JP2002507437A

JP2002507437A - 組織の増強及び回復のための注射可能インプラント

Info

Publication number: JP2002507437A
Application number: JP2000533072A
Authority: JP
Inventors: アリー，ダン・ダブリュ; パーカー，ティモシー・エム; グレーザー，ポール・エー
Original assignee: バイオエラスチックス・リサーチ・リミテッド
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2002-03-12
Also published as: EP1056413A4; US20020116069A1; CA2319558A1; US6699294B2; WO1999043271A1; US6533819B1; AU2798599A; EP1056413A1; US20020038150A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物の組織増強のための方法であって、増強の必要がありそして組織温度を有する組織部位に重合体を注入することを含み、重合体がノナペプチド、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群から選択される繰り返しペプチド単量体単位を含む（ここで、単量体単位はβターン間にかけられた可動性架橋セグメントによって分離されている一連のβターンを形成し、重合体は組織温度より低い逆温度転移Ｔtを有し、そして重合体を付加的水の実質的に不在下でコアセルベート濃度の水溶液として注射する）方法を提供する。注射可能なバイオエラスチックポリマー及びシリンジを包含するキットもまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】謝辞本発明は、国立衛生研究所（National Institute of Health）、国立小児保健
・ヒト発育研究所（National Institute of Child Health and Human Developme
nt）により与えられたグラント番号Ｒ４３ＨＤ３４６５９−０１の下、政府の支
援を受けてなされた。この支援の結果として、米国政府は、発明のある程度の権
利を有する。

【０００２】技術領域本発明は、硬組織及び軟組織の増強のための、哺乳動物における（注射可能又
はさもなければ挿入可能な）インプラントとして用いられうる重合体材料の領域
に関する。

【０００３】背景注射可能インプラントを用いた形成外科又は再建手術のための多数の方法が存
在する。インプラントは、皮膚のしわの充填のような化粧用の理由、及び尿失禁
の治療のような医学的な理由で用いられている。尿失禁に関して、この医学的状
態は、ほとんどが高齢者である１千万人の、アメリカ人に影響を及ぼしており、
その費用は控えめに見積もっても年間１００億ドルを超えている。明らかに、尿
失禁を含む組織増強のための材料又は材料ファミリーの商業的適用の成功には、
価値があるであろう。

【０００４】軟組織のための可能性のさらなる例は、椎間板修復の分野において見られる。
米国では毎年、腰痛のため、他のいずれの医学的状態よりも多い生産性の損失が
生じ、３３０億ドルを超える保健医療費が生じている。身体障害及び損失生産力
を追加すると、経済的な損失は年間１兆ドルを超える。腰痛のよくある原因は、
軟組織、椎間板の病理である。板の変性が起こると、板空間の崩壊が起こり、神
経孔（neuroforaminal）狭窄及び神経衝撃がもたらされる。損傷を受けた椎間板
の軟組織の回復又は修復は、理論的には、２つのレベルで起こりうる。一つのレ
ベルは、失敗腰部手術症候群（failed back surgery syndrome）を引き起こす癒
着及び線維症を予防するための材料を用いて、椎間板切除又は椎弓切除手法の結
果を改善することである。もう一つのレベルは、正しい板の寸法及び粘弾特性を
取り戻し、同時に、ほぼ形成された板が支持するであろう力を細胞が感知するこ
とができる細胞接着を提供するための材料を用いることである。現在までのとこ
ろ、これらの目的のための満足のゆく材料は開発されていない。

【０００５】内因性括約筋欠損症（intrinsic sphincter deficiency）（ＩＳＤ）のような
状態から生じる尿失禁に対抗するための尿道周囲膨張剤として過去に本格的に考
慮されてきた材料には、合成有機重合体、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦ
Ｅ）（Blaivas and Jacobs, J. Urol. 145:1214-1218(1991); Malizia et al.,
JAMA 251:3277-3281(1984)）、自己由来脂肪（Santarosa and Blaivas, J. Urol
. 151:607-611(1994)）、モルイン酸ナトリウム（Murless, J. Obstet. Gynaeco
l. 45:67-73(1938)）、及びパラフィン（Quackels, Acta. Urol. Belg. 23:259-
262(1955)）がある。ＰＴＦＥの初期使用は、腹圧性尿失禁に対して７３％の改善率を示したが（Blaivas and Jacobs (1991)）、その後、肺、肝臓、脾臓、及び脳への遠位粒子移動が、異物肉芽腫の形成と共に観察された（Malizia et al.
、前記）。他の材料は、Canning（Dial. Ped. Urol. 14 (1991)）により概説されている。注射可能バイオガラス（bioglass）も考慮されているが、組織損傷及
びバイオガラスの漏出を引き起こす１６から１８ゲージの注射針が、注射に必要
とされるようである（Walker, et al., J. Urol. 148:645-647 (1992)）。

【０００６】結合組織の天然成分であるコラーゲンも、ポリエチレングリコールのような重
合体コンジュゲートと同様に（米国特許第５，４７６，６６６号）、軟組織増強
のため用いられている（米国特許第５，４２８，０２２号；Richardson,et al.,
Adult Urology, 46:378-381 (1995)；Frank et al., Plastic and Reconstructi
ve Surgery, 87:1080-1088 (1991)；国際特許公開第９５／２６７６１号）。抗原性を低下させ、線維芽細胞分泌コラゲナーゼに対する耐性を増加させたグリセ
ルアルデヒド架橋ウシ皮膚コラーゲンは、有望な材料として出現し、治療された
患者の約８０％がこの材料の注射後に治癒又は改善された（Richardson, et al.
(1995)；Stricker and Haylen, The Medical Journal of Australia, 158:89-9
1 (1993)）。しかしながら、最近の研究は、治癒率が実際には２５％であり、成
功例の４６％が３年以内に注射の繰り返しを必要とすること、即ち３年治癒率が
１０〜１５％であることを示している。Herschom, et al.,J. Urol. 156:1305-1
309 (1996)。さらに、患者の最大で５％が、この材料による必要な皮内皮膚テス
トの後に、過敏反応を示し（Siegle et al., Arch. Dermatol. 120:183-187 (19
84)）、従ってコラーゲン療法のための適当な候補でない。注射は、注射されたコラーゲンが約６ヶ月間にわたりほぼ等量の宿主コラーゲンを誘引し、穏和な炎
症応答を引き起こし、永久的な斑痕を引き起こす（Stricker and Haylen (1993)
）。そのような斑痕は治療におけるさらなる努力を複雑化しうる。さらに、材料
は９〜１９ヶ月で完全に分解するため、反復注射が必要となる（Appell, The Cr
aft of Urological Surgery 21(1):177-182 (1994)）。

【０００７】人工的なバイオエラスチック（bioelastic）ポリペプチドは、本発明者の研究
室において生まれ、過去に出願された一連の特許及び特許出願に開示されている
、比較的新しい開発である。例えば、米国特許第４，４７４，８５１号は、バイ
オエラスチック重合体を形成するために用いられうる多数のテトラペプチド及び
ペンタペプチド繰り返し単位を記載している。特定のバイオエラスチック重合体
は、米国特許第４，１３２，７４６号、第４，１８７，８５２号、第４，５８９
，８８２号、及び第４，８７０，０５５号にも記載されている。米国特許第５，
０６４，４３０号は、ポリノナペプチド・バイオエラストマーを記載している。
バイオエラスチック重合体は、他の目的のために調製されるペプチド繰り返し単
位を含有するが、最終重合体にバイオエラスチック・セグメントも含有しうる重
合体に関する関連特許：「走化性ペプチドによる走化性の刺激（Stimulation of
Chemotaxis by Chemotactic Peptides）」なる表題の米国特許第４，６０５，４１３号、米国特許第４，９７６，７３４号、及び米国特許第４，６９３，７１
８号、「テトラ／ペンタペプチド単位含有バイオエラストマー（Bioelastomer C
ontaining Tetra/Pentapeptide Units）」なる表題の米国特許第４，８９８，９
２６号、「エラスチン・ポリテトラペプチドの温度相関力及び構造発達（Correl
ated Force and Structure Development of Elastin Polytetrapeptide）」なる
表題の米国特許第４，７８３，５２３号、「ポリペプチド含有エラストマー様複
合材料（Elastomeric Composite Material Comprising a Polypeptide）」なる表題の米国特許第４，５００，７００号、「創傷修復部位の保護に適したバイオ
エラストマー様材料（Bioelastomeric Materials Suitable for the Protection
of Wound Repair Sites）」なる表題の米国特許第５，２５０，５１６号、「生
物学的材料の癒着を予防するためのエラストマー様ポリペプチド・マトリックス
（Bioelastomeric Polypeptide Matrices for Preventing Adhesion of Biologi
cal Materials）」なる表題の米国特許第５，５２７，６１０号、並びに「血管プロテーゼ材料としてのエラストマー様ポリペプチド（Elastomeric Polypeptid
e as Vascular Prosthetic Materials）」なる表題の米国特許第５，３３６，２
５６号にも開示されている。

