CN105025919A - 用于血糖控制的治疗剂、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明部分地涉及具有治疗益处的胰岛素蛋白和药物组合物。肽和小分子药物的有效性通常受到此类药物在循环中的半衰期以及难以获得基本上恒定的血浆水平的限制。例如，肠促胰岛素GLP-1必须以相对较高的剂量施用以克服其在循环中较短的半衰期，此外这些较高的剂量与恶心相关。Murphy和Bloom,非肽类胰高血糖素样肽1受体激动剂：是治疗糖尿病的魔弹吗。

Description

用于血糖控制的治疗剂、组合物和方法

优先权

本申请要求2013年1月15日提交的美国临时申请号No.61/752,542和2013年5月30日提交的美国临时申请号61/829,074的利益和优先权，并且其全部内容均通过引用并入本申请。

发明领域

本发明部分地涉及胰岛素融合蛋白，以及包含其的药物组合物和联用疗法，其为血糖控制提供了治疗益处。

背景

肽和小分子药物的有效性通常受到此类药物在循环中的半衰期以及难以获得基本上恒定的血浆水平的限制。例如，肠促胰岛素GLP-1必须以相对较高的剂量施用以克服其在循环中较短的半衰期，此外这些较高的剂量与恶心相关。Murphy和Bloom,Nonpeptidic glucagon-like peptide 1 receptor agonists:A magic bullet for diabetes？(非肽类胰高血糖素样肽1受体激动剂：是治疗糖 尿病的魔弹吗？)PNAS 104(3):689-690(2007)。而且，在一些评估中，肽剂血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)显示出低于1分钟的半衰期，这使得将该药剂作为药物使用是不切实际的。Domschke等,Vasoactive intestinal peptide in man:pharmacokinetics,metabolic and circulatory effects(血 管活性肠肽在男性中的药代动力学、代谢和循环效应),Gut 19:1049-1053(1978)；Henning和Sawmiller,Vasoactive intestinal peptide:cardiovascular effects (血管活性肠肽的心脏效应),Cardiovascular Research 49:27-37(2001)。肽类药物较短的血浆半衰期通常是由于其在系统循环中具有迅速的肾脏清除率和酶促降解所致。

胰岛素或其衍生物面临类似的困境，但是还存在其他挑战。胰腺的胰岛细胞在进餐和头天晚上之间分泌基础水平的胰岛素以确保血糖水平维持在适宜的范围，特别是防止出现夜间低血糖。进餐消化后，大量胰岛素释放进入循环以便使得葡萄糖在消化和吸收后内流进入循环。为了优化血糖水平的控制和阻止高血糖，这种被称为餐时胰岛素的物质必须释放的非常迅速；在正常个体中胰岛素的峰值出现在开始进餐后30-45分钟。

目前用于1型和2型糖尿病治疗的胰岛素疗法基本上分为两种形式：基础胰岛素以便在全天提供低水平的胰岛素和用于在餐前立即注射的胰岛素以模拟机体在餐时胰岛素的正常释放。基础胰岛素产品面临的挑战是提供恒定的胰岛素水平，使其峰和谷水平之间不存在较大的差异，理想的情况是注射不超过每日一次，优选地每周一次。对于餐时胰岛素而言，其分子需要非常迅速地从皮下注射部位吸收，其水平在2小时左右以内衰减至接近基础水平。

目前可用的餐时胰岛素制剂具有较高的胰岛素浓度，并且这些胰岛素分子在存在锌时自组装成六聚体。因此，这些胰岛素分子通常以六聚体、二聚体和单体的动态平衡存在于溶液中，其比例取决于该溶液的浓度和pH。在中性pH的市售胰岛素制剂中，该平衡强烈偏向于锌稳定的六聚体，其对于保存期限的稳定性是有利的，因为单体胰岛素通常是不稳定的并可能会脱酰胺。皮下注射时，六聚体胰岛素吸收较差并且必须解离成二聚体和单体才能摄取进入循环，这导致达到最高水平的显著延迟。

速效胰岛素具有改变的氨基酸序列以使得二聚体和六聚体不稳定，这样胰岛素能够更加迅速的转化为单体形式。但是目前市场上销售的产品与内源性释放的胰岛素相比其达到峰值水平仍明显较慢，因此需要在餐前20分钟注射才能达到最佳控制。目前正在对多种方法进行研究以进一步加速注射胰岛素的摄取，包括将注射部位升温以增加血流，注射酶破坏皮下脂肪层的透明质酸层(Heinemann和Muchmore综述，2012.Ultrafast-Acting Insulins:State of the Art(超速效胰岛素：技术现状)Journal of Diabetes Science and Technology6,728-742)。通过合并来自持续的葡萄糖监测的数据扩展胰岛素递送泵的用途受到越来越多的关注，这最终导致产生需要较少或不需要用户输入的闭环系统。然而，目前的速效胰岛素作用过于缓慢以至于不能真正产生此类反馈回路系统，因为其对于血糖水平的作用被显著延迟。在泵储液器的生理上可接受的溶液中稳定的更速效的胰岛素将能够用于开发此类称为“人工胰腺”的系统(Cenzig,2012.Undeniable Need for Ultrafast-Acting Insulin:The Pediatric Perspective(对于超速效胰岛素不可否认的需求：儿科透视)Journal ofDiabetes Science and Technology 6,797-801)。

在基础胰岛素产品的研发方面则属于相反情形，其目标为从注射部位具有持续摄取，或具有延长的循环半衰期的胰岛素分子，或者这两者的组合。目前市场上最受欢迎的基础胰岛素是精甘胰岛素，但是这种产品不能提供全部24小时的覆盖。

因此，仍需要一种显示出具有改善的药学性质的胰岛素疗法，例如改进的基础胰岛素产品和更速效的餐时胰岛素。特别地，需要具有相容性的和能够共同配制的基础和速效胰岛素以便能够每日施用一次，以针对否则导致最高或最大程度长期血糖偏移的餐食通常是早餐提供基础组分加餐时的覆盖。

本发明的其他目的从下述本发明的说明书中将是显而易见的。

发明概述

本发明提供了基于胰岛素的药剂及其组合物、组合和制剂。所述药剂显示出一种或多种选自下述的益处：持续释放、迅速起效(由于例如六聚体形式丧失或减少)和IGF受体的降低的活性。本发明在各个方面涉及提供持续释放(例如长效)或速效性质的胰岛素的融合伴侣，其能够单独施用，或者作为共同疗法单独或一同施用。

在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含胰岛素B链和胰岛素A链和5至200个氨基酸的融合伴侣，如约50至约150个氨基酸残基，所述融合伴侣抑制胰岛素多聚体(例如六聚体)形成。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构象，其可以形成随机卷曲或重复的β-转角构象，其可能是由于所述融合伴侣主序列的脯氨酸残基和/或总体氨基酸组分的模式导致的。在一些实施方式中，所述融合伴侣的序列含有少于约35％、或者少于约30％、或者少于约20％的疏水性残基，疏水性残基不包括丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸。例如，疏水性残基在这个上下文中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。所述融合伴侣可以包括一个或多个带正电荷的残基以降低所述融合伴侣的疏水性。在一些实施方式中，减少或消除六聚体形成的序列不诱导从注射部位的持续释放。在进一步的实施方式中，所述序列稳定在生理上可相容的溶液中单体或基本上单体形式的胰岛素。在这些方面，本发明提供了用于提供餐时胰岛素的治疗剂和药物组合物或制剂。

在另一个方面，本发明提供了用于提供持续血糖控制的药物组合物和制剂，所述药物组合物和制剂包含有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含胰岛素氨基酸序列(例如胰岛素A链和胰岛素B链)和融合伴侣，所述融合伴侣具有提供从注射位点持续释放的氨基酸序列，以及以达到持续释放的药物赋形剂。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构象，其可以形成随机卷曲或重复的β-转角构象，其可能是由于所述融合伴侣的脯氨酸残基和/或总体氨基酸组分的模式导致的。在这些实施方式中，所述融合伴侣可以在约35℃或约外周体温下显示出相转变(phase transition)，使得导致所述药物从注射部位持续释放的基质或药物储库。这些方面对于例如在糖尿病患者中提供基础胰岛素是有用的。

在一些实施方式中，本申请所述的药剂和组合物提供了在IGF受体具有降低的或可忽略的结合和/或活性的益处，使得制备例如本发明特别适用于1型或2型糖尿病患者的慢性治疗的药剂、组合物和制剂。

在一些实施方式中，本发明提供了本申请所述活性剂的共制剂和联用疗法，包括基础胰岛素和速效胰岛素融合蛋白的共制剂和联用疗法，以及所述胰岛素药剂与其他药剂如GLP-1受体激动剂的共制剂。例如，在一些实施方式中，本申请所述的基础胰岛素和速效胰岛素的共同疗法或共制剂通过单次注射为整日提供迅速和持续性的胰岛素作用。此外，所述持续释放融合蛋白与GLP-1受体激动剂的共制剂能够对血糖控制提供协同效应，包括在一些实施方式中，通过每周施用一次提供基础胰岛素水平。

在另一个方面，本发明提供了治疗糖尿病、低胰岛素血症或高血糖症的方法，包括施用本申请所述的药物组合物、制剂或联合疗法。在一些实施方式中，患者患有1型糖尿病或2型糖尿病，或者前驱糖尿病。在一些实施方式中，所述方法包括以从每月约1次至约30次的频率施用本申请所述的药物组合物，包括约每周一次，或者约每周两次或三次，或者约每日一次。在一些实施方式中，所述方法包括皮下或肌内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，所述方法提供了长期疗法，其中所述药剂施用多年。在施用餐时胰岛素的情况下，在一些实施方式中，所述方法包括在进餐前立即施用所述药物组合物，例如开始进餐前约15分钟、约10分钟、约5分钟或小于1分钟。在一些实施方式中，在给药后和/或开始进餐后30-45分钟获得胰岛素的峰值水平。

在一些实施方式中，所述方法包括通过任选地带有闭环系统的泵系统施用本申请所述的一种或多种药剂或组合物以基于例如通过葡萄糖监测系统确定的血液中的葡萄糖水平控制胰岛素的递送量。所述系统可以控制和施用基础胰岛素(例如，如本申请所述的)和速效胰岛素(例如，如本申请所述的)，并且还可以控制GLP-1受体激动剂的施用，亦如本申请所述的。

附图简述

图1A显示了人胰岛素原序列(SEQ ID NO:13)。胰岛素原序列由与C肽连接的B链和A链组成。在两个邻近的二元位点(下划线斜体表示)酶促裂解后，C肽被除去以形成成熟的胰岛素。

图1B显示了称为PE0139或INSUMERA或胰岛素-ELP1-120的构建示意图，其具有与胰岛素A链的C-末端融合的120ELP单元。

图2显示了pPE0139质粒的图谱。

图3显示了胰岛素原ELP1-120融合蛋白(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。所述胰岛素原序列(下划线)与ELP1-120序列融合。所述氨基酸序列任选地在N-末端包括起始甲硫氨酸残基。

图4显示了非还原SDS-PAGE实验。非还原SDS-PAGE显示了C-肽裂解的酶促加工后预期减少的融合蛋白分子量。第1道：Plus2预染色标准品(INVITROGEN)，第2道：ELP1-120，第3道：胰岛素原ELP1-120，第4道：胰岛素ELP-1203μg，第5道：胰岛素ELP1-1206μg，第6道：Plus2预染色标准品(INVITROGEN)。

图5显示了抗-胰岛素B链的western印迹。进行抗-胰岛素B链的western印迹以确证与ELP融合的A链和B链两者的存在。数据显示在非还原条件下存在B-链，这表明在A链和B链之间形成了二硫键。融合蛋白和二硫键的还原导致从所述融合中除去B链。第1道：还原的胰岛素ELP融合显示B链的缺失，第2道：非还原的胰岛素ELP融合显示B-链的存在，第3道：ELP1-120，第4道：胰岛素原ELP融合显示B-链的存在。

图6显示未加工的胰岛素-ELP1-120的ESI-MS数据。电喷雾离子化质谱确证了未加工的胰岛素原ELP融合的质量为57008.5Da(SGS M扫描代码104531&104532)。存在附加的盐加合物。

图7显示了经加工的pPE0139的ESI-MS数据。电喷雾离子化质谱确证了在酶促除去C-肽后的成熟胰岛素ELP融合的质量(SGS M-扫描代码107610)。胰岛素ELP的ESI-MS显示了分子量约53298Da的主要产物峰，其代表C-肽裂解后成熟的胰岛素ELP。小峰可能归因于部分降解的融合或盐加合物。

图8显示了在正常小鼠中使用胰岛素-ELP1-120融合相比于甘精胰岛素血糖更低。

图9显示了在1型糖尿病(1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中定量给予INSUMERA(PE0139)。特别地，显示了单次给药的数据。结果表明与等摩尔LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)给药相比，INSUMERA的血糖降低持续时间更长。STZ是链脲菌素；未给药组指正常的、非糖尿病动物；N＝每组8只。

