)，已经预先被发明人用基因工程技术删除，这有利于后续利用人工合成的DNA序列中的AleI位点(在人血清白蛋白基因的序列上)完成HSA基因序列的克隆工作。
利用pPICZA-a-GLP-12载体上的克隆位点将人血清白蛋白的AleI-EcoRI片段连接上形成完整的rGLP-12/HSA片段。由此完成可由人血清白蛋白分泌肽分泌表达rGLP-12/HSA融合蛋白的酵母菌表达载体DNA质粒的构建。
实施例5：重组人胰高糖素类肽2/人血清白蛋白/胰高糖素类肽2融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)表达载体质粒构建
将实施例3中的Seq No.3的DNA片段(Bsu36I-XhoI)，其中含有双GLP-12序列，插入实施例4构建的rGLP-12/HSA表达载体质粒DNA中的Bsu36I和XhoI位点。同理，也可以将实施例4这的Seq No.4插入到实施例3构建的rHSA/GLP-12表达载体质粒DNA中的HindIII-AleI位点来构建表达rGLP-12/HSA/GLP-12药物分子结构的表达载体质粒。
Seq No.7：
5’-AAGCTTATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGACATGGTGAAGGTACTTTTACTTCTGATGTTTCTTCTTACTTGGAAGGTCAAGCTGCTAAGGAA TTTATTGCTTGGTTGGTTAAGGGTAGACACGGAGAGGGCACCTTCACAAGCGACGTCTCCTCGTATCTTGAGGGCC AGGCCGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTCGTGAAAGGACGTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGG AGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTACATGGTGAAGGTACTTTTACTTCAGAT GTTTCTTCTTACTTGGAAGGTCAAGCTGCTAAGGAATTTATTGCTTGGTTGGTTAAGGGTAGACACGGAGAGGGCA CCTTCACAAGCGACGTCTCCTCGTATCTTGAGGGCCAGGCCGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTCGTGAAAGGACG TTGATAACTCGAGAATTC-3′
经酵母工程菌发酵酵母菌细胞通过高尔基体加工，在人血清白蛋白的分泌肽引导下，成熟肽rGLP-12/HSA/GLP-12则分泌到培养基上清液中，此时表达的rGLP-12/HSA/GLP-12成熟肽(药物实际分子结构)的氨基酸序列则为：
rGLP-12/HSA/GLP-12的药物氨基酸分子序列则为：
Seq No.8：
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRH GEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR..
这一DNA核苷酸序列SeqNo.7和能表达这一融合蛋白(SeqNo.8)的重组毕氏酵母工程菌特意被发明人保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No.9645；分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris；保藏单位地址：北京中科院微生物所；保藏日期：2014年9月11日。作为本发明中的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)的一个代表。
附图1.和附图2.的DNA测序结果分别验证了重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)的基因序列5’端和3’端的DNA序列含有基因拼接和克隆用限制性内切酶位点，以及人血清白蛋白成熟肽序列的两端各与1个串联的GLP-12直接连接的实际状况。附图3是重组人血清白蛋白以及3种不同药物分子结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白结构示意图，(A)：rHSA；(B)：rGLP-12/HSA；(C)：rHSA/GLP-12；(D)：rGLP-12/HSA/GLP-12。
实施例6：毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将毕氏酵母菌菌株X33菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml培养基中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到OD600＝1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1M Sortbitol溶液洗涤一次。
在实例3、4和5中构建的质粒pYZ-HSA/GLP-12、pYZ-GLP-12/HSA和pYZ-GLP-12/HSA/GLP-12质粒DNA均分别经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5μg线性化后质粒DNA与80ul处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于点脉冲仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1MSorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测。不同的毕氏酵母菌菌株，如GS115，KM71以及蛋白酶缺陷型酵母菌株，如SMD1168均可用来表达和分泌重组的重组人血清白蛋白融合蛋白。
实施例7：酵母菌表达及分泌的各种GLP-1重组人血清白蛋白融合蛋白的特性
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD600＝2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5％甲醇，细胞密度达到OD600＝1.0，继续培养。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％。在不同的时间点分别收集培养上清液。使用SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白质免疫印迹法测定GLP-1融合蛋白的表达和产量。
