MX2012001979A - Peptidos intestinales vasoactivos modificados. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona Péptidos Intestinales Vasoactivos (VIPs por sus siglas en inglés) modificados, que codifican polinucleótidos y vectores, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos. La invención proporciona además métodos de elaboración y uso de los agentes VIP modificados. De acuerdo con la invención, el VIP muestra una vida media circulatoria prolongada, enlace al receptor de potencia biológica, y/o perfil alterado del receptor de enlace con respecto a un VIP no modificado.

Description

PEPTIDOS INTESTINALES VASOACTIVOS MODIFICADOS REFERENCIA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica prioridad conforme al 35 U.S. C. § 119(e) a la Solicitud Provisional de Estados Unidos serie N° 61/234,151, presentada el 14 de agosto de 2009, la cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia./ CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a péptidos intestinales vasoactivos (VIP) y composiciones farmacéuticas que los comprenden, incluidos los VIP que tienen una semivida circulatoria prolongada y los VIP que tienen perfiles de unión al receptor que difieren del péptido maduro sin modificar.

DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO DE FORMA ELECTRÓNICA El contenido del archivo de texto presentado de forma electrónica se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Copia del formato legible informáticamente del Listado de Secuencias (nombre del archivo: PHAS_019_01US_SeqList_ST25.txt, fecha registrada: i 4 de agosto, 2010, tamaño del archivo 44 kilobytes) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El péptido intestinal vasoactivo. (VIP) posee una cantidad de efectos biológicos incluidos los relativos a la hemostasis, el sistema inmune y el sistema nervioso. Véase, Delgado et ál., The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation, Pha.rma.col. Reviews 56 (2) :249-290 (2004). Por ejemplo, los VIP poseen un efecto beneficioso sobre la presión sanguínea y pulmonar y sobre una amplia variedad de afecciones inmunológicas e inflamatorias. El VIP posee un gran potencial como agente activo para la hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y asma por mencionar algunos.

Hay al menos dos receptores de VIP, incluidos VPAC1 y VPAC2. Estos receptores se unen al VIP y al polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) en algún grado. Ambos receptores son miembros de la familia receptora acoplada a la proteína G 7-transmembrana . El VPAC1, por ejemplo, se distribuye en el CNS, hígado, pulmón, intestino y T- linfocitos . El VAPAC2 se encuentra, por ejemplo, en el CNS, páncreas, músculo esquelético, corazón, riñon, tejido adiposo, testículos y estómago.

La corta semivida de VIP proporciona este péptido poco práctico como un agente farmacéutico. Véase Pozo D, et ál . , Tuning immune tolerance with vasoactive intestinal peptide: A new therapeutic approach for immune disorders. Peptides 28 (9) : 1833-1846 (2007) . De hecho, los estudios han demostrado que la semivida del VIP en la sangre es menor a 2 minutos (Domschke et ál., 1978, Gut 19: 1049-53; Burhol et ál . , 1978, Scand J Gastroent 13: 807-813). Además, la multitud de efectos biológicos del VIP puede complicar su desarrollo por cualquier indicación particular. Por lo tanto, se necesitan versiones modificadas de VIP para proporcionar el agente terapéuticamente práctico, por ejemplo, prologando la semivida y/o diseñando moléculas deseadas con perfiles de unión al receptor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona péptidos intestinales vasoactivos modificados (VIP) así como polinucleótidos y vectores codificantes y composiciones farmacéuticas que comprenden los VIP modificados. La invención también proporciona métodos para fabricar moléculas de VIP modificado y métodos para usar agentes de VIP modificado para el tratamiento de pacientes. De acuerdo con la invención, el VIP modificado exhibe una semivida circulatoria prolongada o persistencia en el cuerpo y/o potencia biológica y/o unión al receptor comparable y/o perfil de unión al receptor alterado con respecto al VIP sin modificar.

En un aspecto, la invención proporciona moléculas de VIP modificado y composiciones f rmacéuticas que las comprenden. Las moléculas de VIP modificado se modifican de forma recombinante o química en los extremos N y/o C mediante la adición de uno o más aminoácidos y/o mediante la fusión con secuencias de aminoácidos heterólogas para proporcionar una semivida circulatoria más larga o persistencia en el cuerpo en comparación con la potencia biológica y/o el perfil de unión al receptor modificado. Por ejemplo, en algunas modalidades, el VIP maduro de 28 aminoácidos que comienza con un extremo N His, comprende aminoácidos del extremo N, tales como un aminoácido simple en el extremo N (por ej . , Met) . En estas u otras modalidades, el VIP modificado contiene una fusión al extremo N o C con un péptido tipo elastina (ELP) , tal como se describe en la presente. Dichas moléculas de VIP modificado muestran una semivida circulatoria persistencia en el cuerpo' aumentadas y/o una preferencia de unión alterada para VPAC2 sobre VPAC1.

Por ejemplo, se puede fusionar un VIP (por ej . , mediante medios recombinantes) con el extremo N de un ELP. La histidina del VIP natural y maduro puede estar en el extremo N. Tales agentes terapéuticos pueden requerir una dosificación significativamente menos frecuente que la contraparte no fusionada, tal como dosificación de alrededor de 1-7 veces por semana (por ej . , dosificación diaria o semanal) .

En modalidades alternativas, la fusión VIP-ELP puede contener una metionina en el extremo N con el His del producto de VIP maduro natural en la posición 2. En aun otras modalidades, la molécula VIP-ELP comienza con metionina alanina alanina. Al producirse en bacterias, la primera metionina se pierde y el producto contiene Ala-Ala en el extremo N. Se retira el Ala-Ala in vitro o in vivo mediante la acción de peptidasa DPP-IV saliendo así del extremo N del VIP maduro natural. Estas construcciones que contienen aminoácidos adicionales en el extremo N exhiben una actividad significativamente diferente al analizar la actividad de unión en los receptores VPACl y VPAC2. Por ejemplo, mientras que las dos construcciones pueden activar el receptor VPAC2 con CE50 similar, una construcción con metionina en el extremo N (y His en la posición 2) es al menos 100 veces menos activo en el receptor VPACl.

En diversas modalidades, el VIP modificado de la invención que tiene un Met en el extremo N tiene la ventaja de poder obtenerse mediante medios recombinantes , tales como mediante la producción en E.coli u otro sistema de expresión, sin post-expresión adicional para exponerse al extremo N del VIP natural o deseado.

En aun otras modalidades, el VIP puede modificarse químicamente, por ejemplo, mediante la adición de uno o más PEG u otros restos químicos (por ej . , en o cerca del extremo N) , tal como se describe detalladamente en la presente.

En otros aspectos, la presente invención proporciona polinucleótidos y vectores que codifican el VIP modificado de la invención, así como células hospedadoras que los contienen. Las células hospedadoras pueden ser adecuadas para producción recombinante del VIP modificado, tal como células i bacterianas o de levadura para su uso con sistemas de expresión conocidos.

En otros aspectos, la invención proporciona métodos para tratar, mejorar o prevenir una afección en un mamífero. Dichas condiciones incluyen una variedad de afecciones cardiovasculares, inmunológicas (por ej . , autoinmunes) y neurológicas . Por ejemplo, el VIP modificado se puede usar para ajustar el equilibrio entre efectores pro- inflamatorios y anti- inflamatorios en un paciente, incluido un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria o una afección inflamatoria. Ejemplos de indicaciones para el VIP modificado incluyen hipertensión, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , diabetes, fibrosis de miocardio, insuficiencia cardíaca, cardiomiopatía, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y asma, entre otros.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína modificada de fusión VIP-ELP (M-VIP-ELP1-12Q, SEQ ID NO: 14) que posee Met en el extremo N y 120 unidades ELPl (VPGXG, SEQ ID NO: 3) fusionado al VIP en el extremo C.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína modificada de fusión VIP-ELP ( AA-VIP-ELP1 - 120 , SEQ ID NO: 15) que posee Met-Ala-Ala en el extremo N, activable con el péptido VIP maduro natural y 120 unidades ELPl (VPGXG, SEQ ID NO: 3) fusionado al VIP en el extremo C.

La Figura 3 es un mapa de plásmido de pPB1031, que codifica ELP1-120 para la producción conveniente de fusiones recombinantes .

La Figura 4 representa pPB1046 que codifica una proteína de fusión M-VIP-ELP1-120 (SEQ ID NOs : 39 y 40) . Se muestran cebadores (P0045, SEQ ID NO: 31, P0048, SEQ ID NO: 32, y P0065, SEQ ID NO: 34) para la construcción del gen recombinante .

La Figura 5 representa pPB1047 que codifica una proteína de fusión MAA-VIP-ELPl-120 (SEQ ID NOs : 41 y 42) . Se muestran cebadores (P0066, SEQ ID NO: 35, P0064, SEQ ID NO: 33, P0067, SEQ ID NO: 36) para la construcción del gen recombinante .

La Figura 6 representa pPB1048 que codifica una proteína de fusión ELP1-120-VIP (SEQ ID NOs : 43 y 44) . Se muestran cebadores para la construcción del gen recombinante (P0068, SEQ ID NO: 37, P0069, SEQ ID NO: 38) .

La Figura 7 es un análisis del gel Tris -Acetato NuPAGE al 10% de proteínas de fusión de VIP-ELP purificadas, con o sin desnaturalización por calor.

La Figura 8 muestra la actividad in vitro de VIP natural y las proteínas de fusión de VIP-ELP PB1046 y PB1047 para el receptor VPAC2.

La Figura 9 muestra la actividad in vitro de VIP natural y las proteínas de fusión de VIP-ELP PB1046 y PB1047 para el receptor VPAC1.

La Figura 10 muestra el efecto in vivo de la proteíria de fusión de VIP-ELP en la presión sanguínea de ratas. El panel izquierdo muestra una presión sanguínea sistólica. El panel derecho muestra una presión sanguínea diastólica. El VIP-ELP reduce la presión sanguínea por un período de más de 12 horas.

La Figura 11 es un mapa de plásmido de pPB1120 (SEQ ID NO: 48), que codifica VIP-ELP1-120.

La Figura 12 muestra la actividad in vitro de VIP natural y las proteínas de fusión de PB1120 y PB1046 para el receptor VPAC1.

La Figura 13 muestra la actividad in vitro de VIP natural y las proteínas de fusión de PB1120 y PB1046 para el receptor VPAC2. > La Figura 14A muestra un perfil farmacocinético de la proteína de fusión de VIP-ELP PB1120 en monos (n = 3) seguido de una única inyección subcutánea de 3 mg/kg con ejes lineales. La Figura 14B muestra el perfil farmacocinético de una proteína de fusión de VIP-ELP PB1120 con ejes semilogarítmicos .

Las Figuras 15A, 15B, y 15C muestran el cambio promedio en la presión arterial sistólica, diastólica y media, respectivamente en intervalos de 3 hr en ratas inyectadas de forma subcutánea con PB1120 en dosificaciones de 0.1 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg. La Figura 15D muestra el ritmo cardíaco promedio de las ratas objeto en intervalos de 3 hr seguido de la administración de PB1120.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona péptidos intestinales vasoactivos modificados (VIP) , polinucleótidos y vectores codificantes, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los VIP modificados. La invención también proporciona métodos para fabricar y usar los agentes VÍP modificados para el tratamiento de pacientes. De acuerdo con la invención, el VIP puede exhibir una semivida circulatoria prolongada o persistencia en el cuerpo, unión al receptor o potencia biológica comparable y/o perfil de unión al receptor alterado con respecto al VIP sin modificar. En diversas modalidades, los compuestos de la invención exhiben una frecuencia de dosificación reducida en comparación con las contrapartes sin modificar.