图10显示了在1型糖尿病(1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中给予INSUMERA(PE0139)。特别地，显示了每日给药的数据。结果表明在活性和半衰期方面与LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比，INSUMERA具有优效性。STZ是链脲菌素；未给药组指正常的、非糖尿病动物；在6h时间点，25mg和50mg/kg组N＝5；在8h时间点，25mg/kg组N＝3和50mg/kg组n＝2；在24h时间点，25mg/kg组N＝1和5mg/kg组N＝7。

图11A显示了在1型糖尿病(1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中与LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的剂量滴定。特别地，图11A显示了单次s.c.给药。STZ是链脲菌素；未给药组指正常的、非糖尿病动物；LANTUS组、PE01391mg/kg组和未给药组N＝8；PE01393.33mg/kg组N＝7。

图11B显示了在1型糖尿病(1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中与LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的剂量滴定。特别地，图11B显示了每日s.c.给药14天。STZ是链脲菌素；未给药组指正常的、非糖尿病动物；LANTUS组、PE01391mg/kg组和未给药组N＝8；PE01393.33mg/kg组N＝7。

图12A显示了相对于LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)INSUMERA(PE0139)具有显著增加的血糖控制。相对于Lantus在第1、3、7和14天的血糖曲线下面积(AUC)减少27-39％。特别地，图12A显示了化合物施用第1天且在0-24hrs的血糖AUC。

图12B显示了相对于LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)INSUMERA(PE0139)具有显著增加的血糖控制。相对于Lantus在第1、3、7和14天的血糖曲线下面积(AUC)减少27-39％。特别地，图12B显示了化合物施用第14天且在0-24hrs的血糖AUC。

图13A显示了皮下注射后INSUMERA(PE0139)达到了具有较小的峰谷比值的长的半衰期。特别地，图13A显示了在糖尿病猪中单次s.c.注射后的药代动力学(PK)药物水平。

图13B显示了每日皮下注射后INSUMERA(PE0139)达到了稳态峰谷药代动力学(PK)水平。特别地，图13B显示了在糖尿病猪中每日s.c.注射2周；测定给药前的PK水平。

图14显示了根据本公开的示例性速效胰岛素的设计。胰岛素B链-胰岛素A链-ELP1-20的序列如(SEQ ID NO:15)所示。

图15显示了速效胰岛素的产生和离子交换色谱。

图16显示了与INSUMERA相比速效胰岛素的效能，并且显示其效能相当。

图17显示了质粒pPE0224编码的胰岛素原ELP1-20融合蛋白。

图18显示了胰岛素原ELP1-20融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。

图19显示了质粒pPE0262编码的胰岛素原ELP1-10融合蛋白。

图20显示了胰岛素原ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。

图21显示了质粒pPE0259编码的胰岛素原ELP2-20融合蛋白。

图22显示了胰岛素原ELP2-20融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)。

图23显示了质粒pPE0266编码的胰岛素原ELP2-10融合蛋白。

图24显示了胰岛素原ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。

图25显示了质粒pPE0283编码的胰岛素原ELP1-10(4xGlu)融合蛋白。

图26显示了胰岛素原ELP1-10(4xGlu)融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:20)。

图27显示了质粒pPE0284编码的赖脯ELP1-10融合蛋白。

图28显示了赖脯ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。

图29显示了质粒pPE0285编码的赖脯ELP1-10融合蛋白。

图30显示了门冬ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。

图31显示了质粒pPE0289编码的ELP2-10ELP1-120分离融合蛋白。

图32显示了质粒pPE0285编码的赖脯ELP1-10融合蛋白。

图33显示了胰岛素原ELP2-10ELP1-120分离融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。带有下划线的序列是胰岛素原，用粗体表示的序列是ELP2-10和用斜体表示的序列是ELP1-120。两个带有下划线的精氨酸是释放两个构建体的胰酶位点。

图34显示了PE0244和PE0139及其组合对于STZ小鼠血糖水平的作用。

图35A显示了3μM INS-ELP(B30)和PE0139显示出与胰岛素受体的结合，如Biacore光学生物传感器所示。

图35B显示了使用Biacore光学生物传感器3μM INS-ELP(B30)和PE0139未显示出可检测的与IGF-1受体的结合。

图36A和图36B显示了INS-ELP(B30)和PE0139显示出与胰岛素受体具有相似的结合。

图37显示了在db/db小鼠中PE0139剂量的增加对空腹和餐后血糖显示出增加的作用。

图38显示了在db/db小鼠中向PE0139中加入固定剂量的PB1023(GLP-1-ELP1-120)进一步增强了餐后控制。

图39显示了在db/db小鼠中PB1023剂量的增加显示了对空腹和餐后血糖增加的作用。

图40显示了在db/db小鼠中向PB1023中加入固定剂量的PE0139加强了空腹和餐后控制。

图41显示了PE0139剂量的增加显示对血糖具有很小的影响，PB1023剂量的增加对于空腹血糖显示出增加的作用，对于餐后血糖显示出有限的影响。

图42显示了低剂量PE0139和PB1023联用具有增强的空腹和餐后控制。

详细描述

本发明提供了基于胰岛素的药剂、组合物、制剂、联用和共疗法，其显示出治疗性的益处，如持续的血糖控制、速效(由于例如胰岛素六聚体形成的丧失或减少)和/或降低的或可忽略的IGF受体结合和/或活性。还提供了使用本发明的药剂、组合物和制剂用于治疗疾病的方法和用途，包括高血糖、低胰岛素血症、糖尿病(包括1型和2型)、代谢疾病和肥胖症。

在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含胰岛素B链和胰岛素A链，和5至200个氨基酸的融合伴侣，如约50至约150个氨基酸，所述融合伴侣抑制胰岛素多聚体(例如六聚体)形成。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构象，其可以形成随机卷曲或重复的β-转角构象，其可能是由于所述融合伴侣主序列的脯氨酸残基或总体氨基酸组分的模式导致的。在一些实施方式中，所述融合伴侣的序列含有少于约35％、或者少于约30％、或者少于约25％、或者少于约20％的疏水性残基(疏水性残基不包括丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。例如，疏水性残基在这个上下文中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些实施方式中，六聚体形成减少或消除的序列不诱导从注射部位的持续释放，或在体温显示出相转变。在进一步的实施方式中，所述序列在生理上可相容溶液中稳定单体或基本上单体形式的胰岛素。在这些方面，本发明提供了基于本申请所述的起效迅速用于提供餐时胰岛素的治疗剂和药物组合物。在一些实施方式中，所述速效胰岛素在约45分钟或更短的时间内、或者约35分钟或更短的时间内、或者约30分钟或更短的时间内达到峰作用。

在其他实施方式中，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含胰岛素B链和胰岛素A链，和约400至约1000个氨基酸的融合伴侣，如约400至约800个氨基酸，所述融合伴侣在体温显示出相转变以提供活性剂从注射部位的持续释放。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构象，其可以形成随机卷曲或重复的β-转角构象，其可能是由于在氨基酸序列中的脯氨酸残基或总体氨基酸组分的模式导致的。在这些方面，本发明提供了基于本申请所述的持续释放和从循环中减慢的清除用于提供基础胰岛素的治疗剂和药物组合物和制剂。在一些实施方式中，所述持续性释放胰岛素是通过每日一次或每周一次施用给药。

在不同实施方式中，所述胰岛素氨基酸序列包含A链和B链氨基酸序列并且A链和B链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列(图1)，其任选地总体具有1至8个或1至5个氨基酸插入、缺失或取代。例如，胰岛素B链的位置3、28、29和30以及A链的位置21可以被取代，包括被K3、G21、K28、D28、P29、Q29取代。在一些实施方式中，在B链的C-末端加入1至5个氨基酸，或者除去B链的T30。此类改变可以任选地对应于赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素。在一些实施方式中，提供从注射部位缓慢吸收或者减少或消除胰岛素多聚体形成的氨基酸序列与胰岛素A链共价结合。在另一个实施方式中，所述A链和B链由一个或多个二硫键结合或者通过肽或化学接头连接。

在不同实施方式中，所述融合伴侣与胰岛素A链共价结合，并且所述融合伴侣可以包含弹性蛋白样肽(ELP)单元，例如约5至约180个ELP单元，其取决于是否迅速或持续的生物作用是所需的。在一些实施方式中，所述ELP包含VPGXG(SEQ ID NO:3)的重复，其中各X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基。在一些实施方式中，X独立地选自V、I、L、A、G和W。在一些实施方式中，所述ELP包含AVGVP(SEQ ID NO:4)、IPGVG(SEQ IDNO:6)或LPGVG(SEQ ID NO:8)的重复。对所述融合伴侣的尺寸和氨基酸组成进行选择以提供速效或持续的活性，如在本申请中更加详细的描述。

在提供速效胰岛素的一些实施方式中，所述融合可以含有1至约10个带负电的氨基酸例如谷氨酸和/或天冬氨酸以增加所述融合伴侣的负电荷和降低疏水性。在一些实施方式中，所述ELP包含约10至约25个VPGXG单元(SEQID NO:3)，其中X独立地选自V、G和A，其中G和A作为客体残基(例如在约1或2个以内)以大致相等的量存在，和V以比G或A高约2至约3倍存在。或者，所述ELP单元是AVGVP(SEQ ID NO:4)。例如，用于速效胰岛素的示例性融合或融合伴侣通过SEQ ID NO:16(图18)或SEQ ID NO:17(图20)示例。在其他实施方式中，所述ELP包含约10至约25个VPGXG单元(SEQ ID NO:3)，其中X独立地选自V、G和A，其中G和A作为客体残基(例如在约1或2个以内)以大致相等的量存在，和V以比G或A低约2至约3倍存在。例如，用于速效胰岛素的示例性融合蛋白或融合伴侣通过SEQ ID NO:18(图22)或SEQ ID NO:19(图24)或SEQ ID NO:21(图28)或SEQ ID NO:22(图30)示例。在其他实施方式中，所述ELP包含如上所述的约10至约25个VPGXG单元(SEQ ID NO:3)，其中将带有正电荷的残基插入所述ELP单元的部分之间，例如约2至约6个位置(例如约3、4或5个位置)。根据这些实施方式的示例性融合蛋白或融合伴侣如图26所示(SEQ ID NO:20)。或者，可以将带正电荷的残基作为所述ELP序列的一个或多个客体残基插入，或者将其插入所述ELP单元的其他位置。

在一些实施方式中，提供持续释放和速效的所述融合蛋白可以作为“分离”融合在一起生产，并且在通过蛋白酶(例如胰酶)作用的加工过程中释放。此类设计如图33所示(SEQ ID NO:23)。在此类实施方式中，速效和持续作用胰岛素的1:1共制剂(或者其他定义的摩尔比)能够方便的制备。在不同实施方式中，所述分离构建体包含1至5个速效胰岛素单元(例如1或2个)和1至5个(例如1或2个)持续释放胰岛素单元，各自通过蛋白酶裂解位点连接。

在一些方面，本发明提供了作为带有赋形剂的药物组合物的持续释放融合蛋白，其能够持续释放，和/或在大量单体状态保持迅速起效。例如，所述药物组合物或制剂可以具有约110mM氯化钠和约20mM组氨酸的离子强度。在一些实施方式中，将所述药物组合物制成用于约每周一次或每日一次施用。

在一些方面，本发明提供了治疗糖尿病或低胰岛素血症的用途和方法，所述用途和方法包括向需要其的患者施用本申请所述的有效量的药物组合物或制剂。在一些实施方式中，所述患者患有1型或2型糖尿病或处于前驱糖尿病，和/或患有代谢疾病或临床肥胖症。在一些实施方式中，用于持续释放的所述药物组合物以每月1至约30次、或约每周一次、或约每周2至3次、或约每日一次的频率施用。在一些实施方式中，所述方法还递送餐时胰岛素。例如，所述方法可以包括施用包含在进餐前立即使用的速效胰岛素的药物组合物以提供餐时胰岛素例如，在进餐前约15分钟、约10分钟、约5分钟、或者少于1分钟。本发明进一步提供了本申请所述的胰岛素融合蛋白用于制备用于治疗此类疾病的药物的方法和用途。

在一些实施方式中，所述方法包括皮下或肌内施用所述药物组合物。在一些实施方式中，本申请所述的药剂和组合物适于慢性疗法，由于其TGF受体的降低的活性。在一些实施方式中，所述方法提供了长期疗法，其中所述药剂施用多年，包括约2年以上、约5年以上、约10年以上或者更长时间。

在一些实施方式中，所述方法包括通过任选地带有闭环系统的泵系统施用药物组合物以基于例如根据通过葡萄糖监测系统确定的血液中的葡萄糖水平控制胰岛素的递送量。所述泵系统可以递送速效和持续作用胰岛素，其基于例如以具有规律的频率施用持续作用胰岛素和速效胰岛素以响应升高的血糖水平或者用于在开始进餐前定时递送。

