CN101367873A - 一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类胰高血糖素样肽－1(GLP－1)的改构多肽及其修饰物，具体的，该改构多肽是在胰高血糖素样肽－1的N端前面添加一个赖氨酸，所述的胰高血糖素样肽－1包括天然的GLP－1(7－36)酰胺或GLP－1(7－37)，及其部分氨基酸取代的衍生物。本发明提供的GLP－1改构多肽及其修饰物不但显示了促胰岛素分泌和降血糖作用，而且与天然的GLP－1相比，其对蛋白水解酶的稳定性和体内作用时间有明显的提高，可用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物。

Description

一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用

【技术领域】：

本发明涉及一类新颖的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其修饰物。具体地，本发明涉及GLP-1多肽的改造和修饰。这类多肽不但显示出天然GLP-1的优越生物学特性，并且与天然的GLP-1相比，其对蛋白水解酶的稳定性和体内作用时间有明显的提高，可用于糖尿病的治疗和肥胖的辅助治疗。

【背景技术】：

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是严重危害人类健康的疾病，患病人数正随着生活水平的提高、人口老龄化以及诊断技术的进步而迅速增加。糖尿病患者分为两种，即胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型糖尿病)。其中，2型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。近年的研究表明2型糖尿病的主要病理表现为胰岛素抵抗和由胰岛细胞功能失调所致的胰岛素分泌相对不足，形成持久的高血糖，并可产生多种致命性并发症。目前的药理研究和治疗方法尚不能涵盖该疾病所涉及的所有代谢性缺陷，因而许多新的药物作用靶点有待开发，如：乙酰辅酶2(ACC2)、Iκ激酶(IKK)β、DPP-IV等，用以寻找能提高胰岛素敏感性，促进糖和脂质代谢或增加葡萄糖依赖性胰岛素分泌的新药。GLP-1由于其具备的多种生理功能正是针对2型糖尿病患者中普遍存在的异常，从而引起了许多糖尿病学家的极大兴趣，成为近年来在这一领域内较受关注的研究热点。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是1983年Bell等在对胰高血糖素原(proglucagon)基因进行序列分析时发现的。人胰高血糖素样肽-1主要是由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌的一种31肽的多肽激素，分子量约为3，355KD。研究表明，GLP-1与同属肠肽激素的GIP相互协同，对营养物质的吸收和代谢起着重要的调节作用。GLP-1具有多种生理功能，主要包括以下几个方面：

1.与胰岛素分泌相关的作用

1)GLP-1的血糖依赖性刺激胰岛素分泌作用是其最重要的生理功能之一。

2)GLP-1可以调控β细胞内一些特异基因的表达。

3)GLP-1可刺激β细胞再生。

4)GLP-1能够抑制细胞因子和脂肪酸诱导的β细胞程序性死亡。

2.GLP-1能够血糖依赖性的抑制胰高血糖素分泌。

3.血浆GLP-1浓度生理性升高不仅抑制五肽胃泌素介导的和饮食促发的胃酸分泌，而且抑制胃排空和其胰腺外分泌。

4.GLP-1能够作用于中枢神经系统而抑制食欲。

5.GLP-1能增加胰岛素非依赖性的糖利用，增加外周组织对胰岛素的敏感性。

6.脂肪细胞存在GLP-1的结合位点，可刺激脂肪组织中脂肪酸的合成。通过对胃肠的抑制作用减少食物中甘油三脂(TG)的吸收，还可增加脂肪组织中脂蛋白酶的活性而增加TG的脂解作用，降低TG水平。

7.GLP-1能促进神经的增殖和分化，诱导神经突的生成，并有增强神经生长因子(NGF)的作用。

8.GLP-1还可以剂量和时间依赖性地提高胰岛素及胰岛素原与胰岛素瘤细胞和单核细胞的结合力，减少餐后胰岛素原的分泌，从而避免了与胰岛素原水平升高有关的β细胞损伤、肥胖症、2型糖尿病等疾病的发生。

