CN102596217A - 经修饰的血管活性肠肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了经修饰血管活性肠肽(VIP)、编码多聚核苷酸和载体，以及包含它们的药物组合物。本发明进一步提供了制备和使用所述经修饰VIP药剂的方法。根据本发明，所述VIP表现出与未修饰VIP相比延长的循环半衰期、受体结合或生物效力和/或改变的受体结合特征。

Description

经修饰的血管活性肠肽
相关申请的交叉引用
根据美国35U.S.C.第119条第(e)项，本申请要求2009年8月14日提交的第61/234,151号美国临时申请的优先权，所述临时申请全文在此以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及血管活性肠肽(VIP)和包含血管活性肠肽的药物组合物，包括具有延长循环半衰期的VIP和受体结合特征不同于未修饰的成熟肽的VIP在内。
以电子版形式递交的文本文件的描述
随此以电子版形式递交的文本文件的内容其全文以引用的方式并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：PHAS_019_01US_SeqList_ST25.txt，录入时间：2010年8月4日，文件大小44千字节)。
发明背景
血管活性肠肽(VIP)具有包括针对止血、免疫系统和神经系统在内的多种生物学效应。见Delgado等，The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation，Pharmacol.Reviews56(2)：249-290(2004)。例如，VIP对于血压和肺动脉压以及对于广泛的免疫和炎症病状具有有益效果。VIP有很大潜力作为活性剂来用于肺高血压、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎、炎性肠病(IBD)和哮喘，以上仅为部分例子。
VIP有至少两种受体，包括VPAC1和VPAC2。这些受体对于VIP以及相关分子垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)均有某种程度的结合。两种受体均为7次跨膜G蛋白偶联受体家族的成员。VPAC1的分布区域如中枢神经系统、肝脏、肺脏、小肠和T淋巴细胞。VPAC2可见于，例如，中枢神经系统、胰脏、骨骼肌、心脏、肾脏、脂肪组织、睾丸和胃。
VIP的短暂半衰期使该肽作为药物剂不具现实性。见Pozod等，Tuning immune tolerance with vasoactive intestinal peptide：A new therapeutic approach for immune disorders.Peptides 28(9)：1833-1846(2007)。事实上，研究表明VIP在血液中的半衰期小于2分钟(Domschke等，1978，Gut 19：1049-53；Burhol等，1978，Scand JGastroent 13：807-813)。此外，VIP的多重生物学效应可能令它针对任何特定适应症的开发复杂化。因此需要VIP的修饰版本以使该药剂在治疗上具备现实性，例如，通过延长半衰期和/或设计具有所需受体结合特征的分子。
发明概要
本发明提供了经修饰血管活性肠肽(VIP)，以及编码多聚核苷酸和载体，以及包含所述经修饰VIP的药物组合物。本发明进一步提供了制备所述经修饰VIP分子的方法以及使用所述经修饰VIP药剂治疗患者的方法。根据本发明，经修饰VIP与未修饰的VIP相比表现出延长的循环半衰期或者体内存留期，和/或类似的受体结合和/或生物学效力，和/或不同的受体结合特征。
在一个方面，本发明提供了经修饰VIP分子和包含所述VIP分子的药物组合物。对所述经修饰VIP分子通过添加一个或多个氨基酸，和/或通过与异源氨基酸序列融合，在其N末端和/或C末端进行了重组或者化学修饰，以此提供较长的循环半衰期或者体内存留期、类似的生物学效力，和/或经修饰的受体结合特征。例如，在一些实施方案中，起始于N末端组氨酸的28个氨基酸的成熟VIP包含额外的N末端氨基酸，如N末端处单一的氨基酸(如甲硫氨酸)。在这些或者其它的实施方案中，经修饰VIP如本文所述含有N末端或者C末端的类弹性蛋白肽(ELP)融合蛋白。这类经修饰VIP分子可表现出提高的循环半衰期或者体内存留期，和/或不同的对VPAC2高于对VPAC1的结合优选性。
例如，VIP可同ELP的N末端进行融合(例如，通过重组手段)。天然的成熟VIP的组氨酸可位于其N末端。这类治疗剂与无融合的对应物相比可能需要频率显著降低的给药，例如每周给药约1到7次(例如按日或者按周给药)。
在另一些实施方案中，所述VIP-ELP融合蛋白可在N末端含有甲硫氨酸而天然成熟VIP产物的组氨酸位于第二位。在又一些实施方案中，VIP-ELP分子以甲硫氨酸-丙氨酸-丙氨酸起始。当在细菌中产生的时候，第一个甲硫氨酸失去并且产物在其N末端含有丙氨酸-丙氨酸。丙氨酸-丙氨酸通过DPP-IV肽酶的作用在体内或体外去除，从而产生天然的成熟VIP的N末端。这些在N末端含有额外氨基酸的构建体在进行VPAC1和VPAC2受体结合活性的测试时表现出显著不同的活性。例如，尽管两种构建体均能以类似的EC50激活VPAC2受体，但在N末端具有甲硫氨酸(第二位为组氨酸)的构建体对于VPAC1受体具有低至少100倍的活性。
在多种不同的实施方案中，本发明中具有N末端甲硫氨酸的经修饰VIP具有通过重组手段获得而无进一步的表达后制造加工以暴露其天然或者所需的VIP的N末端的优势，通过重组手段获得的例子如在大肠杆菌或者其它表达系统中的产生。
在又一些实施方案中，VIP可根据本文的详细描述进行化学修饰，例如通过添加一个或多个聚乙二醇或其它化学基团(例如，在N末端或其附近)进行修饰。
在其它的方面，本发明提供了编码本发明的经修饰VIP的多聚核苷酸和载体，以及含有上述多聚核苷酸和载体的宿主细胞。所述宿主细胞可适用于经修饰VIP的重组产生，例如适用于已知表达系统的细菌或者酵母细胞。
在其它的方面，本发明提供了在哺乳类体内治疗、改善或者预防病状的方法。这类病状包括多种不同的心血管、免疫(例如自体免疫)或者神经病状。例如，经修饰VIP可用于在患者体内调节促炎性和抗炎性效应因子之间的平衡，所述患者包括罹患自体免疫疾病或者炎症病状的患者。经修饰VIP的示例性适应症包括高血压、慢性阻塞性肺病(COPD)、糖尿病、心肌纤维化、心力衰竭、心肌病、关节炎、炎性肠病(IBD)和哮喘以及其它适应症。
附图说明
图1所示为经修饰VIP-ELP融合蛋白的氨基酸序列(M-VIP-ELP1-120，SEQ ID NO：14)，该融合蛋白在N末端为甲硫氨酸并且120个ELP1单位(VPGXG，SEQ ID NO：3)在VIP的C末端与其融合。
图2所示为N末端为甲硫氨酸-丙氨酸-丙氨酸的经修饰VIP-ELP融合蛋白的氨基酸序列(MAA-VIP-ELP1-120，SEQ ID NO：15)，所述融合蛋白可被激活成为天然的成熟VIP肽，并且120个ELP1单位(VPGXG，SEQ ID NO：3)在VIP的C末端与其融合。
图3为pPB1031的质粒图谱，该质粒编码ELP1-120以便于重组融合蛋白的产生。
图4所示为编码M-VIP-ELP1-120(SEQ ID NO：39和40)融合蛋白的pPB1046。显示了用于构建该重组基因的引物(P0045，SEQ IDNO：31，P0048，SEQ ID NO：32，及P0065，SEQ ID NO：34)。
图5所示为编码MAA-VIP-ELP1-120(SEQ ID NO：41和42)融合蛋白的pPB1047。显示了用于构建该重组基因的引物(P0066，SEQ IDNO：35，P0064，SEQ ID NO：33，P0067，SEQ ID NO：36)。
图6所示为编码ELP1-120-VIP(SEQ ID NO：43和44)融合蛋白的pPB1048。显示了用于构建该重组基因的引物(P0068，SEQ ID NO：37，P0069，SEQ ID NO：38)。
图7为对纯化的VIP-ELP融合蛋白的经热变性或未经热变性的10％Tris-醋酸NuPAGE凝胶分析。
图8所示为天然VIP和VIP-ELP融合蛋白PB1046和PB1047对VPAC2受体的体外活性。
图9所示为天然VIP和VIP-ELP融合蛋白PB1046和PB1047对VPAC 1受体的体外活性。
图10所示为VIP-ELP融合蛋白对于大鼠血压的体内效应。左栏所示为收缩压。右栏所示为舒张压。VIP-ELP融合蛋白在12小时期间降低血压。
图11所示为编码VIP-ELP1-120的pPB1120(SEQ ID NO：48)的质粒图谱。
图12所示为天然VIP和VIP-ELP融合蛋白PB1120和PB1046对VPAC1受体的体外活性。
图13所示为天然VIP和VIP-ELP融合蛋白PB1120和PB1046对VPAC2受体的体外活性。
图14A以线性坐标轴显示VIP-ELP融合蛋白PB1120在猴体内(n＝3)进行3mg/kg的单次皮下注射后的药物动力学特征。图14B以半对数坐标轴显示VIP-ELP融合蛋白PB1120的药物动力学特征。
图15A、15B和15C分别显示了以0.1mg/kg、1mg/kg或5mg/kg的剂量皮下注射PB1120后以三个小时为间隔大鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压的平均变化。图15D示出施用PB 1120后以三个小时为间隔受试者大鼠的平均心率。
发明详述
本发明提供了经修饰的血管活性肠肽(VIP)、编码多聚核苷酸和载体，以及包含所述经修饰VIP的药物组合物。本发明进一步提供了制备和使用所述经修饰VIP以对患者进行治疗的方法。根据本发明，所述VIP与未修饰的VIP相比表现出延长的循环半衰期或者体内存留期、类似的受体结合或生物学效力，和/或不同的受体结合特征。在多种不同的实施方案中，同未修饰的对应物相比本发明的化合物表现出降低的给药频率。
血管活性肠肽
血管活性肠肽(VIP)是一种含有28个氨基酸残基的肽类激素并产生于人体内包括肠道、胰腺以及脑部下视丘中的上视束交叉神经核在内的多个部位。VIP表现出广泛多种的生物学作用，包括动物或人体内的全身性血管舒张、降血压、心输出增加、呼吸兴奋、血糖升高、冠脉扩张、支气管扩张。VIP还影响免疫系统的平衡。