Péptido intestinal vasoactivo El péptido intestinal vasoactivo (VIP) es una hormona peptídica que contiene 28 residuos de aminoácidos y se produce en muchas áreas del cuerpo humano incluido el intestino, páncreas y núcleo supraquiasmático del hipotálamo en el cerebro. El VIP exhibe una amplia variedad de acciones biológicas que incluyen vasodilatación sistémica, hipotensión, disminución del rendimiento cardíaco, estimulación respiratoria, hiperglucemia, dilatación coronaria, broncodilatación en animales y humanos. El VIP también afecta el equilibrio del sistema inmune.

El VIP tiene un efecto sobre diversas partes del cuerpo. Con respecto al sistema digestivo, el VIP puede inducir una relajación del músculo liso (esfínter esofágico inferior, estómago, vesícula) , estimula la secreción de agua en el jugo biliar y la bilis y produce la inhibición de la secreción de ácido gástrico y la absorción desde el lumen intestinal. Su función en el intestino es estimular la secreción de agua y electrolitos, así como dilatar el músculo liso intestinal, dilatar los vasos sanguíneos periféricos, estimular la secreción de bicarbonato pancreático e inhibir la secreción de ácido gástrico estimulado por gastrina. Estos efectos funcionan juntos para aumentar la motilidad. El VIP tiene la función de estimular la secreción de pepsinógeno mediante células principales .

Se han encontrado VIP en el corazón y tienen efectos importantes en el sistema cardiovascular. Provoca vasodilatación coronaria, y tiene un efecto inotrópico y cronotrópico positivo.

El VIP es un péptido de inmunomodulación útil para el tratamiento de inflamación y enfermedad autoinmune tipo TH1 (Véase Delgado et l., The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulatipn, Pharmacol . Reviews 56 (2) : 249-290 (2004)). El VIP es útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (Véase la patente estadounidense N° 5,972,883) que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. El VIP y su polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) relacionado estructuralmente, tiene efectos terapéuticos importantes en enfermedades reumáticas inflamatorias crónicas, tales como osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (RA) mediante la regulación por disminución de componentes inflamatorios y autoinmunes de la enfermedad (Juarranz et l . , Vasoactiye intestinal peptide modulates proinflammatory mediator synthesis in osteoarthritic and rheumatoid synovial cells, Rheumatology, 2004, 43:416-422) . Además, el VIP participa en el mantenimiento de la tolerancia inmune regulando él equilibrio entre efectores proinflamatorios y antiinflamatorios o induciendo la emergencia de células T que tienen una actividad supresora contra las células T autorreactivas (Pozo et ál . , Tuning immune tolerance with vasoactive intestinal peptide: A new therapeutic approach for immune disorders, Peptide, 2007, 28 (9) : 1833-1846) .

El VIP maduro tiene 28 aminoácidos con la siguiente secuencia: HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN (SEQ ID NO: 13) . El VIP resulta del procesamiento de la molécula precursora de 170 aminoácidos prepro-VIP. Las estructuras de VIP y ejemplos de análogos se han descrito en las patentes estadounidenses 4,835,252, 4,939,224, 5,141,924, 4,734,400, 4,605,641, 6,080,837, 6,316,593, 5,677,419, 5,972,883, 6,489,297, 7,094,755 y 6,608,174, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos .

Una cantidad de mutaciones para mejorar la estabilidad de péptidos contra proteasas, etc. se detallan en ía bibliografía (véase Onune efc ál Physicochemical and pharmacological characterization of novel vasoactive intestinal peptide derivatives with improved stability, Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, que se incorpora en la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos) . Estos péptidos VIP modificados tienen secuencias de SEQ ID NO. 21 (M17L, para prevenir la oxidación de Met) , SEQ ID NO. 22 (K15R, K20R y K21R, para aumentar la estabilidad proteolítica) , y SEQ ID NO. 23 (N24A y S25A, para aumentar la estabilidad proteolítica/térmica) . La presente invención proporciona péptidos VIP modificados que incluyen una o más de esas modificaciones y con modificaciones VIP adicionales descritas en la presente. Ejemplos de moléculas de VIP modificado incluyen péptidos VIP modificados de SEQ ID NO's 14-15, 17-27, 40, 42, 44 y 50.

En diversas modalidades descritas en la presente, se proporciona un VIP modificado (por ej . , que comprende SEQ ÍD NO: 13) (o un análogo funcional como se describe en la presente) . En general análogos funcionales de VIP incluyen fragmentos funcionales truncados en el extremo N o C por entre 1 y 10 aminoácidos, incluidos 1, 2, 3 o hasta alrededor de 5 aminoácidos (con respecto a SEQ ID NO: 13) . Dichos análogos funcionales pueden contener entre 1 y 5 inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos (colectivamente) con respecto a la secuencia natural (por ej . , SEQ ID NO: 13), y en cada caso reteniendo la actividad del péptido (por ej . , a través de la unión de VPAC2 y/o VPAC1) . Dicha actividad se puede confirmar o ensayar usando cualquier ensayo disponible, incluido un ensayo descrito en la presente e incluido cualquier ensayo adecuado para determinar o cuantificar la actividad descrita en Delgado et ál . , The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodu1ation, Pharmacol . Reviews 56 (2) : 249-290 (2004). En estas u otras modalidades, el componente VIP del VÍP modificado de la invención tiene al menos alrededor de 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 97% de identidad con la secuencia madura natural (SEQ ID NO: 13) . La determinación de identidad de secuencia entre dos secuencias (por ej . , entre una secuencia natural y un análogo funcional) se puede lograr usando una herramienta de alineación, incluyendo Tatusova et ál . , Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, FEMS Microbiol Lett . 174:247-25.0 (1999) .

En un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de VIP modificado que tiene una preferencia de vector por VPAC1 o VPAC2 en comparación con un VIP sin modificar (por ej . , un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13) . Por ejemplo, el VIP modificado puede tener una preferencia de unión relativa por VPAC2 sobre VPAC1 de al menos alrededor de 2:1, alrededor de 5:1, alrededor de 10:1, alrededor de 25:1, alrededor de 50:1, alrededor de 100:1, alrededor de 500:1 o más. En otras modalidades, el VIP modificado puede tener una preferencia de unión relativa por VPAC1 sobre VPAC2 de al menos alrededor de 2:1, alrededor de 5:1, alrededor de 10:1, alrededor de 25:1, alrededor de 50:1, alrededor de 100:1, alrededor de 500:1 o más. Por ejemplo, en determinadas modalidades, el VIP modificado activa el receptor de VPAC2 sustancialmente como un VIP humano, sin modificar, maduro, esto es, con un CE50 dentro de un factor de alrededor de 2 del VIP humano, sin modificar, maduro (SEQ ID NO: 13) . Sin embargo, este mismo VIP modificado es 50 o 100 veces menos efectivo que el VIP humano, sin modificar, maduro en la activación del receptor de VPAC1.

Dichas moléculas de VIP modificado pueden contener regiones de extremo N modificadas tales como una adición de entre 1 y alrededor de 500 aminoácidos con la histidina en el extremo N de VIP, que puede incluir un secuencia de aminoácidos mamíferos heteróloga. Por ejemplo, el VIP modificado puede contener una metionina simple en el lado del extremo N de la histidina en el extremo N natural de VIP maduro. Esta molécula también se prepara convenientemente en E.coli u otro sistema de expresión bacteriano, dado que la metionina no será retirada por E.coli cuando el aminoácido adyacente es histidina. De manera alternativa, el aminoácido de extremo N puede ser cualquiera de los aminoácidos de origen natural, a saber, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina y prolina.

La secuencia adicional agregada al extremo N de VIP puede ser cualquier secuencia, incluidas secuencias biológicamente activas y biológicamente inertes de entre liy alrededor de 100, 1 y alrededor de 50, 1 y alrededor de 20, 1 y alrededor de 10 y 1 y alrededor de 5 aminoácidos.

El extremo N del VIP modificado puede tener la estructura M-N donde M es metionina y N es el extremo N de la molécula de VIP (por ej . , SEQ ID No. 14, FIGURA 1) . Esta metionina respalda la traducción de la proteína en una célula hospedadora eucariota o bacteriana. Por lo tanto, el VIP modificado se puede fabricar en un sistema biológico, incluidos sistemas de expresión de bacterias y levadura (por ej . , E.coli) . Mientras la metionina se puede algunas veces retirar mediante metionina aminopeptidasa (MA) en sistemas de expresión bacteriana, la histidina (H) es uno de los residuos menos preferidos en la posición 2 para MA.

En aun otras modalidades, el extremo N se modifica por fusión con una proteína heteróloga de mamífero, tal como una proteína de mamífero eficaz para prolongar la semivida de moléculas terapéuticas. Dichas secuencias pueden ser secuencias de mamífero, tales como albúmina, transferrina o secuencias de anticuerpo Fe. Dichas secuencias se describen en la patente estadounidense N° 7,238,667 (particularmente con respecto a conjugados de albúmina) , la patente estadounidense N° 7,176,278 (particularmente con respecto a conjugados de transferrina) , y la patente estadounidense N° 5,766,883, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

En otras modalidades, el VIP es activable mediante- una peptidasa o proteasa, tal como una peptidasa o proteasa endógena. Dichas secuencias activables se describen en la solicitud internacional N° PCT/US2009/068656 , la cual se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. Tal como se usa en la presente, los términos "peptidasa" y "proteasa" se usan de manera intercambiable. Por ejemplo, el VIP se puede diseñar para poder activarse mediante una dipeptidíl peptidasa. Ejemplos de dipeptidil peptidasas incluyen dipeptidíl peptidasa-1 (DPP-I) , dipeptidil peptidasa-3 (DPP-III) , dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV) , dipeptidil peptidasa-6 (DPP-VI) , dipeptidil peptidasa-7 (DPP-VII) , dipeptidil peptidasa-8 (DPP-VIII) , dipeptidil peptidasa-9 (DPP-IX) , dipeptidil peptidasa-10 (DPP-X) . Se conocen secuencias de sustrato para estas dipeptidasas .

El extremo N de un VIP activable puede tener la estructura Z-N donde Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ej . , se retira Z por exposición a dipeptidasa) y N es el extremo N del VIP. El VIP activable puede tener una secuencia de extremo N con la fórmula M-X-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser, y N es el extremo N del VIP o análogo de VIP. De este modo, M y X son sensibles a y se retiran mediante una célula hospedadora (por ej . , E.coli) y/o una dipeptidasa (por ej . , DPP-IV) , posteriormente. De manera alternativa, la secuencia de extremo N del VIP activable puede ser X1-X2-N, donde XI es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es el extremo N del VIP. X1-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ej . , DPP-IV), y la asimilación de dipeptidasa se expondrá a N, el extremo N del VIP o el análogo de VIP (por ej . , SEQ ID NO. 15, FIGURA 2) . En dichas modalidades, la proteína se puede producir mediante la expresión de una construcción que codifica M-X1-X2-N (donde M es metionina) en una célula hospedadora (por ej . , É. coli.), dado que Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro en la segunda posición señalizará la supresión del Met, dejando así XI-X2 en el extremo N que se puede activar mediante una dipeptidasa (por ej . , DPP-IV) in vivo. Dichas moléculas de VIP activables que se activan para poseer el extremo N del VIP maduro natural no muestran preferencia por un receptor.