【０００８】多数の他のバイオエラスチック材料及びそれらの使用のための方法が、１９９
４年１０月３日に出願された、「バイオエラストマーの薬物放出システム（Bioe
lastomeric drug delivery system）」なる表題の米国特許出願第０８／３１６，８０２号、１９９４年１月２４日に出願された、「光応答性重合体（Photores
ponsive Polymers）」なる表題の米国特許出願第０８／１８７，４４１号、１９
９５年６月７日に出願され、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９７７６として公開された、
「電気エネルギー応答性重合体（Polymers Responsive to Electrical Energy）
」なる表題の米国特許出願第０８／４８７，５９４号、１９９５年１０月１６日
に出願され、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５２６６として公開された、「食品添加物と
して適当なバイオエラストマー（Bioelastomer Suitable as Food Product Addi
tives）」なる表題の米国特許出願第０８／７３５，６９２号、１９９５年１０月１３日に出願された、「バイオエラスチック・ポリペプチドの過剰発現（Hype
rexpression of Bioelastomeric Polypeptides）」なる表題の米国特許出願第０
８／５４２，０５１号、１９９５年１０月１３日に出願され、ＰＣＴ／ＵＳ９６
／０５１８６として公開された、「バイオエラスチック重合体の精製のための簡
単な方法（A Simple Method for the Purification of a Bioelastic Polymer）
」なる表題の米国特許出願第０８／５４３，０２０号を含む係属中の米国特許出
願に記載されている。前記の特許及び特許出願は全て、バイオエラストマー及び
／又はそれらの成分並びにそれらの調製を詳細に記載しているため、参照として
本明細書に組み込まれる。

【０００９】人工的なバイオエラスチック材料は、繰り返しペプチド配列からなるエラスト
マー様ポリペプチド及び関連ポリペプチドに基づいている（Urry, Angew. Chem.
(German) 105:859-883 (1993)；Angew. Chem. Omt. Ed. Engl. 32:819-841 (19
93)）。本発明者により行われた研究の結果として、ＶＰＧＶＧに基づくバイオエラスチック・ポリペプチドは２５℃未満の水に溶解性であることが見出された
が、温度を上昇させると、それらは、ポリペンタペプチド（「ＰＰＰ」）及びポ
リテトラペプチド（「ＰＴＰ」）の場合には、可逆的に会合し高密度の水含有粘
弾性相を形成し、ポリヘキサペプチド（「ＰＨＰ」）は不可逆的に水中で会合し
て、再溶解のためには凝集物へのトリフルオロエタノールの添加を通常必要とす
る顆粒状沈殿物を形成する。粘弾性相はコアセルベートと呼ばれ、コアセルベー
ト上部の溶液は平衡溶液と呼ばれる。架橋により、ＰＰＰ及びＰＴＰ重合体はエ
ラストマーとなることが見出されているが、ＰＨＰ重合体はエラストマーとはな
らず、弾性生成（elastogenesis）において鎖の整列化及び連結のための手段を提供するようである。

【００１０】エラストマー状態を形成するため温度を上昇させる過程は、典型的なゴムの無
秩序なネットワーク構造とは異なり、規則的な可動性構造の発生をもたらす逆温
度転移である。規則的な構造は、βスパイラルすなわちβターンと、へリックス
ターン間の疎水的接触を提供し、かけられたペプチド・セグメントを有するヘリ
ックスのターン間のスペーサーとを含む緩い水含有らせん構造、である。これら
のペプチド・セグメントは、振動と呼ばれる、大きな振幅、低周波数の横揺れ運
動を自由に受けることができる。さらに、これらのβスパイラルのいくつかは、
会合して、ねじれたフィラメントを形成する。これらの様々なバイオエラストマ
ーのエラストマー力は、それらの規則的可動性構造が発達するにつれ増加する。
様々な部分モル比率の構成繰り返し単位を有するバイオエラスチック材料を合成
することにより、そして初期の粘弾性相を支持するための特定の溶媒を選択する
ことにより、得られたバイオエラストマーがエラストマー力を発揮する温度を厳
密に調節することが可能である。最大のエラストマー力は、最大約７５℃までの
範囲にわたる温度で、比較的狭い温度範囲で発生する。

【００１１】バイオエラスチック材料は、前記の出願及び特許の全般的な主題により示され
るような多数の用途及び装置のため提唱されており、シート、ゲル、フォーム、
又は粉末のような異なる物理的形態で利用可能にされている。例えば、組成物は
、術後癒着の予防（Urry, et al.,「バイオテクノロジカル・重合体：医学的、薬学的、及び工業的適用(Biotechnological Polymers：Medical, Pharmaceutica
l and Industrial Applications)」, 82-103頁(1993)）からプログラム化された
薬物輸送までにわたる医学的適用において用いられうる。Urry,「組織再構築のためのマトリックスとしてのバイオエラスチック材料（Bioelastic Materials a
s Matrices for Tissue Reconstruction）」, Tissue Engineering Current Per
spectives, (Eugene Bell.Ed.), Birkhauser Boston, Div.Springer-Verlag, Ne
w-York, NY, 199-206頁 (1993)も参照のこと。癒着から傷修復部位を単離するた
め、火傷区域の保護のため、及び損傷を負った組織の修復を促進するための絶縁
体材料として機能するマトリックスが、米国特許第５，２５０，５１６号、第５
，５２７，６１０号に記載されている。

【００１２】組織増強のための技術は過去に多数存在しているにも関わらず、既存の技術は
全て、患者にとって最適ではない結果を引き起こす何らかの欠陥を抱えている。
組織増強のための生体適合性インプラント、特に注射可能インプラントの必要性
が残っており、本発明は、先行技術の欠陥をもたない、これらの必要を満たすた
めの組成物及び方法を提供する。

【００１３】発明の概要組織の増強又は回復のための長期持続型インプラントを提供することが、本発
明の目的である。

【００１４】内視鏡下手術及び関連技術における据え付け（emplacement）を含む様々な外科的条件の下で注射可能であるインプラントを提供することも、本発明の目的で
ある。

【００１５】適用組織部位のコンプライアンスとマッチし、異なるコンプライアンス値を最
少の困難をもってマッチさせるために選択されうるインプラントを提供すること
が、本発明のさらなる目的である。

【００１６】生物学的に不活性であるか又は少なくとも非毒性生成物へと分解されうる担体
重合体と、生物学的に活性な成分との両方を有するインプラントを提供すること
が、本発明のさらにもう一つの目的である。

【００１７】容易に安定化可能であり、かつ生体適合性であって、宿主において非有意な免
疫原性及び抗原性応答を誘発するインプラントを提供することが、本発明のもう
一つの目的である。

【００１８】組織の再生又は回復のような、外来性材料の組織への移植を含む生物学的状況
において、組成物の基本構造に対する適当な修飾又は付加により、細胞接着及び
その結果の細胞成長を刺激することができるインプラントを提供することが、本
発明のさらなる目的である。

【００１９】形成外科（例えば、しわの除去）のような組織増強のための、又は医学的状態
（例えば、尿失禁、もしくは椎間板の変性性欠陥から生じる背痛）を修正するた
めの方法を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。