VIP对体内多个部位具有作用。对于消化系统，VIP可诱导平滑肌舒张(下食道括约肌、胃、胆囊)、刺激水向胰腺液和胆汁中的分泌，并且引起胃酸分泌的抑制和小肠腔吸收的抑制。它在小肠中的作用为刺激水和电解质的分泌，以及扩张小肠平滑肌、扩张外周血管、刺激胰腺的碳酸氢盐分泌，和抑制胃泌素刺激的胃酸分泌。这些作用合在一起提高了肠动力。VIP具有刺激主细胞分泌胃蛋白酶原的功能。
VIP可见于心脏之中并且对于心血管系统具有显著作用。它引起冠脉血管舒张，并具有正性变力变时效应。
VIP是一种免疫调控肽，可用于治疗炎症和TH1型自体免疫病(见Delgado等，The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation，Pharmacol.Reviews 56(2)：249-290(2004))。VIP可用于神经退行性疾病的治疗(见美国专利第5,972,883号，在此全文以引用的方式并入本文)。在慢性炎症性风湿疾病如骨关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)中，，VIP和与之在结构上相关的肽类垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)通过下调该疾病的炎症和自体免疫组分而具有重要的治疗作用(Juarranz等，Vasoactive intestinal peptide modulates proinflammatory mediator synthesis in osteoarthritic and rheumatoid synovial cells，Rheumatology，2004，43：416-422)。另外，VIP通过调控促炎性和抗炎性效应因子之间的平衡或者通过诱导具有针对自体反应T细胞的抑制活性的T细胞的出现而参与维持免疫耐受(Pozo等，Tuning immune tolerance with vasoactive intestinal peptide：A new therapeutic approach for immune disorders，Peptide，2007，28(9)：1833-1846)。
成熟的VIP具有28个氨基酸残基，其序列如下HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN(SEQ ID NO：13)。VIP产自于对170个氨基酸的前体分子前VIP原(prepro-VIP)进行的加工。VIP的结构和示例性类似物在美国专利4,835,252、4,939,224、5,141,924、4,734,400、4,605,641、6,080,837、6,316,593、5,677,419、5,972,883、6,489,297、7,094,755和6,608,174中有所描述，出于各种目的这些专利均全文以引用的方式并入本文。
用以提高肽对于蛋白酶等因素的稳定性的大量突变在文献中有详细描述(见Onune等，Physicochemical and pharmacological characterization of novel vasoactive intestinal peptide derivatives with improved stability，Eur.J.Pharm.Biopharm.2009，出于各种目的该文献全文以引用的方式并入本文)。这些经修饰VIP肽具有序列SEQID NO.21(M17L，以防止甲硫氨酸的氧化)、序列SEQ ID NO.22(K15R、K20R和K21R，以提高蛋白酶解稳定性)和序列SEQ ID NO.23(N24A和S25A，以提高蛋白酶解稳定性/热稳定性)。本发明提供了经修饰VIP肽，该VIP肽包括以上一种或多种修饰以及本文描述的其它VIP修饰。经修饰VIP分子的例子包括SEQ ID NOs.14-15、17-27、40、42、44和50的经修饰VIP肽。
在本文所述的多种不同的实施方案中，提供了经修饰VIP(例如，包含SEQ ID NO：13)(或者如本文所述的功能性类似物)。总体上，VIP的功能性类似物包括在N末端或C末端切除1到10个氨基酸的功能性片段，该切除包括了切除1、2、3或多达约5个氨基酸(相对SEQ ID NO：13而言)。这类功能性类似物可能含有对天然序列(例如SEQ ID NO：13)进行的1到5个氨基酸的插入、缺失和/或替换(合计)，在每种情况下都保留了所述肽的活性(例如通过VPAC2和/或VPAC1结合)。该活性可通过任何已有的分析方法进行确证和分析，所述分析方法包括本文所述的分析方法，并且包括用于对Delgado等，The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation，Pharmacol.Reviews 56(2)：249-290(2004)中所描述的活性进行测定或者定量的任何一种适当的分析方法。在这些或者其它的实施方案中，本发明经修饰VIP的VIP组分同天然的成熟序列(SEQ ID NO：13)具有至少约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或者约97％的一致性。两序列(例如一个天然序列和一个功能性类似物)之间的序列一致性的测定可使用任何比对工具来完成，包括Tatusova等，Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences，FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)。
在一个方面，本发明提供了一种经修饰VIP分子，所述分子同未修饰VIP(例如，由氨基酸序列SEQ ID NO：13所组成的肽)相比，具有对VPAC2或对VPAC1的受体优选性。例如，经修饰VIP可能具有至少约2∶1、约5∶1、约10∶1、约25∶1、约50∶1、约100∶1、约500∶1或更高的对VPAC2高于对VPAC1的相对结合优选性。在其它实施方案中，经修饰VIP可能具有至少约2∶1、约5∶1、约10∶1、约25∶1、约50∶1、约100∶1、约500∶1或更高的VPAC1高于VPAC2的相对结合优选性。例如，在一些实施方案中，经修饰VIP对VPAC2受体的激活基本类似于成熟的未经修饰的人VIP，即EC50在成熟的未经修饰的人VIP(SEQ ID NO：13)的约2倍到约1/2之间。但是，在激活VPAC1方面，此同样的经修饰VIP与成熟的未经修饰的人VIP相比低效50或100倍或更低。
这些经修饰VIP分子可含有经修饰的N末端区域，例如在VIP的N末端组氨酸上添加1到约500个氨基酸，这些氨基酸可包括异源哺乳类氨基酸序列。例如，经修饰VIP可在成熟VIP的天然N末端组氨酸的N末端一侧含有单一的甲硫氨酸。该分子也可在大肠杆菌或者其它细菌表达系统中便利地制备，因为当邻接的氨基酸为组氨酸的时候该甲硫氨酸不会被大肠杆菌去除。或者，所述N末端氨基酸可以为任何天然氨基酸，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸。
添加于VIP的N末端的额外序列可为任何一种序列，包括长度为1到约100、1到约50、1到约20、1到约10、1到约5个氨基酸的具生物活性序列和不具生物活性的序列。
所述经修饰VIP的N末端可具有M-N结构，其中M为甲硫氨酸并且N为VIP分子的N末端(例如，图1的SEQ ID No.14)。所述甲硫氨酸支持所述蛋白在细菌或者真核宿主细胞中的翻译。因此，经修饰VIP可在生物系统中进行制备，所述生物系统包括细菌和酵母表达系统(例如大肠杆菌)。尽管甲硫氨酸某些情况下可在细菌表达系统中被甲硫氨酰氨肽酶(MA)所去除，但组氨酸(H)是最不受MA青睐的第2位残基之一。
在又一些实施方案中，所述N末端可通过与哺乳类异源蛋白进行融合来修饰，例如对延长治疗分子半衰期有效的哺乳类蛋白。这类序列可为哺乳类序列，例如白蛋白、转铁蛋白或抗体Fc序列。这类序列的描述见美国专利第7,238,667号(特别针对白蛋白连接物)、美国专利第7,176,278号(特别针对转铁蛋白连接物)以及美国专利第5,766,883号，这些专利的全文均以引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，所述VIP可通过肽酶或者蛋白酶激活，例如内源肽酶或者蛋白酶。这类可激活序列在国际申请第PCT/US2009/068656号中有描述，该申请的全文以引用的方式并入本文。如本文中所用，术语“肽酶”和“蛋白酶”可交互使用。例如，该VIP可以设计为可受二肽基肽酶激活。示例性的二肽基肽酶包括二肽基肽酶-1(DPP-I)、二肽基肽酶-3(DPP-III)、二肽基肽酶-4(DPP-IV)、二肽基肽酶-6(DPP-VI)、二肽基肽酶-7(DPP-VII)、二肽基肽酶-8(DPP-VIII)、二肽基肽酶-9(DPP-IX)、二肽基肽酶-10(DPP-X)。这些二肽酶的底物序列是已知的。
可激活VIP的N末端可具有Z-N结构，其中Z为一种二肽酶的底物(例如，Z可通过暴露于二肽酶而去除)，并且N为VIP的N末端。所述可激活VIP可具有M-X-N格式的N末端序列，其中M为甲硫氨酸，X为脯氨酸、丙氨酸或丝氨酸，并且N为VIP或VIP类似物的N末端。以这种方式，M和X将对某种宿主细胞(例如大肠杆菌)和/或二肽酶(例如DPP-IV)具敏感性并随后被其去除。或者，该可激活VIP的N末端序列可为X1-X2-N，其中X1为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸或脯氨酸；X2为脯氨酸、丙氨酸或丝氨酸；并且N为VIP的N末端。X1-X2为二肽酶(例如DPP-IV)的底物，并且二肽酶的消化将使所需的VIP或VIP类似物(例如图2的SEQ ID NO.15)的N末端N暴露。在这类实施方案中，可通过编码M-X1-X2-N(其中M为甲硫氨酸)的构建体在宿主细胞(例如大肠杆菌)中进行表达而产生所述蛋白，这是因为在第2位的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸或脯氨酸可为甲硫氨酸的去除提供信号，由此而产生位于N末端的X1-X2，所述过程可在体内通过二肽酶(例如DPP-IV)而激活。这类经激活而拥有天然成熟VIP的N末端的可激活VIP不表现出受体优选性。