En otra modalidad, el extremo N del VIP activable modificado puede tener la estructura M-Z-N donde M es metionina, Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ej . , se retira Z por exposición a dipeptidasa) y N es un extremo N no His de un VIP activo (VIP modificado) . Por ejemplo, el VIP activable modificado puede tener una secuencia de extremo N con la fórmula M-X-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser, y N es un extremo N no His del VIP activo. De este modo, M y X son sensibles a y se retiran mediante una célula hospedadora (por ej . , E.coli) y/o una dipeptidasa (por ej . , DPP-IV), posteriormente. De manera alternativa, la secuencia de extremo N del VIP activable puede ser X1-X2-N, donde XI es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es un extremo N no His del VIP activo. XI-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ej . , DPP-IV), y la asimilación de dipeptidasa se expondrá a N, el extremo N no His del VIP.

En aun otra modalidad, el extremo N de un VIP activable modificado puede tener la estructura M-Z-S-N donde M es metionina; Z es un sustrato para dipeptidasa (por ej . , Z se retira mediante la exposición de dipeptidasa) ; N es el extremo ? del VIP maduro (His) ; y S es uno o más aminoácidos que se exponen luego de la asimilación de dipeptidasa y que proporcionan un VIP modificado tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, el VIP activable modificado puede tener una secuencia de extremo N con la fórmula M-X-S-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser; N es el extremo | N del VIP maduro; y S es uno o más aminoácidos que se exponen luego de la asimilación de dipeptidasa, y que proporcionan una preferencia por un receptor. De manera alternativa, la secuencia de extremo N del VIP activable puede ser X1-X2-S-N, donde XI es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es un extremo N no His del VIP; y S es uno i o más aminoácidos que se exponen luego de la asimilación de dipeptidasa. X1-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ej J , DPP-IV) y la asimilación de dipeptidasa expondrá S.

En estas u otras modalidades , las modificaciones químicas del extremo N con el extremo N del VIP puede proporcionar preferencia por un receptor. La modificación química de las proteínas y métodos de los mismos son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de modificaciones químicas son PEGilación, metilglioxalación, alquilación reductora, oxidación de ácido perfórmico, sucinilación, aminoetilación y lipidación (Clifton, New Protein Techniques, Nueva Jersey: (Academic Press, 1985) ; ISBX. 0-89603-126-8. Volumen. 3 de Methods in Molecular Biology) . Se han descrito anteriormente grupos químicos, tales como PEGilación, se puede adjuntar mediante modificaciones de cisteina, metionina, histidina, lisina, arginina, triptófano, tirosina, grupos carboxilo (véase Lundblad, Techniques in Protein Modification, CRC Press, 1995) .

Fusiones con polímeros bioelásticos En algunas modalidades, el VIP de la invención contiene un componente polimérico bioelástico del extremo N y/o extremo C. Un "polímero bioelástico" puede exhibir una transición de temperatura inversa. Los polímeros bioelásticos se conocen y describen en, por ejemplo, la patente estadounidense N° 5,520,672, Urry et ál . Los polímeros bioelásticos pueden ser polipéptidos que comprenden unidades elastoméricas de pentapéptidos , tetrapéptidos y/o nonapéptidos (por ej . , "péptidos tipo elastina"). Los polímeros bioelásticos que se pueden usar para realizar la presente invención se establecen en la patente estadounidense N° 4,474,851, la cual describe una cantidad de unidades de repetición de tetrapéptidos y pentapéptidos que se pueden usar para formar un polímero bioelástico. Polímeros bioelásticos específicos también se describen en la patente estadounidense N° 4,132,746; 4,187,852; 4,500,700; 4,589,882; y 4,870,055. Aun otros ejemplos de polímeros bioelásticos se establecen en la patente estadounidense N° 6,699,294 y patente estadounidense N° 6,753,311 y patente estadounidense N° 6,063,061. Las estructuras de dichos polímeros bioelásticos se incorporan a la presente mediante esta referencia.

En una modalidad, los polímeros bioelásticos son polipéptidos de la fórmula general (VPGXG) m donde X es cualquier aminoácido (por ej . , Ala, Leu, Phe) y m es de entre alrededor de 20 y alrededor de 2000, o de entre alrededor de 50 y alrededor de 180. En ejemplos de modalidades, m es 60, 90, 120, 150 o 180. La frecuencia de diversos aminoácidos como la del cuarto aminoácido se puede cambiar, así como la identidad de X.

Por ejemplo, los polímeros bioelásticos pueden comprender unidades elastoméricas de repetición de pentapéptidos y tetrapéptidos bioelásticos, donde las unidades de repetición comprenden residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en residuos de glicina y aminoácido hidrofóbico y donde las unidades de repetición existen en una conformación que tiene un giro beta de la fórmula: donde R1-R5 representa cadenas laterales de residuos de aminoácido 1-5, y m es 0 donde la unidad de repetición es un tetrapéptido o 1 donde la unidad de repetición es un pentapéptido . Las unidades de repetición de nonapéptido generalmente consisten en tetra- y pentapéptidos secuenciales . Los residuos de aminoácido hidrofóbico se seleccionan de alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. En muchos casos, el primer residuo de aminoácido de la unidad de repetición es un residuo de valina, leucina, isoleucina o fenilalanina; el segundo residuo de aminoácido es un residuo de prolina; el tercero residuo de aminoácido es un residuo de glicina; y el cuarto residuo de aminoácido es glicina o un residuo múy hidrofóbico tal como triptófano, fenilalanina o tirosiná.

Ejemplos particulares incluyen el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly, el tetrapéptido GGVP, el tetrapéptido GGFP, el tetrapéptido GGAP, el pentapéptido es Val-Pro-Gly-Val-Gl , el pentapéptido GVGVP, el pentapéptido GKGVP, el pentapéptido GVGFP, el pentapéptido GFGFP, el pentapéptido GEGVP, el pentapéptido GFGVP, y el pentapéptido GVGIP. Véase, por ej . , la patente estadounidense N° 6,699,294.

En determinadas modalidades, el VIP de la invención contiene un componente de ELP del extremo N y/o extremo C. El componente de ELP comprende o consiste en unidades o secuencias peptídicas estructurales que se relacionan o derivan de la proteína elastina. Dichas secuencias son útiles para mejorar las propiedades de proteínas terapéuticas en uno o más de biodisponibilidad, frecuencia de administración y/o dosificación terapéuticamente eficaz, acción biológica, compatibilidad de formulación, resistencia a prpteólisis, solubilidad, semivida y otra medida de persistencia en el cuerpo posterior a la administración y/o tasa de depuración i desde el cuerpo. Véase, por ejemplo, US 2008/030968, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia .

Cuando el ELP se posiciona en el extremo C del VIP, se pueden realizar modificaciones adicionales en el extremo N del VIP, tales como la adición de uno o más aminoácidos, tal como se describe anteriormente. En modalidades alternativas, no existen tales modificaciones en el extremo N del VIP.

El componente de VIP se construye a partir de unidades estructurales de entre tres y alrededor de veinte aminoácidos, o en algunas modalidades, de entre cuatro y diez aminoácidos, tales como cinco o seis aminoácidos. La longitud de las unidades estructurales individuales en un componente de ELP particular puede variar o puede ser uniforme. En algunas modalidades, el componente de ELP se construye con n motivo politetra-, polipenta- , polihexa-, polihepta÷, poliocta, y polinonapéptido de unidades estructurales de repetición. Ejemplos de unidades estructurales incluyen unidades definidas por SEQ ID NO: 1-12 (véase a continuación) que se pueden emplear como unidades estructurales de repetición, incluidas unidades de repetición tándem o se pueden usar en alguna combinación para crear un ELP eficaz para mejorar las propiedades del componente terapéutico. Pór lo tanto, el componente de ELP puede comprender o consistir esencialmente en unidades estructurales seleccionadas de SEQ ID NO: 1-12, tal como se define a continuación. ; El componente de ELP, que comprende dichas estructurales, puede tener distintos tamaños. Por ejemplo, él componente de ELP puede comprender o consistir esencialmente en entre alrededor de 10 y alrededor de 500 unidades estructurales, o en determinadas modalidades entre alrededor de 20 y alrededor de 200 unidades estructurales, o en determinadas modalidades de entre alrededor de 50 y alrededor de 150 unidades estructurales, o de entre alrededor de 75 y alrededor de 130 unidades estructurales, incluidos una o una combinación de unidades definidas por SEQ ID NO: 1-12. El componente de ELP puede comprender alrededor de 120 unidades estructurales tales como repeticiones de unidades estructurales definidas por SEQ ID NO: 3 (definida a continuación) . Por lo tanto, el componente de ELP puede tener t una longitud de entre alrededor de 50 y alrededor de 2000 residuos de aminoácido, p de entre alrededor de 100 y alrededor de 600 residuos de aminoácido, o de entre alrededor de 200 y alrededor de 500 residuos de aminoácido o de entre alrededor de 200 y alrededor de 400 residuos de aminoácido.

En algunas modalidades, el componente de ELP, o en algunos casos el agente terapéutico, tiene un tamaño menor a alrededor de 150 kDa, o menor a alrededor de 100 kDa, o menor a alrededor de 55 kDa, o menor a alrededor de 50 kDa, o menor a alrededor de 40 kDa, o menor a alrededor de 30 o 25 kDa.

En algunas modalidades, el componente de ELP en el estado no transitorio puede tener una forma prolongada, relativamente no estructurada y no globular para escapar de la filtración del riñon. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos de la invención tienen un peso molecular menor al corte generalmente reconocido para filtración del riñon, tal como menor a alrededor de 60 kD, o en algunas modalidades menor a alrededor a 55, 50, 45, 40, 30, o 25 kDa, y sin embargo persiste en el cuerpo por al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 100 veces más que una contraparte terapéutica no acoplada (por ej . , no fusionado o no conjugado) .

En estas u otras modalidades, el componente de ELP no impacta sustancial o considerablemente la acción biológica del péptido terapéutico. Por lo tanto, el VIP con la fusión de ELP de la presente invención puede exhibir una potencia (acción biológica) que es igual o similar a su contraparte no fusionada. El VIP con la fusión de ELP de la presente invención puede exhibir una potencia o un nivel de acción biológica (por ej . , según se prueba in vitro o in vivo) o de 10-100% del exhibido por la contraparte no fusionada en el mismo ensayo. En diversas modalidades, el VIP (activado) con la fusión de ELP de la presente invención puede exhibir una potencia o un nivel de acción biológica (por ej . , según se prueba in vitro o in vivo) o de al menos 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% o más del exhibido por la contraparte no fusionada.

En determinadas modalidades, el componente de ELP se somete a una transición de fase inversa reversible. Es decir, los componentes de ELP presentan trastornos estructurales y gran solubilidad en agua por debajo de la temperatura de transición (Tt) , pero exhiben una marcada transición de fase desorden-orden (intervalo de 2-3°C) cuando la temperatura se aumenta sobre la Tt, lo que provoca la desolvatación y la agregación de los componentes de ELP. Por ejemplo, el ELP forma polímeros no solubles, cuando alcanza el tamaño suficiente, que se puede retirar y aislar fácilmente de la solución mediante centrifugación. Dicha transición de fase es reversible, y los ELP no solubles aislados se pueden volverla solubilizar por completo en solución amortiguadora cuando ía temperatura se lleva nuevamente por debajo de la Tt de los ELP. Por lo tanto, los agentes terapéuticos de la invención, en algunas modalidades, se pueden separar de otras proteínas contaminantes a alta pureza usando procedimientos de ciclo de transición inversa, por e . , utilizando la solubilidad qúe depende de la temperatura del agente terapéutico o la adición de sal al medio. Se pueden usar ciclos sucesivos de transición de fase inversa para obtener un alto grado de pureza. Además de la temperatura y la fuerza iónica, otras variables ambientales útiles para modular la transición inversa de los agentes terapéuticos incluyen pH, la adición de solutos y solventes inorgánicos y orgánicos, ionización de cadena lateral o modificación química y presión.