【００２０】これら及び他の本発明の目的は、増強が必要であり、かつ組織温度を有する組
織部位に、ノナペプチド、ペンタペプチド、及びテトラペプチド単量体単位から
なる群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を含む重合体を注射すること
を含む、温血動物における組織増強のための方法（ここで、該単量体単位はβタ
ーン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された一連のβターンを形
成し、該重合体は該組織温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有し、該重合体は付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液として注射される）を提
供することにより達成される。単量体単位は、全て同一であっても、又は異なっ
ていてもよい。特別な実施態様において、組織再構築は、有利には、増強される
天然の組織と同一の弾性率を有し、そしていくつかの場合には、組織の（又は組
織周囲の）天然の細胞が再構築部位へ侵入し該部位において機能することを誘導
する能力を有する重合体を用いて達成されうる。

【００２１】本発明のさらなる目的は、部位温度を有する枯渇した髄核部位に、ノナペプチ
ド、ペンタペプチド、及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される
繰り返しペプチド単量体単位を含む重合体を注射することを含む、哺乳動物にお
ける椎間板の組織回復のための方法（ここで、該単量体単位はβターン間にかけ
られた可動性架橋セグメントにより分離された一連のβターンを形成し、該重合
体は該組織温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有し、該重合体は付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液として注射され、膨潤して該板内の圧
力を増加させる）を提供することにより達成される。

【００２２】本明細書において教示される注射可能タンパク質ベース重合体は、生物学的安
定性、生物学的機能、及び明確な重合体サイズを含む多数の利点を有するよう設
計されうる。これらの利点は、それ自体が多様な構造及び化学的特性を有し、容
易に修飾される、容易に入手及びカップリングされる単量体単位、例えばアミノ
酸からなる重合体を提供することにより達成される。さらに、バイオエラスチッ
ク単位又は非弾性生機能性（biofunctional）セグメントのいずれかにおいて、特別なペプチド骨格を作製するため、組換えペプチド工学技術が有利に用いられ
うる。従って、重合体はテトラマー、ペンタマー、又は他の単量体単位の混合物
を含有する共重合体として存在しうる。

【００２３】重合体は、単量体単位の異なる位置について異なるアミノ酸を選択することに
より、そして最終生成物を形成させるために用いられる架橋過程（例えば、化学
的過程、酵素的過程、又は放射線）を変動させることにより、広範囲の疎水性を
有し、ほぼ任意の所望の弾性率を有し、様々な架橋度を有する広く異なる水組成
物を用いて調製されうる。本発明において用いられうる多様な重合体の調製は、
例えば上記で論じた出版物に既に記載されており、重合体自体の調製は今や確立
されており、本発明の新規な部分ではないが、組織増強における使用のための注
射可能製剤としてのこれらの材料の調製は新規である。さらに、それ自体新規で
ある、本明細書に記載のようにして調製されうる重合体のいくつかの好ましい実
施態様が存在する。しかし、ほとんどの部分において、本発明は既存の重合体（
及び新規重合体）の、それらが以前には用いられていなかった新規領域への適用
を含む。

【００２４】本発明は、この明細書の一部を形成する図面と共に、以下の特別な実施態様の
詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。

【００２５】特定の実施態様の説明軟組織増強の方法は、典型的には、合成重合体又はコラーゲン誘導体を用いて
過去に達成されている。ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）のような合成
重合体が関与する先行技術における方法は、合成重合体が外来材料として生体に
より認識され、ＰＴＦＥが肉芽腫形成を促進するという明確な欠点を有する。コ
ラーゲン誘導体はある程度成功して用いられているが、それらは過剰の水と共に
注射される必要があり、それが後に充填容量の減少から生じる合併症を引き起こ
す。さらに、コラーゲン誘導体は、時間の経過と共に分解し、斑痕組織形成を促
進する。組織増強において用いられる先行技術の材料のこれら及び他の欠点は、
注射可能バイオエラスチック重合体のインプラントとしての使用により、本発明
において克服される。しかしながら、コラーゲン注射の方法は、ほとんどの部分
において、組織増強のため本発明の組成物を用いる方法に直接的に適用されるこ
とができ、本明細書に記載される変形の対象である。

【００２６】本発明において用いられる人工的バイオエラスチック重合体の明確な構造は、
天然の生成物から調製される材料の、調節可能性が低い特性に依存しなければな
らないのではなく、選択された物理的特性を有する重合体を設計し合成すること
を可能にする。「バイオエラスチック重合体」、「バイオエラストマー様重合体
」、及び「バイオエラストマー」なる用語が、本明細書において相互に交換可能
に用いられること、さらに、「バイオエラストマー」なる用語は、ノナペプチド
、ペンタペプチド、及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰
り返しペプチド単量体単位〔該単量体単位はβターン間にかけられた可動性架橋
セグメントにより分離された一連のβターンを形成する〕を含む重合体を説明す
る、当分野において認識された用語となっているため、これらの用語が、（可塑
性の特徴を有するある種の重合体のような）エラストマーとして考えることがで
きない材料を包含することに注意すべきである。（先行実施態様における）これ
らの材料の例は、上に挙げられ、本明細書に参照として組み込まれる特許を含む
多数の出版物に記載されている。

【００２７】バイオエラストマーは、前記のように包括的に、又は様々な程度の特異性をも
って記載されうる。包括的記載は、多数の発行された米国特許及び外国特許の請
求の範囲における包含に十分であった。しかし、バイオエラストマーに比較的精
通していない者のため、多数の準包括的（subgeneric）かつ特異的な記載を提供
する。

【００２８】一つは、式αＰρΩＧ又はＶＰθδ 〔式中、ＶはＬ−バリンのペプチド形成残基であり、ＰはＬ−プロリンのペプチド形成残基であり、Ｇはグリシンのペプチド形成残基であり、 αはＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニンのペ
プチド形成残基、又はＬ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−
Ｔｙｒ、及び他のイオン化可能ペプチド形成Ｌ−アミノからなる群より選択され
るイオン化可能ペプチド形成残基酸であり、 ρはグリシンのペプチド形成残基、又はＤ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｈｉｓ、
Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒのペプチド形成残基、又は（場合により）弾性重合リピ
ート（elastic polymeric repeats）のための他のイオン化可能ペプチド形成Ｄ −アミノ酸、又は弾性形成リピート（elastic forming repeats）のための任意のＬ−アミノ酸であり、 ΩはＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニンのペ
プチド形成残基、又は（場合により）イオン化可能ペプチド形成Ｌ−アミノ酸で
あり、 θはグリシンのペプチド形成残基、又はＤ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｈｉｓ、
Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｔｙｒのペプチド形成残基、又は（場合により）他のイオン化
可能ペプチド形成Ｄ−アミノ酸であり、及び δはグリシンのペプチド形成残基、又はＬ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、
Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｔｙｒのペプチド形成残基、又は（場合により）他のイオン化
可能ペプチド形成Ｌ−アミノ酸である〕の繰り返し単位を含有するような（下記
の目的のため用いられる）イオン化可能アミノ酸残基を含有するこれらの材料の
分類を記載することである。

【００２９】より一般的には、バイオエラスチック・ポリペプチド重合体は、一般的に、バ
イオエラスチックペンタペプチド及びテトラペプチドからなる群より選択される
繰り返しエラストマー単位を含み、繰り返し単位は疎水性アミノ酸残基及びグリ
シン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含み、繰り返し単位は下記式

【００３０】

【化１】

【００３１】（式中、Ｒ₁〜Ｒ₅はアミノ酸残基１〜５の側鎖を表し、そしてｍは、繰り返し単
位がテトラペプチドである場合には０、繰り返し単位がペンタペプチドである場
合には１を表す）のβターンを有するコンホメーションで存在する：。ノナペプ
チド繰り返し単位は、一般的に、連続するテトラペプチド及びペンタペプチドか
らなる。好ましい疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンからな
る群より選択される。多くの場合において、繰り返し単位の最初のアミノ酸残基
は、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニンの残基であり、２
番目のアミノ酸残基はプロリン残基であり、３番目のアミノ酸残基はグリシン残
基であり、そして４番目のアミノ酸残基はグリシン、又はトリプトファン、フェ
ニルアラニン、もしくはチロシンのような極めて疎水性の残基である。