在另一个实施方案中，所述经修饰的可激活VIP的N末端可具有M-Z-N结构，其中M为甲硫氨酸，Z为一种二肽酶的底物(例如，Z可通过暴露于二肽酶而去除)，并且N为某种活性VIP(经修饰VIP)的非组氨酸N末端。例如，经修饰的可激活VIP可具有格式为M-X-N的N末端序列，其中M为甲硫氨酸，X为脯氨酸、丙氨酸或丝氨酸，并且N为该活性VIP的非组氨酸N末端。以这种方式，M和X将对某种宿主细胞(例如大肠杆菌)和/或二肽酶(例如DPP-IV)具敏感性并随后被其去除。或者，可激活VIP的N末端序列可为X1-X2-N，其中X1为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸或脯氨酸；X2为脯氨酸、丙氨酸或丝氨酸；并且N为活性VIP的非组氨酸N末端。X1-X2为二肽酶(例如DPP-IV)的底物，并且二肽酶的消化将使所需的该VIP的非组氨酸N末端N暴露。
在又一个实施方案中，经修饰的可激活VIP的N末端可具有M-Z-S-N结构，其中M为甲硫氨酸；Z为一种二肽酶的底物(例如，Z可通过暴露于二肽酶而去除)；N为成熟VIP的N末端(组氨酸)；并且S为将在二肽酶消化后被暴露的一个或多个氨基酸，这将提供上文所述的经修饰VIP。例如，经修饰的可激活VIP可具有格式为M-X-S-N的N末端序列，其中M为甲硫氨酸，X为脯氨酸、丙氨酸或丝氨酸，N为成熟VIP的N末端；并且S为将在二肽酶消化后被暴露的一个或多个氨基酸，这将提供受体优选性。或者，可激活VIP的N末端序列可为X1-X2-S-N，其中X1为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸或脯氨酸；X2为脯氨酸、丙氨酸或丝氨酸；N为VIP的非组氨酸N末端，并且S为将在二肽酶消化后被暴露的一个或多个氨基酸。X1-X2为一种二肽酶(例如DPP-IV)的底物并且二肽酶消化将暴露S。
在这些或者其它的实施方案中，对VIP的N末端进行的N末端化学修饰可提供受体优选性。蛋白质的化学修饰及实施方法在本领域中知之甚详。非限制性的示例性化学修饰为聚乙二醇化、甲基乙二醛化(methylglyoxalation)、还原性烷基化、过甲酸氧化、琥珀酰化、氨乙基化和脂化(Clifton，New Protein Techniques，New Jersey：Humana Press，1985.ISBX.0-89603-126-8.Methods in Molecular Biology中的第三卷)。化学基团，例如聚乙二醇化，可通过对半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、羧基进行的修饰来进行连接，此前已有描述(见Lundblad，Techniques in Protein Modification，CRC Press，1995)。
与生物弹性聚合物的融合物
在一些实施方案中，本发明的VIP含有一种N末端和/或C末端的生物弹性聚合物组分。“生物弹性聚合物”可表现出反转变温度(inverse temperature transition)。生物弹性聚合物已为人所知并且有所描述，例如在Urry等的美国专利第5,520,672号的描述。生物弹性聚合物可为包含弹性体单位为五肽、四肽和/或九肽(例如，“类弹性蛋白肽”)的多肽。可用于实施本发明的生物弹性聚合物在美国专利第4,474,851号有详尽描述，该专利描述了可用于形成生物弹性聚合物的多种四肽和五肽重复单位。美国专利第4,132,746号；第4,187,852号；第4,500,700号；第4,589,882号和第4,870,055号中也描述了具体的生物弹性聚合物。生物弹性聚合物的另外例子在美国专利第6,699,294号、美国专利第6,753,311号和美国专利第6,063,061号中有详细描述。这些生物弹性聚合物的结构均以引用的形式并入本文。
在一个实施方案中，所述生物弹性聚合物是通式为(VPGXG)m的多肽，其中X为任一氨基酸(例如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)并且m介于约20到约2000之间或介于约50到约180之间。在示例性实施方案中，m为60、90、120、150或180。作为第四位氨基酸的不同氨基酸的出现频率以及X的成分可以变动。
例如，生物弹性聚合物可包含选自生物弹性五肽和四肽的重复弹性体单位，其中所述重复单位包含选自于由疏水氨基酸和甘氨酸残基组成的群组的氨基酸残基，并且其中所述重复单位以beta转角的构象存在，其结构式为：
其中R1-R5代表氨基酸残基1-5的侧链，并且当重复单位为四肽的时候m为0，当重复单位为五肽的时候m为1。九肽重复单位一般由四肽和五肽按次序组成。疏水氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在许多情况下，重复单位的第一个氨基酸残基为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或者苯丙氨酸残基；第二个氨基酸残基为脯氨酸残基；第三个氨基酸残基为甘氨酸残基；并且第四个氨基酸残基为甘氨酸或者一个极度疏水残基，例如色氨酸、苯丙氨酸或者酪氨酸。具体例子包括四肽Val-Pro-Gly-Gly、四肽GGVP、四肽GGFP、四肽GGAP，五肽为Val-Pro-Gly-Val-Gly、五肽GVGVP、五肽GKGVP、五肽GVGFP、五肽GFGFP、五肽GEGVP、五肽GFGVP和五肽GVGIP。例见美国专利第6,699,294号。
在一些示例性实施方案中，本发明的VIP含有N末端和/或C末端ELP组分。所述ELP组分包含结构肽单位或序列或由该结构肽单位或序列组成，所述结构肽单位或序列相关于或衍生于弹性蛋白。这类序列可用于改善治疗蛋白在生物利用率、治疗有效剂量和/或施用频率、生物学作用、制剂相容性、蛋白酶降解抗性、溶解度、半衰期或施用后的体内存留期的其它量度，以及/或者从体内的清除率方面中一个或多个方面的特性。例见，WO 2008/030968，该专利全文以引用的方式并入本文。
当所述ELP位于VIP的C末端时，可在VIP的N末端进行额外的修饰，例如据前文所述添加一个或多个氨基酸。在另一些实施方案中，VIP的N末端没有这类修饰。
所述ELP组分由三到约二十个氨基酸的结构单位进行构建，或者在一些实施方案中，由四到十个氨基酸进行构建，例如五个或六个氨基酸。在特定的ELP组分中，单个结构单位的长度是可变或统一的。在一些实施方案中，ELP组分由多聚四肽、多聚五肽、多聚六肽、多聚七肽、多聚八肽或多聚九肽的重复结构单位的基元(motif)进行构建。示例性结构单位包括由SEQ ID NO：1-12所定义的单位(见下文)，这些单位可以作为包括串联重复单位在内的重复结构单位进行使用或以某一组合进行使用，从而产生对改善治疗组分的特性有效的ELP。由此，如下文所定义所述ELP组分可包含选自SEQ ID NO：1-12的结构单位或者基本由这些结构单位组成。
包含这类结构单位的ELP组分可具有不同的大小。例如，ELP组分可包含约10到约500个结构单位或者基本由其组成，或者在一些实施方案中包含约20到约200个结构单位或者基本由其组成，或者在一些实施方案中包含约50到约150个结构单位或者基本由其组成，或者在一些实施方案中包含约75到约130个结构单位或者基本由其组成，这些单位包含了SEQ ID NO：1-12所定义的一个单位或者多个单位的组合。ELP组分可包含约120个结构单位，例如SEQ IDNO：3所定义的结构单位的重复(见下文)。由此，ELP组分可长约50到约2000个氨基酸残基，或长约100到约600个氨基酸残基，或长约200到约500个氨基酸残基，或长约200到约400个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述ELP组分的大小或在一些情况下所述治疗剂的大小低于约150kDa、或低于约100kDa、或低于约55kDa、或低于约50kDa、或低于约40kDa、或低于约30或25kDa。
在一些实施方案中，处于非相变状态(untransitioned state)的ELP组分可具有伸展的、相对无序和非球状形态从而避免肾脏过滤。在这类实施方案中，本发明治疗剂的分子量低于肾脏过滤的一般公认界限，例如低于约60kD，或在一些实施方案中低于约55、50、45、40、30或25kDa，尽管如此，在体内的存留期仍然是无偶联的(例如无融合或者无连接)治疗对应物的至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。
在这些或者其它的实施方案中，所述ELP组分对于所述治疗肽的生物学作用无实质或显著影响。因此，本发明的具有ELP融合的VIP可表现出与它的无融合对应物相同的或者类似的效力(生物学作用)。本发明的具有ELP融合的VIP表现出的效力或者生物学作用水平(例如，体内或体外的测试)为无融合对应物在相同测定中所表现的10-100％。在多种不同的实施方案中，本发明的具有ELP融合的(激活)VIP可表现出的效力或生物学作用水平(例如，体内或体外的测试)是无融合对应物所表现的至少50％、60％、75％、80％、90％、95％或者更高。
在一些实施方案中，所述ELP组分经受了可逆的反向相变。即，ELP组分低于相变温度(Tt)时在结构上无序并且高度可溶于水，但是当温度升高至高于Tt时表现出狭窄的(2-3℃范围)无序至有序的相变，从而导致ELP组分的去溶剂化和聚集。例如，当达到足够大小的时候ELP形成不溶的聚合物，该不溶的聚合物可容易地通过离心从溶液中去除和分离。这种相变是可逆的，并且当温度回至ELP的Tt之下的时候已分离的不溶ELPs可完全复溶于缓冲溶液。因此，在一些实施方案中可使用反向相变循环程序，例如利用治疗剂的温度依赖性溶解度或者向介质中添加盐，以将本发明的治疗剂同其它的污染蛋白进行分离以达到高纯度。可以使用连续的反向相变循环以获得高纯度。除温度和离子强度外，其它可用于调控治疗剂的反向相变的环境变量包括pH、添加无机和有机溶质和溶剂、侧链离子化或化学修饰，以及压力。
在一些实施方案中，所述ELP组分不经受可逆的反向相变，或者在生物学相关Tt下不经受这样的相变，因此该分子的生物学和/或生理学特性的改善(如本文其它地方所述)可完全或者大体上独立于任何相变特性。尽管如此，这样的相变特性还可能提供其它的实用优点，例如，与这些分子的回收和纯化相关的优点。