在不同实施方式中，提供治疗益处(例如持续释放或速效)的氨基酸序列具有伸展构象，或随机卷曲，这是由于在所述融合伴侣中的脯氨酸残基的模式导致的。所述模式可以是重复的β转角模式。例如，在一些实施方式中所述氨基酸序列是弹性蛋白样肽(ELP)氨基酸序列。在一些实施方式中，所述ELP包含VPGXG(SEQ ID NO:3)重复，其中各X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基。在一些实施方式中，所述ELP氨基酸序列包含AVGVP(SEQ ID NO:4)、IPGVG(SEQ ID NO:6)或LPGVG(SEQ ID NO:8)重复。在不同实施方式中，所述ELP包含至少5个、或至少10个、或至少15个、或至少30个、或至少60个、或至少90个、或至少120个、或至少180个ELP氨基酸单元的重复(如本申请所述)。在一些实施方式中，所述ELP是少于约60个ELP单元，或少于约30个ELP单元，以避免形成胰岛素多聚体。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有约5至约30个ELP单元，如约10至约25个，包括约10个、约15个、约20个和约25个。在这些实施方式中，所述ELP不诱导从注射部位的持续释放，并且在体温下不显示出反向相转变。在另一个实施方式中，所述ELP氨基酸序列包括至少60个ELP单元，包括至少90个ELP单元，和包括约120个ELP单元，并且在生理盐水中具有略低于37℃的转变温度，从而提供持续释放作用。例如，在一些实施方式中，所述ELP的转变温度可以是约36℃、或约35℃、或约34℃、或约33℃、或约32℃、或约31℃、或约30℃。

在一些实施方式中，提供治疗益处的所述氨基酸序列形成随机卷曲或非球状伸展结构或非结构化的生物聚合物，包括根据Chou-Fasman算法确定的至少50％的氨基酸缺乏二级结构的生物聚合物。在此类实施方式中，可以将所述融合伴侣描述为随机卷曲构象。在又一个实施方式中，提供持续释放的所述氨基酸序列是具有伸展的、非球形结构或随机卷曲结构的蛋白，如在下文中更加详细的描述，除了其他以外，其还提供了大的流体力学半径以减慢从循环中的清除速率。

在不同实施方式中，本发明提供了基础胰岛素(包括本申请所述的持续释放融合蛋白)和速效胰岛素(其可以包括本申请所述的融合蛋白)的共制剂，其中基础和餐时胰岛素可以通过单次注射每日施用一次或两次(例如在早餐前)。在这些或其他实施方式中，所述共制剂包括一种或多种GLP-1受体激动剂，其可以提供优效的血糖控制，或控制潜在或并发的代谢疾病或超重(例如临床肥胖症)。

本发明进一步的方面和实施方式将是从下面的详细描述中显而易见的。

胰岛素氨基酸序列

胰岛素例如人胰岛素的注射能够用于治疗糖尿病。机体产生胰岛素的细胞称为β-细胞，发现位于胰腺中。这些细胞聚集在一起形成“朗格罕氏岛”，采用发现其的德国医学生命名。

胰岛素的合成始于胰岛素基因的翻译，该基因位于11号染色体上。在翻译期间，两个内含子从mRNA产物中剪接除去，其编码长度为110个氨基酸的蛋白。该初级翻译产物被称为前胰岛素原并且其是没有活性的。其含有长度为24个氨基酸的信号肽，这是该蛋白跨过细胞膜所需的。人胰岛素原由通过31个氨基酸的C肽连接在一起的A链和B链组成(图1)。

一旦前胰岛素原到达内质网，蛋白酶裂解除去信号肽以形成胰岛素原。特别地，一旦在A链和B链之间形成二硫键，胰岛素原通过胰酶/羧肽酶B-样系统除去C肽转化成在体内成熟的胰岛素。胰岛素原由三个结构域组成：氨基末端B链、羧基末端A链和在中间称为C-肽的连接肽。胰岛素由称为A链(21个氨基酸-GIVEQCCASVCSLYQLENYCN)(SEQ ID NO:24)和B链(30个氨基酸-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA)(SEQ IDNO:25)的两条氨基酸链组成，其间通过两个二硫键桥连接在一起。在A链中的第三个二硫键桥将A链的第6个和第11个残基连接在一起。在大多数物种中，A链和B链的长度和氨基酸组成是相似的，并且这三个二硫键的位置是高度保守的。出于这个原因，可以使用猪胰岛素替代糖尿病患者中缺乏的人胰岛素水平。今天，猪胰岛素在很大程度上已经被由细菌大量生产的人胰岛素原(重组胰岛素)所替代。

胰岛素分子具有在溶液中形成二聚体的倾向，并且在存在锌离子时，胰岛素二聚体结合成六聚体。尽管胰岛素单体易于通过血液扩散并且迅速起效，但是六聚体扩散缓慢并且延迟起效。在重组胰岛素的设计中，可以从降低胰岛素分子形成二聚体和六聚体趋势的方式对胰岛素的结构进行修饰，但是其不会妨碍与胰岛素受体的结合。采用这种方式，制成了一系列从短效到长效的制剂。

在内质网中，胰岛素原暴露于若干特定的肽酶，其除去C-肽并产生胰岛素的成熟和活性形式。在高尔基体中，胰岛素和游离的C-肽包装进入分泌颗粒，其累积在β-细胞的细胞质中。该颗粒的胞吐作用被葡萄糖进入β-细胞触发。胰岛素的分泌对代谢具有广泛的影响。

存在两个阶段的胰岛素释放以响应血糖升高。第一个阶段是胰岛素的立即释放。其归因于储存在分泌颗粒中的预先形成的胰岛素的释放。在短期延迟后，出现第二个、持续更久的新合成胰岛素的释放。

一旦释放后，在其被酶降解前胰岛素的活性仅能持续非常短的时间。发现位于与肝脏和肾脏中的胰岛素酶破坏在血浆中循环的胰岛素，并且作为结果，胰岛素的半衰期仅为约6分钟。这种较短的作用持续时间导致循环中胰岛素水平的迅速变化。

已研发得到的具有改善的治疗性质的胰岛素类似物(Owens等，2001,Lancet 358:739-46；Vajo等，2001,Endocr Rev 22:706-17)，并且可以在本发明中使用此类类似物。不同的策略，包括延长胰岛素B-链的COOH-末端和对白蛋白具有牢固的亲和性的工程化脂肪酸-乙酰化胰岛素均用于生产长效胰岛素类似物。然而，使用可用的更长效胰岛素化合物的体内治疗仍会导致较高频率的低血糖和高血糖偏移以及HbA1c适度降低。因此，研发真正的长效和稳定的人胰岛素类似物仍是一项重要任务。

可以依据本发明使用的胰岛素功能类似物包括速效类似物如赖脯胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素，其在皮下注射后迅速吸收(<30分钟)，在1小时达峰，并且具有相对短的作用持续时间(3至4小时)。此外，已研发得到了两种长效胰岛素类似物：甘精胰岛素和地特胰岛素，并且其可以与本发明联用。该长效胰岛素类似物在约2小时起效，在4至6小时达到生物学作用平台，并且可以持续达24小时。

因此，在一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有赖脯胰岛素(也称为HUMALOG,Eli Lilly)的A链和/或B链。赖脯胰岛素与人胰岛素的差别在于胰岛素B链28位的脯氨酸被赖氨酸取代和29位的赖氨酸被脯氨酸取代。尽管这些修饰不会改变受体结合，但是有助于胰岛素二聚体和六聚体的去稳定化，允许餐时注射后活化的单体胰岛素更加迅速的释放。然而，仍有必要对这些胰岛素进行制剂，使得其作为二聚体和多聚体存在于溶液中以提供长期稳定性。因此，在一些实施方式中，将赖脯胰岛素的A链和B链与本申请所述的针对速效的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将赖脯胰岛素与本申请所述的持续释放胰岛素融合共配制。

在另一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有门冬胰岛素(也称为NOVOLOG,Novo Nordisk)的A链和/或B链。门冬胰岛素被设计为人胰岛素B链28位的氨基酸脯氨酸被天冬氨酸的单一取代。该修饰有助于阻止胰岛素六聚体的形成，以形成更加速效的胰岛素。因此，在一些实施方式中，将门冬胰岛素的A链和B链序列与本申请所述的针对速效的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将门冬胰岛素与本申请所述的持续释放胰岛素融合共配制。

在又一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有赖谷胰岛素(也称为APIDRA,Sanofi-Aventis)的A链和/或B链。赖谷胰岛素是通过人胰岛素B链3位的天冬酰胺被赖氨酸取代和29位的赖氨酸被谷氨酰胺取代形成的短效类似物。与常规人胰岛素相比，赖谷胰岛素起效更为迅速和作用持续时间更短。因此，在一些实施方式中，将赖谷胰岛素的A链和B链与本申请所述的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将赖谷胰岛素与本申请所述的持续释放胰岛素融合共配制。

在另一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有甘精胰岛素(也称为LANTUS,Sanofi-Aventis)的A链和/或B链。LANTUS具有延迟的吸收，由于其酸性pH导致其在中性生理pH下形成胰岛素晶体的微沉淀。甘精胰岛素与人胰岛素的差异为A链21位的天冬酰胺被甘氨酸取代并且B-链的C-末端添加了两个精氨酸。与睡时使用的中性鱼精蛋白锌(NPH)胰岛素(中效胰岛素)相比，甘精胰岛素在2型糖尿病患者中与更少的夜间低血糖相关。因此，在一些实施方式中，将甘精胰岛素的A链和B链序列与本申请所述的用于持续释放的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将甘精胰岛素与本申请所述的速效胰岛素融合共配制。

在又一个实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以含有地特胰岛素(也称为LEVEMIR,Novo Nordisk)的A链和/或B链。地特胰岛素是可溶性(在中性pH)长效胰岛素类似物，其中在B30的氨基酸苏氨酸被除去并且14-碳、肉豆蔻酰脂肪酸被乙酰化为LysB29的ε-氨基。皮下注射后，地特胰岛素解离，从而暴露能可逆性地与白蛋白分子结合的游离脂肪酸。这样在稳态时，游离未结合胰岛素的浓度极大地降低导致稳定的血浆葡萄糖水平。因此，在一些实施方式中，将地特胰岛素的A链和B链序列与本申请所述的用于持续释放的融合蛋白策略联用。在其他实施方式中，将地特胰岛素与本申请所述的速效胰岛素融合共配制。

在一些实施方式中，胰岛素氨基酸序列可以是单链胰岛素类似物(SIA)(例如，如美国专利6,630,438和WO 2008/019368所述，其全部内容通过引用并入本申请)。单链胰岛素类似物包含一组结构相关的蛋白，其中A链和B链通过多肽接头共价连接。所述多肽接头将所述B链的C-末端与所述A链的N-末端连接。所述接头可以是任意长度，只要所述接头提供对SIA具有葡萄糖摄取和胰岛素受体结合效应所必须的结构构象即可。在一些实施方式中，所述接头的长度为约5-18个氨基酸。在其他实施方式中，所述接头的长度为约9-15个氨基酸。在某些实施方式中，所述接头为约12个氨基酸长。在某些示例性实施方式中，所述接头具有序列KDDNPNLPRLVR(SEQ ID NO:26)或GAGSSSRRAPQT(SEQ ID NO:27)。然而，应理解该序列的多种变体是可能的，如基本上不会损失所产生的SIA在葡萄糖摄取和胰岛素受体结合活性方面作用的长度(添加和缺失)和氨基酸取代。例如，可以在任一末端添加或除去基本上不会降低所产生的SIA活性的若干不同的氨基酸残基。

目前在临床上研发的示例性单链胰岛素类似物是albulin(Duttaroy等，2005,Diabetes 54:251-8)。Albulin能够在酵母或哺乳动物细胞中生产。其由通过十二肽接头连接在一起的人胰岛素的B链和A链组成(与天然人胰岛素具有100％的一致性)并且融合至天然人血清白蛋白的NH2末端。对于albulin的表达和纯化而言，使用四重叠引物和PCR扩增构建编码单链胰岛素的合成基因，所述单链胰岛素包括由十二肽接头连接在一起的成熟人胰岛素的B链和A链。将所得到的PCR产物连接在人血清白蛋白(HSA)单肽和成熟HSA的NH2末端之间的框架中，其包含于用于在酵母中表达的pSAC35载体中。根据本发明，abulin的HSA成分可以被如本申请所述的提供持续释放的氨基酸序列所取代。