En determinadas modalidades, el componente de ELP no se somete a una transición de fase inversa reversible o no se somete a tal transición en un Tt biológicamente relevante y por lo tanto las mejoras en las propiedades biológicas y/o fisiológicas de la molécula (tal como se describe en la presente) , pueden ser entera o sustancialmente independientes de cualesquiera propiedades de transición de fase. Sin embargo, dichas propiedades de transición de fase pueden impartir ventajas prácticas adicionales, por ejemplo, con relación a la recuperación y purificación de dichas moléculas .

En la práctica de la presente invención, el - componente de ELP funciona para estabilizar o de otra manera mejorar el componente de VIP en la composición terapéutica. Posterior a la administración de la construcción de VIP-ELP acoplada con el paciente que necesita el agente terapéutico de VIP, el componente de VIP y .el ELP permanece acoplado entre sí mientras el VIP es terapéuticamente activo, por ej . , para el tratamiento o la profilaxis de un estado de enfermedad o afección fisiológica u otra intervención terapéutica.

En determinadas modalidades, el componente de ELP se puede formar con unidades estructurales, incluyendo de modo no taxativo: (a) el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly o VPGG 3 O (SEQ ID NO: 1) ; (b) el tetrapéptido Ile-Pro-Gly-Gly o IPGG (SEQ ID NO: 2) ; (c) el pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3) o VPGXG, donde X es cualquier residuo de aminoácido natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas; (d) el pentapéptido Ala-Val-Gly-val-Pro o AVGVP (SEQ ID NO: 4) ; (e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-X-Gly o IPGXG (SEQ ID NO: 5) donde X es cualquier residuo de aminoácido natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas; (e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-Val-Gly o IPGVG (SEQ ID NO: 6) ; (f) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-X-Gly o LPGXG (SEQ ID NO: 7) donde X es cualquier residuo de aminoácido natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas; (g) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-Val-Gly o LPGVG (SEQ ID NO: 8) ; (h) el hexapéptido Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly o VAPGVG (SEQ ID NO: 9) ; (I) el octapéptido Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly o GVGVPGVG (SEQ ID NO: 10) ; (J) el nonapéptido Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly o VPGFGVGAG (SEQ ID NO: 11); y (K) los nonapéptidos Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly o VPGVGVPGG (SEQ ID NO: 12) .

Dichas unidades estructurales definidas por SEQ ID NOS:l-12 pueden formar unidades de repetición estructurales^ se pueden usar en combinación para formar un componente de I ELP de acuerdo con la invención. En algunas modalidades, el componente de ELP se forma enteramente (o al menos enteramente) de una o una combinación de (por ej . , 2, 3 o 4) unidades estructurales seleccionadas de SEQ ID NO: 1-12. En otras modalidades, al menos el 75%, o al menos 80%, o al menos 90% del componente de ELP se forma a partir de una o una combinación de unidades estructurales seleccionadas de i SEQ ID NO: 1-12, y que puede estar presente como unidades de repetición.

En determinadas modalidades, el componente de ELP contiene unidades de repetición que incluyen unidades de repetición tándem del pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3), donde X es tal como se define anteriormente, y donde el porcentaje de unidades de pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3) tomado con respecto al componente de ELP (que puede comprender unidades estructurales distintas de VPGXG (SEQ ID NO: 3)) es mayor a alrededor de 75%, o mayor a alrededor de 85%, o mayor a alrededor de 95% del componente de ELP . El componente de ELP puede contener motivos que tienen una repetición de 5 a 15 unidades (por ej . , repeticiones de alrededor de 10 unidades o de alrededor de 12 unidades) de los pentapéptidos de SEQ ID NO: 3, con el residuo huésped X que varía entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades estructurales dentro de cada repetición. Los residuos huésped se pueden seleccionar independientemente tal como desde los aminoácidos V, I, L, A, G y (y se pueden seleccionar para retener una propiedad de transición de fase inversa deseada) . Ejemplos y motivos incluyen VPGXG (SEQ ID NO: 3), donde los residuos huésped son V (que pueden estar presentes de entre 40% y 60% de unidades estructurales) , G (que pueden estar presentes de entre 20% y 40% de unidades estructurales) , y A (que pueden estar presentes de entre 10% y 30% de unidades estructurales) . El motivo de repetición en sí mismo se puede repetir, por ejemplo, de entre alrededor de 5 y alrededor de 20 veces, tal como entre alrededor de 8 y 15 veces (por ej . , alrededor de 12 veces) para crear un ejemplo de componente de ELP. El componente de ELP tal como se describe en este párrafo puede por supuesto estar construido a partir de cualquiera de las unidades estructurales definidas por SEQ ID NO: 1-12, o una combinación de la misma. Un ejemplo del componente de ELP se muestra en la Figura 1 fusionado con el extremo C del VIP.

En algunas modalidades, las unidades de ELP pueden formar una estructura de giro ß que proporciona una propiedad tipo elastina (por ej . , transición de fase inversa). Ejemplos de secuencias peptídicas adecuadas para la creación de una estructura de giro ß se describe en la solicitud de patente internacional PCT/US96/05186 , que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. Por ejemplo, el cuarto residuo (X) en la secuencia de pentapéptido elastina, VPGXG i (SEQ ID NO: 3), se puede alterar sin eliminar la formación de un giro ß.

En determinadas modalidades, los componentes de ELP incluyen repeticiones poliméricas u oligoméricas del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 3) , donde el residuo huésped X es cualquier aminoácido. X puede ser un aminoácido de origen natural o de origen no natural. En algunas modalidades, X se selecciona de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisterna, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidin , isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. En algunas modalidades, X es un aminoácido natural distinto de prolina o cisteína .

El residuo huésped X (por ej . , con respecto a SEQ ID NO: 3, u otra unidad estructural de ELP) puede ser un aminoácido no clásico (no codificado genéticamente) . Ejemplos de aminoácidos no clásicos incluyen: D- isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2 , 4 -diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido A- aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, ?-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina , ciclohexilalanina, ß-alanina, fluoro-aminoácidos , aminoácidos diseñadores tales como aminoácidos ß-metilo, aminoácidos C -metilo, aminoácidos a-metilo y análogos de aminoácidos en general.

La selección de X puede ser independiente en cada unidad estructural de ELP (por ej . , para cada unidad estructural definida en la presente que tiene un residuo huésped X) . Por ejemplo, X se puede seleccionar independientemente para cada unidad estructural como un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente, una cadena lateral cargada negativamente o un aminoácido que tiene una cadena lateral neutra, incluidas en algunas modalidades, una cadena lateral hidrofóbica.

En aun otras modalidades, el componente de ELP puede incluir repeticiones poliméricas u oligoméricas de los pentapéptidos VPGXG (SEQ ID N0:3), IPGXG (SEQ ID N0:5) o LPGXG (SEQ ID NO: 7), o una combinación de los mismos donde X es tal como se define anteriormente.

En cada modalidad, las unidades estructurales o en algunos casos las repeticiones poliméricas u oligoméricas de las secuencias de ELP se pueden separar por uno o más residuos de aminoácidos que no eliminan el efecto general de la molécula, esto es, al impartir determinadas mejoras en él componente terapéutico tal como se describe. En determinadas modalidades, los mencionados uno o más aminoácidos tampoco eliminan ni afectan sustancialmente las propiedades de transición de fase del componente de ELP (con respecto a la supresión de los mencionados uno o más aminoácidos) .

La estructura de los componentes de ELP (péptidos tipo elastina) resultantes se puede describir mediante la nota ELPk [XjYj-n] , donde k designa una unidad de repetición de ELP particular, las letras mayúsculas entre corchetes son códigos de aminoácidos de letra individual y sus subíndices correspondientes designan la proporción relativa de cada residuo huésped X en las unidades estructurales (cuando corresponda) y n describe la longitud total de la cantidad de ELP de las repeticiones estructurales. Por ejemplo, ELP1 [V5A2G3-10] designa un componente de ELP que contiene 10 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEQ ID N0:3), donde X es valina, alanina y glicina a una proporción relativa de 5:2:3; ELP1 [KiV2Fi-4] designa un componente de ELP que contiene 4 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEQ ID N0:3), donde X es lisina, valina y fenilalanina a una proporción relativa de 1:2:1; ELP1 [KiV7Fi-9] designa un polipéptido que contiene 9 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEQ ID N0:3), donde X es lisina, valina y fenilalanina a una proporción relativa de 1:7:1; ELP1 [ViA8G7-10] designa un componente de ELP que contiene 10 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 3) , donde X es valina, alanina y glicina a una proporción relativa de 1:8:7; ELP1 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEQ ID N0:3), donde X es exclusivamente valina; ELP1 [V-20] designa un polipéptido que contiene 20 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO:3), donde X es exclusivamente valina,- ELP2 [5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido AVGVP (SEQ ID NO:4); ELP3 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido IPGXG (SEQ ID NO:5), donde X es exclusivamente valina; ELP4 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido LPGXG (SEQ ID ÑO : 7 ) , donde X es exclusivamente valina. Dichos componentes de ELP, como los que se describen en este párrafo, se pueden usar con relación a la presente invención para aumentar las propiedades terapéuticas del componente terapéutico.

Además, la Tt es una función de la hidrofobicidad del residuo huésped. Por lo tanto, variandP la identidad del residuo huésped y sus fracciones molares, se pueden sintetizar los ELP, los cuales exhiben una transición inversa en un intervalo de 0-100°C. Por lo tanto, la Tt a una longitud de ELP determinada se puede disminuir incorporando una fracción más grande de los residuos hidrofóbicos huésped en la secuencia de ELP. Los ejemplos de residuos hidrofóbicos huésped adecuados incluyen valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano y metionina. También se puede usar tirosina, que es moderadamente hidrofóbica. A la inversa, se puede aumentar la Tt incorporando residuos, tales como los que se seleccionan del grupo que consiste en: ácido glutámico, cisteína, lisina, aspartato, alanina, asparagina, serina, treonina, glicina, arginina y glutamina; preferentemente se seleccionan de alanina, serina, treonina y ácido glutámico.

El componente de ELP en algunas modalidades se selecciona o diseña para proporcionar una Tt (en condiciones fisiológicas) en el intervalo de alrededor de 10 a alrededor de 80°C, tal como, de alrededor de 35 a alrededor de 60°C o de alrededor de 38 a alrededor de 45 °C. En algunas modalidades, la Tt es superior a alrededor de 40°C o superior a alrededor de 42 °C o superior a alrededor de 45 °C lo superior a alrededpr de 50 °C. La temperatura de transición, en algunas modalidades, es superior a la temperatura corporal del sujeto o paciente (por ej . , >37°C) , permaneciendo de esta manera solubles in vivo o, en otras modalidades, la Tt es inferior a la temperatura corporal (por ej . , < 37°C) para proporcionar otras ventajas, tales como, la formación in vivo de un depósito de fármaco para la liberación sostenida del agente terapéutico. Ver, por ejemplo, US 2007/Q0Q9602 , que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.