在本发明的实施中，所述ELP组分具有稳定或以其它方式改善所述治疗组合物中的VIP组分的功能。在以偶联的VIP-ELP构建体对需要VIP治疗剂的患者进行施用之后，VIP组分和ELP组分保持相互偶联，而同时VIP具有治疗活性以用于，例如疾病状态或者生理病状的治疗或预防，或者用于其它治疗性干预。
在一些实施方案中，所述ELP组分可由结构单位形成，所述结构单位包括但不限于：
(a)四肽Val-Pro-Gly-Gly或VPGG(SEQ ID NO：1)；
(b)四肽Ile-Pro-Gly-Gly或IPGG(SEQ ID NO：2)；
(c)五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)，或VPGXG，其中X为任一天然或者非天然的氨基酸残基，并且X在多聚或者寡聚重复中任选地变动；
(d)五肽Ala-Val-Gly-Val-Pro或AVGVP(SEQ ID NO：4)；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly或IPGXG(SEQ ID NO：5)，其中X为任一天然或者非天然的氨基酸残基，并且X在多聚或者寡聚重复中任选地变动；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-Val-Gly或IPGVG(SEQ ID NO：6)；
(f)五肽Leu-Pro-Gly-X-Gly或LPGXG(SEQ ID NO：7)，其中X为任一天然或者非天然的氨基酸残基，并且X在多聚或者寡聚重复中任选地变动；
(g)五肽Leu-Pro-Gly-Val-Gly或LPGVG(SEQ ID NO：8)；
(h)六肽Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly或VAPGVG(SEQ ID NO：9)；
(I)八肽Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly或GVGVPGVG(SEQID NO：10)；
(J)九肽Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly或VPGFGVGAG(SEQ ID NO：11)；以及
(K)九肽Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly或VPGVGVPGG(SEQ ID NO：12)。
由SEQ ID NO：1-12定义的这些结构单位可形成结构重复单位，或进行组合使用以形成本发明的ELP组分。在一些实施方案中，所述ELP组分完全(或几乎完全)由选自SEQ ID NO：1-12的一种结构单位或者结构单位的组合(例如2、3、或者4个)所形成。在其它实施方案中，至少75％，或者至少80％，或者至少90％的ELP组分由选自SEQ ID NO：1-12的一种结构单位或者结构单位的组合而形成，而且这些结构单位可以作为重复单位的形式存在。
在一些实施方案中，所述ELP组分含有五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)的重复单位，包括串联重复单位，其中X如上文定义，并且其中五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)相对于完整ELP组分(可包含除VPGXG(SEQ ID NO：3)以外的结构单位)的百分比高于ELP组分的约75％，或高于约85％，或高于约95％。ELP组分可含有具有SEQ ID NO：3五肽的5到15个单位的重复(例如，约10个单位或约12个单位的重复)的基元，在各个重复中客位残基X在至少2个或至少3个结构单位中有所变化。可独立地选择所述客位残基，例如从氨基酸V、I、L、A、G和W中选择(并且可进行选择以保留所需的反向相变特性)。示例性基元包括VPGXG(SEQ IDNO：3)，其中客位残基为缬氨酸(可存在于40％到60％的结构单位中)、甘氨酸(可存在于20％到40％的结构单位中)和丙氨酸(可存在于10％到30％的结构单位中)。重复基元自身可被重复以产生示例性ELP组分，例如重复约5到约20次，如约8到15次(例如约12次)。本段落所描述的ELP组分当然可以由SEQ ID NO：1-12定义的任一结构单位或者其组合而构建。图1中显示了与VIP的C末端融合的一种示例性ELP组分。
在一些实施方案中，所述ELP单位可形成一种提供类弹性蛋白性质(例如反向相变)的β转角结构。适用于产生β转角结构的示例性肽序列在国际专利申请PCT/US96/05186中有所描述，该申请全文以引用的方式并入本文。例如，弹性蛋白五肽序列VPGXG(SEQ IDNO：3)中的第四位残基(X)可加以改变而不消除β转角的形成。
在一些实施方案中，所述ELP组分包括五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的多聚或者寡聚重复，其中的客位残基X为任一氨基酸。X可为天然存在或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，X选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，X为除脯氨酸或半胱氨酸之外的天然氨基酸。
所述客位残基X(例如，相对于SEQ ID NO：3或者其它ELP结构单位的客位残基)可为非经典(非基因编码的)的氨基酸。一般来说，非经典氨基酸的例子包括：常见氨基酸的D型异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、A-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计产生氨基酸(designer amino acids)，如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及氨基酸类似物。
各ELP结构单位(例如，本文所定义的具有客位残基X的各结构单位)中的X的选择可独立进行。例如，各结构单位中的X可独立地选为具有正电侧链的氨基酸、具有负电侧链的氨基酸、或者具有中性侧链的氨基酸，包括在一些实施方案中具有疏水侧链的氨基酸。
在又一些实施方案中，所述ELP组分可包括五肽VPGXG(SEQID NO：3)、IPGXG(SEQ ID NO：5)或LPGXG(SEQ ID NO：7)的多聚或者寡聚重复，或其任何组合，其中X如上文所定义。
在各实施方案中，所述ELP序列的结构单位或在一些情况下所述ELP序列的多聚或寡聚重复可被一种或多种氨基酸残基分开，该一种或多种氨基酸残基不消除所述分子的总体效能，即根据描述为所述治疗组分提供某些改善作用。在一些实施方案中，这样的一种或多种氨基酸也不消除或大体上不影响ELP组分的相变特性(相对缺失所述一种或多种氨基酸的情况而言)。
所产生的ELP组分的结构可使用符号ELPk[XiYj-n]来描述，其中k代表特定的ELP重复单位，(适用时)括号中的大写字母为单字母氨基酸编码，它们对应的下标代表各客位残基X在结构单位中的相对比例，而n以结构重复次数的形式描述ELP的总长度。例如，ELP1[V5A2G3-10]表示含有10个五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)重复单位的ELP组分，其中X为相对比例为5∶2∶3的缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；ELP1[K1V2F1-4]表示含有4个五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)重复单位的ELP组分，其中X为相对比例为1∶2∶1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELP1[K1V7F1-9]表示含有9个五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)重复单位的多肽，其中X为相对比例为1∶7∶1的赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；ELP1[V1A8G7-10]表示含有10个五肽VPGXG(SEQ IDNO：3)重复单位的ELP组分，其中X为相对比例为1∶8∶7的缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；ELP1[V-5]表示含有5个五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)重复单位的多肽，其中X完全为缬氨酸；ELP1[V-20]表示含有20个五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)重复单位的多肽，其中X完全为缬氨酸；ELP2[5]表示含有5个五肽AVGVP(SEQ ID NO：4)重复单位的多肽；ELP3[V-5]表示含有5个五肽IPGXG(SEQ ID NO：5)重复单位的多肽，其中X完全为缬氨酸；ELP4[V-5]表示含有5个五肽LPGXG(SEQ ID NO：7)重复单位的多肽，其中X完全为缬氨酸。本段落中所描述的这些ELP组分可与本发明联合使用以增强所述治疗组分的治疗特性。
此外，所述Tt为所述客位残基的疏水性的函数。因此，通过改变客位残基的成分及它们的摩尔分率可以合成出在0-100℃范围内表现出相反相变的ELPs。因此，可通过向ELP序列中加入较大比例的疏水性客位残基而降低给定ELP长度下的Tt。适当的疏水客位残基的例子包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可使用中度疏水的酪氨酸。相反地，该Tt可以通过加入残基而提高，所加入的残基的例子如选自由以下氨基酸组成的群组的氨基酸：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺；优选地，选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸。