目前，GLP-1在2型糖尿病治疗中的显著效果已被人们所公认。但是，其在体内很短的半衰期限制了其直接用药的可能。研究表明GLP-1在体内酶解主要是在DPP-IV和NEP24.11的作用。其中，DPP-IV是使GLP-1失活的主要蛋白酶，其作用位点是Ala₈和Glu₉之间的肽键。NEP24.11在体内可以水解芳香族氨基或者疏水性氨基酸的氨基端的肽键，在GLP-1中存在6个位点：Asp₁₅-Val₁₆，Ser₁₈-Tyr₁₉，Tyr₁₉-Leu₂₀，Glu₂₇-Phe₂₈，Phe₂₈-Ile₂₉和Trp₃₁-Leu₃₂。因此，目前多数研究组织主要围绕天然的人GLP-1分子进行改造，来设计长效GLP-1类似物。

(1)7位组氨酸的改造

将7位的组氨酸进行了N-甲基化、α-甲基化、脱氨基、咪唑乳酸取代等修饰，发现除了α-甲基化GLP-1外，其它的肽在体外很难被DPP-IV降解。对RINm5F细胞中的GLP-1R亲和力最高的是咪唑乳酸GLP-1，其次是α-甲基化GLP-1和N-甲基化GLP-1，只有脱氨基GLP-1对GLP-1R的亲和力最差，与天然GLP-1相比降低了15倍。所有这些模拟肽都能刺激细胞内cAMP生成。另外，将酰基连接到组氨酸的α-氨基基团也能使GLP-1体内的活性明显增加。

此外，His(7)-glucitol-GLP-1是另一种合成的GLP-1类似物。N-pyroglutamyl-GLP-1和N-acetyl-GLP-1是两种新的7位组氨酸改造的GLP-1类似物，虽然两者能与GLP-1R受体结合，但亲和力比天然GLP-1低。

(2)8位丙氨酸的改造

N端的Xaa-Pro和Xaa-Ala是DPP-IV的识别位点，所以人们也尝试了对GLP-1N端第二个氨基酸丙氨酸进行改造。用丝氨酸取代丙氨酸能明显增强GLP-1(7-36)酰胺的稳定性，[Ser]GLP-1(7-36)酰胺具有强的体内促胰岛素活性，大鼠试验显示胰岛素的增加值是GLP-1(7-36)酰胺组的2倍。用甘氨酸来取代得到的GLP-1-Gly8对GLP-1R的亲和力有轻微降低。

分别用苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸和α-氨基异丁酸来取代8位的丙氨酸，所得到的4种肽都能一定程度地抗DPP-IV的降解，并能与GLP-1R结合。但只有Aib8和Gly8类似物与GLP-1(7-36)酰胺有相似的亲和力。此外，还有用D-Ala来替换8位的L-Ala。[D-Ala(8)]-GLP-1对受体的亲和力和促cAMP产生的活性相对较低，不过体内的葡萄糖耐受实验显示，它能明显减少葡萄糖曲线。

(3)9位谷氨酸的改造

9位的谷氨酸对于DPP-IV的降解也是重要的。用赖氨酸取代9位的谷氨酸得到的[Lys(9)-GLP-1]，它能明显地抗DPP-IV作用，对受体有亲和力，但丧失了GLP-1的那些促胰岛素分泌、cAMP产生等作用，所以它与已知的GLP-1拮抗剂exendin(9-39)类似。在另一个研究中，得到了三种新的Glu9取代物[(Pro9)GLP-1，(Phe9)-GLP-1，(Tyr9)GLP-1]，与天然GLP-1相比，与受体结合的能力及促进cAMP产生的能力均稍有下降，不过促胰岛素产生的能力相同或稍有增强。另外，在严重胰岛素抵抗的肥胖糖尿病动物中发现，(Pro9)-GLP-1能明显地改善血浆葡萄糖曲线并增加体液循环中胰岛素的浓度。

(4)其它位点氨基酸的改造

以下几种是对其它位点的氨基酸进行修饰或取代：(Ala10)，(Ser15)，(Tyr16)，(Arg17)，(Lys18)，(Gly21)，(Lys27)，(Asp31)-GLP-1(7-36)，此外还有GRF和(Glu15)-GLP-1(8-36)酰胺(GLP-1的拮抗剂)。这些肽的促胰岛素活性依次为GLP-1(7-36)酰胺＝Tyr16>Lys18，Lys27>Gly21>Asp31>>Ser15，Arg17>Ala10>>GRF>(Glu15)-GLP-1(8-36)酰胺。

然而，上述GLP-1的分子结构改变都没有获得比天然GLP-1显著提高的降糖作用和稳定性，仍然需要开发有效的GLP-1类似物，其不仅显示对DPP-IV等蛋白/肽水解酶的抗降解性，而且应具有更长的药理学作用时间。