经纯化后的3种不同分子结构的重组胰高糖素类肽融合蛋白与同样是有毕赤酵母工程菌表达，分离纯化的重组人血清白蛋白(rHSA)一同电泳显示各自的分子量差异和分子量确认。附图4中的条带M：蛋白质标准分子量、条带A：酵母工程菌表达的重组人血清白蛋白(rHSA)，分子量～66.5kD；条带B：酵母工程菌表达的人血清白蛋白C端与串联的胰高糖素类肽形成的重组融合蛋白(rHSA/GLP-12)，分子量～73kD；条带C：酵母工程菌表达的人血清白蛋白N端与串联的胰高糖素类肽形成的重组融合蛋白(rGLP-12/HSA)，分子量～73kD；条带D：酵母工程菌表达的人血清白蛋白的N端和C端各有1个串联的胰高糖素类肽形成的重组融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)，分子量～79.5kD。发明人继续就融合蛋白开展免疫原性验证。
典型的蛋白质免疫印迹实验是将变性(SDS)凝胶电泳分离的蛋白质，经电泳仪将蛋白质转移到尼龙或醋酸纤维膜上，再以特异抗体(第一抗体)识别相对应的蛋白质。然后带有荧光功能基因的第二抗体，识别并结合于第一抗体，经荧光显色整个特异性结合 的复合物，即特异蛋白质在X光片上留下印记。也可以使用Biotin标记抗体、或HRP标记抗体，在待检样品中可与特异抗体结合的抗原，被经功能基团显色或曝光方法，形成着色被检定出来。标准蛋白分子量用于决定未知蛋白的分子量。对经酵母菌表达分泌的各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白获得重组融合蛋白以抗人HSA鼠单克隆抗体(Sigma Cat：A6684)进行检测，确认含有人血清白蛋白蛋白质序列，并拥有完整具生物活性的人血清白蛋白分子结构(附图5，各对应条带标识与附图4相同)。同理，以相同的样品电泳胶转印后，以美国Abcam公司抗人GLP-1的单克隆抗体Anti-GLP1antibody[EPR4042](ab111125)所做的蛋白质免疫印迹实验表明，融合蛋白含有GLP-1与纯品hGLP-1(R&D System公司)具有相同的抗原性，并显示二者之间在免疫反应强度与分子大小上具有相同的比率。相同结果也得到证实。为此，确认所表达的各种分子结构的重组胰高糖素类肽融合蛋白电泳结果和使用人血清白蛋白特异抗体(Sigma)与人GLP-1特异抗体(Abcam)单克隆抗体，所作的Westernblot结果。在二者的分子量上，十分明显地表现出差异。HSA的分子量为66471.35D、rGLP-12/HSA和rHSA/GLP-12的分子量为73004.58D以及rGLP-12/HSA/GLP-12的分子量为79537.81D，电泳迁移率也就不同。GLP-12双串联的分子量为6533.23D，GLP-1单体分子量为3266.615D。使用相同剂量的各重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白开展免疫印迹试验是，N端和C端单个串联和同时N端、C端串联GLP-1分子时，重组融合蛋白两端都有串联的GLP-1的融合蛋白其着色度要更深些(见附图6的条带E)。
实施例8：大规模高密度表达重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白
发明人使用200L生物发酵罐系统和1000L(吨级)生物发酵罐系统开展了重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的3种不同分子结构的融合蛋白，rHSA/GLP-12、rGLP-12/HSA和rGLP-12/HSA/GLP-12的吨级规模化生产和发酵工艺以及公斤级重组人血清白蛋白融合蛋白原料药的制备工艺和技术建立。实验中表明应用毕氏酵母表达和规模化生产重组融合蛋白比起其它任何系统都要容易的多。重组株分离到后，重组蛋白表达株可有Mut+和Muts两种形式。重组酵母工程菌按发明人研发的工艺程序制备工程菌种子库、主种子库和工作种子库。取一支工作种子库接种到三角瓶中在摇床从小规模培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐(1吨体积)。经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至低限再回升时，启动甘油流加。待流加结束，溶氧在回升时，启动甲醇流加，进入诱导和融合蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。可在不同培养时间点取样测试融合蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE 方法进行分析，对表达产物的生物活性，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。结果展示不同发酵液中的3种不同分子结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白融合蛋白的表达水平均在300mg/L左右。
实施例9：分泌的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的纯化与特性
重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白经酵母工程菌发酵培养直接分泌到上清液。经连续流离心将含有分泌出的血清白蛋白融合蛋白上清液与菌体分离后，直接上美国GE公司的MMC分离填料介质，用柱层析法将目标蛋白质收集。进入下一步疏水型层析柱、离子交换层析柱的精纯阶段。最后纯化的融合蛋白原料药(原液)通过0.2uM滤膜以达无菌要求。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Lowyr法蛋白质浓度测定方法。以本发明人的注射用重组人血清白蛋白融合蛋白制剂配方和成品冻干粉针剂生产工艺的授权发明专利(ZL200910210379.8)为依托，用于生产符合临床注射用药物用于动物实验和临床治疗用途的注射用冻干粉针剂。
实施例10：重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的细胞生物活性测定试验