在一些实施方案中，选择或设计了ELP组分以提供介于约10到约80℃之间的Tt(在生理条件下)，例如介于约35到约60℃之间或介于约38到约45℃之间。在一些实施方案中，所述Tt高于约40℃或高于约42℃，或高于约45℃，或高于约50℃。在一些实施方案中，该相变温度高于受试者或患者的体温(例如＞37℃)，由此而在体内保持可溶，或者在其它实施方案中，Tt低于体温(例如＜37℃)以提供其它优点，例如在体内形成药物贮库用于治疗剂的缓释释放。例见US 2007/0009602，其全文以引用的方式并入本文。
由于Tt一般随MW的降低而升高，所以可通过改变ELP链长而修饰所述ELP组分的Tt。对于分子量＞100,000的多肽，Urry等(PCT/US96/05186，其全文以引用的方式并入本文)所开发的疏水性标度法(hydrophobicity scale)提供了预测某一特定ELP序列的近似Tt的方法。但是，在一些实施方案中，可通过在所述ELP序列中引入较大比例的疏水客位残基(例如具有疏水侧链的氨基酸)来保持相对较小的ELP组分长度同时又维持目标Tt。对于分子量＜100,000的多肽，可通过以下的二次函数来预测或者测定Tt∶Tt＝M0+M1X+M2X2，其中X为融合蛋白的分子量，并且M0＝116.21；M1＝-1.7499；M2＝0.010349。
客位残基X的成分和疏水性影响所述ELP组分的Tt并由此而影响同治疗组分相偶联的ELP组分的Tt的同时，该分子的其它性质也可能受到影响。这类性质包括但不限于，分子的溶解度、生物利用率、存留期、半衰期、效力和安全性。
在下文的实施例一节中，可见所述与ELP偶联的VIP药剂相对无融合形式的VIP保留了相当数量的天然VIP生物活性。另外，据显示ELP表现出长半衰期。因此，ELP可根据本发明使用从而使VIP在同ELP连接时与自由(未连接)形式的治疗剂相比较显著地提高半衰期(例如在具体的实施方案中提高超过10％、20％、30％、50％、100％、200％或更多)。具有延长的循环半衰期的经修饰VIP可每周施用1到约10次，例如每周1到约5次或1到约3次。经修饰VIP或者包含该VIP的药物组合物的施用可以约每日一次，或约每两日一次，或约每三日一次或者约每周一次(即一周一次给药)。
连接和偶联
根据本发明的一些实施方案，重组产生的VIP融合蛋白包括通过基因融合而相互结合的融合组分(例如ELP)和VIP或VIP的类似物。例如，可通过对编码了克隆入ELP组分读码框架的VIP或VIP类似物的多聚核苷酸进行翻译而产生所述融合蛋白。
在一些实施方案中，可使用一种不同长度的连接肽来使所述ELP组分和VIP或VIP的类似物进行融合以提供较大的物理分隔并容许融合部分间具有更大的空间活动性，并且由此而使VIP或VIP的类似物的可接近程度最大化，例如对于与它的同源受体的结合。所述连接肽可由柔性或较为刚性的氨基酸组成。例如，柔性连接体可包括侧链相对较小的氨基酸，并且这些氨基酸可能是亲水的。非限制性地，所述柔性连接体可包含甘氨酸和/或丝氨酸。较为刚性的连接体可含有，例如空间位阻更大的氨基酸侧链，如(并不限于)酪氨酸和组氨酸。连接体可小于约50、40、30、20、10或5个氨基酸残基。连接体可共价连接VIP或VIP的类似物与ELP组分并处于它们之间，例如通过重组融合进行连接。
所述连接体或者肽间隔体可为蛋白酶可切割的或不可切割的。例如，可切割的肽间隔体包括但不限于，为不同种类蛋白酶(在体内或体外)所识别的肽序列，例如烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tev)、凝血酶、凝血因子Xa、纤溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶(例如GFLG，SEQ ID NO：47等)以及其它生物区室(corporealcompartment)中可见的蛋白酶。在使用可切割连接体的一些实施方案中，融合蛋白在呈融合形式时可为无活性、低活性或低效力，随后可通过在体内切割间隔体进行激活。或者，在治疗剂呈融合形式时具有充分活性的情况下，可以使用不可切割的间隔体。所述不可切割的间隔体可为任何适当的类型，包括例如，分子式为[(Gly)n-Ser]m的不可切割的间隔部分，其中n介于包括上下限在内的1到4之间，m介于包括上下限在内的1到4之间。或者，在达到所述必需效果的同时，可以使用与骨架ELP有所不同的短ELP序列替代连接体或者间隔体。
在又一些实施方案中，所述治疗剂为一种重组融合蛋白，该蛋白具有两个末端均侧接ELP组分的治疗组分。所述ELP组分中的至少一个可通过可切割的间隔体而连接，从而使治疗组分无活性，但可通过对单个ELP组分进行蛋白酶切除而在体内进行激活。所产生的单ELP融合蛋白具有活性以及增强的体内半衰期(或本文所述的其它性质)。
在其它实施方案中，本发明提供了VIP或VIP类似物同所述ELP组分的化学连接物。通过使用本领域已知的许多方法(例见Nilsson等，2005，Ann Rev Biophys Bio Structure 34：91-118)，将ELP组分同VIP或VIP类似物进行化学偶联可制备所述连接物。在一些实施方案中，该化学连接物的形成可通过将VIP或VIP类似物共价连接于ELP组分以形成共价连接物而进行，所述共价连接可直接进行或者通过一个短或长连接部分、通过所述治疗性蛋白组分上的一个或多个官能团，例如胺基、羧基、苯基、硫醇基或者羟基而达成。可以使用多种常规连接体，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、碳化二亚胺、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯(maleimide-hydroxysuccinimide ester)、戊二醛等。
非肽类化学间隔体可以是另外其它任何适用的类型，包括例如，通过Greg T.Hermanson著的Academic Press，Inc.于1995年出版的Bioconjugate Techniques中所描述的以及可购自Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Illinois)的在Cross-Linking Reagents TechnicalHandbook中具体描述的功能性连接体，这些出版物各自的全文以引用的方式并入本文。示例性化学间隔体包括可连接赖氨酸的氨基的同型双功能连接体，以及可一端连接半胱氨酸而另一端连接赖氨酸的异型双功能连接体。
在一些实施方案中，在室温下(或人体温度，例如Tt＞37℃)不发生相变的相对较小的ELP组分(例如小于约30kDa、25kDa、20kDa、15kDa或10kDa的ELP组分)经过化学偶联或交联。例如，具有相同或不同性质的两个相对较小的ELP组分可进行化学偶联。在一些实施方案中，通过在ELP的C末端或其附近添加单一的半胱氨酸残基，所述的偶联可在体内发生。这些ELP组分可各自同一个或多个治疗组分进行融合以在目标中提高活性或者亲合力。
多聚核苷酸、载体、宿主细胞和产生方法
在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明的经修饰VIP的核苷酸序列的多聚核苷酸。除编码VIP或VIP类似物的序列和融合序列之外，所述多聚核苷酸可进一步包含一个或多个表达控制元件。例如，多聚核苷酸可包含一个或多个启动子或者转录增强子、核糖体结合位点、转录终止信号以及多聚腺苷酸化信号以作为表达控制元件。多聚核苷酸可插入任何适当的载体内，该载体可包含于任何适用于表达的宿主细胞，例如大肠杆菌。
一般来说，可将包含所述多聚核苷酸的载体引入用于表达所述治疗剂的细胞。在编码治疗剂的插入片段可被转录的前提下，所述载体可保持游离态或者整合入染色体。载体可通过标准的重组DNA技术进行构建。载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒或者本领域中的任何已知类型，这些载体可用于原核或真核细胞中的复制和表达。本领域的技术人员应当理解，本领域中已知的广泛种类的组分(例如表达控制元件)可包含入这些载体，这些组分包括广泛种类的转录信号，例如启动子和其它调控RNA聚合酶同启动子结合的序列。任何在表达所述载体的细胞中已知有效的启动子均可用于起始治疗剂的表达。适当的启动子可以为诱导型或者组成型。
在一些实施方案中，所述经修饰VIP从大肠杆菌或其它细菌表达系统中进行表达。大肠杆菌一般在表达期间不会去除N末端甲硫氨酸，因此经修饰VIP分子保持受体特异性。可根据本发明使用包括酵母表达系统、哺乳类细胞表达系统和杆状病毒表达系统在内的其它表达系统。
在使用ELP融合序列时可通过反向温度循环回收所述治疗蛋白。具体而言，如上文所述，ELP组分经受可逆的反向相变。即，ELP组分在低于相变温度(Tt)时为结构无序并高度可溶于水，但当温度升高超过Tt时表现出狭窄的(2-3℃范围)无序至有序的相变，从而导致ELP组分的去溶剂化和聚集。例如，ELP在达到足够大小的时候形成不溶的聚合物，该不溶的聚合物可容易地通过离心从溶液中去除和分离。这种相变是可逆的，并且当温度回至ELP的Tt之下的时候已分离的不溶ELP可完全复溶于缓冲溶液。因此，在一些实施方案中可使用反向相变循环程序，例如利用治疗剂的温度依赖性溶解度或者向介质中添加盐，以将本发明的治疗剂同其它的污染蛋白进行分离以达到高纯度。可以使用连续的反向相变循环以获得高纯度。除温度和离子强度外，其它可用于调控治疗剂的反向相变的环境变量包括pH、添加无机和有机溶质和溶剂、侧链离子化或化学修饰，以及压力。
药物组合物和施用方法
本发明进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的经修饰VIP(如上文所述)以及药学上可接受的载体、稀释剂或者赋型剂。如本文所述，所述药物组合物有治疗或改善效果，例如治疗或改善自体免疫或炎症性疾病。
本发明的治疗剂本身可用于施用，也能以包括其药学上可接受的酯类、盐类和其它生理功能性衍生物在内的多种形式进行施用。在这些药物制剂中，治疗剂可单独使用或与其它治疗成份一同使用(包括共同配制)，例如抗炎剂或免疫抑制剂。
所述载体必须是药学上可接受的，其意义为与制剂中其它成份相容并且对其受者无不良影响。
所述治疗剂的制剂包括适于肠胃外施用以及非肠胃外施用的制剂。示例性施用模式包括口服、口腔、局部、鼻腔、皮下、肌内和静脉内以及其它方式。适用于肠胃外施用的制剂较为优选。