La Tt del componente de ELP se puede modificar variando la longitud de cadena de ELP, ya que la Tt, en general, aumenta con la disminución del M (peso molecular) . Para los polipéptidos que tienen un peso molecular > 100.000, la escala de hidrofobicidad desarrollada por Urry et ál . (PCT/US96/05186 , que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia) proporciona un medio para predecir la Tt aproximada de una secuencia de ELP específica. Sin embargo, en algunas modalidades, la longitud del componente de ELP se puede mantener relativamente corta, mientras se mantiene una Tt diana, incorporando una fracción más grande de los residuos hidrofóbicos huésped (por ej i , residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrofóbicas) en la secuencia de ELP. Para los polipéptidos I que tienen un peso molecular <1QQ,000, la Tt se puede predecir o determinar mediante la siguiente cuadrática: Tt = M0 + ?? + M2X2 donde X es el peso molecular de la proteína de fusión y M0 = 116.21; Mi = -1.7499; M2 = tanto, del componente de ELP acoplado a un componente terapéutico, se ve afectada por la identidad e hidrofobicidad del residuo huésped, X, también se pueden ver afectadas otras propiedades de la molécula. Dichas propiedades incluyen, de modo no taxativo, solubilidad, biodisponibilidad, persistencia, semivida, potencia y seguridad de la En la sección de Ejemplos que figura más a demuestra que el agente VIP acoplado a ELP co cantidad significativa de la actividad biológica naturales, con relación a las formas no fusionadas de los VIP. Adicionalmente , se demuestra que los ELP exhiben semividas prolongadas. Por consecuencia, los ELP se pueden usar de acuerdo con la invención para aumentar considerablemente {por ej . , superior a 10%, 20%, 30%, 50%, 100%, 200% o más, en modalidades específicas) la semivida VIP, como se conjuga con un ELP, en comparación con la semivida de la forma libre (no conjugada) del agente terapéutico. El VIP modificado, que tiene una mayor semivida circulatoria, se puede administrar de 1 a alrededor de 10 veces por semana, tal como, de 1 a alrededor de 5 o l ia alrededor de 3 veces por semana. El VIP modificado o ía composición farmacéutica que lo comprende se puede i administrar alrededor de una vez al día o alrededor de día por medio o alrededor de cada tres días o alrededor de una vez por semana (es decir, dosificación de una vez por semana) .

Conjugación y acoplamiento Una proteína de fusión VIP producida de manera recombinante , de acuerdo con determinadas modalidades de la invención, incluye el componente de fusión (por ej . , ELP) íy i un VIP o un análogo de VIP asociados entre sí mediante fusión genética. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede generar mediante la traducción de un polinucleótido que codifica VÍP i o un análogo de VIP clonado dentro del marco con el componente de ELP.

En determinadas modalidades, el componente de ELP y VIP o un análogo de VIP se puede fusionar usando un péptido de ¡ enlace de varias longitudes para proporcionar mayor separación física y otorgar más movilidad espacial entre las porciones fusionadas y, por lo tanto, maximizar la accesibilidad de VIP o un análogo de VIP, por ejemplo, para unirse a su receptor afín. El péptido de enlace puede consistir de aminoácidos que son flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un enlace flexible puede incluir aminoácidos que tienen cadenas laterales relativamente pequeñas y que pueden ser hidrofílieos . De modo no taxativo, el enlace flexible puede comprender residuos de glicina y/o serina. Los enlazadores más rígidos pueden contener, por ejemplo, cadenas laterales de aminoácidos más estéricamente obstaculizantes, tales como (de modo no taxativo) tirosina o histidina. El enlazador puede tener menos de alrededor de 50, 40, 30, 20, 10 o 5 residuos de aminoácidos. El enlazador puede estar enlazado a y entre VIP o un análogo de VIP y a un componente de ELP, por ejemplo, mediante fusión recombinante .

El enlazador o péptido espaciador puede ser escindible con proteasa o no escindible. A modo de ejemplo, los péptidos espaciadores escindibles incluyen, de modo no taxativo, una secuencia de péptidos reconocidos por las proteasas (in vitro o in vivo) de varios tipos, tales como, Tev, trombina, factor Xa, plasmina (proteasas sanguíneas), metaloproteasas , catepsinas (por ej . , GFLG, SEQ ID NO: 47, etc.), y proteasas encontradas en otros compartimientos corpóreos. En algunas modalidades que utilizan enlazadores escindibles, la proteína de fusión puede ser inactiva, menos activa o menos potente como una fusión, que luego se activa luego de la escisión del espaciador in vivo. De manera alternativa, cuando el agente terapéutico es lo suficientemente activo como una fusión, se puede usar un espaciador no escindible. El espaciador no escindible puede ser de cualquier tipo adecuado, que incluye, por ejemplo, restos de espaciador no escindibles que tienen la fórmula [ (Gly ) n- Ser] m donde n es de 1 a 4, inclusive, y m es de 1 a 4 , inclusive . De manera alternativa, se puede usar una secuencia de ELP pequeña diferente del ELP principal, en lugar de un enlazador o espaciador, a la vez que se logra el efecto necesario.

En aún otras modalidades, el agente terapéutico es una fusión recombinante que tiene un componente terapéutico flanqueado en cada extremo por un componente de ELP. Al menos uno de dichos componentes de ELP se puede unir mediante un espaciador escindible, de modo que el componente terapéutico se inactive pero se active in vivo mediante la supresión proteolítica de un solo componente de ELP. La fusión de un solo ELP resultante que es activo y tiene una mayor semivida (u otra propiedad descrita en la presente) in vivo.

En otras modalidades, la presente invención proporciona conjugados químicos de un VIP o un análogo de VIP y el componente de ELP. Los conjugados se pueden realizar acoplando químicamente un componente de ELP a VIP o un análogo de VIP mediante una cantidad de métodos conocidos en la técnica (Véase por ej . , Nilsson et l . , 2005, ñnn Rev Biophys Bio Structure 34: 91-118). En algunas modalidades, el conjugado químico se puede formar enlazando covalentemente VIP o un análogo de VIP al componente de ELP, directamente o mediante un resto de enlace corto o largo, a través de uno o más grupos funcionales en el componente proteinácéo terapéutico, por ej . , grupos amina, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo, para formar un conjugado covalente . Se pueden usar varios enlazadores convencionales, por ej . , diisocianatos , diisotiocianatos , carbodiimidas , ésteres de bis (hidroxisuccinimida) , ésteres de hidroxisuccinimida maleimida, glutaraldehído y similares.

Adicionalmente, los espaciadores químicos no peptídicos pueden ser de cualquier tipo adecuado, que incluyen, por ejemplo, enlazadores funcionales descritos en Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, publicado por Academic Press, Inc., 1995, y los especificados en Cross-Linking Reagents Technical Handbook, disponible en Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois) , cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia, en sus correspondientes totalidades. Los espaciadores químicos ilustrativos incluyen enlazadores homobifuncionales que se pueden unir a grupos amina de Lys, así como enlazadores heterobifuncionales que se pueden unir a Cys en un extremo y a Lys en el otro extremo .

En determinadas modalidades, los componentes de ELP relativamente pequeños (por ej . , componentes de ELP inferiores a alrededor de 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa o 10 kDa) , que no atraviesan transición a temperatura ambiente (o temperatura corporal humana, por ej . , Tt >37°C) , se acoplan o reticulan químicamente. Por ejemplo, dos componentes de ELP relativamente pequeños, con las mismas propiedades o diferentes, se acoplan químicamente. Dicho acoplamiento, en algunas modalidades, pueden ocurrir in vivo, mediante la adición de un solo residuo de cisteína en el extremo C de ELP o alrededor del mismo. Cada uno de dichos componentes de ELP también se puede fusionar a uno o más componentes terapéuticos, para aumentar la actividad o avidez en el dian .

Polinucleótidos , vectores, células hospedadoras y métodos para la producción En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el VIP modificado de la invención. Dichos polinucleótidos también pueden comprender, además de las secuencias que codifican a VIP o un análogo de VIP y secuencias de fusión, uno o más elementos de control de la expresión. Por ejemplo, el polinucleótido puede comprender uno o más promotores o potenciadores transcripcionales , sitios de unión al ribosoma, señales de terminación transcripcional y señales de poliadenilacion, como elementos de control de la expresión. El polinucleótido se puede insertar dentro de cualquier vector adecuado, que puede estar contenido dentro de cualquier célula hospedadora adecuada para la expresión, tal como, E. coli.

En general, un vector que comprende el polinucleótido se puede introducir en una célula para la expresión del agente terapéutico. El vector puede permanecer episómico o integrarse de manera cromosómica, en la medida en que el inserto que codifica el agente terapéutico se pueda transcribir. Los vectores se pueden construir mediante tecnología de ADN recombinante estándar. Los vectores pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, virus :o cualesquiera otros tipos conocidos en la técnica, que se usan para la replicación y la expresión en las células procariotas o eucariotas . El experto en la técnica reconocerá que una gran variedad de componentes conocidos en la técnica (tales como, elementos de control de la expresión) se pueden incluir en dichos vectores, que incluyen una gran variedad de señales de transcripción, tales como, promotores y otras secuencias que regulan la unión de la polimerasa ARN en el promotor. Se puede usar cualquier promotor que se sabe que es eficaz en las células en las que el vector se expresará, para iniciar la expresión del agente terapéutico. Los promotores adecuados pueden ser inducibles o" constitutivos .

En determinadas modalidades, el VIP modificado se expresa a partir de E. coli u otro sistema de expresión bacteriana. En general, el E. coli no retira la metionina en el extremo N durante la expresión, de modo que la molécula de i VIP modificada conserva la especificidad del receptor. Se pueden emplear otros sistemas de expresión de acuerdo con la invención, que incluyen, sistemas de expresión en levaduras, sistemas de expresión en células de mamíferos y sistemas de baculovirus .

La proteína terapéutica, cuando se usan las secuencias de fusión de ELP, se puede recuperar mediante un ciclo de temperatura inverso. Específicamente, tal como se describió anteriormente, el componente de ELP se somete a una transición de fase inversa reversible. Es decir, los componentes de ELP presentan trastornos estructurales y gran solubilidad en agua por debajo de la temperatura de transición (Tt) , pero exhiben una marcada transición de fase desorden-orden (intervalo de 2-3°C) cuando la temperatura se aumenta sobre la Tt, lo que provoca la desolvatación y la agregación de los componentes de ELP. Por ejemplo, el ELP forma polímeros no solubles, cuando alcanza el tamaño suficiente, que se puede retirar y aislar fácilmente de la solución mediante centrifugación. Dicha transición de fase es reversible, y los ELP no solubles aislados se pueden volver ¡ a solubilizar por completo en solución amortiguadora cuando la temperatura se lleva nuevamente por debajo de la Tt de los ELP. Por lo tanto, los agentes terapéuticos de la invención, en algunas modalidades, se pueden separar de otras proteínas contaminantes a alta pureza usando procedimientos de ciclo de transición inversa, por ej . , utilizando la solubilidad dependiente de la temperatura del agente terapéutico o adición de sal al medio. Se pueden usar ciclos sucesivos transición de fase inversa para obtener un alto grado pureza. Además de la temperatura y la fuerza iónica, otras variables ambientales útiles para modular la transición inversa de los agentes terapéuticos incluyen pH, la adición í de solutos y solventes inorgánicos y orgánicos, ionización de cadena lateral o modificación química y presión. \ Composiciones farmacéuticas y métodos de administración La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz del VIP modificado de la invención (tal como se describe t anteriormente) , junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas son eficaces para tratar o mejorar, por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, tal como se describe en la presente.