实验所用的细胞株是大鼠胰岛瘤细胞株，RIN-5F细胞。细胞生长和维持在含10％小牛血清、1mol/L丙酮酸钠、0.5％HEPES液的RPMI-1640培养液(pH7.2)中，在37℃、5％二氧化碳的条件下培养。取对数生长期的细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度至一定浓度。加细胞悬液于96孔培养板中。CO2培养箱培养3d。除去细胞培养上清液，加入无血清细胞培养基，继续培养2h。取供试品或参考品分别用含一定浓度的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobuty-1-methylxanthine，IBMX)和牛血清白蛋白的细胞培养液对待测样品作倍比稀释，共6个稀释度。除去细胞上清，加入稀释好的不同浓度的参考品及样品液，每个稀释度做3个复孔，同时设立总活性、非特异性、最大结合及底物空白对照。在CO2培养箱中放置5min。随后除去细胞上清，用cAMP试剂盒(cAMP Low pH试剂盒：R&D System公司生产，货号：DE035)检测。检测波长为405nm，参考波长为570nm。获得以诱导cAMP 50％的最大刺激反应的稀释倍数。活性单位定义：以能诱导cAMP 50％的最大刺激反应的稀释倍数为1个活性单位(即Au)。
附图7显示了各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白不同结构样品，对细胞的刺激生物活性。以rHSA为阴性对照，3种不同分子结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白在相同剂量条件下对大鼠胰岛瘤细胞株，RIN-5F细胞细胞的生物活性测定值，表明各种分子结构重组胰高糖素类肽融合蛋白均具有刺激细胞生成cAMP的功能， 并且在人血清白蛋白的N端和C端同时含有串联的GLP-1的分子结构融合蛋白的生物活性更高(意味着可稀释倍数更高)，显示同剂量下GLP-1的刺激产生cAMP的生物活性更高。试验显示N端或C端直接连接串联的GLP-1融合蛋白(rGLP-12/HSA或rHSA/GLP-12)的生物活性二者在数值上有着相同摩尔浓度活性。在比活与其分子量大小相一致的比例。而在N端和C端同时分别直接连接串联的GLP-1时，同等剂量的融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)则具有高约1倍的生物活性。这一结果与药物分子结构中的GLP-1含量相吻合。生物活性测定表明分离纯化工艺稳定，获得的产品质量可控。
实施例11：重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白降血糖的生物学功能
糖尿病模型鼠BSKdb/db的第一个表征是高血糖，为健康鼠血糖水平的2-4倍；第二个表征为肥胖，体重超出正常鼠体重标准值的2-4倍。在规定饲养条件下，将12只小鼠随机分为4组，每组3只。分别皮下注射各种符合注射用药物规定的供试品剂量相当于1mg/kg(平均体重约50g/只)。其中A组注射阴性对照品重组人血清白蛋白(rHSA)、B组注射给药rGLP-12/HSA、C组注射给药rHSA/GLP-12以及D组注射给药rGLP-12/HSA/GLP-12。经隐静脉采集血样约200微升，其中50微升用血糖仪来测定血糖水平，其余分离的血浆使用美国Alpco公司的GLP-1(7-36)酶联免疫试剂盒(Cat No.：43-GP1HU-E01)检测GLP-1在血液中的血药浓度用于药代动力学分析和实施例12的胰岛素诱导生成。血样采集点为(药前0h)，药后24h(1d)、48h(2d)、96h(4d)、144h(6d)、192h(8d)、240h(10d)、288h(12d)、384(16d)。血糖浓度测定结果表明除rHSA阴性对照组(A)血糖水平没有显著改变外，其余3个受试组均呈现显著改善，并可维持血糖水平控制。注射给药rGLP-12/HSA(B)和rHSA/GLP-12(C)注射给药两组的效果可维持1周，显示出它们具长效性。而注射给药rGLP-12/HSA/GLP-12组(D)则可以显著维持近2周，显示出在控制动物的血糖水平具有更好的长效性(见附图8)。
实施例12.重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的血药浓度测定(药代)
与实施例11同时开展了阴性对照组rHSA和3种不同结构的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白皮下注射后的GLP-1酶联免疫试剂盒检测其血药浓度。各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白经皮下注射后在动物血浆中药代动力学分析和半衰期计算结果显示在人血清白蛋白的C端或N端分别直接连接的融合蛋白表现相似，但给药同等剂量的在人血清白蛋白的N端和C端同时分别直接连接串联的GLP-1时，则其血药浓度(GLP-1)显著具有更高的药物含量和更长的半衰期，达90小时左右；而仅在N端和C端连接串联时半衰期也在70小时左右(见附图9)。
实施例13.重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白减轻体重的效果考察
与实施例11试验的同时开展了注射给药后鼠体重的变化。结果表明除A组(注射给予rHSA)外，其余各组的体重均显著下降达20-30％与文献报道相似，同时，D组(注射给药rGLP-12/HSA/GLP-12)则维持低体重时间较B和C组的7天要更长些达到10-16天。结果见附图10。
实施例14：重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白诱导小鼠胰岛素生成的测定