包含本发明治疗剂的制剂可方便地以单位剂量的形式提供并且可通过制药领域所熟知的任何方法进行制备。这类方法一般包括将治疗剂结合于由一种或多种附加成份所构成的载体的步骤。通常，通过将治疗剂均一而紧密地结合于液态载体、细化的固态载体或同时结合于这两者，并且随后在必要的情况下将产品塑形成为剂量形式的所需制剂，来制备所述制剂。
适用于肠胃外施用的制剂可方便地包含所述治疗剂的无菌水性制备物，该制备物优选地与受者血液的渗透压相等(例如生理盐水溶液)。这类制剂可包括悬浮剂和增稠剂或其它微颗粒系统，这些系统经设计以用于将治疗剂靶定于血液循环(circulation)或者一个或多个器官。制剂可以以单位剂量或多重剂量的形式存在。
除上文提及的成份外，本发明的制剂可以进一步包含一种或多种附加成份，这些附加成份选自稀释剂、缓冲液、调味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。
尽管本领域的技术人员可以确定在各种情况下的所需剂量(包括用于储库式施用的单位剂量)，但获得治疗良效所需的治疗剂的适当剂量可为，例如，约1微克(μg)到约100毫克(mg)每千克受者体重的范围，或约10μg到约50mg每千克受者体重的范围，或约10μg到约10mg每千克受者体重的范围。所述所需剂量可以是单剂或者在整个给药时期以适当的间隔(例如一周、两周等)进行施用的两个或更多的亚剂(sub-dose)。这些亚剂可以以单位剂量的形式进行施用，例如每单位剂量形式含有约10μg到约500mg、或约50μg到约200mg、或约50μg到约100mg的活性成份。或者，如果受者病状所需，所述剂量可以以连续输注的方式施用。
施用模式和剂量形式必然会影响所述肽类活性治疗剂对于给定的治疗应用所需和有效的治疗用量。例如，口服施用剂量可为肠胃外施用方法的剂量水平的至少两倍，例如2-10倍。储库式制剂也可容许递送显著较多的治疗剂，由此使药剂随时间缓释释放。
在正常个体的血浆中循环的VIP起始于胃肠道中含VIP的神经纤维并从血管神经反映肽过量(overflow)(Cugini等，1991，Reg Pept 34：141-8)。如大多数血管活性蛋白一样，VIP具有相对较短的半衰期。血液中VIP的半衰期低于2分钟(Domschke等，1978，Gut 19：1049-53；Burhol等，1978，Scand J Gastroent 13：807-813)。本文所述的经修饰VIP一个优点为延长的半衰期或者体内存留期。根据本发明的一些实施方案，VIP可以每周进行1到约10次施用，例如每周1到约5次或1到约3次。经修饰VIP或包含经修饰VIP的药物组合物的施用可为约每日一次、或约每两日一次、或约每三日一次、或约每周一次。
在一些实施方案中，经修饰VIP以肠胃外方式进行施用，例如通过皮下或者肌内注射。根据本文所述，该施用可为单位剂量的经修饰VIP。
在进行肠胃外施用时，经修饰VIP可每日施用一次，或者每周施用一次或两次，或者每月施用一次到五次。在这些实施方案中，如本文所述，经修饰VIP可以以在血液循环中可存留的可溶融合肽的形式进行施用，从而以相对较低频率的施用提供持续活性。另据本文所述，经修饰VIP可以以药物储库的形式进行施用，从而提供融合肽随时间向血液循环中的缓释释放。见US 2007/0009602，该专利以引文的方式并入本文。
使用方法
在另一些方面，本发明提供了在哺乳类体内治疗、改善或者预防某一病状的方法。这些病状包括各种心血管、免疫(例如自体免疫)和神经病状。例如，经修饰VIP可用于在患者体内调节促炎性和抗炎性效应因子之间的平衡，所述患者包括罹患自体免疫疾病或者炎症病状的患者。经修饰VIP的示例性适应症包括高血压、心肌纤维化、心力衰竭、心肌病、糖尿病、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎、炎性肠病(IBD)、帕金森氏症、脑损伤和哮喘以及其它适应症。
本发明因此提供了一种用于治疗多种包括以自体免疫或炎症为特征的病状在内的病状的方法。所述方法包括以有效量的本发明的经修饰VIP对有需求的患者进行施用。
高血压
在本文所述的多种实施方案中，本发明提供了在有需求的患者体内治疗或者预防高血压的方法，所述方法包括以有效量的经修饰VIP进行施用。本发明的经修饰VIP可治疗的高血压的形式包括肺高血压、非受控原发性高血压(uncontrolled essential hypertension)和顽固性高血压。
肺高血压是一种相对少见但是高致死性的疾病，其特征为进行性的肺动脉高血压和肺小动脉增厚的提高，最终出现右心室(RV)衰竭(Said等，2007，Circulation 115：1260-8)。已经将VIP同肺循环和体循环相关联。对于肺血管床和它在肺高血压中的变化，VIP在体外可舒张多种哺乳类物种的肺血管平滑肌，在患有肺高血压的患者体内中和或者削弱内皮素和其它血管收缩剂的活性，降低缺氧性肺血管收缩，并且抑制肺血管平滑肌的增殖。此外，VIP是肺血管平滑肌舒张的生理性非肾上腺素非胆碱能系统的协同递质(cotransmitter)。而且，正常情况下在肺动脉中含量充足的含VIP的神经已被报道在患有肺高血压的患者的肺动脉中含量缺乏，并且吸入所述肽对这些患者具有有益疗效(Petkov等，2003，J.Clin Invest.111：1339-1346)。最后，研究已经显示在VIP-/-小鼠体内进行的VIP置换疗法能够阻止或至少减缓肺高血压中关键生理变化的发展(Said等，2007，Circulation 115：1260-8)。因此，可以预期对患有肺高血压的患者使用VIP将引起该疾病血流动力学和预后参数的实质性改善(Petkov等，2003，J.ClinInvest.111：1339-1346)。
非受控原发性高血压是指在未见高血压原因的情况下血压持续高于正常值。原发性高血压是最为流行的高血压类型，影响了90-95％的高血压患者(Carretero等，2000，Circulation 101：329-35)，并且专家认为它是由多种未发现的因素所致。在有中风倾向的原发性高血压大鼠体内，VIP浓度有所降低(Mori等，1993，Jpn Heart J.34：785-94)，并且在自发性高血压的仓鼠体内通过立体稳定脂质体使用人VIP可使体循环动脉压正常化(Onyuksel等，2006，Peptides 27：2271-5)。
顽固性高血压是对治疗无反应的一种高血压形式(即，即使使用药物组合进行施用，血压仍然居高不下)。血压控制不力的原因有很多。由于过量钠摄入、药物不耐受、不遵医嘱和继发性高血压这些因素中任何一个所导致的容积超负荷是最有可能的原因(Graves JW等，2000，Mayo Clin Prac 75：278-84)。作为一种强力的全身性血管舒张剂，VIP可用于对产生顽固性高血压标志的患者的高血压进行治疗和预防。
心脏疾病
在额外的实施方案中，本发明提供了治疗或预防有需求的患者的心脏疾病的方法，所述方法包括施用有效量的经修饰VIP。本发明的经修饰VIP可治疗的心脏疾病的形式包括心肌纤维化、心力衰竭和心肌病。
在多种疾病的病理发作中，例如心力衰竭和心肌纤维化，VIP在心脏中的合成和分泌的变化表现出起一定作用(DvorákováMC，2005，Drug News Perspect.18：387-91)。例如，在患有心肌病的患者的组织和心力衰竭的动物模型的心脏组织中，VIP的浓度均有显著降低(Unverferth等，1986，J.Lab Clin Med 108：11-16)。此外，在出现纤维化的心脏中，VIP的降解有所提高并且由此心肌VIP浓度有所降低。因此，降低的VIP在该疾病的病理发作中表现为重要因素(Ye等，2003，Acta Physiol Scand 179：353-60)，而且降低的VIP浓度同心力衰竭的进行性恶化相关联。与对照相比较，已知能降低VIP的代谢清除率的血管肽酶抑制剂奥马屈拉(omapatrilat)的使用引起收缩压的降低以及心肌纤维化降低(Ye等，2004，Eur J Pharmacol 485：235-42)。VIP的保护性效果在缺血再灌注的心肌中也有所报道(Kalfin等，1994，J Pharmacol Exp Ther 268：952-8)。因此，预期本发明的经修饰VIP的使用可在包括心力衰竭、心肌病和心肌纤维化在内的多种病理状态中具有有益效果。
2型糖尿病
在额外的实施方案中，本发明提供了治疗或预防有需求的患者的糖尿病的方法，所述方法包括施用有效量的经修饰VIP。具体地，本发明的经修饰VIP可用于2型糖尿病的治疗和预防。
研究表明，糖尿病大鼠的胃窦和十二指肠中的VIP含量显著低于正常大鼠(Gozes等，2004，Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18：623-640)。胃十二指肠腔内VIP的低组织水平可部分地归因于糖尿病患者体内所观察到的异常胃肠运动(Adeghate等，2001，Arch PhysBioc 109：246-51)。VIP刺激胰岛素从胰岛瘤细胞、小鼠胰岛和灌流大鼠胰腺中的分泌。VPAC1的激活已同升高的葡萄糖输出相关联(Gozes等，2004，Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18：623-640)，而VIP受体VPAC2在胰岛β-细胞中有表达并且它的激活导致环式AMP的升高和胰岛分泌的刺激(DeSouza等，2009，Nature Reviews 8：361-7)。此外，VIP在人体内刺激胰高血糖素的分泌，从而引起肝脏中的葡萄糖释放。综上所述，这些研究揭示，VIP对于葡萄糖代谢具有多方面的直接作用。因此，VIP和经修饰形式的VIP，例如本文所公开的融合肽，可预期成为用于2型糖尿病的治疗和预防的有效疗法。
VPAC2受体优选性
在一些实施方案中，例如在所述经修饰VIP同未修饰的VIP相比对VPAC2具较高优选性的实施方案中，经修饰VIP可在患者体内降低炎症反应，例如迟发型超敏反应。在一些这样的实施方案中，经修饰VIP减慢自体反应性T细胞的发育。在这些实施方案中，患者可具有由TH1型炎症或者TH1自体免疫所定义的一种或多种病状，例如关节炎(包括RA)、炎性肠病(例如克罗恩病)、1型糖尿病、多发性硬化、移植排异、干燥综合征、胰腺炎、葡萄膜视网膜炎、角膜炎和败血性休克。
VPAC1受体优选性