【发明内容】：

本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种新型胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其修饰物，使其具有天然GLP-1的促胰岛素分泌及降血糖作用，同时与天然的GLP-1相比有较长的半衰期，可以用于糖尿病的治疗或肥胖的辅助治疗。

本发明的目的是通过如下的技术方案来实现的：

化学合成GLP-1的类似物(改构多肽)，通过转染有GLP-1受体(GLP-1R)基因和绿色荧光蛋白报告基因的CHO/GLP-1R/EGFP细胞筛选与评价模型，评价改构多肽结合并活化GLP-1R的能力，并在体外考察改构多肽对DPP-IV酶的稳定性，然后采用整体动物实验来验证其降糖效果和促胰岛素分泌效果，最终评价本发明设计的GLP-1类似物的生物活性。

本发明提供了一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其结构特征是在胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，其中所述的胰高血糖素样肽-1包括天然的GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)，及其部分氨基酸取代的衍生物。

优选的改构多肽是在天然的胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，即SEQ NO 1-2所示。

部分氨基酸取代的衍生物是指保持第7位的组氨酸，第8位的丙氨酸，和第9位的谷氨酸不变，而其它部分氨基酸位点取代的GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)，其中所述的部分取代的氨基酸位点是指第16，17，19，27，29，31位氨基酸中的至少一个位点。

本发明提供的一种类似物多肽，其具有如下结构：

Lys-His₇-Ala₈-Glu₉-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Ser-Xaa₁₉-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Xaa₂₇-Phe-Xaa₂₉-Ala-Xaa₃₁-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-y

其中，

y：NH₂或Gly；

Xaa₁₆：Asp，Glu，Lys，Gln，Arg，Asn，Gly，Ala，Pro，Leu，Ile，或Phe；

Xaa₁₇：Thr，Glu，Tyr，Asn，Met，Cys，Gln，或Trp；

Xaa₁₉：Pro，Met，Ser，Cys，Asn，Thr，Trp，或Gln；

Xaa₂₇：Thr，Pro，Asp，或Gln；

Xaa₂₉：Phe，Leu，Arg，Lys，Gly，Ala，Val，或Pro；

Xaa₃₁：Lys，Arg，Met，Tyr，Ser，Cys，Asn，Gln，或Thr

式中英文缩写表示：Lys(缩写为：K，以下相同。)赖氨酸、His(H)组氨酸、Ala(A)丙氨酸、Glu(E)谷氨酸、Gly(G)甘氨酸、Thr(T)苏氨酸、Phe(F)苯丙氨酸、Ser(S)丝氨酸、Asp(D)天冬氨酸、Leu(L)亮氨酸、Gln(Q)谷氨酰胺、Val(V)缬氨酸、Arg(R)精氨酸、Asn(N)天冬酰胺、Pro(P)脯氨酸、Ile(I)异亮氨酸、Tyr(Y)酪氨酸、Met(M)蛋氨酸、Cys(C)半胱氨酸、Trp(W)色氨酸。

优选的改构多肽的氨基酸序列如SEQ NO 3-8所示

本发明还提供了一种胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物，是对所述的胰高血糖素样肽-1的类似物多肽进行化学修饰和/或生物修饰的衍生物。

所述的化学修饰是指，对所述的胰高血糖素样肽-1的类似物采用PEG、脂肪酸长链及其它亲脂性分子进行氨基酸修饰。

所述的生物修饰是指，采用分子生物学手段，将所述的胰高血糖素样肽-1的类似物与人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc片段IgG-Fc融合表达，制备胰高血糖素样肽-1类似物的融合蛋白。

以上所述的胰高血糖素样肽-1的类似物、或胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物的应用，用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物。

所述的治疗糖尿病或肥胖症的药物是以单独的胰高血糖素样肽-1的类似物、或胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物为原料制备成的药剂；或者，将胰高血糖素样肽-1的类似物、或胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物与其他药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体配合制成的复方制剂。