因此，在一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含提供改进的治疗性质(例如持续释放或减少多聚体形成)的氨基酸序列，包括例如，弹性蛋白样肽(ELP)，和胰岛素氨基酸序列。例如，在某些实施方式中，所述胰岛素是哺乳动物胰岛素，如人胰岛素或猪胰岛素。根据本发明，可以将提供持续释放或减少多聚体形成的氨基酸序列与胰岛素的A链、或B链或者这两者偶联(例如通过重组融合或化学缀合)。在一些实施方式中，将提供从注射部位缓慢吸收的氨基酸序列与胰岛素A链共价结合。所述胰岛素可以含有胰岛素原并且包含A链、B链和C链中的每一个，或者可以含有仅含A链和B链的加工形式。在一些实施方式中，A链和B链通过短连接肽连接以形成单链胰岛素。所述胰岛素可以是人胰岛素的功能性类似物，包括在(A链和B链之一或这两者的)N-末端和/或C-末端截短或延伸1至10个氨基酸，包括1、2、3或约5个氨基酸的功能性片段。功能性类似物相对于天然序列而言(例如SEQ ID NO:24和25)可以含有1至10个氨基酸插入、缺失和/或取代(共同地)，并且在各情况下均保留肽的活性。例如，所述胰岛素B链的位置3、28、29和30以及A链的位置21可以被取代，包括被K3、G21、K28、D28、P29、Q29取代。在一些实施方式中，在B链的C-末端加入1至5个氨基酸，或可以除去B链的T30。此类改变可以任选地对应于赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素和地特胰岛素的序列。因此，功能性类似物相对于天然序列而言(其可以含有A链和B链，或者A链、B链和C链)可以具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失和/或取代(共同地)并且在一些实施方式中可以进一步支持迅速起效或延迟起效。可以使用任意可用的检测确证或测定此类活性，包括本申请所述的那些。在这些或其他实施方式中，所述胰岛素链具有与A链和B链的各天然序列(SEQ IDNOS:24和25)具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸序列。可以使用任意比对工具确定两条序列之间的序列同一性(例如天然序列和功能性类似物)，包括Tatusova等，Blast 2序列-一种用于比较蛋白和核苷酸序列的新工具,FEMS Microbiol Lett.174:247-250(1999)。所述胰岛素成分可以含有本领域公知的其他化学修饰。

在一些实施方式中，本发明提供了基础胰岛素和餐时胰岛素的联用疗法，包括本申请所述的速效和延迟起效胰岛素疗法的任意组合，并且其中至少一种此类试剂具有提供使多聚体形成丧失或持续释放的融合伴侣。在一些实施方式中，至少一种试剂是甘精胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、单链胰岛素类似物(SIA)和albulin。

为了表征胰岛素类似物或含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素类似物的体外结合性质，可以在多种表达胰岛素受体的细胞系中进行竞争结合检测(Jehle等，1996,Diabetologia 39:421-432)。例如，可以使用过表达人胰岛素受体的CHO细胞进行竞争结合检测。胰岛素还能够与低于胰岛素受体的亲和性与IGF-1受体结合。为确定含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素类似物的结合亲和性，可以在L6细胞中使用¹²⁵I-标记的IGF-1进行竞争结合检测。

胰岛素的活性包括刺激外周葡萄糖处置和抑制肝脏葡萄糖产生。可以使用公知的方法在体外检测含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素类似介导这些生物活性的能力。例如，可以测定含有提供持续释放的氨基酸序列的类似物在3T3-L1脂肪细胞中对葡萄糖摄取的作用并且将其与胰岛素比较。使用具有生物活性的类似物对细胞进行预处理将通常产生剂量依赖性的2-脱氧葡萄糖摄取增加。可以在任意数量的细胞类型例如H4IIe肝细胞瘤细胞中测定含有提供持续释放的氨基酸序列的胰岛素调节葡萄糖产生的能力。在这项检测中，使用具有生物活性的类似物进行预处理将通常产生剂量依赖性的所释放的葡萄糖量的抑制。

提供持续释放和/或多聚体形成丧失的氨基酸序列

在一些实施方式中，提供持续释放的氨基酸序列包含通过蛋白主链基团和/或侧链基团形成氢键的结构单元，并且其可能有助于形成基质的疏水性相互作用相关。在一些实施方式中，所述氨基酸侧链不含有氢键供体基团，其氢键基本上通过蛋白主链形成。示例性的氨基酸包括脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸和异亮氨酸，以及类似的氨基酸。在一些实施方式中，所述结构单元是基本上重复的结构单元，以形成基本上重复的结构基序和基本上重复的氢键结合力。在这些和其他实施方式中，所述氨基酸序列包含至少10％、至少20％、至少40％或至少50％的脯氨酸，其可能位于一种模式中。所述脯氨酸的模式可以形成重复的β-转角结构，或形成具有少的或无定义的二级结构的伸展构象(例如无β片层或α螺旋)。在这些实施方式中，将所述融合伴侣定义为随机卷曲构象。在这种情况下，脯氨酸残基的模式指氨基酸序列至少50％或至少75％的脯氨酸残基是可定义的单元或主序列部分。在其他实施方式中，所述氨基酸序列包含具有氢键供体侧链的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸。在一些实施方式中，所述重复序列可以含有1至约4个脯氨酸残基，其余的残基独立地选自非极性残基，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。非极性或疏水性残基可能有助于形成基质的疏水性相互作用。

在这些实施方式中，所述氨基酸序列在高于贮存温度的温度下注射后可以形成“凝胶-样”状态。具有重复肽单元的示例性序列在较低温度下可能是相对非结构化的，并且在较高的温度下实现氢键键合的结构化状态。

在一些实施方式中，在体温下能够形成所述基质的氨基酸序列是具有4至10个氨基酸的重复单元的肽。所述重复单元在基质形成中可以形成1、2或3个氢键。在某些实施方式中，在体温下能够形成所述基质的氨基酸序列是丝蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白或角蛋白的氨基酸序列，或其模拟物，或者在美国专利6,355,776中所公开的氨基酸序列，其通过引用并入本申请。

在某些实施方式中，所述氨基酸序列是弹性蛋白样蛋白(ELP)序列。所述ELP序列包含或由于弹性蛋白相关或模拟其的结构肽单元或序列组成。所述ELP序列由3至约20个氨基酸，或者在一些实施方式中，由4至10个氨基酸的结构单元构成，如4、5或6个氨基酸。各结构单元的长度可以是变化的，也可以是均一的。示例性的结构单元包括SEQ ID NOS:1-12(如下文所示)所定义的单元，可以将其作为重复结构单元使用，包括串联重复单元，或者可以将其在一些组合中使用。因此，所述ELP可以包括或基本上由选自如下文所定义的SEQ ID NOS:1-12的结构单元组成。

在一些实施方式中，包括其中的结构单元是ELP单元的实施方式，所述氨基酸序列包含或基本上由约50至约500个结构单元组成，或者在某些实施方式中约50至约200个结构单元，或者在某些实施方式中约80至约180个结构单元，或者约100至约150个结构单元，如SEQ ID NOS:1-12所定义的一个单元或其组合。因此，所述结构单元共同地可以具有约50至约2000个氨基酸残基，或者约100至约800个氨基酸残基，或者约200至约700个氨基酸残基，或者约400至约600个氨基酸残基，或者约400至约1000个氨基酸残基，或者约500至约1000个氨基酸残基，或者约600至约1000个氨基酸残基，或者约700至约1000个氨基酸残基的长度。

所述氨基酸序列可以显示出具有选定制剂的可见或可逆的反相转化。也就是说，在低于转变温度(Tt)时，所述氨基酸序列在所述制剂中可能是结构混乱和高度可溶的，但是当所述制剂的温度上升至高于Tt时，其显示出尖锐的(2-3℃范围)无序至有序的相转变。除了温度以外，氨基酸聚合物的长度、氨基酸组成、离子强度、pH、压力、温度、选定的溶剂、存在的有机溶质和蛋白浓度也可以影响转变性质，并且这些可以针对所需的吸收性质在制剂中定制。可以通过确定胰岛素氨基酸序列的血浆浓度或随时间的活性容易地对吸收性质进行检测。

在某些实施方式中，所述ELP成分可以形成结构单元，包括但不限于：

(a)四肽Val-Pro-Gly-Gly，或VPGG(SEQ ID NO:1)；

(b)四肽Ile-Pro-Gly-Gly，或IPGG(SEQ ID NO:2)；

(c)五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO:3)，或VPGXG，其中X是任意天然的或非天然的氨基酸残基，并且其中X任选地在多聚物或寡聚物重复之间改变；

(d)五肽Ala-Val-Gly-Val-Pro，或AVGVP(SEQ ID NO:4)；

(e)五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly，或IPGXG(SEQ ID NO:5)，其中X是任意天然的或非天然的氨基酸残基，并且其中X任选地在多聚物或寡聚物重复之间改变；

(f)五肽Ile-Pro-Gly-Val-Gly，或IPGVG(SEQ ID NO:6)；

(g)五肽Leu-Pro-Gly-X-Gly，或LPGXG(SEQ ID NO:7)，其中X是任意天然的或非天然的氨基酸残基，并且其中X任选地在多聚物或寡聚物重复之间改变；

(h)五肽Leu-Pro-Gly-Val-Gly，或LPGVG(SEQ ID NO:8)；

(i)六肽Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，或VAPGVG(SEQ ID NO:9)；

(j)八肽Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly，或GVGVPGVG(SEQ ID NO:10)；

(k)九肽Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly，或VPGFGVGAG(SEQ IDNO:11)；和

(l)九肽Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly，或VPGVGVPGG(SEQ IDNO:12)。

由SEQ ID NO:1-12定义的此类结构单元可以形成结构重复单元，或者可以联合使用以形成ELP。在一些实施方式中，所述ELP成分完全(或几乎完全)由选自SEQ ID NO:1-12的结构单元中的一个或其组合(例如2、3或4个)形成。在其他实施方式中，至少75％、至少80％或至少90％的ELP成分由选自SEQ ID NO:1-12的结构单元中的一个或其组合形成，并且其可以以重复单元的形式存在。

在某些实施方式中，所述ELP包含Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO:3)的重复单元，其包括串联重复单元，其中X如上文所定义，并且Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO:3)单元的百分率相对于整个ELP成分(其可以包含VPGXG(SEQ ID NO:3)以外的结构单元)高于所述ELP的约50％、或者高于约75％、或者高于约85％、或者高于约95％。所述ELP可以含有SEQ ID NO:3的基序，其客体残基X在所述基序中在至少2个或至少3个单元之间变化。所述客体残基可以独立地选自例如非极性或疏水性残基，如氨基酸V、I、L、A、G和W(并且可以对其进行选择以保留所需的反相转变性质)。

在一些实施方式中，所述ELP可以形成β-转角结构。适于形成β-转角结构的示例性肽序列如国际专利申请PCT/US96/05186中所述，其通过全文引用并入本申请。例如，可以对序列VPGXG(SEQ ID NO:3)中的第4个残基(X)进行改变，而不会消除β-转角的形成。

可以使用表示法ELPk[XiYj-n]描述示例性ELP的结构，其中k表示特定的ELP重复单元，括号内的大写字母是单字母氨基酸代码，其相应的下标表示各客体残基X在结构单元中(在适用的情况下)的相对比例，以及n以结构重复数描述ELP的总长。例如，ELP1[V5A2G3-10]表示含有10个五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)重复单元的ELP成分，其中X是相对比例为约5:2:3的缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；ELP1[K1V2F1-4]表示含有4个五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)重复单元的ELP成分，其中X是相对比例为约1:2:1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELP1[K1V7F1-9]表示含有9个五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)重复单元的多肽，其中X是相对比例为约1:7:1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELP1[V-5]表示含有5个五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP1[V-20]表示含有20个五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP2[5]表示含有5个五肽AVGVP(SEQID NO:4)重复单元的多肽；ELP3[V-5]表示含有5个五肽IPGXG(SEQ ID NO:5)重复单元的多肽，其中X是缬氨酸；ELP4[V-5]表示含有5个五肽LPGXG(SEQ ID NO:7)重复单元的多肽，其中X是缬氨酸。

关于ELP，Tt是客体残基疏水性的函数。因此，通过改变客体残基的一致性及其摩尔分数，可以合成出在较宽范围内显示出反相转变的ELP。因此，可以通过在ELP序列中引入更高分数的疏水性客体残基在给定ELP长度降低Tt。适宜的疏水性客体残基的示例包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨基酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可以使用具有中度疏水性的酪氨酸。相反地，可以通过引入残基增加Tt，如选自下述的那些：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。

对于分子量>100,000的多肽而言，在PCT/US96/05186中(其通过全文引用并入本申请)披露的亲水性指数提供了用于预测特定ELP序列大致Tt的一种方法。对于分子量<100,000的多肽而言，可以通过下述二次函数预测或确定Tt：Tt＝M0+M1X+M2X2，其中X是融合蛋白的MV，和M0＝116.21；M1＝-1.7499；M2＝0.010349。