在一些实施方案中，例如在所述经修饰VIP同未修饰的VIP相比对VPAC1具较高优选性的实施方案中，经修饰VIP可在患者体内促进TH1炎症反应，例如迟发型超敏反应。在这些实施方案中，患者可具有一个或多个同TH2免疫性相关联的病状，例如哮喘或者慢性阻塞性肺病(COPD)。
COPD是呼吸道的慢性炎症疾病，工业化国家中多达8％的个体受到该疾病的影响。罹患COPD的女性和男性的数目有所增加。肺高血压是慢性气流阻塞的常见症状，但是血管阻力升高的精确机理尚不明朗。COPD中肺高血压的可能的原因包括毛细血管床的气肿性破坏、肺血管的重塑和缺氧性肺血管收缩。
VIP是可见于呼吸道中丰度最高的分子之一。由于它的抗炎性和支气管扩张特性，有人提出VIP是COPD和哮喘的一种新颖治疗方法。尽管VPAC1的上调占主导地位，但VPAC1和VPAC2对于最佳的抗炎信号转导都是必需的(Burian等，2010，Peptides 31：603-8)。因此，使用VIP和经修饰形式VIP的治疗，例如使用本文所公开的融合多肽的治疗，被预期能够在COPD和哮喘患者的肺部帮助减弱慢性炎症。
本发明进一步通过以下非限定性实施例进行说明。本申请全文中引用的所有文献、发明和公开的发明申请以及附图均出于所有目的全文以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1
VIP-ELP构建体的克隆
所述VIP肽的DNA序列的描述见Simoncsits等(Synthesis，cloning and expression in Escherichia coli of artificial genes coding for biologically active elongated precursors of the vasoactive intestinal polypeptide，Eur.J. Biochem.1988，178(2)：343-350，只是所述VIP肽的残基17为天然的甲硫氨酸并且不具有任何一个该文献所述的C末端延伸(见SEQ ID NO.16)，出于所有目的该文献的全文以引用的方式并入本文。
制备了两种初始变体，其中之一在N末端具有一个甲硫氨酸(PB1046，SEQ ID NO.17)，这是出于所需的ATG起始密码子的原因，而其中一个在N末端为三肽MAA(PB1047，SEQ ID 18)。PB1046中的甲硫氨酸在正常情况下被甲硫氨酸氨肽酶(MA)所去除，但是由于组氨酸是第二位残基并且是这个位置上最不受MA青睐的氨基酸之一，因此甲硫氨酸不被去除。PB1047中的甲硫氨酸被去除而留下AA，该AA可在体外或体内被DPPIV去除而使组氨酸成为N末端残基。将所述VIP的DNA序列克隆入携带有ELP1-120DNA序列的载体pPB1031(见图3)以产生处于T7启动子控制之下的表达盒。
合成的寡聚核苷酸P0045(SEQ ID NO.31)、P0048(SEQ ID NO.32)、P0064(SEQ ID NO.33)和P0065(SEQ ID NO.34)在一起进行退火，经限制性酶XbaI消化并且连接进入经限制性酶XbaI/KpnI消化的质粒pPB1031以产生表达质粒pPB1046(见图4)。
合成的寡聚核苷酸P0066(SEQ ID NO.35)、P0064(SEQ ID NO.33)、P0067(SEQ ID NO.36)和P0065(SEQ ID NO.34)在一起进行退火，经限制性酶XbaI消化并且连接进入经限制性酶XbaI/KpnI消化的质粒pPB1031以产生表达质粒pPB1047(见图5)。
除此之外，在假定N末端对于活性并非绝对必要的情况下，也制备了一种C末端的融合蛋白，pPB1048(见图6)。合成的寡聚核苷酸P0068(SEQ ID NO.37)和P0069(SEQ ID NO.38)在一起进行退火并且连接进入经限制性酶BglI/NheI消化的质粒pPB1031以产生表达质粒pPB1048。
实施例2
VIP-ELP构建体的表达
使用质粒pB1046、pPB1047和pPB1048对大肠杆菌生产菌株BLR(Novogen)进行了转化并且将其在摇瓶内在丰富培养基中于37℃下过夜生长。在pH8.0的TE缓冲液中重悬浮细胞沉淀(pellet)，通过高压微射流均质机(Microfluidics)进行裂解，离心去除不溶物质并使用添加NaCl至3M以产生‘相变’(ref)的方式将产物从所产生的可溶裂解液中纯化。对样品再进行两回合相变以产生最终纯化样品。通过SDS-PAGE分析这些样品，发现PB1046和PB1047得出两条泳带(见图7)。假设这是蛋白酶解的后果，对培养物进行重新生长，但这次在裂解前进行了60℃的15分钟加热。通过10％的Tris-醋酸NuPAGE凝胶分析表明蛋白酶解已受到抑制(见图7)。
所述蛋白酶解最为可能发生在肽内部，并且有可能接近肽与ELP的接合处，这是因为C末端融合蛋白PB1048未见断裂。可通过在细胞裂解前对蛋白酶进行热变性而防止蛋白酶解，这往往会涉及到一种周质蛋白酶而非胞质蛋白酶，或一种非通过裂解而激活或发生作用的胞质蛋白酶。
实施例3
经修饰VIP-ELP融合蛋白的体外活性
使用一种基于细胞的生物分析来测定VIP或VIP-ELP融合蛋白的体外生物活性或效力。所述分析在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内测量由于VIP或VIP-ELP融合蛋白处理而引起的胞内环腺苷单磷酸(cAMP)浓度的升高，所述CHO细胞经工程化改造而表达人血管活性肠肽受体2(VPAC2)或者人血管活性肠肽受体1(VPAC1)两者中的一种。VIP和VIP-ELP融合蛋白均可在这些细胞中刺激cAMP的产生，这表明融合蛋白保留了结合并激活所述受体的活性。由于受体介导的配基结合和激活后cAMP在细胞内的积累量与存在的完整肽或融合蛋白的量呈正比，所以该分析可用于测定生物活性或者相对效力。
在本实施例中测试了VIP-ELP融合蛋白PB1046和PB1047的活性。构建体PB1046含有在N末端为甲硫氨酸的VIP，而构建体PB 1047含有在N末端为丙氨酸-丙氨酸的VIP。两种构建体均在它们的C末端具有ELP(1-120)。在第一个实验中，使用表达VIP受体VPAC2的CHO细胞测试了构建体的活性。在将不同浓度的融合蛋白同细胞孵育30分钟之后，细胞发生裂解并且使用商业试剂盒对所产生的cAMP量进行测量。在加入细胞之前使用DPP-IV对PB1047进行了处理。图8显示了结果。如图所示，经修饰VIP融合蛋白PB1046在某种程度上比天然VIP蛋白活性更高，而PB1047则活性低于天然VIP蛋白。
还使用表达VIP受体VPAC1的CHO细胞测试了PB 1046和PB 1047的活性。在将不同浓度的融合蛋白同CHO细胞孵育30分钟之后，细胞发生裂解并且使用商业试剂盒对所产生的cAMP量进行测量。在加入细胞之前使用DPP-IV对PB1047进行了处理。图9显示了结果。这一次，经修饰VIP融合蛋白PB1046远比天然VIP蛋白活性更低，而PB1047同天然VIP相比的相对活性与对VPAC2受体进行的测试中的相对活性大致相同。这些结果暗示相对VPAC1受体，PB1046选择性地激活VPAC2受体。
实施例4
VIP-ELP融合蛋白的血压效果
还在体内对经修饰VIP-ELP融合蛋白PB1047的活性进行了测试。具体地，测试了VIP-ELP融合蛋白对血压的效果。使用PB1047(10mg/kg)或对照缓冲液对自发性高血压大鼠进行了皮下处理，并且在融合蛋白施用后的多个时间点测量了这些大鼠的血压。各实验组使用了五只动物并且这些图显示出平均值和标准差。在施用后至少12个小时PB1047在这些动物体内显著地降低了收缩和舒张血压(见图10)，表明VIP-ELP融合蛋白具有活性，并且在治疗VIP相关疾病中有用作药物的潜在可能。
实施例5
额外的VIP-ELP融合蛋白
DPP IV对PB1047的处理导致了AA和HS都受到从N末端的去除和肽的失活。因此而构建了质粒pPB1064，其中将N末端改成SEQID NO：45的MAAHG而替代了SEQ ID NO：46的MAAHS，这是因为HG对于DPP IV的抗性高于HS。
还构建了质粒pPB1056，该质粒编码一种在ELP前具有带相反电荷的连接体重复的VIP，所述连接体基于SEQ ID NO：3的VPGXG(SEQ ID NO.20)。
实施例6
额外的ⅥP-ELP融合蛋白PB1120的克隆、表达和分析
将所述VIP的DNA序列克隆进入携带了ELP1-120的DNA序列的载体pPB1120(SEQ ID NO：48)(见图11)从而产生处于T7启动子控制下的表达盒。其次，根据上文所述，使用质粒pB1120对大肠杆菌生产菌株BLR进行了转化并且将其在丰富培养基生长。纯化并使用SDS-PAGE分析了所产生的VIP-ELP1-120融合肽pPB1120的样品。
对PB1120融合肽的活性进行了体外测试。根据上文实施例3所述，使用一种利用表达VIP受体(VAPC1)的CHO细胞的分析对该活性进行了测试。如图12所示，PB1120对VPAC1受体的活性是天然VIP肽的约1.4分之一。与之相比，含有N末端甲硫氨酸残基的构建体PB1046的活性是天然VIP肽约11分之一。在多次实验过程中，PB 1120对VPAC1受体的活性与天然VIP肽相比为约1.4分之一到6分之一之间的任何倍数。
图13显示了PB1120对VPAC2受体的活性。与对VPAC1受体所见的结果类似，PB1120对VPAC2受体显示出的活性略低于天然VIP肽(～1.5分之一)。但是，同VPAC1所见的结果相对比，PB1046与天然肽对于VPAC2具同等效力。在多个实验过程中，PB1120对VPAC2受体的活性与天然VIP肽相比为约1.5分之一到7分之一之间的任何倍数。
实施例7
经修饰VIP-ELP融合蛋白PB1120的药物动力学特征
除上述的生物效力分析外，还对经修饰VIP-ELP融合蛋白PB1120的药物动力学特征进行了检测。对猴给以PB1120的单次皮下(SC)注射(3mg/kg的剂量)并在一周时间内对血浆药物浓度进行每日测量。使用了三只动物，并且这些图显示了平均值和标准差。到第4天PB 1120在血液循环中保持了超过一半的初始剂量(见图14A和14B，这些图分别以线性和半对数的坐标轴显示了SC施用后PB1120的平均血浆浓度)。