本发明涉及的改构多肽，以天然GLP-1为对照，在体外试验中利用CHO/GLP-1R/EGFP细胞受体模型，评价其活化GLP-1R的能力，以及对DPP-IV酶降解的稳定性；在体内试验中，分别以正常小鼠和糖尿病模型小鼠为试验模型，鉴定其降血糖和促胰岛素分泌的效果。综合体内外试验结果，证明本发明提供的GLP-1类似物及其修饰物能有效的抗DPP-IV降解，并在持续地降低血糖，促进胰岛素分泌方面，能明显的优于天然的GLP-1。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供的新型GLP-1类似物及其修饰物，不但显示出天然GLP-1优越的生物学特性，促胰岛素分泌及降血糖作用，而且与天然的GLP-1相比，其对二肽水解酶的稳定性和体内作用时间有明显的提高，可用于糖尿病的治疗和肥胖的辅助治疗。

【附图说明】

图1是实施例2，GLP-1类似物的体外活性测定的图示

图2是实施例3，GLP-1类似物的抗DPP-IV降解性测定的图示

图3是实施例4，GLP-1类似物在正常小鼠体内降血糖作用的图示

图4是实施例5，GLP-1类似物在正常小鼠体内促胰岛素分泌作用的图示

图5是实施例6，GLP-1类似物在糖尿病模型小鼠体内降血糖效果的图示

图6是实施例7，KGLP-1/HSA融合蛋白的SDS-PAGE及Westernblot检测的图示

其中，条带M所示为低分子量蛋白质marker，条带1，4所示为GS115-pPIC9K发酵液上清；条带2，5所示为GS115-pPIC9K/KGLP-1/HSA发酵液上清；条带3，6所示为纯化后的KLP-1/HSA.

图7是实施例7，KGLP-1/HSA融合蛋白的HPLC(A)和MALDI-TOF-MS(B)检测的图示

图8是实施例8，KGLP-1/HSA融合蛋白在小鼠体内的降血糖效果的图示。

【具体实施方式】

实施例1 化学合成胰高血糖素样肽-1类似物

本发明的类似物可通过常规的固相肽合成法来制备发明涉及的GLP-1类似物，具体操作委托上海吉尔生化公司完成。

采用固相合成法合成本发明多肽之一，序列为：

SEQ NO 1：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

其它多肽合成方法类似。

合成工艺采用Fmoc合成法，选择Rink-Amide-MBHA Resin进行合成。合成步骤如下：

(1)16种带侧链保护基的Fmoc-氨基酸原料

(2)固相合成

(3)脱侧链保护基

(4)HPLC纯化

(5)冷冻干燥

(6)GLP-1类似物。

实施例2 GLP-1类似物的体外活性测定

试验样品：

SEQ NO 1：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 2：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

SEQ NO 3：KHAEGTFTSD

SSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 4：KHAEGTFTSDV

SYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 5：KHAEGTFTSDVSS

LEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 6：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAK

FIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 7：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEF

AWLVKGR-NH₂

SEQ NO 8：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA

LVKGR-NH₂

GLP-1(7-36)酰胺为阳性对照：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

试验方法：

将CHO/EGFP/GLP-1R细胞接种于96孔板，密度为2×10⁴个/孔，用含100mg/L Zeocin的RPMI-1640完全培养液培养48小时后移去培养液，分别加入用RPMI-1640基础培养液系列稀释的上述GLP-1类似物(SEQ NO 1，SEQ NO 2，SEQ NO 3，SEQ NO 4，SEQ NO 5，SEQ NO 6，SEQ NO 7，和SEQ NO 8)，以及GLP-1(7-36)酰胺对照品，每孔100μL。在37℃，5％ CO₂条件下培养8小时后，用倒置荧光显微镜进行观察。荧光强度用Image Pro Plus 5.1软件进行分析，并用GraphPad Prism5软件计算EC₅₀值。

结果：

如图1所示，各试验类似物都以剂量依赖的方式激活GLP-1R，其EC50值分别为GLP-1(7-36)酰胺，0.8298nM；SEQ NO 1，2.444nM；SEQ NO 2，2.554nM；SEQ NO 3，8.355nM，SEQ NO4，8.756nM；SEQ NO 5，4.47nM；SEQ NO 6，13.11nM；SEQ NO 7，22.30nM；和SEQ NO 8，30.27nM；其中以类似物SEQ NO 1和SEQ NO 2的作用活性最优。

实施例3 GLP-1类似物的体外抗DPP-IV降解性测定

试验样品：

SEQ NO 1：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 2：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

SEQ NO 3：KHAEGTFTSDSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 4：KHAEGTFTSDVSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 5：KHAEGTFTSDVSS

LEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

SEQ NO 6：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAK

FX₂₉AX₃₁LVKGR

SEQ NO 7：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE

AWLVKGR-NH₂

SEQ NO 8：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA

LVKGR-NH₂

GLP-1(7-36)酰胺为阳性对照：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

试验方法：

取20g新鲜的猪肾脏皮层组织切碎，按20％(w/v)加入0.25mol/L的蔗糖溶液，用匀浆器进行匀浆。匀浆液于8,000rpm离心15min，然后取上清液于15,000rpm离心2小时。将沉淀溶于0.1mol/L Tris/HCl缓冲液(pH7.4)中，即得到DPP-IV粗提物，于-20℃保存备用。

取1nmol上述GLP-1类似物(SEQ NO 1，SEQ NO 2，SEQ NO 3，SEQ NO 4，SEQ NO 5，SEQNO 6，SEQ NO 7，和SEQ NO 8)，以及GLP-1(7-36)酰胺对照品于100μL0.1mol/L Tris/HCl缓冲液(pH7.4)中，加入1μlDPP-IV粗提物(相当于5mU的DPP-IV)，在37℃作用不同时间后，取一定量加入3倍体积的乙腈终止反应。室温放置2小时后，12,000rpm离心10min，取上清液，真空浓缩除去乙腈。经DPP-IV处理后的样品，参照实施例2用CHO/EGFP/GLP-1R细胞评价体系进行活性检测。

结果：

如图2所示，与DPP-IV酶作用后，GLP-1(7-36)酰胺的活性迅速下降。当作用12小时后，与反应前的活性相比，GLP-1(7-36)酰胺刺激CHO/EGFP/GLP-1R细胞产生EGFP的表达量，降至4.8％；而四个GLP-1类似物，均显示了明显的抗DPP-IV酶降解作用，当DPP-IV酶作用12小时后仍能刺激CHO/EGFP/GLP-1R细胞产生较强的荧光，其EGFP的表达强度分别为原来的79.8％(SEQ NO 1)；80.5％(SEQ NO 2)；83.8％(SEQ NO 3)；84.5％(SEQ NO 4)；84.0％(SEQ NO 5)；81.0％(SEQ NO 6)；82.6％(SEQ NO 7)；和85.0％(SEQ NO 8)。

实施例4 GLP-1类似物的体内降血糖作用(正常小鼠)

试验样品：

SEQ NO 1：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂.

GLP-1(7-36)酰胺为对照：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

试验方法：

取7-8周龄雌性昆明种(KM)雌性小鼠(购自北京军事医学科学院实验动物中心)，随机分为空白对照组、试验组和GLP-1(7-36)酰胺对照组，禁食不禁水16-18小时后，经腹腔注射上述配置的受试药物(剂量：10nmol/kg体重)，分别于给药后0h，1h，2h和4h用灌胃针口腔灌注葡萄糖(剂量：1.5g/kg体重)，灌胃30min后从尾静脉取血置于肝素处理的离心管中，6,000rpm离心10min后，用葡萄糖检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)检测血糖含量。

结果：

如附图3所示，SEQ NO 1有较好的降血糖作用。同天然GLP-1(7-36)酰胺相比，在相同的给药剂量下，在给药2小时后仍具有明显的降血糖效果(p<0.01)。

实施例5 GLP-1类似物的体内促胰岛素分泌作用(正常小鼠)

试验样品：

SEQ NO 1：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂.

GLP-1(7-36)酰胺为对照：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

试验方法：

按照实施例4所述的方法获得血浆，再用胰岛素酶联免疫试剂盒(Linco Research，Charles，USA)测定血浆中胰岛素的含量。

结果：

如附图4所示，SEQ NO 1有较好的促进胰岛素分泌作用。同天然GLP-1(7-36)酰胺相比，在相同的给药剂量下，在给药2小时后仍具有明显的促胰岛素分泌的效果(p<0.01)。

实施例6 GLP-1类似物的体内降血糖作用(糖尿病模型小鼠)