【００３２】特に有用なテトラペプチドは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１
６）である。ＧＧＶＰ（配列番号４１）、ＧＧＦＰ（配列番号４２）、及びＧＧ
ＡＰ（配列番号５０）も有用である。特に有用なペンタペプチドは、Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１７）である。ＧＶＧＶＰ（配列番号
２０）、ＧＫＧＶＰ（配列番号４３）、ＧＶＧＦＰ（配列番号４４）、ＧＦＧＦ
Ｐ（配列番号４５）、ＧＥＧＶＰ（配列番号４８）、ＧＦＧＶＰ（配列番号４９
）、及びＧＶＧＩＰ（配列番号５１）も有用である。他の特に好ましい個々の単
量体単位及びバイオエラストマーについては、参照として本明細書に組み込まれ
る特許のいずれかを参照のこと。

【００３３】本発明のバイオエラストマーは、ノナマー（ポリノナペプチド）のみ、テトラ
マー（ポリテトラペプチド）、ペンタマー（ポリペンタペプチド）のみ、又はこ
れらの単位の混合物からなることができるが、より典型的には、テトラペプチド
単位とペンタペプチド単位との混合物（共重合体）からなる。さらに、バイオエ
ラストマーは、前記の単量体単位のうちの一つと１〜１００アミノ酸、より典型
的には１〜２０アミノ酸を含有する第二のペプチド単位とから形成される共重合
体であることができる。より小さい側では、この第二のペプチドは、例えば、フ
ィブロネクチン細胞接着配列ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４６）、又は線維芽細胞及
び単球のための化学誘因物質であるＧＶＧＶＡＰ（配列番号４７）もしくはＶＧ
ＶＡＰＧ（配列番号５２）のような単量体でありうる。より大きい側（９０〜１
００アミノ酸）では、第二のペプチドは、多少非特異的なＧＲＧＤＳＰ細胞接着
配列より特異的な細胞接着を提供する、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テ
ネイシン、タイチン、又は他の関連細胞接着タンパク質のIII型ドメイン由来の細胞接着配列でありうる。

【００３４】一つの側面において、本発明は、組織増強のための特別な所望の特性のため選
択され、そしてそれを示す注射可能バイオエラスチック重合体、並びにそれらの
調製及び使用の方法を提供する。例えば、重合体は、好ましくは、生体適合性、
使用温度における微細な外科用注射針（例えば２２ゲージ）からの押し出し可能
性、及び注射後の非有意な容量変化を示す。治療された部位における好ましい接
合（充填の程度）が、充填容量の後の増加又は減少、及び関連合併症を考慮する
必要なく、例えば膀胱鏡検査により、注射時に視覚的に調べられるため、最後の
特徴は重要である。下記により詳細に記載されるように、注射部位に残存するよ
う、そして長期持続型の組織増強を提供するよう、バイオエラスチック重合体を
設計することもできる。

【００３５】もう一つの側面において、本発明は、椎間板修復の分野における組織回復のた
めの特別な所望の特性のため選択され、かつそれを示す注射可能バイオエラスチ
ック重合体、並びにそれらの調製及び使用の方法を提供する。例えば、組織増強
適用と同様に、重合体は、好ましくは、生体適合性を示す。しかし、板修復の場
合には、重合体は使用温度においてより粘性であり、内視鏡的又は経皮的椎間板
切除手法において用いられる装置に存在するような、より大きい孔から注射され
、さらに膨潤により注射後に有意な容量変化を示す。ある種の重合体、特にＧＶ
ＧＩＰ（配列番号５１）のような一つもしくは複数のペンタペプチド単位、又は
一つもしくは複数、典型的には一つもしくは二つのフェニルアラニンのような芳
香族残基を含有する一つもしくは複数の単量体、例えばＧＶＧＦＰ（配列番号４
４）、ＧＦＧＦＰ（配列番号４５）、及びＧＦＧＶＰ（配列番号４９）を含有す
る重合体が、この適用にとって好ましい。

【００３６】本明細書において用いられるように「注射可能」とは、典型的な注射圧を使用
することにより、内視鏡的又は経皮的椎間板切除手法において用いられる装置の
ような、適当な外科用注射針又は他の外科用装置からの流出を可能にする特質及
び粘性を有する材料に関する。例えば、低粘性の注射可能材料は少なくとも直径
２２ゲージの注射針から押し出されうる。高粘性の注射可能材料は、例えば、ま
ずトロカールで輪に孔を作成し、次に外科医の手及び指により適用可能な通常の
圧力下で、大きなシリンジ、即ち約１３から１９ゲージのシリンジの内腔からバ
イオエラストマーを押し出すことにより、導入されうる。混合物は、真皮（皮下
）、椎間板、尿道周囲、腱、又は軟骨のような増強が必要な部位に直接的に注射
され、検出可能な炎症又は異物反応を本質的に引き起こさない。

【００３７】「増強」とは、そのような組織の提供、増強、又は交換による、欠陥、特に組
織の消失又は欠損による欠陥の修復、予防、又は寛解を意味する。本発明は、軟
組織増強のため主に設計されるが、本発明の注射可能組成物は、例えば他の部分
に記載されているような石灰化又は骨形成を促進するための材料と組み合わせて
用いられうるため、硬組織増強も同様に範囲内である。

【００３８】最も広義の側面において、本発明は、増強が必要な組織部位にバイオエラスチ
ック重合体を注射することによる、温血動物における組織増強のための方法を提
供する。方法は、しばしばヒトに適用されるであろうが、本発明が、ウシ、ウマ
、ブタ、及びヒツジのような哺乳動物を含む農業的に重要な動物、並びに（外傷
を負った家畜の回復の提供などにおいて）ニワトリ、シチメンチョウ、及びガチ
ョウのような他の種蓄、それからネコ及びイヌのような重要な家畜に適用可能で
あることも容易に理解される。

【００３９】本発明のもう一つの実施態様において、哺乳動物における組織の増強又は回復
のための方法は、ａ）組織の増強又は回復が必要であり、かつ部位温度（Ｔ_s）を有する組織部位を同定する工程、及びｂ）ペンタペプチド及びテトラペプチド
単量体単位からなる群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を単独で、又
は組み合わせて含む重合体を部位に注射する工程〔ここで、該単量体単位はβタ
ーン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された一連のβターンを形
成し、（ｉ）該重合体は、Ｔ_sより低い逆温度転移Ｔ_tを有し、（ii）該重合体は
、付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液として注射され
、かつ（iii）コアセルベートは、１から１００，０００ミリポアズのＴ_sにおけ
る粘性を有する〕を含む。

【００４０】バイオエラスチック重合体は、繰り返しペプチド配列の高分子量重合体であり
、背景の項に記載されたような本発明者らの研究室からの多数の特許及び特許出
願の主題である。バイオエラストマーは、水溶性重合体鎖の、より規則的な濃縮
された（コアセルベート）相の状態への折り畳み及び凝集が、温度の上昇により
起こる相分離の形態で、逆温度転移を示す。先行特許及び出願は、組織増強のた
めの注射可能組成物に関連していないが、それらは、本明細書に記載された使用
のための有用な構造的特徴を得るためのバイオエラストマーの生体適合性及び製
造に関するかなりの指針を提供する。

【００４１】エラストマー様のテトラペプチド、ペンタペプチド、及びノナペプチド単量体
又は単量体単位に基づくバイオエラスチック材料は、生体適合性であることが既
に証明されているため、これらの材料は特に好ましいバイオエラスチック材料で
ある。単量体単位の弾性は、タンパク質の二次構造内の一連のβターン、即ちβ
ターン間にかけられた可動性（剛性の逆として）橋かけセグメントにより分離さ
れたそのペプチド鎖のコンホメーションによると考えられている。典型的な重合
体は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくと
も２０個の単量体を含有し、生物学的使用にとって望ましい水性溶媒における限
定された溶解度のため、通常１０００個未満、通常５００個未満のそのような単
位を含有する。

【００４２】注射可能バイオエラスチック重合体は、充分に低い温度においては任意の割合
で水溶性であるが、Ｔ_tと名付けられた臨界値を超えて温度が上昇すると、それらは、重量で５０％ペプチド／５０％水のオーダーのような予め定められた組成
の、より規則的な状態へと折り畳まれ、集合し、相分離する。しかし、この値は
、変動し、本発明の適用における使用には広範囲が許容される。例えば、ペンタ
ペプチド単量体ＧＶＧＶＰを含有する重合体は、４０wt% ペプチド／６０wt% 水
の結果としての規則的状態を有することが示されているが、ＧＶＧＩＰを含有す
る重合体は、６０重量％ペプチド／４０重量％水の結果としての規則的状態を有
する。この相分離は、逆温度転移と呼ばれ、より高密度の相はコアセルベートと
呼ばれる。