因人GLP-1也可以在小鼠中作用于小鼠GLP-1受体，诱导产生鼠胰岛素。为此与实施例11试验的同时开展了诱导体内胰岛素刺激生成的监控。使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒方法(Mercodia公司小鼠超敏胰岛素酶联免疫检测试剂盒，Cat：10-1249-10)检测胰岛素水平。以此考察阴性对照品(附图3的A)和3种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(附图3中的B、C、D)受试药与对小鼠诱导产生新的胰岛素，达到血液这胰岛素含量和水平提高作用功能。试验结果(附图11)表明各种重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白的分子结构均可显著大幅提高诱导胰岛素产生的能力。其中同剂量的重组人血清白蛋白N端、C端同时含有串联的GLP-1时，rGLP-12/HSA/GLP-12则可诱导胰岛素的产生，同时具有更长的作用时间，显示出更好的长效性。据此推断，如果GKS公司的Albiglutide(与本发明中的串联GLP-1连接在人血清白蛋白N端分子结构完全相同)可以在临床上以50mg/次/周给药，可维持1周有效，则本发明的在人血清白蛋白分子的N端、C端同时连接串联的GLP-1是具有可达到一半剂量给药或可达到每10天或14天给药一次的显著优势。
因此，在使用同样剂量时，人血清白蛋白的N端和C端同时含有串联的2个GLP-1的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白(rGLP-12/HSA/GLP-12)，可具有较长的半衰期和更稳定的血药浓度控制功能，这在临床上作为药物使用时应具有极大的应用价值。当然在临床上使用仅一半的药物剂量就可以获得与GSK公司完成临床试验III期的Albiglutide(本发明中的rGLP-12/HSA的分子结构完全相同)具相似治疗效果。当使用低剂量药物也可以获得相似临床治疗效果时，则受药患者，可显著减少药物带来的毒副反应和免疫原性，特别是本发明的产品是作为2型糖尿病患者的终身用药，低剂量长期使用就更彰显显示出本发明具有显著的成药性上优势。
Claims (7)
1.一种融合蛋白，其特征为人血清白蛋白(HSA)和人胰高糖素类肽(GLP-1)相连构成的融合蛋白；该融合蛋白中的人血清白蛋白成熟肽的N端和C端各直接连接1个串联的人胰高糖素类肽GLP-12；且该融合蛋白编码成熟肽的氨基酸序列如Seq No.8所示。
2.如权利要求1所述融合蛋白，其编码基因的核苷酸序列如Seq No.7所示。
3.如权利要求1所述融合蛋白，其是通过将含有融合蛋白核苷酸序列的表达载体经转化、转染或转导脊椎动物细胞或酵母菌宿主获得；所述的脊椎动物细胞为中国仓鼠细胞(CHO)；所述的酵母菌是酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。
4.如权利要求3所述融合蛋白，其中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母，其工程菌保藏号为CGMCC No.9645。
5.保藏号为CGMCC No.9645的工程菌。
6.一种用于糖尿病疾病治疗的制剂，其特征为含有权利要求1所述融合蛋白。
7.一种用于减轻体重为目的的制剂，其特征为含有权利要求1所述融合蛋白。
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Address after: 100026 Beijing city Chaoyang District xiaoyunli Street Xiaoyun center building block A room 1601-1602 Patentee after: BEIJING MEIFUYUAN BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee after: TIANJIN SINOBIOTECH Ltd. Patentee after: FORTUNEROCK BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Address before: 100026 Beijing city Chaoyang District xiaoyunli Street Xiaoyun center building block A room 1601-1602 Patentee before: BEIJING MEIFUYUAN BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: TIANJIN SINOBIOTECH Ltd. Patentee before: Fortunerock (China) Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20220321 Granted publication date: 20191018 |
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| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20220926 Granted publication date: 20191018 |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100026 rooms 1601-1602, block a, Xiaoyun center building, xiaoyunli South Street, Chaoyang District, Beijing Patentee after: BEIJING MEIFUYUAN BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Patentee after: TIANJIN SINOBIOTECH LTD. Patentee after: Fortune Rock (China) Co.,Ltd. Address before: 100026 rooms 1601-1602, block a, Xiaoyun center building, xiaoyunli South Street, Chaoyang District, Beijing Patentee before: BEIJING MEIFUYUAN BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Patentee before: TIANJIN SINOBIOTECH LTD. Patentee before: FORTUNEROCK BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
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