在一些实施方式中对ELP进行选择或设计以使得在制剂条件下Tt的范围为约10至约37℃，如约20至约37℃，或者约25至约37℃，或者约30至约37℃。在一些实施方式中，考虑到外周温度略有降低，在生理条件下(例如0.9％生理盐水)的转变温度为约32至36℃(或者大约或在35至36℃范围内)。

在一些实施方式中，具有氢键结合力的氨基酸序列具有足够短和/或少的疏水性，以便有效避免胰岛素多聚体的形成，同时不诱导持续释放的功能。例如，当使用ELP融合时，“速效”胰岛素可以含有约5至约50个ELP单元，如约10至约30个ELP单元，如约10、约15、约20或约25个ELP单元，或约30个ELP单元。

在不同实施方式中，提供速效作用的融合伴侣可以具有5至200个氨基酸，如约50至约150个氨基酸，以抑制胰岛素多聚体(例如六聚体)形成。在一些实施方式中，所述融合伴侣具有伸展构象，其可以形成随机卷曲或重复的β-转角构象，其可能是由于在所述氨基酸序列中脯氨酸残基的模式导致的。在一些实施方式中，所述融合伴侣的序列含有低于约35％、低于约30％、或低于约25％、或低于约20％的疏水性残基(不包括丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸作为疏水性残基)。例如，疏水性残基在这个上下文中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。六聚体形成减少或消除的序列应不诱导从注射部位的持续释放，或在体温或以下显示出反相相转变。所述序列的作用应为在生理相容性溶液中稳定单体或基本上单体形式的胰岛素。

在一些实施方式中，提供速效作用的融合含有1至约10个带负电的氨基酸，如谷氨酸和/或天冬氨酸以增加融合伴侣的负电荷和降低其疏水性。在一些实施方式中，可以将此类残基插入ELP结构单元之间。在一些实施方式中，所述ELP包含约10至约25个ELP单元(例如SEQ ID NOS:1-12)，如VPGXG单元(SEQ ID NO:3)，其中X独立地选自V、G和A，其中G和A作为客体残基(例如在约1或2个以内)以大致相等的量存在，和存在的V比G或A高约2至约3倍。或者，所述ELP单元是AVGVP(SEQ ID NO:4)。例如，用于速效胰岛素的示例性融合伴侣通过SEQ ID NO:16(图18)或SEQ IDNO:17(图20)示例。在其他实施方式中，所述ELP包含约10至约25个VPGXG单元(SEQ ID NO:3)，其中X独立地选自V、G和A，其中G和A作为客体残基(例如在约1或2个以内)以大致相等的量存在，和存在的V比G或A低约2至约3倍。例如，用于速效胰岛素的示例性融合蛋白通过SEQ IDNO:18(图22)或SEQ ID NO:19(图24)或SEQ ID NO:21(图28)或SEQID NO:22(图30)示例。在其他实施方式中，所述ELP包含如上所述的约10至约25个VPGXG单元(SEQ ID NO:3)，其中将带有正电荷的残基插入所述ELP单元的部分之间，例如约2至约6个位置(例如约3、4或5个位置)。根据这些实施方式的示例性融合伴侣如图26所示(SEQ ID NO:20)。或者，可以将带正电荷的残基作为所述ELP序列的一个或多个客体残基插入，或者将其插入所述ELP单元的其他位置。

在一些实施方式中，提供持续释放和速效的所述融合蛋白可以作为“分离”融合在一起生产，并且在通过蛋白酶(例如胰酶)作用的加工过程中释放。此类设计如图33所示(SEQ ID NO:23)。在此类实施方式中，速效和持续作用胰岛素的1:1共制剂(或者定义的其他摩尔比)能够方便的制备。在不同实施方式中，所述分离构建体包含1至5个速效胰岛素单元(例如1或2个)和1至5个(例如1或2个)持续释放胰岛素单元，其均通过蛋白酶裂解位点连接。

在示例性实施方式中，能够在体温下形成氢键基质的氨基酸序列(例如结果导致持续释放)包含[VPGXG]₉₀(SEQ ID NO:28)，其中各X选自V、G和A，并且其中V:G:A的比例可以是约5:3:2。例如，能够在体温下形成氢键基质的氨基酸序列可以包含[VPGXG]₁₂₀(SEQ ID NO:29)，其中各X选自V、G和A，并且其中V:G:A的比例可以是约5:3:2。该ELP的120个结构单元能够提供约5至15mg/ml(例如约10mg/ml)蛋白的约37℃的转变温度。在约40至约100mg/mL浓度下，转变温度为约33、或约34、或约35、或约36摄氏度(略低于体温)，其考虑到外周体温略低于37℃。

或者，能够在体温下形成所述基质的氨基酸序列包含[VPGVG]₉₀(SEQ IDNO:28或[VPGVG]₁₂₀(SEQ ID NO:29)。如本申请所示，该ELP的120个结构单元能够提供约0.005至约0.05mg/ml(例如约0.01mg/ml)蛋白的约37℃的转变温度。

可以如美国专利公开号2010/0022455中的描述制备弹性蛋白样肽(ELP)蛋白聚合物和重组融合蛋白，其通过引用并入本申请。

在其他实施方式中，能够在体温下形成所述基质的氨基酸序列可以包括随机卷曲和非球状伸展结构。例如，能够在体温下形成所述基质的氨基酸序列可以包含美国专利公开号No.2008/0286808、WIPO专利公开号No.2008/155134和美国专利公开号No.2011/0123487中公开的氨基酸序列，其均通过引用并入本申请。在一些实施方式中，能够在体温下形成所述基质的氨基酸序列可以是主要由脯氨酸和一个或多个丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸残基组成。在一些实施方式中，能够在体温下形成所述基质的氨基酸残基含50％、或60％、或70％、或75％、或80％、或90％的脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸残基(共同地)。

例如，在一些实施方式中，所述氨基酸序列包含至少40个氨基酸的非结构化重组多肽。例如，可以将所述非结构化的聚合物定义为在所述非结构化聚合物中包含的甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基之和，其构成了氨基酸总量的约80％以上。在一些实施方式中，至少50％的氨基酸缺乏根据Chou-Fasman算法确定的二级结构。所述非结构化的聚合物可以包含超过约100、150、200个或者更多个连续的氨基酸。在一些实施方式中，所述氨基酸序列形成随机卷曲结构域。特别地，具有或形成“随机卷曲构象”的多肽或氨基酸聚合物基本上缺乏确定的二级和三级结构。

在不同实施方式中，所述目标对象是人，并且所述体温是约37℃，并且因此将所述药物组合物设计为在此温度下提供持续释放。缓慢释放进入循环以及氢键的逆转和/或疏水性相互作用由在注射部位产物扩散的浓度下降所驱动，尽管体温仍保持恒定。在其他实施方式中，所述对象是非人哺乳动物，并且将所述药物组合物设计为在所述哺乳动物的体温下显示出持续释放，其可以是约30至约40℃。在一些实施方式中，如针对某些家养宠物(例如狗或猫)或家畜(例如奶牛、马、绵羊或猪)。在通常情况下，Tt高于制剂的贮存条件(其可以是10至约25℃，或者15至22℃)，这样所述药物组合物仍是注射用溶液。

在一些实施方式中，缓释受到给予本发明药物组合物冷制剂(例如2-15℃，或2-10℃，或2-5℃)的影响。因此，在一些实施方式中，提供冷制剂。冷制剂可以在约2至约3℃、约2至约4℃、约2至约5℃、约2至约6℃、约2至约7℃、约2至约8℃、约2至约10℃、约2至约12℃、约2至约14℃、约2至约15℃、约2至约16℃、约2至约20℃、约10至约25℃或15至22℃施用。

持续释放性质

在一个方面，本发明提供了一种持续释放(例如长效)药物制剂。所述制剂包含系统性施用的药物组合物，其中所述药物组合物包含胰岛素氨基酸序列和如本申请所述的能够在对象的体温下形成可逆基质(即提供持续释放的氨基酸序列)的氨基酸序列。所述可逆基质由氢键(例如分子内和/或分子间氢键)和疏水性作用形成。所述制剂还包含诱导所述基质在施用时形成的一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。所述基质提供从注射部位向循环中的缓慢吸收。从注射部位的持续释放或缓慢吸收是由于随着注射部位的浓度分散所述基质的缓慢逆转导致的。一旦产品移动进入循环，该制剂赋予其长的半衰期和改善的稳定性。因此，实现了缓慢吸收和较长半衰期的独特组合，这导致产生了具有低峰谷比值和/或较长Tmax的理想PK性质。

特别地，本发明针对基础胰岛素提供了改善的药代动力学性质，包括具有低峰谷比值和/或长Tmax的相对平缓的PK性质。该PK性质可以维持相对不频繁的给药方案，如在一些实施方式中每月注射1至8次。在一些实施方式中，所述基础胰岛素的PK性质适于每周注射一次或每日注射一次，其提供了每天至少约15小时、至少约20小时或约24小时，和每周至少约4天、至少约5天、至少约6天或约7天的大量生物学作用。

在一个方面，本发明提供了持续释放药物制剂。所述制剂包括用于系统性施用的药物组合物，其中所述药物组合物包含胰岛素氨基酸序列和能够在受试者的体温下形成基质的氨基酸序列。所述可逆基质自氢键(例如分子内和/或分子间氢键)和疏水性贡献形成。所述制剂还包含诱导所述基质在施用时形成的一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。所述基质提供从注射部位向循环中的缓慢吸收，并且不受理论的束缚，这种缓慢吸收是由于随着注射部位的蛋白浓度的降低所述基质的缓慢逆转导致的。该缓慢吸收的性质提供了平缓的PK性质，以及方便和舒适的给药方案。例如，在不同实施方式中，使用每日或每周持续释放产品，所述胰岛素氨基酸序列的血浆浓度在这些天内(例如2至约60天，或约4至约30天)不会改变超过10倍、或超过约5倍、或超过约4倍或者约3倍。在通常情况下，这种平缓的PK性质可见于多次(基本上是均等间隔的)施用中，如至少2次、至少5次或至少10次施用该制剂。在一些实施方式中，所述缓慢吸收显示出Tmax(至最高血浆浓度时间)高于约1小时、高于约2小时、高于约5小时或者高于约10小时。

从注射部位的持续释放或缓慢吸收受到能够在对象的体温下形成氢键基质的氨基酸序列以及该制剂成分的控制。

所述制剂包含诱导所述基质在施用时形成的一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。例如，此类赋形剂包括盐和可以稳定氢键的其他赋形剂。示例性的盐包括碱土金属盐，如钠、钾和钙。抗衡离子包括氯和磷酸盐。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙和磷酸钾。

通过定制的制剂中的蛋白浓度以及赋形剂驱动在施用温度下基质的形成。例如，较高的蛋白浓度有助于驱动所述基质的形成，并且针对这一目的的所需蛋白浓度的变化取决于所使用的ELP系列。例如，在使用ELP1-120或者具有可比性的转变温度的氨基酸序列的实施方式中，蛋白在约10mg/mL至约200mg/mL的范围中存在，或者在约50mg/mL至约150mg/mL的范围中存在。在示例性实施方式中，本发明提供了包括治疗剂的持续释放的药物制剂，所述治疗剂(例如肽或蛋白治疗剂)包含胰岛素氨基酸序列和含有[VPGXG]₉₀(SEQ ID NO:28)或[VPGXG]₁₂₀(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列，其中各个X选自V、G和A。V、G和A可以以约5:3:2的比例存在。

所述药物组合物在pH、离子强度和通常地赋形剂足以驱动在体温下(例如37℃，或者在一些实施方式中32至36℃)形成所述基质的条件下制剂。通常将所述药物组合物制成在贮存条件下不形成所述基质。贮存条件通常低于所述制剂的转变温度，如低于约32℃，或低于约30℃，或低于约27℃，或低于约25℃，或低于约20℃，或低于约15℃。例如，所述制剂可以与血液是等张的，或具有模拟生理条件的离子强度。例如，所述制剂的离子强度可以是至少25mM氯化钠、或至少30mM氯化钠、或至少40mM氯化钠、或至少50mM氯化钠、或至少75mM氯化钠、或至少100mM氯化钠、或至少150mM氯化钠。在某些实施方式中，所述制剂的离子强度低于约0.9％的生理盐水。在一些实施方式中，所述制剂包含氯化钙、氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠和磷酸氢二钠中的两种或多种。在某些实施方式中，所述制剂可以包含约50mM组氨酸、或约40mM组氨酸、或约30mM组氨酸、或约25mM组氨酸、或约20mM组氨酸、或约15mM组氨酸。所述液体制剂可以包含约100mM氯化钠和约20mM组氨酸，并且可以将其冷藏或在室温下保存。可以调整盐浓度以提供在注射部位的等张性。