Los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar per se, así como de varias formas, que incluyen, ésteres y sales farmacéuticamente aceptables y otros derivados fisiológicamente funcionales de estos. En dichas formulaciones farmacéuticas, los agentes terapéuticos se pueden usar de manera individual o junto (que incluye formulados) con otros ingredientes terapéuticos, tales como, agentes antiinflamatorios o inmunosupresores .

El portador debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no demasiado perjudicial para quien lo recibe.

Las formulaciones del agente terapéutico incluyen las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, así como no parenteral. Los ejemplos de modalidades de administración incluyen oral, bucal, tópica, nasal, subcutánea, intramuscular e intravenosa, entre otros. Se prefieren las formulaciones adecuadas para la administración parenteral .

Las formulaciones que comprenden el agente terapéutico de la presente invención se pueden presentar de manera conveniente en formas de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica de la farmacia. En general, dichos métodos incluyen la etapa de asociar los agentes terapéuticos con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el agente terapéutico con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido o ambos y luego, si fuera necesario, dándole forma al producto en formas de dosificación de la formulación deseada.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril del agente terapéutico que preferentemente es isotónico con la sangre del receptor (por ej . , solución salina fisiológica) . Dichas formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigirse al agente terapéutico en la circulación o uno o más órganos. Las formulaciones pueden presentarse en formas de dosificación unitaria o múltiple.

Además de los ingredientes mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invención también pueden incluir uno o más ingredientes accesorios seleccionados de diluyentes, soluciones amortiguadoras, agentes saborizantes , desintegrantes, agentes activos en la superficie, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes) y similares.

Si bien un experto en la técnica puede determinar la dosis deseable en cada caso (que incluye una dosis unitaria para la administración de depósito) , una dosis adecuada del agente terapéutico para alcanzar el beneficio terapéutico puede encontrarse, por ejemplo, en el intervalo de alrededor de 1 microgramo (yg) a alrededor de 100 miligramos (mg) por kilogramo de peso corporal del receptor, o en un intervalo de alrededor de 10 yg a alrededor de 50 mg por kilogramo de peso corporal, o en el intervalo de alrededor de 10 yg a alrededor de 10 mg por kilogramo de peso corporal. La dosis deseada puede presentarse como una dosis o dos o más sub-dosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del período de dosificación (por ej . , una semana, dos semanas, etc...). Estas sub-dosis se pueden administrar en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, contienen de alrededor de 10 yg a alrededor de 500 mg, o de alrededor de 50 yg a alrededor de 200 mg, o de alrededor de 50 yg a alrededor de 100 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. De manera alternativa, si la afección del receptor i así lo requiere, las dosis se pueden administrar como una infusión continua.

El modo de administración y las formas de dosificación obviamente afectarán la cantidad terapéutica del agente terapéutico activo del péptido que es deseable y eficaz para una aplicación de tratamiento determinada. Por ejemplo, las dosificaciones administradas oralmente pueden ser de al menos 2 veces, por ej . , 2-10 veces, los niveles de dosificación usados en los métodos de administración parenteral . Las formulaciones de depósito también permitirán que se administre más significativamente el agente terapéutico, de modo que el agente terapéutico tenga una liberación sostenida en el tiempo.

El VIP que circula en el plasma de los individuos normales se origina a partir de las fibras nerviosas que contienen VIP en el tracto gastrointestinal y también refleja el exceso de péptidos de los nervios vasculares (Cugini et ál . , 1991, Reg Pept 34: 141-8). Como la mayoría de las proteínas vasoactivas, el VIP tiene una semivida relativamente corta. La semivida del VIP en la sangre es menor a 2 minutos (Domschke et ál . , 1978, Gut 19: 1049-53; Burhol et ál . , 1978, Scand J Gastroent 13: 807-813). Una ventaja del VIP modificado que se describe en la presente es la semivida prolongada o la persistencia en el organismo, be acuerdo con determinadas modalidades de la invención, el VIP se puede administrar de 1 a alrededor de 10 veces por semana, tal como, de 1 a alrededor de 5 o de 1 a alrededor de 3 veces por semana. El VIP modificado o la composición farmacéutica que lo comprende se pueden administrar alrededor de una vez por día o alrededor de día por medio o alrededor de cada tres días o alrededor de una vez por semana.

En determinadas modalidades, el VIP modificado se administra de manera parenteral, tal como, por inyección subcutánea o intramuscular. La administración puede ser una dosis unitaria del VIP modificado, tal como se describe en la presente.

El VIP modificado, cuando se administra de manera parenteral, se puede administrar una vez por día o una vez o dos veces por semana o de una a cinco veces por mes. En estas modalidades, el VIP modificado se puede- administrar como un péptido de fusión soluble, que persiste en la circulación, tal como se describe en la presente, para proporcionar actividad sostenida con administración relativamente poco frecuente. El VIP modificado se puede administrar como un depósito de fármaco, tal como se describe asimismo en la presente, para proporcionar una liberación sostenida del péptido de fusión en la circulación con el transcurso del tiempo. Véase US 2007/0009602, que se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Métodos de uso En otros aspectos, la invención proporciona métodos para tratar, mejorar o prevenir una afección en un mamífero. Dichas condiciones incluyen una variedad de afecciones cardiovasculares, inmunológicas (por ej . , autoinmunes) y neurológicas . Por ejemplo, el VIP modificado se puede usar para ajustar el equilibrio entre efectores pro- inflamatorios y anti- inflamatorios en un paciente, incluido un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria o una afección inflamatoria. Los ejemplos de indicaciones del VIP modificado incluyen- hipertensión, fibrosis del miocardio, insuficiencia cardíaca, cardiomiopatía, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) , enfermedad de Parkinson, traumatismo cerebral y asma, entre otros.

Por lo tanto, la invención proporciona un método para tratar una variedad de afecciones, que incluyen afecciones caracterizadas por la autoinmunidad o inflamación. El método comprende administrar una cantidad eficaz del VIP modificado de la invención a un paciente que lo necesite.

Hipertensión En varias modalidades descritas en la presente, ía presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir la hipertensión en un paciente que lo necesite, lo que comprende administrar una cantidad eficaz del VIP modificado. Las formas de hipertensión tratables con VIP modificados de la presente invención incluyen hipertensión pulmonar, hipertensión esencial no controlada e hipertensión resistente.

La hipertensión pulmonar es una enfermedad relativamente rara pero altamente mortal, caracterizada por hipertensión arterial pulmonar progresiva y aumento del espesor de las arterias y arteriolas pulmonares más pequeñas, lo que culmina en insuficiencia del ventrículo derecho (RV) (Said et ál . , 2007, Circulation 115: 1260-8). El VIP se relaciona con la circulación pulmonar y sistémica. Con respecto al lecho vascular pulmonar y sus alteraciones en la hipertensión pulmonar, el VIP relaja el músculo liso vascular pulmonar de varias especies de mamíferos in vitro, neutraliza o atenúa los efectos de la endotelina y otros vasoconstrictores, reduce la vasoconstricción pulmonar hipóxica e inhibe la proliferación del músculo liso vascular pulmonar de pacientes con hipertensión pulmonar. Además, el VIP es un cotransmisor del sistema no adrenérgico no colinérgico fisiológico de la relajación del músculo liso vascular pulmonar. Además, se ha informado que los nervios que contienen VIP - en general, abundantes en las arterias pulmonares - están ausentes en las arterias pulmonares de los pacientes con hipertensión pulmonar y la inhalación del péptido produce un efecto terapéutico beneficioso en dichos pacientes (Petkov et ál . , 2003, J". Clin Invest. 111: 1339-1346) . Finalmente, los estudios han demostrado que la terapia de reemplazo de VIP en ratones VIP"''" puede prevenir o ál menos enlentecer el avance de cambips patológicos claves en ? la hipertensión pulmonar (Said et ál . , 2007, Circulation 115: i 1260-8) . Por lo tanto, puede esperarse que la aplicación de VIP a pacientes con hipertensión pulmonar dé como resultado una mejora considerable de los parámetros hemodinámicos y de pronóstico de la enfermedad (Petkov et ál., 2003, J. Clin Invest. 111: 1339-1346) .

La hipertensión esencial no controlada es la presión sanguínea que es constantemente superior al nivel normal cuando no se puede encontrar una causa para la presión sanguínea elevada. La hipertensión esencial es el tipo hipertensión mas predominante; afecta al 90-95% de pacientes hipertensos (Carretero et ál., 2000, Circulation i 101: 329-35) y los expertos consideran que es causada por i varios factores desconocidos. Las concentraciones de VIP j disminuyen en las ratas hipertensas esenciales propensas ¡a apoplejía (Mori et ál . , 1993, Jpn Heart J. 34: 785-94) y el uso del VIP humano con liposomas estabilizados estéricamenie puede normalizar la presión arterial sistémica en hámsters espontáneamente hipertensos (Onyuksel et ál. , 2006, Peptides 27 : 2271-5) . 1 La hipertensión resistente es una forma de presión sanguínea elevada que no responde al tratamiento (es decir, la presión sanguínea permanece elevada aun cuando se administra una combinación de fármacos) . Las causas de escaso control de la presión sanguínea son numerosas. Las causas más comunes son la sobrecarga de volumen, ya sea debido al exceso del consumo de sodio, la intolerancia a medicamentos, no cumplimiento e hipertensión secundaria (Graves JW, 2000, Mayo Clin Prac 75: 278-84). Como vasodilatador sistémico potente, el VIP es útil para el tratamiento y la prevención de la hipertensión en pacientes que producen los signos característicos de la hipertensión resistente.

Enfermedad cardíaca En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir la enfermedad cardíaca en un paciente que lo necesite, lo que comprende administrar una cantidad eficaz del VIP modificado. Las formas de enfermedad cardíaca tratables con los VIP modificados de la presente invención incluyen fibrosis del miocardio, insuficiencia cardíaca y cardiomiopatía .

Los cambios en la síntesis y la secreción del VIP en el corazón aparentemente cumplen una función en la patogénesis de varias enfermedades, tales como, insuficiencia cardíaca y fibrosis del miocardio (Dvoráková MC, 2005, Drug News Perspect. 18: 387-91). Por ejemplo, la concentración de VIP disminuye significativamente en ambos tejidos de pacientes con cardiomiopatía y en el tejido cardíaco de animales modelo de insuficiencia cardíaca (Unverferth et ál . , 1986, J. Lab Clin Med 108: 11-16) . Además, la degradación de VIP aumenta en los corazones con fibrosis y, por consiguiente, disminuye la concentración de VIP en el miocardio. Por lo tanto, la j disminución de VIP aparentemente es un factor importante en la patogénesis de la enfermedad (Ye et ál., 2003, Acta Physiol Scand 179: 353-60) y la disminución en las concentraciones de VIP se asocia con un empeoramiento de la insuficiencia cardíaca. El uso del inhibidor de vasopeptidasa omapatrilat, que se sabe que disminuye la tasa de depuración i metabólica de VIP, da como resultado la disminución de la presión sanguínea sistólica, así como la disminución de ia fibrosis del miocardio en comparación con el control (Ye et ál., 2004, Eur J Phar acol 485: 235-42).' También se informa el efecto protector de VIP en el miocardio isquémico y reperfundido (Kalfin et ál., 1994, J Pharmacol Exp Ther 268: 952-8) . Por lo tanto, se espera que la aplicación de los VIP modificados de la presente invención tenga un efecto beneficioso en una variedad de afecciones patológicas, que incluyen insuficiencia cardíaca, cardiomiopatía y fibrosis del miocardio.