【００４３】特定のバイオエラスチック重合体の転移温度は、好ましくは、周知のように組
織の部位によりわずかに変動する、組成物が注射される組織の正常な温度より低
く選択される。例えば、ヒトにおける皮膚は内部組織よりもわずかに低い温度を
有する。従って、安定なコアセルベートを提供するためには、通常は、Ｔ_tは３７℃より低く、好ましくは３５℃より低く、より好ましくは３０℃より低く、さ
らに好ましくは２５℃より低く、最も好ましくは２０℃より低く選択される。予
め選択された２５℃というＴ_tを有するバイオエラストマーの調製は、以前に何度も記載されている。表１は、所望の場合は転移温度に戻すため、そうしなけれ
ば非機能性である残基を変化させるために用いられうるＴ_tベース疎水性尺度を示す。従って、表１はタンパク質工学のための尺度を表す。

【００４４】

【表１】

【００４５】ａ＝ＮＭｅＮはリシン側鎖にぶら下がったＮ−メチルニコチンアミド、即ちＬ
ｙｓの−ω−ＮＨ₂にアミド結合により付着したＮ−メチルニコチナートを表す。還元型状態はＮ−メチル−１，６−ジヒドロニコチンアミドである。ｂ＝Ｐｒｏに関するＴ_t計算値は、Ｖａｌ及びＧｌｙの実験値を用いた場合のポリ（ＶＰＧＶＧ）から得られた。この−８℃という疎水性値は、Ｖａｌ¹−ＣＨ₃部分とＰｒｏ²−ＣＨ₂部分との間に疎水性接触が存在するβスパイラル構造に特有である。ｃ＝ポリ〔ｆυ（ＶＰＧＶＧ），ｆ_p（ＰＰＧＶＧ）〕から決定された実験値。

【００４６】事実上全ての変数が、タンパク質ベース重合体の適当な組成と共に、Ｔ_tの値を変化させうる。そのような変数は、基準の中でも特に、（１）重合体濃度、（
２）重合体長、（３）アミノ酸組成、（４）塩、例えばホフマイスター（離液）
系列の存在、（５）有機溶質及び溶媒、（６）重合体側鎖イオン化、（７）重合
体側鎖の化学的修飾、例えばリン酸化又はニトロ化、（８）例えば芳香族残基に
影響を与えるような圧力、（９）重合体に付着した化学基の酸化還元状態、（１
０）重合体に付着した化学基による光吸収、及び（１１）イオン対形成、例えば
陰イオン性側鎖の陽イオン中和、陽イオン性側鎖の陰イオン中和、及び側鎖間の
イオン対形成による側鎖中和を含む。

【００４７】本発明の実施における使用のためのバイオエラストマーは、適当な粘性で容易
に調製されうるが、これは以前にはこれらの材料の調製において重要でなかった
。典型的には、コアセルベートは、１から１００，０００ミリポアズの組織部位
温度における粘性を有する。用いられる単量体、重合体の鎖長、及び（重合体の
分野において周知であるような）架橋の量の選択により、粘性は、容易に調節さ
れうる。実際、特定の適用に応じて広範囲の粘性が用いられうる。例えば、組織
増強のための所望の組織部位へ重合体を注射するため、医師又は他の者により用
いられているシリンジのほどよい調節を可能にするために、十分に低いコアセル
ベートの粘性を有することが望ましい。他方、椎間板回復のような組織回復のた
め、より大きいシリンジから重合体が注射される場合には、より高い粘性が望ま
しい。

【００４８】重合体の注射可能性は、通常、注射が通常行われる形態であるコアセルベート
濃度の粘性により調節される。しかし、用いられるシリンジから、適当なサイズ
の注射針を通して、以前には用いられていない任意の組成物を押し出すことを単
純に試みることにより、適合性を容易に調べることが可能であるため、粘性の測
定は必要ない。例えば、ポリペンタペプチド（ＧＶＧＶＰ)₂₅₁（配列番号１８）
は、最初に４℃で５００mg／mlの濃度で溶解された後（そして、下記のようにコ
アセルベートから過剰水を排出した後）、３７℃において、２２ゲージ、そして
２７ゲージの注射針からですら押し出し可能である。本発明の組織の増強及び回
復の面における使用のための好ましいバイオエラスチック材料は、３７℃で２２
ゲージ及び２７ゲージ両方の注射針から押し出し可能であり、直ぐに使用できる
状態の形態での重合体の保存を可能にするため十分な時間（数週間から数ヶ月）
押し出し可能なままである、ポリ〔０．６（ＧＧＶＰ）、０．４（ＧＧＦＰ）〕
（配列番号４１及び４２）のようなポリテトラペプチドを含む。椎間板の回復に
おける使用のための好ましいバイオエラスチック材料は、より高い粘性を有し、
典型的には板部位における温度において５×１０⁴〜５×１０⁶ Ｎ／ｍ²の範囲内
の弾性率を示す。約５×１０⁵ Ｎ／ｍ²である大腿動脈の血管壁の弾性率に近づけることが望ましく、５×１０⁵ Ｎ／ｍ²未満である髄核の弾性率に近づけることがさらに好ましいかもしれない。特定の重合体系が、本明細書及び他において
例示的に言及されているが、これら及び他の例は、本明細書に論じられた組織増
強のための所望の特性を有する多数の組成物を提供するため容易に修飾され得る
ため、そのような記載が本発明を限定しないことが認識されよう。

【００４９】重合体は、過剰の水の全部又は実質的に全部が排除されたコアセルベート組成
物で、本発明の方法で注射される。既に述べたように、この方法において用いら
れる重合体のコアセルベート状態は、本質的に、固定された比率の水及び重合体
を含有する粘弾性状態である。Ｔ_t未満の温度、通常４℃における最初の重合体の水への溶解から存在する過剰水は、上清の水から相分離状態を分離するために
利用可能な任意の技術により、この固体相から容易に除去される。従って、コア
セルベートは、生理学的条件下で安定な容量を提供し、過剰水の存在を必要とす
るコラーゲンの注射で起こるような、注射後の注射部位における容量変化を受け
ることなく、適当な外科用注射針から重合体を注射することを可能にする。従っ
て、形成外科医は、部位からの水漏出により引き起こされる注射部位の後の萎縮
を見込む必要なく、注射される重合体の量を観察により容易に調べることができ
る。

【００５０】当然、その量がコアセルベートの注射を妨害するのに十分でない限りにおいて
、本発明の実施を損なうことなく、コアセルベートと共にある程度の量の過剰水
が残存してもよい。例えば、外科医が最終容量を予想するため注射容量を調整す
ることを厭わないのであれば、（容量で）３０％もの過剰水が存在しうるが、２
０％以下の過剰水が好ましく、１０％以下がより好ましく、５％以下が最も好ま
しい。

【００５１】全てのバイオエラスチック重合体と同様に、コアセルベート状態への転移は、
他の環境因子の調節下であるか温度の変化なしに起こりうる。これは、転移のΔ
Ｔ_tメカニズムと呼ばれ（参照として本明細書に組み込まれる、米国特許出願第０８／１８７，４４１号；Urry et al., Biopolymers 24:2345-2346 (1985)）、
多数の内因性及び外因性因子を変化させることにより達成されうる。以下の、（
ａ）重合体自体の濃度、（ｂ）重合体バイオエラスチック単位内のアミノ酸組成
の変化、（ｃ）pH変化により調節される官能側鎖のイオン化の程度の変化、（ｄ
）キナーゼと呼ばれる酵素によるセリンのような側鎖のリン酸化、（ｅ）重合体
に付着した側鎖の電気的、化学的、又は酵素的な酸化又は還元、及び（ｆ）例え
ば、電磁放射に応答した側鎖の化学反応は、５０，０００kDa又はそれ以上の分子量のモデル・タンパク質のクラスに内因的なものである。Ｔ_tに影響を与える外因的な化学的変化は、塩、有機溶質及び溶媒の効果を含む。さらに、より長い
ペプチド鎖長を有する重合体と比較して、より短いペプチド鎖長を有する重合体
がより高いＴ_t値を示す、より低分子量において重要となる鎖長依存性が存在する。