试验样品：

SEQ NO 1：KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂，

GLP-1(7-36)酰胺为对照：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

试验方法：

糖尿病小鼠模型的制备：选取体重20-25g的雌性KM小鼠，禁食16-18小时；新鲜配置10mg/mL的四氧嘧啶水溶液，腹腔注射给药(给药量：200mg/kg体重)；提供鼠粮，以及100mg/mL的葡萄糖溶液作自由饮用水，给药48小时后改为饮用自来水；给药72小时后，禁食5小时以上，测定空腹血糖；进一步选择空腹血糖值≥11.0mmol/L者入围实验。

血糖含量的测定：取糖尿病模型小鼠，随机分为3组：空白对照组、试验组和GLP-1(7-36)酰胺对照组，禁食不禁水16-18小时后，进行葡萄糖耐受实验。经腹腔注射给药(剂量：10n mol/kg体重)，1小时后，用灌胃针口腔灌注葡萄糖(剂量：1.5g/kg体重)，并分别于不同时间从尾静脉取血置于肝素处理的离心管中，6,000rpm离心10min后，用葡萄糖检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)检测血糖含量。

结果：

如附图5所示，SEQ NO 1对糖尿病小鼠有较好的降血糖作用，同天然GLP-1(7-36)酰胺相比，在相同的给药剂量下，在给药1小时后仍具有明显的降血糖效果(p<0.01)。

实施例7 GLP-1类似物的与人血清白蛋白(HSA)的融合表达

采用分泌型毕赤酵母表达系统表达人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。本实施例中选取SEQ NO 1，以其氨基酸对应基因序列为基础，构建SEQ NO1和人血清白蛋白(HSA)的融合表达载体，pPIC9K/KGLP-1/HSA，并在毕赤酵母GS115菌株中发酵表达融合蛋白KGLP-1/HSA，其中KGLP-1表示SEQ NO 1多肽。其它GLP-1类似物与人血清白蛋白的融合表达方法类似。

具体操作如下；

1.融合表达载体pPIC9K/KGLP-1/HSA的构建：

以pPIC9K/GLP-1/HSA为模板，通过PCR扩增得到KGLP-1与HSA的融合基因，所用的引物如下：

P1：5’-CAC GAA TTC GAG AAA AGA GAG GCT AAA CAT GCT GAA GGG ACC-3’

P2：5’-TAT GCG GCC GCT TAT AAG CCT AAG GC-3’

PCR方法如下：25μl的反应体系中加入：10μmol/L的P1和P2引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP1μl，10×pfu Buffer 2.5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶1μl，质粒pPIC9K/GLP-1/HSA 1μg，加双蒸水补齐25μl，PCR条件为；94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，循环30次。

通过琼脂糖凝胶电泳分析反映产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出目标片段；经EcoR I和Not I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接到经同样双酶切的pPIC9K；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，最后进行测序验证。阳性重组子保存在含有40％甘油的LB中，冻于-70℃；重组质粒命名为pPIC9K/KGLP-1/HSA，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9K/KGLP-1/HSA。

2.毕赤酵母的转化及重组菌株的筛选：

提取DH5α/pPIC9K/KGLP-1/HSA中的质粒，用限制性内切酶Sal I酶切后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布于MDS组氨酸营养缺陷型固体培养基上，选取阳性重组子进行PCR鉴定。接着，在含不同浓度G418的YPD平板上进行多拷贝筛选，得到阳性克隆。提取阳性转化子的基因组DNA进行PCR鉴定。阳性重组子命名为GS115/pPIC9K/KGLP-1/HSA。

3.融合蛋白的诱导表达和纯化

将GS115/pPIC9K/KGLP-1/HSA接种至装有25ml BMGY生长培养基的250ml三角瓶中，250rpm，30℃培养至A600nm为2～6，离心收集酵母细胞，重悬于装有100ml BMMY培养基的500ml三角瓶中，250rpm，30℃诱导表达，每隔12小时补加甲醇，使其终浓度维持在0.5％(V/V)。诱导72小时后，离心得到上清液。采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定。使用亲和层析方法分离纯化融合蛋白KGLP-1/HSA。用HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定纯化的融合蛋白。

结果：

如附图6所示，融合蛋白KGLP-1/HSA在酵母表达体系中得到良好的表达，SDS-PAGE及Western blot中可以清晰地检测到融合蛋白的条带。如附图7所示，经亲和层析分离纯化的融合蛋白KGLP-1/HSA用HPLC检测纯度为92.0％，MALDI-TOF-MS鉴定分子量为70,297.8Da，同预测结果相一致，证明融合蛋白KGLP-1/HSA得到良好的表达和纯化。