Diabetes mellitus de tipo 2 En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir la diabetes en un paciente que lo necesite, lo que comprende administrar una cantidad eficaz del VIP modificado. Específicamente, los VIP modificados de la presente invención son útiles para el tratamiento y la prevención de la diabetes mellitus de tipo 2.

Los estudios han demostrado que el contenido de VIP del astrum gástrico y el duodeno de las ratas diabéticas es significativamente inferior al de las ratas normales (Gozes et ál . , 2004, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18: 623-640) . Los bajos niveles de VIP en el tejido en el tracto gastroduodenal pueden contribuir parcialmente a la motilidad intestinal anormal observada en pacientes diabéticos (Adeghate et ál., 2001, Arch Phys Bioc 109: 246-51) . El VIP estimula la secreción de insulina en las células de insulinoma, los islotes pancreáticos de ratón y el páncreas perfundido de rata. La activación de VPAC1 ha estado involucrada en el aumento de la producción de glucosa (Gozes et ál., 2004, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18: 623-640) , mientras que el receptor de VIP VPAC2 se expresa en las células ß de islotes pancreáticos y su activación causa una elevación del AMP cíclico y la estimulación de la secreción de insulina (DeSouza et ál . , 2009, Nature Reviews 8: 361-7). Además, VIP estimula la secreción de glucagón en humanos, lo que da como resultado la liberación de glucosa del hígado. En conjunto, estos estudios revelan que VIP produce amplios efectos directos en el metabolismo de la glucosa. Por consiguiente, puede esperarse que VIP y las formas modificadas de VIP, al como los péptidos de fusión que se divulgan en la presente, constituyan una terapia útil para él tratamiento y la prevención de la diabetes de tipo 2.

Preferencia por el receptor VPAC2 En algunas modalidades, por ejemplo, cuando el VIP modificado tiene una preferencia más alta por VPAC2 en comparación con el VIP sin modificar, el VIP modificado puede reducir las respuestas inflamatorias, tal como, las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado, en un paciente. En algunas de dichas modalidades, el VIP modificado reduce el desarrollo de las células T autorreáctivas . En estas modalidades, el paciente puede tener una o más afecciones definidas por la inflamación de tipo TH1 o la autoinmunidad de TH1 , tales como, artritis (incluyendo RA), enfermedad inflamatoria intestinal (por ej . , enfermedad de Crohn) , diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, rechazo de transplante, síndrome de Sjogren, pancreatitis, uveoretinitis , keratitis y choque séptico.

Preferencia por el receptor VPAC1 En algunas modalidades, por ejemplo, cuando el VIP modificado tiene una preferencia más alta por VPAC1 én comparación con el VIP sin modificar, el VIP modificado puede fomentar las respuestas inflamatorias TH1, tal como, las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado, en un paciente. En estas modalidades, el paciente puede tener una o más afecciones asociadas con la inmunidad de TH2 , tal como, asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) .

El COPD es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias que afecta hasta el 8% de los individuos en los países industrializados. Hay un aumento en la cantidad de mujeres y hombres que padecen COPD. La hipertensión pulmonar es un síntoma común de la obstrucción crónica del flujo del aire pero los mecanismos precisos del aumento de la resistencia vascular no son claros. Las causas potenciales de la hipertensión pulmonar en el COPD incluyen la destrucción enfisematosa del lecho capilar, el remodelado de los vasos pulmonares y la vasoconstricción pulmonar hipóxica.

VIP es una de las moléculas más abundantes que se encuentran en el tracto respiratorio- Debido a sus propiedades antiinflamatorias y broncodilatadoras , se ha propuesto como un tratamiento novedoso del COPD y el asma. Si bien la regulación por incremento de VPAC1 es dominante, ambos VPAC1 y VPAC2 son necesarios para la señalización antiinflamatoria óptima (Burian et ál . , 2010, Peptides 31: 603-8) . Por consiguiente, puede esperarse que el tratamiento con VIP y las formas modificadas de VIP, tal como, los péptidos de fusión que se divulgan en la presente, ayuden a disminuir la inflamación crónica en los pulmones de pacientes que padecen COPD y asma.

La presente invención se ilustra asimismo mediante los siguientes ejemplos que no deberían interpretarse como restrictivos. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas que se citan a lo largo de la presente soligitud, así como las Figuras, se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos.

EJEMPLOS Ej emplo 1 Clonación de las construcciones de VIP-ELP La secuencia de ADN para el péptido de VIP es tal como se describe en Simoncsits et ál. (Synt esis, cloning and expression in Escherichia coli of artificial genes coding fór biologically active elongated precursors of the vasoactive intestinal polypeptide, Eur. J. Biochem. 1988, 178(2) :343-350, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos) , salvo que el residuo 17 fuera la metionina natural y no tuviera ninguna de las extensiones del extremo C descritas (Véase SEQ ID NO. 16) .

Se realizaron dos variantes iniciales, una con una metionina en el extremo N, debido al codón de inicio ATG requerido, (PB1046, SEQ ID NO. 17) y otra con el tripéptido MAA en el extremo N (PB1047, SEQ ID 18) . En general, la metionina en el PB1046 se retira mediante aminopeptidasa de metionina (MA) pero, dado que la histidina es el segundo residuo y uno de los aminoácidos menos preferidos en esta posición para MA, la metionina no se retira. La metionina en el PB1047 se retira para dejar el AA, que luego se puede retirar in vitro o in vivo por DPPIV para dar la histidina como el residuo del extremo N. La secuencia de ADN de VIP se clonó en el vector pPB1031 (véase Figura 3) que lleva la secuencia de ADN de ELPl-120 para dar un cásete de expresión bajo el control del promotor T7.

Los oligonucleótidos sintéticos P0045 (SEQ ID NO. 31) , P0048 (SEQ ID NO. 32), P0064 (SEQ ID NO. 33) y P0065 (SEQ ID NO. 34) se hibridaron juntos, se asimilaron con la enzima de restricción Xbal y se ligaron en el plásmido pPB1031 que se había asimilado con las enzimas de restricción Xbal/Kpnl para dar el plásmido de expresión pPB1046 (véase Figura 4) .

Los oligonucleótidos sintéticos P0066 (SEQ ID NO. 35)', P0064 (SEQ ID NO. 33, P0067, SEQ ID NO: 36) y P0065 (SEQ ID NO. 34) se hibridaron juntos, se asimilaron con la enzima de restricción Xbal y se ligaron en el plásmido pPB1031 que se había asimilado con las enzimas de restricción Xbal/Kpnl para dar el plásmido de expresión pPB1047 (véase Figura 5) . ; Además, y suponiendo que el extremo N no es un requisito absoluto de actividad, también se realizó una fusión en el extremo C, pPB1048 (véase Figura 6) . Los oligonucleótidos sintéticos P006S (SEQ ID NO. 37) y P0069 (SEQ ID NO. 38) se hibridaron juntos y se ligaron en él plásmido pPB1031 que se había asimilado con las enzimas de Ejemplo 2 Expresión de las construcciones de VIP-ELP ¡ La cepa de producción E.coli BLR (Novogen) se transformó con los plásmidos pB1046, pPB1047 y pPB1048 y se cultivó en medio rico en matraces de agitación a 37°C durante la noche. Los gránulos celulares volvieron a suspenderse en la solución amortiguadora de TE pH 8.0, se lisaron a través de un microfluidizador (Microfluidics) , se centrifugaron para retirar el material insoluble y el producto se purificó !a partir del lisado soluble resultante realizando una 'transición' (ref) con la adición de NaCl a 3M. Las muestras í se sometieron a dos rondas adicionales de transición para brindar las muestras purificadas finales. Estos se analizaron por SDS-PAGE y se descubrió que PB1046 y PB1047 brindan dos bandas (véase Figura 7) . Suponiendo que esto es un resultado de la proteólisis, los cultivos se cultivaron nuevamente pero esta vez, antes de la lisis, se calentaron a 60°C de 15 minutos. El análisis mediante el gel NuPAGE Tris-Acetato al 10% indicó que la proteólisis se había inhibido (véase Figura 7) .

Lo más probable es que la proteólisis se encuentre dentro del péptido y probablemente cerca de la unión del I péptido y el ELP, ya que no se observó desintegración en ía fusión del extremo C PB1048. Dicha proteólisis podría prevenirse mediante la desnaturalización por calor de las proteasas antes de la lisis de las células, lo que implicaría una proteasa periplásmica en vez de una proteasa citosólica' o una proteasa citosólica que se activó o se comporta de forma diferente luego de la lisis. j Ejemplo 3 Actividad de la proteína de fusión de VIP-ELP modificado in vi tro Para medir la actividad biológica in vitro y la potencia de las proteínas de fusión de VIP o VIP-ELP, se utilizó un ensayo biológico basado en células. El ensayo mide el aumento de la concentración del monofosfato de adenosina cíclica intracelular (cAMP) en respuesta al tratamiento con las proteínas de fusión de VIP o VIP-ELP en células de ovario de hámster chino (CHO) que se diseñaron para expresar el receptor humano de péptidos intestinales vasoactivos ¡ 2 (VPAC2) o el receptor humano de péptidos intestinales vasoactivos 1 (VPAC1) . Tanto las proteínas de fusión de VIP; y VIP-ELP pueden estimular la producción de cAMP en estas células, lo que indica que las proteínas de fusión conservan la capacidad para unirse y activar el receptor. Dado que la cantidad de acumulación de cAMP en las células luego de la unión y activación del ligando mediado por el receptor és directamente proporcional a la cantidad de péptido o proteína de fusión intacto presente, el ensayo se puede usar para determinar la bioactividad y la potencia relativa.

En este ejemplo, se analizó la actividad de las proteínas de fusión de VIP-ELP PB1046 y PB1047. La construcción de PB1046 contiene VIP con un Met en el extremo N y la construcción PB1047 contiene VIP con Ala-Ala en su extremo N. Ambas construcciones tienen ELP (1-120) en él extremo C. En el primer experimento, la actividad de las construcciones se analizó usando las células de CHO que expresan el receptor de VIP VPAC2. Luego de incubaciones de 30 minutos de varias concentraciones de las proteínas de fusión con la célula, las células se lisaron y la cantidad de cAMP producida se midió usando un kit comercial. El PB1047 se ? trató con DPP-IV antes de la adición a las células. La Figura 8 muestra el resultado. Tal como se muestra, la proteína de fusión de VIP modificado PB1046 es un tanto más activa que la proteína de VIP natural, mientras que PB1047 es menos activa.

La actividad de PB1046 y PB1047 también se analizó usando las células de CHO que expresan el receptor de VIP VPACl . Luego de incubaciones de 30 minutos de varias concentraciones de las proteínas de fusión con las células de CHO, las células se lisaron y la cantidad de cAMP producida se midió usando un kit comercial. El PB1047 se trató con DPP- IV antes de la adición a las células. La Figura 9 muestra el resultado. En este momento, la proteína de fusión de VIP modificado PB1046 es mucho menos activa que la proteína de VIP natural, mientras que la actividad relativa de PB1047 en comparación con el VIP natural es aproximadamente la misma que en la prueba del receptor VPAC2. Estos resultados sugieren que PB1046 activa de manera selectiva el receptor VPAC2 sobre el receptor VPACl.