可以将所述制剂包装成用于每周一次、每周两次、或每月1至8次施用的预先设定剂量的笔或注射器形式，或者将其灌装在常规的药瓶中等等。

还可以使用其他制剂成分例如以达到所需的稳定性。此类成分包括氨基酸或糖醇(例如甘露醇)、防腐剂和缓冲剂中的一种或多种，以及本领域公知的此类成分。

在一些实施方式中，所述制剂约每日施用一次，可以皮下或肌肉内施用。

速效性质(Rapid Onset Profile)

在一个方面，本发明提供了速效胰岛素制剂。所述制剂包含用于系统性施用的药物组合物，其中所述药物组合物包含胰岛素氨基酸序列和如所描述的能够抑制胰岛素多聚体形成的氨基酸序列。单体状态在所述制剂中是稳定的，其能够使胰岛素活性迅速起效，并且适于提供餐时胰岛素。

特别地，所述速效胰岛素显示出在1小时内降低葡萄糖的作用，在不同实施方式中，在约30分钟内，或在约15分钟内，或在约10分钟内，或在约5分钟内。在一些实施方式中，在约1小时、或约30分钟显示出最大作用。该作用基本上不能持续超过约6小时、或超过约5小时、或超过约4小时，从而使得该药剂和制剂适于提供餐时胰岛素，并且补充持续的(例如基础)胰岛素产品。

所述制剂包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂，其稳定所述速效胰岛素的单体状态，并且在一些实施方式中，其与使得持续作用胰岛素在体内相转变是相同的条件，从而在实际中能够进行共配制。例如，此类赋形剂包括盐，包括碱土金属盐如钠、钾和钙。抗衡离子包括氯和磷酸盐。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙和磷酸钾。

在所述制剂中的蛋白浓度可以是约10mg/mL至约200mg/mL，或者以约50mg/mL至约150mg/mL的范围存在。所述药物组合物可以以约10mg/mL至约50mg/mL的范围存在。示例性的速效胰岛素构建体包括SEQ ID NOS：16、17、18、19、20、21和22，或者具有相同或相似分子量(例如约10％之内)的类似构建体。在一些实施方式中，所述制剂包含摩尔比为1:1的基础和速效胰岛素。

所述制剂可以包装成预先设定剂量的笔或注射器，或者常规药瓶的形式，用于每日施用一次、两次或三次。

还可以使用其他制剂成分例如以达到所需的稳定性。此类成分包括氨基酸或糖醇(例如甘露醇)、防腐剂和缓冲剂中的一种或多种，以及本领域公知的此类成分。

缀合和偶联

根据本发明的某些实施方式，重组生产的融合蛋白包括提供持续释放或减少多聚体形成的氨基酸序列(例如ELP)和胰岛素氨基酸序列，其通过基因融合彼此连接。例如，所述融合蛋白可以由多核苷酸的翻译产生，所述多核苷酸编码在框架中克隆的胰岛素氨基酸序列所编码和提供持续释放成分的氨基酸序列。

在某些实施方式中，可以使用不同长度的接头肽将融合伴侣的氨基酸序列与胰岛素氨基酸序列融合，以提供融合蛋白之间具有更高程度的物理分离和允许更大的空间移动性，从而使得用于与其受体结合的胰岛素氨基酸序列的易接近性达到最大。所述接头肽可以由柔性的或具有更高刚性的氨基酸组成。例如，柔性接头可以包括具有相对较小侧链的氨基酸，并且其可以是亲水性的。不具有限制性的，所述柔性接头可以包括甘氨酸和/或丝氨酸残基。更高刚性的接头可以含有例如具有更高空间位阻的氨基酸侧链，如(不限于)酪氨酸和组氨酸。所述接头可以小于约50、40、30、20、10或5个氨基酸残基。所述接头可以共价连接至并且在胰岛素氨基酸序列和提供持续释放成分的氨基酸序列之间，例如通过重组融合。

所述接头或肽间隔可以是蛋白酶可裂解的或不可裂解的。举例来说，可裂解的肽间隔包括，但不限于，被不同类型的蛋白酶(体外或体内)识别的肽序列，如Tev、凝血酶、因子Xa、纤溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶、和在其他身体腔隙中发现的蛋白酶。在使用可裂解接头的一些实施方式中，所述融合蛋白可以是没有活性的、低活性的、或作为融合时低效能降的，然后通过在体内裂解所述间隔将其活化。或者，当所述胰岛素的氨基酸序列作为融合足以活化时，可以使用不可裂解的间隔。所述不可裂解的间隔可以是任意适宜的类型。

在其他实施方式中，本发明提供了胰岛素氨基酸序列和提供持续释放和降低的多聚体功能的氨基酸序列的化学缀合物。所述缀合物可以通过将提供持续释放成分的氨基酸序列与胰岛素氨基酸序列化学偶联，或者通过本领域的公知的任意数量的方法固相合成所需的序列制备(参见例如，Nilsson等，2005,Ann Rev Biophys Bio Structure 34:91-118)。在一些实施方式中，所述化学缀合物可以通过将所述胰岛素氨基酸序列与提供持续释放成分的氨基酸序列共价连接形成，其直接或通过短或长的接头部分，通过治疗性proteinacious成分上的一个或多个官能团例如胺基、羧基、苯基、巯基或羟基形成共价缀合物。可以使用多种常见的接头，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、碳二亚胺、二(羟基琥珀酰亚胺)酯、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。

此外，非肽化学间隔可以是任意适宜的类型，包括例如生物缀合技术,Greg T.Hermanson，Academic Press,Inc.出版，1995中所描述的功能接头，和交联试剂技术手册，Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Illinois)中所提及的那些，其全部内容均通过全文引用并入本申请。示例性的化学间隔包括同双功能接头，其能够与Lys的胺基连接，以及异双功能接头连接，所述的异双功能接头能够在一个末端与Cys连接和在另一个末端与Lys连接。

在某些实施方式中，将在室温下(或人体体温，例如Tt>37℃)不转变的相对较小的ELP成分(例如小于约30kDa、25kDa、20kDa、15kDa或10kDa的ELP成分)化学偶联或交联。例如，可以将两个具有相同或不同性质的相对小的ELP成分化学偶联。在一些实施方式中，此类偶联可以发生在体内，通过在ELP的C-末端上或其周围加入单一的半胱氨酸残基。此类ELP成分可以分别与一个或多个胰岛素氨基酸序列融合，以便在靶点增加活性或亲合性。

治疗疾病的方法

在不同实施方式中，所述治疗提供持续的血糖控制。血糖控制指在糖尿病患者中典型的血糖(葡萄糖)水平。多种糖尿病的长期并发症，包括微血管并发症是由于多年的高血糖导致的。良好的血糖控制是糖尿病护理的重要目标。由于血糖水平在一天中是波动的并且葡萄糖记录并不是这些改变的完美指示，因此在糖尿病患者的研究试验和临床护理中使用用于糖基化的血红蛋白的百分率作为长期血糖控制的替代指标。在这项检测中，血红蛋白A1c或糖化血红蛋白(HbA1c)反映了之前2-3个月的平均葡萄糖值。

通过最常用的方法在具有正常的葡萄糖代谢的非糖尿病人群中，糖化血红蛋白水平通常为约4-6％(正常范围可能随着方法而改变)。“完美的血糖控制”指葡萄糖水平一直是正常的(例如约70–130mg/dl，或者约3.9-7.2mmol/L)并且不能区别非糖尿病人群。事实上，由于治疗措施是不完美的，即使“好的血糖控制”所描述的血糖水平在大多数时间里也是平均略高于正常水平的。值得注意的是所认为的“好的血糖控制”随着年龄和患者对低血糖的敏感性而改变。美国糖尿病协会建议患者和医师要努力将平均葡萄糖和血红蛋白A1c值控制在低于200mg/dl(11mmol/l)和8％。“差的血糖控制”指持续升高的血糖和糖化血红蛋白水平，其可能在严重并发症出现前的数月和数年间在例如约200–500mg/dl(约11-28mmol/L)和约9-15％或更高的范围内。

在不同实施方式中，本申请所述的本发明的药物组合物用于管理和护理患有疾病如糖尿病或高血糖或者任意其他状况的患者，对于这些患者胰岛素的施用适用于抗击或减轻这些状况的症状和并发症，其包括多种代谢病症。治疗包括施用本发明的药剂、组合物或制剂以阻止所述症状或并发症的起始、减轻所述症状或并发症，或者消除所述疾病、状况或病症。本方法包括治疗1型糖尿病，即机体不产生胰岛素并且因此不能控制血液中糖的量的状况，和2型糖尿病，即机体不能正确地使用胰岛素并其因此不能控制血液中糖的量的状况。在一些实施方式中，患者患有一种或多种糖尿病并发症，包括心血管并发症，或者在一些实施方式中患有代谢疾病和/或具有临床肥胖症或超重的特征。在一些实施方式中，患者(在治疗方案开始时)的HbA1c高于约12％、高于约10％、高于约9％、或高于约8.5、或高于约8％、或高于约7.5％、或高于约7.0、或高于约6.5。

由于所述活性剂消除或降低与IGF受体的相互作用，在一些实施方式中，本申请所述的活性剂特别适于长期疗法，包括进行多年的治疗(例如至少约2年、至少约3年、至少约5年、至少约10年或者更长时间)。

在一些实施方式中，本发明提供了施用基础胰岛素和餐时胰岛素联合疗法的方法，其可以单独或一起施用。例如，在一些实施方式中，患者接受速效和/或长效胰岛素方案，其中至少一种此类药剂具有提供使多聚体形成丧失或持续释放的融合伴侣。在一些实施方式中，提供降低多聚体形成的速效胰岛素与甘精胰岛素或地特胰岛素作为共同疗法。其是指如所描述的向患者施用所述速效胰岛素融合，其中所述患者正在使用甘精胰岛素或地特胰岛素的基础胰岛素疗法。在其他实施方式中，将提供持续释放的长效胰岛素与赖脯胰岛素、天冬胰岛素或赖谷胰岛素中的一种或多种作为共同疗法。其是指如所描述的向患者施用所述长效胰岛素融合，其中所述患者正在使用具有赖脯胰岛素、天冬胰岛素或赖谷胰岛素的餐时胰岛素疗法。

在不同实施方式中，本发明提供了联合疗法和/或共制剂，其包含本申请所述的药物组合物和有效治疗疾病的其他药剂，例如如上文所述的那些。

在一些实施方式中，本发明提供了(持续释放胰岛素或餐时胰岛素)与胰高血糖素样受体(GLP)-1受体激动剂，如GLP-1(SEQ ID NO:30)、艾塞那肽-4(SEQ ID NO:31)，或如美国专利8,178,495中所公开的其功能性类似物或其衍生物的联用或共制剂，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述GLP-1是GLP-1(A-B)，其中A是1至7的整数和B是38至45的整数。在一些实施方式中，所述GLP-1是GLP-1(7-36)，或其功能性类似物，或者GLP-1(7-37)或其功能性类似物。在一些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂包含还允许持续释放的融合伴侣，例如具有US 2013/0090285中公开的PK性质，其通过引用并入本申请。因此，所述GLP-1受体激动剂可以具有SEQID NO:32所示的序列。在一些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂融合伴侣是ELP1-120，其中所述客体残基是比例约为5:2:3的缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸。如图37至41所示，此类共制剂提供了协同作用，并且能够降低所施用的这两种药剂的剂量。

在另一个实施方式中，本发明提供了与GLP-2、GIP、胰高血糖素和胃泌酸调节素或者其功能性类似物和/或其衍生物的联用或共制剂。功能性类似物相相对于天然序列而言可以含有1至10个氨基酸的插入、缺失和/或取代(共同地)。

在不同实施方式中，所述联用疗法和/或共制剂包含与例如ELP或如本申请所述的基质形成成分的两种或多种融合蛋白。在一些实施方式中，所述ELP包含VPGXG(SEQ ID NO:3)的至少60个单元、或90个单元、或120个单元或者180个单元，其中X独立地选自氨基酸。在不同实施方式中，X是比例为5:3:2的V、G或A，或者比例为1:2:1的K、V或F，或者比例为1:7:1的K、V或F，或者V。

在不同实施方式中，组合物包含胰岛素的持续释放形式，其任选地包含胰岛素的速效形式，其每日在早饭前施用一次。

实施例

实施例1——持续释放胰岛素构建体

将人胰岛素原与ELP1-120生物聚合物基因融合并在大肠杆菌(E coli)的可溶性成分中表达。在经纯化酶促过程将胰岛素原部分转化成成熟的胰岛素后，在正常小鼠模型中测定所述融合蛋白对葡萄糖的降低情况并与单独的胰岛素进行比较。所述胰岛素ELP融合显示出的对葡萄糖的降低情况与胰岛素类似。此外，在该模型中所述融合蛋白的降低作用与胰岛素相比具有更长的持续时间。