【００５２】従って、バイオエラストマーは、本発明の方法のために適当な所望の特性を達
成するため合理的に設計されうる。エラストマー様単位が合成される個々のアミ
ノ酸及び得られるポリペプチドの選択は、得られる構造が、例えば参照として本
明細書に組み込まれる米国特許第４，４７４，８５１号及び第５，０６４，４３
０号に記載された特性を有するエラストマー様構造、特にβターン形成を含み、
得られる重合体が、特に、微細なゲージの注射針からの押し出し可能性を含む本
発明の実施態様に係る目的にとって有用な属性を維持する限りにおいて、制限さ
れない。

【００５３】一般に、特定の単量体単位内のアミノ酸配列の選択、及び単量体単位の必要な
割合の選択は、既知のバイオエラストマーの特性を決定し（又は調査し）、類似
しているが異なるバイオエラストマーを作成し、本明細書並びに引用された特許
及び特許出願に記載のようにして転移温度及び物理的特性を測定することから開
始する経験的な過程により達成されうる。Ｔ_tの値に対するアミノ酸組成物の変化の影響も、米国特許出願第０８／１８７，４４１号に詳細に記載された疎水性
尺度を用いて決定されうる。例えば、重合体の単量体単位内の個々のアミノ酸残
基の平均疎水性を合計し、その結果を既知の転移温度を有する重合体について得
られた合計と比較することにより、推定転移温度のおおまかな推測が得られうる
。典型的には、疎水性の高い残基（例えば、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ）はＴ_tを低下させ、疎水性の低い残基（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ）及び極性残基（例えば、Ａｓｐ
、Ｌｙｓ）はＴ_tを上昇させる。

【００５４】脱リン酸化／リン酸化、酸化還元対の還元／酸化、イオン化／脱イオン化、プ
ロトン化／脱プロトン化、開裂／ライゲーション、アミド化／脱アミド化、コン
ホメーション又は立体配置の変化（例えば、シス−トランス異性化）、電気化学
的変化（例えば、pKaシフト）、遊離／吸収のような、重合体の平均疎水性を変化させる任意の化学的手段、あるいは他の物理的変化（例えば、熱エネルギー放
射／吸収）、もしくは圧力、又はそれらの組み合わせが、転移を起こすために用
いられうる。本発明者の研究室からの米国特許第５，２２６，２９２号は、圧力
関連効果を、米国特許出願第０８／１８７，４４１号は光応答性効果を、及び米
国特許出願第０８／４８７，５９４号は電気応答性効果を詳述しており、これら
はそれぞれ転移を起こすために用いられうる。

【００５５】バイオエラスチック・ポリペプチドの主要な利点は、疎水性／極性の程度及び
得られる逆温度転移におけるシフトの微調整が達成されうる範囲である。例えば
、重合体全体の疎水性（そして、従って、重合体中に存在する官能基の平均疎水
性）は、異なる型の単量体単位の比率を変化させることにより修飾されうる。こ
れらは、転移を受ける官能基を含有する単量体単位又は重合体中に存在する他の
単量体単位でありうる。例えば、基本単量体単位がＶＰＧＶＧ（配列番号１７）
であり、転移を受ける単量体単位がＶＰＧＸＧ（配列番号１９）〔ここで、Ｘは
電気応答性側鎖を有するよう修飾されたアミノ酸残基である〕であるならば、Ｖ
ＰＧＶＧ単位とＶＰＧＸＧ単位との比率を変動させるか、又は適当な転移温度が
達成されるまで、ＩＰＧＶＧのような異なる構造単位を、量を変動させながら含
ませることができる。さらに、タンパク質及びタンパク質ベースバイオエラスチ
ック重合体の構造の規則性は、構造成分の最適な編成を可能にする。例えば、骨
格中に（即ち、一次構造に基づき）カップリングした残基を相互に隣接して配置
することにより、そして、ターン間の近接を提供するための位置づけによっても
、最適な空間的近接が達成されうる。

【００５６】バイオエラスチック重合体は、付加的な特性を得るため、様々な方法で修飾さ
れうるマトリックスを形成するペプチド単位からなる。例えば、ペプチド結合の
うちの一つ又は複数が、還元又は排除により得られるもののような代替的結合に
、場合により交換されうる。従って、当分野において既知の方法により、−ＣＯ
ＮＨ−ペプチド結合のうちの一つ又は複数が、−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂Ｓ−、−
ＣＨ₂ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ₂−、−ＣＨ（
ＯＨ）ＣＨ₂−、及び−ＣＨ₂ＳＯ−のような他の型の結合に交換されうる。一般
的な概説については、Spatola, A. F.（1983）アミノ酸、ペプチド、及びタンパ
ク質の化学及び生化学（Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptide
s and Proteins）（B.Weinstein編）Marcel Dekker, New York, 267頁を参照のこと。アミノ酸残基はこれらの重合体骨格の好ましい構成成分である。当然、エ
ラストマー様単位において骨格修飾がなされる場合には、適当な骨格修飾は重合
体の弾性及び逆温度転移が維持されるものである。

【００５７】当業者には明らかなように、バイオエラスチック重合体の物理的特性は、所望
の特徴、例えば粘性、粘稠度、弾性率、安定性などを示すよう、前記のようにし
て調整されうる。例えば、親エラスチックタンパク質ベース重合体（ＧＶＧＶＰ
）_n（配列番号２０）は、ｎが２００のオーダーで調製され、（下記の）２０Ｍｒａｄのγ線照射により架橋される場合、１０⁵ Ｎ／ｍ²の範囲で、天然の血管壁の弾性率に近い弾性率を有する弾性マトリックスを形成する。組成及び条件の
変動により、弾性率は１０⁴〜１０⁸ Ｎ／ｍ²まで変動しうる。これは、広範囲の
生物学的軟組織にわたるコンプライアンスにマッチする能力を提供する。他の実
施態様において、ポリペプチドの一次配列は、線維性被膜形成を誘発し、それに
より注射部位に重合体を維持するよう設計されうる。特定の重合体は、被検対象
における移植期間後に、当分野において既知の方法により、例えば視覚的に、そ
の線維性被膜形成促進能について調べられうる。好ましい実施態様において、線
維性被膜形成を誘発しない例示的重合体は、Ｘ²⁰−ポリ（ＧＶＧＶＰ）である（
Urry, et al., J. Bioactive Compatible Polym. 6:263-282 (1991)）。放射線架橋により調製されるこの明細書に記載の重合体は、例えば、架橋を形成するた
め２０Ｍｒａｄ線量のコバルト−６０放射線を照射され、それにより不溶性マト
リックスを生じた、ＶＰＧＶＰペンタペプチド単位から調製された重合体をさす
、「Ｘ²⁰−ポリＶＰＧＶＰ」として同定される。注射可能な架橋されたコアセル
ベートは、通常２０Ｍｒａｄ未満、しばしば１０Ｍｒａｄ未満、さらには５Ｍｒ
ａｄ未満という、はるかに低い放射線量により得られるであろう。

【００５８】もう一つの好ましい実施態様において、Ｘ²⁰−ポリ〔０．７５（ＧＶＧＶＰ）
，０．２５（ＧＦＧＶＰ）〕（配列番号２０及び４９）のようなフェニルアラニ
ン（Ｐｈｅ、Ｆ）残基を含む重合体は、炎症を発生させることなく移植後に線維
性被膜形成を促進する。同様に、もう一つの好ましい実施態様において、ポリ〔
０．６（ＧＧＶＰ）、０．４（ＧＧＦＰ）〕（配列番号４１及び４２）の皮下注
射は、線維性被膜形成を誘発する。下記の実施例１は、（ＧＧＶＰ）₃ＧＧＦＰ（ＧＧＶＰ)₃ＧＧＦＰ（ＧＧＶＰ)₃ＧＧＦＰ（配列番号９）を有する、そのよ
うな重合体を例示する。