实施例8 融合蛋白KGLP-1/HSA在小鼠体内的降血糖效果

试验材料为上述实施例7获得的融合蛋白KGLP-1/HSA，试验方法参见实施例4，不同之处在于此实施例中给药量为100n mol/kg体重。

结果如附图8所示，试验融合蛋白具有一定的降血糖作用，同空白组，GLP-1(7-36)酰胺对照组以及SEQ NO 1对照组相比，KGLP-1/HSA试验组在给药8小时后仍具有明显的降血糖效果(p<0.05)。

序列表

<110>南开大学

<120>一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用

<160>10

<210>1

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>1

<210>2

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>3

<210>4

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>4

<210>5

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>5

<210>6

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>6

<210>7

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>7

<210>8

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>8

<210>9

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(12)

<223>X11＝D，E，K，R，Q，G，A，P，L，I，或F

     X12＝T，Y，E，M，C，Q，或W

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X14＝M，S，C，N，T，W，或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(22)..(22)

<223>X22＝T，D，或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(24)..(24)

<223>X24＝F，L，K，G，A，V，或P

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>X26＝K，M，Y，S，C，N，Q，或T

<400>9

<210>10

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(12)

<223>X11＝N，D，E，K，R，Q，G，A，P，L，I，或F

     X12＝N，T，Y，E，M，C，Q，或W

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X14＝P，M，S，C，N，T，W，或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(22)..(22)

<223>X22＝P，T，D，或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(24)..(24)

<223>X24＝R，F，L，K，G，A，V，或P

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>X26＝R，K，M，Y，S，C，N，Q，或T

<400>10

Claims (10)

1.一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其结构特征是在胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，所述的胰高血糖素样肽-1包括天然的GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)，及其部分氨基酸取代的衍生物。

2.根据权利要求1所述的改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其中优选的是在天然的胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，即SEQ NO 1-2所示。

3.根据权利要求1所述的改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其特征是在保持天然的胰高血糖素样肽-1的第7位的组氨酸，第8位的丙氨酸，和第9位的谷氨酸不变，而其它部分氨基酸位点取代的衍生物的N端前面添加一个赖氨酸。

4.根据权利要求3所述的改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其特征是所述的部分取代的氨基酸位点是指第16，17，19，27，29，31位氨基酸中的至少一个位点，其具有如下结构：Lys-His₇-Ala₈-Glu₉-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Ser-Xaa₁₉-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Xaa₂₇-Phe-Xaa29-Ala-Xaa31-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-y，

其中，

y：NH₂或Gly；

Xaa₁₆：Asp，Glu，Lys，Gln，Arg，Asn，Gly，Ala，Pro，Leu，Ile或Phe；

Xaa₁₇：Thr，Glu，Tyr，Asn，Met，Cys，Gln或Trp；

Xaa₁₉：Pro，Met，Ser，Cys，Asn，Thr，Trp或Gln；

Xaa₂₇：Thr，Pro，Asp或Gln；

Xaa₂₉：Phe，Leu，Arg，Lys，Gly，Ala，Val或Pro；

Xaa₃₁：Lys，Arg，Met，Tyr，Ser，Cys，Asn，Gln或Thr。

5.根据权利要求4所述的改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其中优选的多肽如SEQ NO 3-8所示。

6.一种权利要求1-5任一项所述的改构的胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物，是对所述的胰高血糖素样肽-1的类似物多肽进行化学修饰和/或生物修饰的衍生物。

7.根据权利要求6所述的胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物，其特征在于所述的化学修饰是指，对胰高血糖素样肽-1的类似物多肽采用PEG、脂肪酸长链及其它亲脂性分子进行氨基酸修饰。

8.根据权利要求6所述的胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物，其特征在于所述的生物修饰是指，采用分子生物学手段，将胰高血糖素样肽-1的类似物与人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc片段IgG-Fc融合表达制备融合蛋白质。

9.一种权利要求1-5任一项所述的胰高血糖素样肽-1的类似物或权利要求6-8任一项所述的胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物的应用，用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的治疗糖尿病或肥胖症的药物是以单独的胰高血糖素样肽-1的类似物、或胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物为原料制备成的药剂；或者，将胰高血糖素样肽-1的类似物、或胰高血糖素样肽-1的类似物的修饰物与其他药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体配合制成的复方制剂。

Images