Ejemplo 4 Efecto de la presión sanguínea de la proteína de fusión de VIP-ELP La actividad de la proteína de fusión de VIP-ELP modificado PB1047 también se analizó in vivo. Específicamente, se analizaron los efectos de la proteína de fusión de VIP-ELP en la presión sanguínea. Las ratas espontáneamente hipertensas se trataron subcutáneamente con PB1047 (10 mg/kg) o con control de solución amortiguadora y sus presiones sanguíneas se midieron en varios momentos luego de la administración de la proteína de fusión. Se utilizaron cinco animales para cada grupo y las gráficas muestran él promedio y la desviación estándar. El PB1047 redujo significativamente la presión sanguínea sistólica y diastólica en estos animales durante al menos 12 horas luego de la administración (véase Figura 10) , lo que indica que la proteína de fusión de VIP-ELP es activa, y se puede utilizar potencialmente como producto farmacéutico para tratar enfermedades relacionadas con VIP.

Ejemplo 5 Proteínas de fusión de VIP-ELP adicionales El tratamiento de DPP IV de PB1047 dio como resultado la eliminación tanto de AA como de HS del extremo N y la inactivación del péptido. Por lo tanto, se construyó el pPB1064 de plásmido, donde el extremo N se cambió a MAAHG, SEQ ID NO: 45, en lugar de MAAHS , SEQ ID NO: 46, debido a que HG es más resistente a DPP IV que el HS.

También se construyó el pPB1056 de plásmido, que codifica un VIP con un enlazador de carga opuesta (SEQ ID NO. 20) basado en el VPGXG, SEQ ID NO: 3, repetir antes de ELP.

Ejemplo 6 Clonación, expresión y análisis de la proteína de fusión de VIP-ELP adicional, PB1120 i · La secuencia de ADN de VIP se clonó en el vector pPB1120 (SEQ ID NO: 48 (véase Figura 11) que lleva la secuencia de ADN de ELPl-120 para dar un cásete de expresión bajo el control del promotor T7. Luego, la cepa de producción E. coli BLR se transformó con el plásmido pPB1120 y se cultivó en medio rico, tal como se describió anteriormente. Las muestras del péptido de fusión de VIP-ELP1-120 resultante, PB1120, se purificaron y analizaron mediante SDS-PAGE.

La actividad del péptido de fusión PB1120 se analizó in vitro. La actividad se analizó usando un ensayo utilizando células de CHO que expresan el receptor VIP (VPAC1) , tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Tal como lo demuestra la Figura 12, la PB1120 era aproximadamente 1.4 veces menos activa que el péptido VIP natural en el receptor VPAC1. En comparación, la construcción PB1046 que contiene un residuo de metionina en el extremo N era aproximadamente 11 veces menos activa que el péptido VIP natural. Con el transcurso de varios experimentos, la PB1120 era tanto de 1;4 a 6 veces menos activa que el péptido VIP natural en el receptor VPAC1.

La Figura 13 ilustra la actividad de PB1120 para el receptor VPAC2. Al igual que los resultados observados para el receptor VPAC1, PB1120 muestra un poco menos de actividad (-1.5 veces menos) que el péptido VIP natural para VPAC2. Sin embargo, a diferencia de los resultados observados con VPAC1, PB1046 tiene la misma potencia para VPAC2 en comparación con el péptido natural. Con el transcurso de varios experimentos, la PB1120 era tanto de 1.5 a 7 veces menos activa que el péptido VIP natural en el receptor VPAC2.

Ejemplo 7 Perfil farmacocinetico de la proteína de fusión de VIP-ELP modificado, PB1120 Además de los ensayos biológicos de potencia descritos anteriormente, también se examinó el perfil farmacocinetico de la proteína de fusión de VIP-ELP PB1120. Los monos recibieron inyecciones subcutáneas (SC) individuales (dosificadas a 3 mg/kg) de PB1120 y se midieron las concentraciones de fármaco en plasma a diario en el transcurso de una semana. Se utilizaron tres animales y las gráficas muestran el promedio y la desviación estándar. Más de la mitad de la dosis inicial de PB1120 permanecía en la circulación al día 4 (véase Figuras 14A y 14B, que ilustran las concentraciones medias en plasma de PB1120 luego de la administración SC usando ejes lineales y semilogarítmicos , respectivamente) .

Basándose en estos datos, parece haber una fase de absorción prolongada luego de la administración subcutánea de PB1120, constante con la absorción lenta del sitio de administración. La semivida de eliminación aparente (tM) , basada en el deterioro de las concentraciones en plasma, se encuentra en el intervalo de 9.9 a 45.8 h y probablemente refleja la absorción lenta más que la eliminación verdadera. Estos datos indican que la proteína de fusión de VIP-ELP tiene una semivida notablemente amplia en comparación con el VIP natural y potencialmente puede administrarse en intervalos amplios (por ej . , se puede administrar alrededor de una vez por día, alrededor de día por medio, alrededor de cada tres días o alrededor de una vez por semana) .

Ejemplo 8 Efectos de la proteína de fusión de VIP-ELP modificado PB1120 en la presión sanguínea Para medir los efectos de la proteína de fusión de VIP-ELP modificado PB1120 en la presión sanguínea arterial sistólica, diastólica y media, las ratas recibieron inyecciones subcutáneas individuales de 0.1 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg de PB1120 y se evaluaron durante intervalos de 3 horas. Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran el cambio promedio en la presión arterial sistólica, diastólica y media, respectivamente. La Figura 15p muestra el ritmo cardíaco promedio en intervalos de 3 hr luego de la administración de PB1120. Como lo demuestran las Figuras 15A-C, las ratas que recibieron inyecciones de 1 mg/kg o 5 mg/kg de PB1120 mostraron reducciones significativas en la presión arterial sistólica, diastólica y media 9 horas luego de la inyección, lo que indica que la proteína de fusión de VIP-ELP PB1120 potencialmente puede administrarse a los efectos de tratar o prevenir la hipertensión en individuos afectados.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Si bien en la práctica o en el análisis de la presente invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, 'en la presente se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones, patentes y publicaciones de patente que se citan se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos.

Las publicaciones que se analizan en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Ningún contenido de la presente debe tomarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a dicha publicación en virtud de la invención anterior.

Si bien la invención se ha descrito con relación a modalidades específicas de esta, se entiende que pueden realizarse modificaciones adicionales y la presente solicitud pretende abarcar cualesquiera variantes, usos, adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluye las desviaciones de la presente divulgación como sucede en la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que se refiere la invención y como se aplica a las características esenciales establecidas anteriormente y a continuación en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES i 1. Una composición terapéutica que comprende una proteína de fusión y un portador farmacéuticamente aceptable, donde la proteína de fusión comprende un VIP y al menos un componente de péptido tipo elastina (ELP) y donde el VIP exhibe una semivida prolongada para soportar una frecuencia de dosificación de una vez por día o menos. ¡ 2. La composición terapéutica de la reivindicación í, donde el componente de ELP se construye con una o más unidades de repetición de aminoácidos definidas por SEQ ID NO: 1-12. 3. La composición terapéutica de la reivindicación 2, donde el componente de ELP comprende repeticiones de VPGXG i (SEQ ID NO 3), IPGXG (SEQ ID NO : 5), y/o LPGXG (SEQ ID NO: i 7) , donde X es un aminoácido genéticamente codificado. 4. La composición terapéutica de la reivindicación 3, donde el componente de ELP comprende repeticiones de VPGXG (SEQ ID NO 3) donde X se selecciona independientemente de V, A y G, o se selecciona independientemente de K, V y F. \ 5. La composición terapéutica de la reivindicación 4, donde X es V, A y G en una proporción de alrededor de V5, A2 y G3. 6. La composición terapéutica de la reivindicación 5, donde el componente de ELP comprende 60 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3 ) . 7. La composición terapéutica de la reivindicación 6, donde el componente de ELP comprende 120 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . 8. La composición terapéutica de la reivindicación 4, donde X es V, A y G en una proporción de alrededor de VI, A8 y G7. 9. La composición terapéutica de la reivindicación 8, donde el componente de ELP comprende 60 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . 10. La composición terapéutica de la reivindicación 9, donde el componente de ELP comprende 120 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . i 11. La composición terapéutica de la reivindicación 4, donde X es K, V y F en la proporción de alrededor de Kl , V2 !y Fl . 12. La composición terapéutica de la reivindicación lí, donde el componente de ELP comprende 60 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . 13. La composición terapéutica de la reivindicación 12, donde el componente de ELP comprende 120 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . 14. La composición terapéutica de la reivindicación 4, donde X es V. 15. La composición terapéutica de la reivindicación 14, donde el componente de ELP comprende 60 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . 16. La composición terapéutica de la reivindicación 14, donde el componente de ELP comprende 120 unidades de repetición de VPGXG (SEQ ID NO 3) . 17. La composición terapéutica de la reivindicación 1, donde el VIP tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. 18. La composición terapéutica de la reivindicación 1, donde el VIP tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 21-27. 19. La composición terapéutica de la reivindicación 1, donde el componente de ELP se encuentra en el extremo C del VIP. 20. La composición terapéutica de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una secuencia espadadora entre el VIP y el componente de ELP. ? 76 ? 21. La composición terapéutica de la reivindicación 20, donde el péptido espaciador es resistente a la proteasa ¡ o escindible con proteasa. 22. La composición terapéutica de la reivindicación 21, donde el péptido espaciador es una proteasa escindible ; y comprende un sitio de escisión de trombina, un sitio ele escisión del factor Xa, un sitio de escisión ¿le metaloproteasa, un sitio de escisión de enteroquinasa, un sitio de escisión de Tev o un sitio de escisión de catepsina. 23. La composición terapéutica de la reivindicación i, donde la composición se formula para administración parental. i 24. La composición terapéutica de la reivindicación 23, donde la composición se formula para administración subcutánea, intramuscular o intravenosa. 25. Un agente terapéutico que comprende un VIP o un análogo funcional del mismo y un resto del extremo N para modificar la preferencia del VIP por VPAC2 sobre VPAC1 en comparación con un VIP sin modificar. ? 27. El agente terapéutico de la reivindicación 25, donde el VIP tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera ! de SEQ ID NO: 21-27. ! 28. El agente terapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde el agente terapéutico tiene una preferencia de unión relativa por VPAC2 sobre VPAC1 de al menos alrededor de 2:1. 29. El agente terapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde el agente terapéutico tiene una preferencia de unión relativa por VPAC2 sobre VPAC1 de al menos alrededor de 50:1. 30. El agente terapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde el agente terapéutico tiene una preferencia de unión relativa por VPAC1 sobre VPAC2 de al menos alrededor de 2:1. 31. El agente terapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde el agente terapéutico tiene una preferencia de unión relativa por VPAC1 sobre VPAC2 de al menos alrededor de 50:1. 32. Un método para tratar un sujeto que necesita un VIP, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de las reivindicaciones 1-31. 33. El método de la reivindicación 32, donde dicho sujeto es un sujeto humano. 34. El método de la reivindicación 33, donde dicha j composición se formula para administración subcutánea. 35. El método de la reivindicación 33, donde dicha composición se formula para una dosificación de una vez por día . 36. El método de la reivindicación 33, donde dicha composición se formula para una dosificación de tres veces por semana. 37. El método de la reivindicación 33, donde dicha composición se formula para una dosificación de dos veces pór semana. 38. El método de la reivindicación 33, donde dicha composición se formula para una dosificación de una vez por semana . 39. Un método para tratar o prevenir la hipertensión en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-38. 40. El método de la reivindicación 39, donde dicha hipertensión se selecciona de hipertensión pulmonar, hipertensión esencial no controlada e hipertensión resistente. 41. Un método para tratar o prevenir una enfermedad cardíaca en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-38. 42. El método de la reivindicación 41, en donde dichas enfermedades cardíacas se seleccionan de fibrosis del miocardio, insuficiencia cardíaca y cardiomiopatía . 43. Un método para tratar p prevenir diabetes mellitus de tipo 2 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-38.