胰岛素融合的构建

人胰岛素原由B链和A链组成，其通过31个氨基酸的C肽连接在一起(图1A和1B)。一旦在A链和B链之间形成二硫键，胰岛素原通过胰酶/羧肽酶B-样系统除去C肽转化成在体内成熟的胰岛素。可以使用重组的胰酶和羧肽酶B在体外复制这种肽的加工过程。一旦所述融合在大肠杆菌的可溶性成份中表达，则再折叠步骤不是必需的。

合成胰岛素原核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPB1031中，其定位于ELP1-120序列的N-末端以制备质粒pPE0139(图2)。

图3显示了胰岛素原ELP1-120融合蛋白(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。所述胰岛素原序列(下划线)与ELP1-120序列融合。所述氨基酸序列任选地在N-末端包括起始甲硫氨酸残基。

发酵

在分批补料发酵工艺中，在T7启动子的控制下将胰岛素ELP融合质粒pPE0139在大肠杆菌的细胞内成分中表达。使用两阶段摇瓶种子培养，使用含甘油的半定义的、无动物培养基(ECPM+脯氨酸)作为主要碳源和酵母提取物作为主要氮源扩增甘油细胞储备液。在种子培养阶段获得足够的细胞密度后，将培养物转移至含有与种子培养阶段相同培养基的发酵罐中。通过PID控制将工艺参数(pH、温度、溶解的氧)保持在设定点。使培养物生长直至其达到稳定期，随后开始加入甘油/酵母提取物/硫酸镁。将培养物维持在碳限定条件下并且使用IPTG诱导启动子。在发酵结束时，将培养物离心以便将含有胰岛素ELP融合的生物质与废弃的培养基分离。将细胞团贮存在-70℃直至进行随后的纯化。

胰岛素原ELP的纯化

将冷冻细胞团在含有2M尿素的裂解缓冲液(用于使胰岛素原ELP解离)中重悬并混合直至均匀。使用微流化器进行裂解以破坏细胞膜，然后通过离心进行裂解物的初始澄清。使用两阶段切向流过滤(TFF)系统进一步澄清和浓缩产品。使用缓冲液将含有胰岛素原ELP融合的溶液调整浓缩至1M氯化钠并通过疏水性相互作用色谱(HIC)柱(例如TOSOH PPG 600M)作为捕获步骤并且洗去宿主细胞污染物。梯度洗脱产品以分级分离所有产品相关的杂质(例如降解物质)。在选定的组分上进行TFF缓冲液交换以便在进行胰岛素原ELP向胰岛素ELP的酶促转化之前除去残留的盐。

胰岛素原ELP融合的酶促过程

通过使用重组胰酶和羧肽酶B酶促消化C-肽将经纯化的胰岛素原ELP1-120转化为胰岛素ELP，胰岛素原与胰岛素原ELP的比例分别为0.05μg/mg和2.0μg/mg。在室温下(20-25℃)孵育反应3至4小时直至C-肽完全裂解以产生成熟的胰岛素ELP。

胰岛素ELP的纯化

在转化为胰岛素ELP后，通过在捕获HIC柱再处理胰岛素ELP除去残留的酶和产物变体，其中胰岛素ELP与该柱结合，残留的酶通过该柱。对洗脱得到的产物组分进行渗滤以除去NaCl，然后通过离子交换(例如POROS 50PI)对其进行纯化，其中离子交换的条件为使产品流过，使宿主细胞污染物被捕获。最后使用阳离子交换柱(例如POROS 50 HS)除去产物变体、宿主细胞蛋白、内毒素和DNA。然后将洗脱得到的产物浓缩和渗滤至制剂缓冲液(例如20mM组氨酸，110mM NaCl，pH 7.5)。

非还原SDS-PAGE(图4)显示了在经酶促处理后随着C-肽的裂解预期减少的融合蛋白分子量降低。

进行抗-胰岛素B链western印迹(图5)以确证存在与ELP融合的A链和B链。数据显示在非还原条件下存在B链，这表明在A链和B链之间形成了二硫键。对融合蛋白和二硫键的还原导致从所述融合中除去了B链。

电喷雾离子化质谱确证了胰岛素原ELP融合的质量(图6)和在酶促除去C-肽后成熟胰岛素ELP融合的质量(图7)。在这两个样品中存在附加的盐加合物。使用Ellman试剂检测确证存在二硫键。不存在游离的硫醇表明形成了二硫键。

体内葡萄糖降低

将正常小鼠禁食过夜并皮下注射生理盐水(阴性对照)、13nmol/kg甘精胰岛素(阳性对照)或35nmol/kg胰岛素ELP融合(INSUMERA)。在给药前和给药后8小时至24小时每小时获取血糖读数。在给药后1小时提供食物。图8显示了血糖数据(平均值+-SE)。与生理盐水对照相比，所述胰岛素ELP融合显示了明显的血糖降低。此外，所述胰岛素ELP融合显示了血糖降低作用(7小时)长于甘精胰岛素对照(2小时)。

在1型糖尿病模型中的体内作用

在1型糖尿病(1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中给予ELP-胰岛素融合，INSUMERA(PE0139)。特别地，单次给药数据如图9所示。结果表明与等摩尔LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)给药相比，INSUMERA的血糖降低持续时间更长。当以每日方案给予所述化合物时(图10)，结果表明在活性和半衰期方面与LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比，INSUMERA具有优效性。

图11A和11B显示了在1型糖尿病(1型糖尿病，T1DM)小鼠模型中与LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)相比INSUMERA(PE0139)具有低的剂量滴定。图11A显示了单次s.c.给药，图11B 14天每日s.c.给药。在这两种情况下，均显示了INSUMERA的更加显著和持续的血糖降低作用。

还进行了研究以确定INSUMERA的血糖控制程度，对患者的典型血糖水平进行检测。图12A和11B显示了相对于LANTUS(甘精胰岛素，SANOFI-AVENTIS)而言，INSUMERA(PE0139)具有显著增加的血糖控制。血糖曲线下面积(AUC)可见减少27-39％。图12A显示了化合物施用第1天且在0-24hrs的血糖AUC。图12B显示了化合物施用第14天且在0-24hrs的血糖AUC。在这两个给药方案中，INSUMERA对血糖AUC的降低比LANTUS更有效。

还进行了研究以评估INSUMERA治疗的药代动力学(PK)。在糖尿病猪中，给予单次s.c.注射(图13A)或连续2周每日s.c.注射(图13B)。结果显示皮下注射后INSUMERA具有长的半衰期和小的峰谷比值。

胰岛素/受体的相互作用

下述研究的目的是对胰岛素肽和胰岛素肽/蛋白构建体与人胰岛素和IGF-1受体的结合情况进行附加检测。

分析条件：在25℃下使用配有镍电荷NTA传感器芯片和经过运行缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.01％Tween-20，pH 7.8)平衡的BiacoreS51光学生物传感器进行结合研究。针对这些研究，假定LCR-1054胰岛素肽的分子量为5808Da以及INS-ELP(B30)和PE0139的分子量为50,000Da。

还在更高浓度下对INS-ELP(B30)和PE0139进行筛选。在早期检测中，未观察到INS-ELP(B30)和PE0139的受体结合。在3μM下对这两种待测物重新进行检测，并引入LCR-1054(600nM)作为阳性对照。

在3μM时，INS-ELP(B30)和PE0139显示出与胰岛素受体表面的结合(图35A)。在3μM时，INS-ELP(B30)和PE0139未显示出与IGF-1受体显著的结合(图35B)。

为了更加详细的研究这些相互作用，制备新鲜的rhIR和rhIGF-1R的表面。捕获的带His标签的rhIR的密度约1200RU。IGF-1R通过胺基偶联于相同的芯片上，其密度为7500RU。通过与600nM LCR-1054的结合确证这些新鲜的rhIR和rhIGF-1R表面的活性。

系列浓度的INS-ELP(B30)和PE0139。在初始为20μM的3倍系列稀释中检测INS-ELP(B30)和PE0139与这两种受体表面的结合。这两种待测物显示出与胰岛素受体类似的结合(图36A)。

将应答对待测物浓度作图并与样品的结合等温线进行拟合以获得这些相互作用的亲和性估计值(图36B)。

而相反的是，待测物均未显示出与rhIGF-1R表面可靠的结合。事实上，在更高浓度下来自该表面的应答是负的，因为与固化的IGF-1R相比待测物与对照表面(传感器芯片上未连接蛋白的区域)显示出更强的结合。

因此，本实施例尤其显示了在这些分析条件下INS-ELP(B30)和PE0139以约6-8uM的亲和性与胰岛素受体结合，并且INS-ELP(B30)和PE0139未显示出任何与IGF-1受体可检测的结合。

随后使用针对受体活化基于细胞的检测对所述构建体与IGF-1R的结合进行了研究，使用经工程化改造的细胞以表达IGF受体。使用该系统，速效和持续释放构建体均显示出对IGF受体的一些活化作用，但是其水平显著低于胰岛素(数据未显示)。

实施例2—速效胰岛素构建体

为了制备“速效”胰岛素ELP融合，在pPE0139中将胰岛素原序列与长度短于120个ELP五聚体重复的ELP聚合物基因性融合。这些更短的聚合物具有显著高于生理条件的转变温度，其有效地去除了所述聚合物的持续释放功能，但是保留了其阻止胰岛素多聚化的能力并且使其在溶液中具有稳定性。

合成胰岛素原核苷酸序列并使用限制性内切酶将其亚克隆进入基于pET的载体pPE0221中。胰岛素原的位置在ELP1-20序列的N-末端以制备质粒pPE0224(图17)。

图18显示了胰岛素原ELP1-20融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。胰岛素原序列(下划线)与ELP1-20序列(粗体)融合。

为构建与长度短于ELP1-20的聚合物融合的胰岛素原，合成所述胰岛素原的核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPE0215中。胰岛素原的该位置在ELP1-10序列的N-末端以制备质粒pPE0262(图19)。

图20显示了胰岛素原ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。胰岛素原序列(下划线)与ELP1-10序列(粗体)融合。

为构建与比ELP1-20的转变温度更高的聚合物融合的胰岛素原，合成所述胰岛素原核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPE0245中。胰岛素原的位置在ELP2-20序列的N-末端以制备质粒pPE0259(图21)。ELP2-20聚合物使用比例为1:1的丙氨酸和甘氨酸作为VPGXG(SEQ ID NO:3)客体残基，其与ELP1-20相比降低了所述聚合物的疏水性。

图22显示了胰岛素原ELP2-20融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)。胰岛素原序列(下划线)与ELP2-20序列(粗体)融合。

为构建与比ELP2-20长度更短的聚合物融合的胰岛素原，合成所述胰岛素原核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPE0265中。胰岛素原的位置在ELP2-10序列的N-末端以制备质粒pPE0266(图23)。

图24显示了胰岛素原ELP2-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。胰岛素原序列(下划线)与ELP2-10序列(粗体)融合。

为构建与比ELP1-10具有更多负电荷的聚合物融合的胰岛素原，合成所述胰岛素原核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPE0274中。胰岛素原的位置在ELP1-10序列的N-末端，所述ELP1-10序列具有插入ELP五聚体之间的4个谷氨酸残基，以制备质粒pPE0283(图25)。所插入的谷氨酸残基增加了所述聚合物的负电荷。

图26显示了胰岛素原ELP1-10(4xGlu)融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:20)。胰岛素原序列(下划线)与具有插入的所示谷氨酸残基(粗体加下划线)的ELP1-10(4xGlu)序列(粗体)融合。

为构建与ELP聚合物融合的赖脯胰岛素，合成所述赖脯胰岛素的核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPE0265中。赖脯胰岛素的该位置在ELP1-10序列的N-末端以制备质粒pPE0284(图27)。

图28显示了赖脯胰岛素ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:21)。赖脯胰岛素序列(下划线)与ELP1-10序列(粗体)融合。

为构建与ELP聚合物融合的门冬胰岛素，合成所述门冬胰岛素的核苷酸序列并将其亚克隆至基于pET的载体pPE0265中。门冬胰岛素的该位置在ELP1-10序列的N-末端以制备质粒pPE0285(图29)。

图30显示了门冬胰岛素ELP1-10融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:22)。门冬胰岛素序列(下划线)与ELP1-10序列(粗体)融合。

发酵

在分批补料发酵工艺中，在T7启动子的控制下将上文所述的胰岛素原ELP融合在大肠杆菌的细胞内成分中表达。使用两阶段摇瓶种子培养，使用含甘油的半定义的、无动物培养基(ECPM+脯氨酸)作为主要碳源和酵母提取物作为主要氮源扩增甘油细胞储备液。在种子培养阶段获得足够的细胞密度后，将培养物转移至含有与种子培养阶段相同培养基的发酵罐中。通过PID控制将工艺参数(pH、温度、溶解的氧)保持在设定点。使培养物生长直至其达到稳定期，随后开始加入甘油/酵母提取物/硫酸镁。将培养物维持在碳限定条件下并且使用IPTG诱导启动子。在发酵结束时，将培养物离心以便将含有胰岛素ELP融合的生物质与废弃的培养基分离。将细胞团贮存在-70℃直至进行随后的纯化。