根据这些数据，在以PB1120进行皮下施用之后显示出延长的吸收期，这与从施用位点的缓慢吸收相一致。基于血浆浓度衰减的表观消除半衰期(t1/2)介于9.9到45.8小时之间，并且可能反映了缓慢的吸收而非真实的消除。这些数据表明VIP-ELP融合蛋白同天然VIP相比具有明显延长的半衰期并且有潜力进行延长间隔的施用(例如，可约每日一次、约每两日一次、约每三日一次或约每周一次进行施用)。
实施例8
经修饰VIP-ELP融合蛋白PB1120对血压的效果
为测量经修饰VIP-ELP融合蛋白PB1120对收缩压、舒张压和平均动脉血压的效果，对大鼠给以0.1mg/kg、1mg/kg或5mg/kg的PB1120的单次皮下注射并且以3小时的间隔进行评价。图15A、15B和15C分别示出收缩压、舒张压和平均动脉压的平均变化。图15D示出施用PB1120后以三个小时为间隔的平均心率。如图15A-C显示，接受1mg/kg或者5mg/kg的PB1120注射的大鼠于注射后9个小时在收缩压、舒张压和平均动脉压上表现出显著降低，表明VIP-ELP融合蛋白PB 1120有潜力进行施用以用于治疗或预防患病个体的高血压。
除非另行限定，否则本文的所有技术性和科学性术语均具有本发明所属的领域中的普通技术人员所广泛理解的同样含义。尽管与本文所述相类似或者等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施或测试，但本文中描述了优选的方法和材料。出于一切目的，所引用的所有出版物、专利或专利申请均全文以引用的方式并入本文。
本文所讨论的出版物仅仅是为了提供本发明申请日之前的这些出版物所公开的内容。不应解释为承认本发明无权通过以在先发明的方式从而先于这些出版物。
尽管本发明结合其具体的实施方案进行描述，但应当了解可对它进行进一步的修改并且本申请旨在涵盖任何基本根据本发明的原理而对本发明进行的变动、使用或适应性调整，并且包括虽然不属于本公开内容但属于本发明所属领域的已知或习用实施手段的和属于上文所述的实质特征的以及符合所附权利要求范围之内的变更。
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Claims (43)

1.一种治疗组合物，其包含融合蛋白和药学上可接受的载体，
其中所述融合蛋白包含VIP和至少一种类弹性蛋白肽(ELP)组分，并且其中所述VIP表现出延长的半衰期以支持每天一次或更低的给药频率。
2.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述ELP组分由SEQID NO：1-12所定义的一个或多个氨基酸重复单位构成。
3.根据权利要求2所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含VPGXG(SEQ ID NO：3)、IPGXG(SEQ ID NO：5)和/或LPGXG(SEQ ID NO：7)的重复，其中X为基因编码的氨基酸。
4.根据权利要求3所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含VPGXG(SEQ ID NO：3)重复，其中X独立地选自V、A和G，或者独立地选自K、V和F。
5.根据权利要求4所述的治疗组合物，其中X为V、A和G，其比率为约V5、A2和G3。
6.根据权利要求5所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含60个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
7.根据权利要求6所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含120个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
8.根据权利要求4所述的治疗组合物，其中X为V、A和G，其比率为约V1、A8和G7。
9.根据权利要求8所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含60个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
10.根据权利要求9所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含120个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
11.根据权利要求4所述的治疗组合物，其中X为K、V和F，其比率为约K1、V2和F1。
12.根据权利要求11所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含60个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
13.根据权利要求12所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含120个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
14.根据权利要求4所述的治疗组合物，其中X为V。
15.根据权利要求14所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含60个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
16.根据权利要求14所述的治疗组合物，其中所述ELP组分包含120个重复单位的VPGXG(SEQ ID NO：3)。
17.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述VIP具有SEQID NO：13的氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述VIP具有SEQID NO：21-27中任何一个的氨基酸序列。
19.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述ELP组分在VIP的C末端。
20.根据权利要求1所述的治疗组合物，其进一步包含位于VIP和所述ELP组分之间的间隔序列。
21.根据权利要求20所述的治疗组合物，其中所述间隔肽为蛋白酶抗性的或者蛋白酶可切割的。
22.根据权利要求21所述的治疗组合物，其中所述间隔肽为蛋白酶可切割，并且包含凝血酶切割位点、因子Xa切割位点、金属蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tev)切割位点或组织蛋白酶切割位点。
23.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述组合物经配制以用于肠胃外施用。
24.根据权利要求23所述的治疗组合物，其中所述组合物经配制以用于皮下、肌内或静脉内施用。
25.一种治疗剂，其包含VIP或其功能性类似物和N末端部分从而与未修饰的VIP相比，改变所述VIP对VPAC2较之VPAC1的优选性。
26.根据权利要求25所述的治疗剂，其中所述VIP具有SEQ IDNO：13的氨基酸序列。
27.根据权利要求25所述的治疗剂，其中所述VIP具有SEQ IDNO：21-27中任何一个的氨基酸序列。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂具有至少约2∶1的对VPAC2高于对VPAC1的相对结合优选性。
29.根据权利要求25-27中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂具有至少约50∶1的对VPAC2高于对VPAC1的相对结合优选性。
30.根据权利要求25-27中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂具有至少约2∶1的对VPAC1高于对VPAC2的相对结合优选性。
31.根据权利要求25-27中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂具有至少约50∶1的对VPAC1高于对VPAC2的相对结合优选性。
32.一种对需要VIP的受试者进行治疗的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-31的组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者为人受试者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物经配制以用于皮下施用。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物经配制以用于每日一次给药。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物经配制以用于每周三次给药。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物经配制以用于每周两次给药。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物经配制以用于每周一次给药。
39.一种治疗或预防受试者的高血压的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-38中任一项所述的组合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述高血压选自肺高血压、非受控原发性高血压和顽固性高血压。
41.一种治疗或预防受试者的心脏疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-38中任一项所述的组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述心脏疾病选自心肌纤维化、心力衰竭和心肌病。
43.一种治疗或预防受试者的2型糖尿病的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-38中任一项所述的组合物。
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