【００５９】重合体の特徴は、架橋によっても影響を受ける。従って、本発明において用い
られる重合体は、所望により任意の様々な架橋過程、例えば、化学的過程、酵素
的過程、又は放射性過程を用いて、注射の前、間、又は後に架橋されうる。架橋
は、重合体に機械的な強度及び剛性を提供し、架橋の量の増加は硬さの必要性の
増加に適している。ほとんどの好ましい重合体は、注射の前にほとんど又は全く
架橋を有しないが、繰り返し単位２００〜５００個当たり１個の架橋を提供する
架橋が一般的に許容され、粘性の低い重合体においてはより多い架橋が許容され
、その逆も許容される。バイオエラストマー様ポリペプチドを架橋するための方
法は当分野において既知である。例えば、参照として本明細書に組み込まれる米
国特許第４，５８９，８８２号は、酵素的に架橋可能な単位を有するブロック重
合体を合成することによる酵素的架橋を教示する。さらに、放射線による架橋は
本発明者の研究室から生まれた先行特許のほぼ全部に詳細に記載されている。

【００６０】注射部位に重合体を維持するため、その場所での（in situ）架橋も、用いられうる（Kagan, et al., J. Biol. Chem. 255:3656-3659 (1980)）。本発明のこ
の面において、架橋は増強が必要である部位に起こり、重合体の架橋は分子間及
び／又は周囲組織に起こり、組成物を適所に固定する。例えば、ジスルフィド架
橋を介した表面への結合を可能にするため、重合体にシステインを導入すること
ができ、又はコラーゲン及びエラスチンを架橋する天然の細胞外酵素を用いた表
面への酵素的結合のため、リシンを導入することができる。以下の実施例２は、
架橋酵素リシルオキシダーゼのための証明された基質であるＬｙｓ（Ｋ）残基を
配列内に含有する、そのような重合体、（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＫＧＶＰＧＶＧＶＰ
ＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ（配列番号１０）を例示する。

【００６１】注射部位に重合体を維持するためのもう一つの手段は、細胞接着配列の内含を
含む（Nicol, et al., J. Biomed. Mat. Res. 26:393-413 (1992)）。

【００６２】バイオエラスチック重合体は、場合により、例えば、単量体単位間の単一アミ
ノ酸の挿入、いくつかの単量体での１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換又は
弾性率における強度を増加させるため、又はいくつかの他の所望の特徴を提供す
るための、同時にかもしくは順次に付加されうる異なるポリペンタペプチド、ポ
リヘキサペプチド、もしくはポリテトラペプチド配列の内含も有する。米国特許
第４，４７４，８５１号及び第５，０６４，４３０号を参照のこと。従って、得
られる重合体は、異なる単量体単位から形成されているため、適切には共重合体
として知られる。

【００６３】かけられた橋かけセグメントが介在する複数のβターンが弾性を保存するため
に保持される限りにおいて、得られる重合体中の様々な位置に存在するアミノ酸
のかなりの変動も可能である。この理由のため、ポリペプチドの少なくとも５０
％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％が、
繰り返し単量体単位から形成されることが好ましい。にもかかわらず、他の目的
のために設計されたペプチドセグメントを含有する、より大きなポリペプチド全
体に、これらの単量体単位が散在しているポリペプチドを調製することが可能で
ある。例えば、バイオエラストマーは、結合組織の成分であるか、又は生物学的
活性、走化性、細胞のターゲティング及び／もしくは接着、薬物付着、もしくは
プロテアーゼもしくはヌクレアーゼに対する感受性のような機能を部分的に有す
る、天然に存在する配列を含有しうる。配列は、所望の機能を提供するため、共
有結合的に、そして連続的に、又は側鎖として付加されうる。これらの他の配列
と単量体残基との比率は、１：２〜１：５０００の範囲でありうる。好ましくは
、比率は１：１０〜１：１００である。置換基の数及び種類の上限は、弾性重合
体が緩和状態におけるベータスパイラルを獲得するために適切に折り畳まれ／集
合する能力によっても影響を受ける。

【００６４】例えば、実施例３は、弾性マトリックス（ＧＶＧＶＰ)₁₀ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀（配列番号１３）を生じるための、フィブロネクチン由来の細胞接着配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するタンパク質ベース重合体、を
例示する。細胞接着、細胞伸展、及び成長を促進するマトリックスのさらなる例
は、Ｘ²⁰−ポリ〔４０（ＧＧＡＰ）、（ＧＲＧＤＳＰ）〕（配列番号２１）及び
ポリ〔２０（ＧＶＧＶＰ）、（ＧＲＧＤＳＰ）〕（配列番号５３）である（Nico
l,et al.,「細胞接着配列含有バイオエラスチック材料の細胞接着特性（Cell Ad
hesive Properties of Bioelastic Materials Containing Cell Attachment Seq
uences）」,Biotechnol.Bioactive Polym, (Charles G.Gebelein and Charles E
. Carraher, Jr.,編), Plenum Press, New York, 95-113頁（1994）。そのような重合体は、細胞（例えば、線維芽細胞）が、マトリックスへ移動及び付着する
こと、並びにマトリックスがその機能的役割において受ける張力を感知すること
を可能にし、それにより、組織が適当に機能するために必要な力を支持するため
、天然細胞が組織を再生することを可能にする。従って、増強が必要な部位に重
合体を維持し、長期的な増強を生じるため、組み合わせて用いられうる、多数の
方法が存在する。

【００６５】高分子量の重合体を良好な収率で得るため、多数の手段が利用可能である。バ
イオエラスチック繰り返し単位の合成は、ペプチド化学者により、又は微生物発
酵における標準的な方法により、単純に容易に達成される。例えば、重合体の有
機合成は背景の項に挙げられた特許に記載されている。特に、ポリ（ＧＶＧＶＰ
）の合成及び架橋は、米国特許第４，７８３，５２３号に記載されている。ポリ
（ＩＰＧＧ）の合成は、米国特許第５，２５０，５１６号に記載されており、ポ
リ（ＧＧＡＰ）の合成は、米国特許第５，５２７，６１０号に記載されている。
従って、これらの特許の教示は、異なる単量体単位を有するバイオエラスチック
重合体の合成に適用されうる。化学合成により重合体を作製する場合には、低レ
ベルの不純物が重合過程の終結、又は得られる重合体の物理的特性を変更しうる
ラセミ化を引き起こす可能性があるため、不純物を回避するよう注意すべきであ
るが、それが起こらなければ、合成の特定の問題は存在しない。ペンタマーの調
製における小さな変化が、転移温度の１５℃もの変動を引き起こす可能性がある
ため、適当な物理的特性を有する材料の入手において、ペプチド単位純度は重要
である。２５℃の転移温度を有する重合体は３７℃において注射可能であろうが
、４０℃の転移温度を有する調製物は組織増強のための所望の特性を有しないか
もしれないため、この変動を考慮することは重要である。この潜在的な問題の解
決は、単純に、ペプチドを調製するために用いられる成分を精製することである
。

【００６６】純粋な、又は実質的に純粋な本発明のバイオエラストマーは、生物学的に不活
性であることが見出されている。しかし、純粋でないバイオエラストマーであっ
ても、本発明の方法において利用できることが見出された。例えば、純粋でない
（ＧＶＧＶＰ）２５１（配列番号１８）が、線維性被膜を形成するために十分な
組織反応を誘導し、それにより容量を維持すること、即ち本発明の組織増強法に
とって必要な、注射後の非有意な容量変化が見出された。

【００６７】重合体は、単独重合体又は共重合体として調製されうる。単量体単位のうちの
少なくとも２つから調製されるランダム共重合体又はブロック共重合体は、本発
明の方法において有用であるが、単に合成がより複雑であるため、等価な単独重
合体が所望の物理的特性を有する場合にはあまり好ましくない。バイオエラスチ
ック重合体が合成される方法に関わらず、これらは所望によりさらに誘導体化さ
れうる。例えば、米国特許出願第０８／１８７，４４１号及び第０８／４８７，
５９４号に記載のように、光応答性又は電気応答性の側鎖を重合体に組み込むこ
とができる。