初始纯化

将冷冻细胞团在含有2M尿素的裂解缓冲液(用于使胰岛素ELP解离)中重悬并混合直至均匀。使用微流化器进行裂解以破坏细胞膜。通过离心进行裂解物的初始澄清。使用两阶段切向流过滤(TFF)系统进一步澄清和浓缩产品。将胰岛素原ELP融合通过HIC柱作为捕获步骤并洗去宿主细胞污染物。梯度洗脱产品以分级分离所有产品相关的杂质(例如降解物质)。使用pH7.0-9.0的Tris缓冲液在选定的组分上进行TFF缓冲液交换以便在进行胰岛素原ELP向胰岛素ELP的酶促转化之前除去残留的盐。

胰岛素原ELP融合的酶促过程

通过使用重组胰酶和羧肽酶B酶促消化C-肽将捕获的胰岛素原ELP转化为胰岛素ELP，胰岛素原与胰岛素原ELP的比例分别为0.05μg/mg和2.0μg/mg。在室温下(20-25℃)孵育反应3至4小时直至C-肽完全裂解以产生成熟的胰岛素ELP。

最终的纯化

在转化为胰岛素ELP后，使用两种方法除去残留的酶和产物变体。一种方法是，通过在捕获HIC柱再处理胰岛素ELP除去残留的酶，其中胰岛素ELP与该柱结合，残留的酶通过该柱。除去酶之后最终的精制步骤包括通过阳离子交换柱以除去产物变体、宿主细胞蛋白、内毒素和DNA，和通过阴离子交换柱以除去任意残留的DNA和内毒素。或者，可以通过阳离子交换柱同时实现除去酶和精制步骤。酶紧密地与树脂结合以使得能够选择性地洗脱胰岛素ELP，以便将产物与酶、宿主细胞蛋白、内毒素和DNA分离。随后使用阴离子交换柱除去任意剩余的污染物。然后将洗脱得到的产物浓缩和渗滤至制剂缓冲液(例如20mM组氨酸，110mM NaCl)。

在1型糖尿病啮齿动物模型中PE0244(速效胰岛素)和PE0139(持续释放胰岛素)对葡萄糖水平的作用。

采用已建立的方法通过施用链脲菌素(70mg/kg IP)在小鼠中诱导糖尿病。12天后，将小鼠禁食4hr，然后给予PE0244、PE0139、PE0244和PE0139的共制剂、或载体。在注射后至多4hr对血糖进行检测。图Y显示了由于胰岛素快速进入循环PE0244导致血糖迅速降低，但是在观察期结束时该作用开始减弱。而相反的是，PE0139具有明显慢的起效，这是由于其从注射部位的储库中缓慢释放，但是其作用能够在整个观察期中维持。联用制剂显示出迅速起效和对血糖的持续降低，其清楚地显示了在该共制剂中两种分子保留了它们的性质。

ELP1-120序列改善了在大肠杆菌细胞质中的溶解度以及胰岛素融合的下游处理效率。利用这一优势将其与更短的ELP聚合物融合，将胰岛素原ELP2-10聚合物与ELP1-120mer聚合物的N-末端融合，在这两者之间具有胰酶裂解位点。这使得所述聚合物能够一起表达并在纯化工艺的酶促步骤中分离，结果导致与在pPE0266中表达的类似的胰岛素原ELP2-10融合。为构建该“分离”构建体，将ELP2-10聚合物的核苷酸序列与双精氨酸胰酶位点亚克隆至质粒pPB1031中以形成质粒pPE0289(图31)。ELP2-10聚合物的该位置在ELP1-120聚合物的N-末端上。接下来将胰岛素原核苷酸序列克隆至ELP2-10序列的N-末端上以制备质粒pPE0290(图32)。

图33显示了胰岛素原ELP2-10分离蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。胰岛素原序列(下划线)与ELP1-10序列(粗体)融合，其再与ELP1-120序列(斜体)融合。在ELPS之间的胰酶位点已标出(粗体加下划线)。

分离构建体的加工

ELP1-120序列改善了在大肠杆菌细胞质中的溶解度以及胰岛素融合的下游处理效率。利用这一优势将其与更短的ELP聚合物融合，将胰岛素原ELP2-10聚合物与ELP1-120mer聚合物的N-末端融合，在这两者之间具有胰酶裂解位点。这使得所述聚合物能够一起表达并在纯化工艺的酶促步骤中分离，结果产生与在pPE0266中表达的类似的胰岛素原ELP2-10融合。为构建该“分离”构建体，将ELP2-10聚合物的核苷酸序列与双精氨酸胰酶位点亚克隆至质粒pPB1031中以形成质粒pPE0289(图31)。ELP2-10聚合物的该位置在ELP1-120聚合物的N-末端上。接下来将胰岛素原核苷酸序列克隆至ELP2-10序列的N-末端上以制备质粒pPE0290(图32)。

图33显示了胰岛素原ELP2-10分离蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。胰岛素原序列(下划线)与ELP1-10序列(粗体)融合，其再与ELP1-120序列(斜体)融合。在ELPS之间的胰酶位点已标出(粗体加下划线)。

实施例3-持续释放胰岛素与GLP-1受体激动剂的联用疗法

对持续释放胰岛素(PE0139)和GLP-1受体激动剂的联用疗法进行评估。GLP-1受体激动剂如SEQ ID NO:32(PB1023)所示，其包括ELP1-120融合，其中X是比例约5:3:2的Val、Gly和Ala。下述结果在db/db小鼠中获得，并对不同剂量的活性剂对空腹血糖和餐后血糖的作用进行了评估。在0时刻前约3.5小时对小鼠进行禁食，在约240分钟进行IPGTT。

图37显示了在db/db小鼠中PE0139剂量的增加对于空腹和餐后血糖显示出增加的作用。

图38显示了在db/db小鼠中向PE0139中加入固定剂量的PB1023(GLP-1-ELP1-120)进一步增强了餐后控制。

图39显示了在db/db小鼠中PB1023剂量的增加对空腹和餐后血糖显示出增加的作用。

图40显示了在db/db小鼠中向PB1023中加入固定剂量的PE0139进一步增强了餐后控制。

图41显示了PE0139的剂量增加对于血糖具有很小的影响，PB1023的剂量增加对于空腹血糖显示出增加的作用，对于餐后血糖具有有限的影响。

图42显示了低剂量PE0139和PB1023联用具有增强的空腹和餐后控制。

等同物

本领域技术人员将意识到或者能够确定，使用不超过常规的实验就能够获得本申请所特别地描述的特定实施方式的多种等同物。此类等同物旨在包括在下述权利要求的范围内。

Claims (42)

1.一种治疗性蛋白，所述治疗性蛋白包含胰岛素B链和胰岛素A链，以及抑制胰岛素多聚体形成的5至200个氨基酸的胰岛素A链的融合伴侣。

2.根据权利要求1所述的治疗性蛋白，其中所述治疗性蛋白与天然胰岛素相比显示出IGF受体的降低的活化。

3.根据权利要求1或2所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣具有约50至约150个氨基酸。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣具有包含重复的β-转角的伸展构象。

5.权利要求1至4中任意一项所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣的序列含有少于约30％的疏水性残基，所述疏水性残基选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

6.权利要求5所述的治疗性蛋白，其中所述治疗性蛋白在体温不显示相转变。

7.根据权利要求5或6所述的治疗性蛋白，将其制成用于皮下注射的药学上相容的溶液。

8.根据权利要求7所述的治疗性蛋白，其中所述治疗性蛋白在注射45分钟内达到胰岛素作用高峰。

9.根据权利要求1至8中任意一项所述的治疗性蛋白，其中所述A链和B链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列任选地具有1至8个修饰，所述修饰独立地选自氨基酸插入、氨基酸缺失或氨基酸取代。

10.根据权利要求9所述的治疗性蛋白，其中所述胰岛素B链的位置3、28、29和30中的一个或多个被取代，和/或所述A链的位置21被取代。

11.根据权利要求1至10中任意一项所述的治疗性蛋白，其中所述A链和B链由一个或多个二硫键结合，或经由肽或化学接头连接。

12.根据权利要求1至11中任意一项所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣包含ELP单元。

13.根据权利要求12所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣包含约10至约25个VPGXG(SEQ ID NO:3)重复，其中X独立地选自Val、Gly和Ala，或包含约10至25个AVGVP(SEQ ID NO:4)重复。

14.根据权利要求1至13中任意一项所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣包含1至约10个带负电的氨基酸。

15.根据权利要求13或14所述的治疗性蛋白，其中G和A作为残基X以大致相等的量存在，和V作为X以高于G和/或A的频率存在。

16.根据权利要求1至15中任意一项所述治疗性蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的序列。

17.根据权利要求12所述的治疗性蛋白，其中所述融合伴侣包含约10至约25个VPGXG单元(SEQ ID NO:3)，其中X独立地选自V、G和A，其中G和A作为残基X以大致相等的量存在，和V作为X以低于G或A的频率存在。

18.根据权利要求17所述的治疗性蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22所示的序列。

19.根据权利要求17所述的治疗性蛋白，其具有2至6个带正电的残基。

20.根据权利要求19所述的治疗性蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQID NO:20所示的氨基酸序列。

21.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至20中任意一项所述的第一融合蛋白，和包含胰岛素B链和胰岛素A链的第二融合蛋白，以及约400至约1000个氨基酸的融合伴侣，所述第二融合蛋白在体温显示出相转变以提供所述第二融合蛋白从注射部位的持续释放。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述第二融合蛋白具有带有伸展构象的融合伴侣，所述伸展构象包含重复的β-转角。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述第一融合蛋白具有包含[VPGXG]₁₂₀(SEQ ID NO:29)的融合伴侣，其中各X选自V、G和A，并且其中V:G:A的比例约为5:3:2。

24.根据权利要求21至23中任意一项所述的药物组合物，用于每日施用一次。

25.根据权利要求21至24中任意一项所述的药物组合物，其中所述第一和第二融合蛋白是通过蛋白水解加工从单一的融合蛋白分离得到。

26.根据权利要求21至25中任意一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约1:1比例的所述第一和第二融合蛋白。

27.一种用于治疗糖尿病或低胰岛素血症的方法，所述方法包括：给予有此需要的患者权利要求1至20中任意一项所述的治疗剂或权利要求21至26所述的药物组合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述患者患有1型或2型糖尿病或者前驱糖尿病。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述治疗性蛋白每日施用1至3次，或者所述药物组合物每日施用一次。

30.根据权利要求26至29中任意一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白或药物组合物在餐前约15分钟或更短时施用。

31.一种用于治疗糖尿病或低胰岛素血症的方法，所述方法包括：给予患者速效餐时胰岛素，和长效基础胰岛素，其中所述速效胰岛素是权利要求1至20中任意一项所述的治疗性蛋白；和/或所述长效胰岛素包含胰岛素B链和胰岛素A链，和约400至约1000个氨基酸的融合伴侣，所述长效胰岛素在体温显示出相转变以提供从注射部位的持续释放。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述长效胰岛素具有带有伸展构象的融合伴侣，所述伸展构象包含重复的β-转角。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述长效胰岛素每周施用一次或每日施用一次。

34.根据权利要求31至33中任意一项所述的方法，其中所述速效胰岛素在开始进餐前每日施用1次至3次。

35.根据权利要求31至34中任意一项所述的方法，其中所述患者患有1型或2型糖尿病或者前驱糖尿病。

36.根据权利要求31至35中任意一项所述的方法，其中所述速效胰岛素和所述长效胰岛素通过监测血糖的泵系统施用。

37.一种用于治疗糖尿病、代谢疾病或临床肥胖症的方法，所述方法包括：给予长效胰岛素方案，所述长效胰岛素包含胰岛素B链和胰岛素A链，以及约400至约1000个氨基酸的融合伴侣，所述长效胰岛素在体温显示出相转变以提供从注射部位的持续释放，和给予GLP-1受体激动剂方案。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述GLP-1受体激动剂是GLP1-ELP1-120。

39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述长效胰岛素和所述GLP-1受体激动剂各具有包含[VPGXG]₁₂₀(SEQ ID NO:29)的融合伴侣，其中各X选自V、G和A，和其中所述V:G:A的比例为约5:3:2。

40.根据权利要求37至39中任意一项所述的方法，其中所述胰岛素和所述GLP-1受体激动剂分开或一起配制。

41.根据权利要求37至40中任意一项所述的方法，其中所述胰岛素和所述GLP-1受体激动剂共配制和约每周施用一次。

42.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含速效胰岛素和长效胰岛素，以及连接所述速效胰岛素和所述长效胰岛素的蛋白酶位点。