【００６８】タンパク質ベース重合体は、遺伝子工学技術を用いても調製されうる。この手
段を用い、所望のペプチド配列をコードする遺伝子が構築され、人工的に宿主生
物に挿入され、次に翻訳される。生物は、原核生物、例えば細菌であっても、又
は真核生物、例えば酵母もしくは植物であってもよい。適当な宿主生物における
効率的な遺伝子発現のため、遺伝情報（即ち、ＤＮＡ配列）を操作するための技
術は、分子生物学の分野において既知であり（例えば、Sambrook et al., Molec
ular Cloning：A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor, New York
(1989)を参照のこと）、ポリヌクレオチドを開裂、接合、コピー、又はさもなけ
れば修飾することができる酵素の使用を含む。さらに、発現のため適当な様式で
この情報を宿主生物へ導入することを可能にするベクターは、分野において既知
である。ポリＶＰＧＶＧの作製の詳細な例は、本発明者の研究室から生まれた出
版物、McPherson, et al., Biotechnol. Prog. 8:347-352 (1992)に記載されている。この出版物は、本発明において用いられる任意の材料の遺伝子基盤作製の
指針として用いられうる。２０００個ものアミノ酸残基を有する重合体が、適当
なE.coli株により良好な量で発現された。例えば、（ＧＶＧＶＰ)₁₂₁（配列番号
４０）の発現は、E.coli細胞容量の８０％のレベルで起こった。従って、これら
のタンパク質ベース重合体の作製の費用は、合成有機重合体及び十分な精製を必
要とする天然の材料と競合する。産業的タンパク質の作製者は、生物学的に作製
されたタンパク質の費用を有意に減少させうることを証明した。当然、高純度を
必要とする医学的適用は、医学的に重要な適用のためのより高い費用を許容しう
る。例えば、尿失禁を寛解させることを目的としたコラーゲン含有生成物コンチ
ゲン（Contigen）（登録商標）の費用は、１グラム当たり１０００（ＵＳ）ドル
の範囲であると理解される。

【００６９】バイオエラスチック・ポリペプチドは、逆温度転移を受ける能力により、例え
ば、発酵リアクターにおいて成長した培養物から、又は有機合成から精製されう
る。この方法を用いると内毒素レベルが特に減少することが証明されているため
、微生物系において発現した遺伝子工学重合体には、タンパク質ベース重合体の
逆温度転移特性を用いた精製が好ましい。

【００７０】バイオエラスチック・ポリペプチド組成物は、組織インプラントとして生体適
合性であり、容易に滅菌可能である。本明細書において用いられるように「生物
適合性」とは、移植が、修正される欠陥と同等又はそれ以下の有害性を有する程
度に、移植される生物又は細胞に最終的な形態で害を与えない材料に関する。生
物適合性は、当業者に既知の多数の方法により確認されうる（Picciolo, et al.
,「バイオテクノロジー由来生体材料は化学発光により測定される宿主細胞の反応性酸素産生を調節する（A Biotechnology-derived Biomaterials Modulate Ho
st Cell Reactive Oxygen Production as Measure by Chemiluminescence）」,1
9th Annual Meeting,Society for Biomaterials, Birmingham, AL (1993)；Urry
, et al., Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 292:253-264 (1993)；及びHoban, et a
l., J. Surgical Res. 56:179-183 (1984)）。例えば、バイオエラスチック材料
が免疫応答を誘発することができるか否かが決定されうる。好ましくは、バイオ
エラスチック組成物は非免疫原性である。本明細書において用いられるように「
非免疫原性」とは、投与されたときに、実質的な免疫応答、炎症、又は異物反応
を惹起しない材料に関する。目的とする宿主又は代替被検動物に材料を移植し、
移植後の多数の時点において何らかの有害反応についてインプラントを観察する
ことにより、生体適合性に関して材料を試験することもできる。

【００７１】バイオエラスチック・ポリペプチド組成物は、生分解性であるよう選択されう
る。本明細書において用いられるように「生分解性」とは、材料が（例えば、プ
ロテアーゼを含む）酵素の作用又は他の生物学的過程により分解され、正常な生
体過程に適合する非毒性の物質又は副産物を生じる可能性をいう。材料が生分解
性である程度は、特定の指示により変動しうる。そのようなバイオ重合体が無害
に作用する傾向は、組織増強が必要な部位にこれらの重合体を注射し、それらを
数日間、数週間、又はそれ以上にわたり体内に残留させることを可能にする。重
合体の安定性は、当業者には明らかなように、重合体の適当な設計により調節さ
れうる。例えば、重合体のプロテアーゼ、又は欧州特許第０４４９５９２号もし
くはその対応する米国出願に記載の「ケミカル・クロック（chemical clocks）」に対する感受性を増加させるため、重合体の一次配列にプロテアーゼ開裂部位
を含ませることが可能である。

【００７２】本発明の注射可能組成物は、形成外科において、例えば組織再構築又は皮膚増
強（例えば皮膚のしわを充填し、皮膚表面のための支えを提供するため）、括約
筋増強（例えば、尿失禁の回復のため）、細胞の送達、腫瘍血管遮断、腫瘍療法
、及び避妊／不妊治療のため有用である。例えば、腹圧性尿失禁の問題は、膀胱
の基底に尿道周囲膨張能を追加することにより克服されうる。単純に、（ＧＶＧ
ＶＰ₄、ＧＥＧＶＰ₁）（配列番号２２）重合体のＧｌｕ（Ｅ）残基をこのための
ＡｒｇＧｌｙＧｌｕ配列（ＧＲＧＤＳＰ細胞接着配列（配列番号４６）由来）と
交換することにより、重合体の皮下注射は、単純に見えなくなるというよりも、
正常な弾性線維及びコラーゲン線維の分布を有する天然組織の再生又は回復を引
き起こす。同重合体組成物を用いて、天然の膀胱の弾性率とマッチする弾性率を
有するマトリックスを形成させるため架橋し、その上に尿道上皮細胞（uroepith
elial cells）を含有するヒト尿道外植片を置くと、細胞がマトリックス上にと成長するが、膀胱充填と排泄との張力変化を刺激することにより、成長はより高
密度の細胞及び細胞外マトリックスへと刺激される。

【００７３】特に有用な技術は、椎間板における分解又は損傷を受けた髄核の交換である。
本明細書に記載のバイオエラスチック重合体は、枯渇した髄核への圧力応答性細
胞刺激バイオエラスチック材料の関節鏡下移植により、疾患のある椎間板の回復
に用いられうる。この手段において、プロテーゼは、回復される組織の機械的特
性とマッチすべきであり、好ましい実施態様において、それは、組織の正常細胞
が接着する細胞接着部位を含有すべきである。

【００７４】本発明のこの実施態様において、哺乳動物における椎間板の組織回復のための
方法は、部位温度を有する枯渇した髄核部位に、ノナペプチド、ペンタペプチド
、及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰り返しペプチド単
量体単位を含む重合体を注射する工程を含む（ここで、該単量体単位はβターン
間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された一連のβターンを形成し
、該重合体は該部位温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有し、該重合体は付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液として注射され、膨潤して該
板内の圧力を増加させる）。

【００７５】典型的には、内視鏡下椎間板切除又は他の経皮的手法において、商業的に入手
可能な内視鏡下椎間板切除装置により、椎間板から分解又は損傷を受けた髄核が
除去される。最初に、トロカールを用いて輪に孔を作成する。次に内視鏡下椎間
板切除装置を孔から挿入し、髄核を除去する。本発明のバイオエラストマーの注
射は、大きなシリンジにより、又は髄核により開けられた空間へのバイオエラス
トマーの填充及び輸送を提供するための修飾された椎間板切除装置により、予め
形成された孔を通して部位へ注射される。

【００７６】本発明のもう一つの実施態様において、哺乳動物における椎間板の組織回復の
ための方法は、部位温度（Ｔ_s）を有する枯渇した髄核部位に、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる群より選択されるた繰り返しペプチド単
量体単位を単独で、又は組み合わせて含む重合体を注射する工程を含む（ここで
、単量体単位はβターン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された
一連のβターンを形成し、（ｉ）重合体はＴ_sより低い逆温度転移Ｔ_tを有し、（
ii）重合体は付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液とし
て注射され、板内で膨張して圧力を増加させ、（iii）コアセルベートは５×１０⁴〜５×１０⁶ Ｎ／ｍ²の範囲内のＴ_sにおける弾性率を有する）。

【００７７】最初に、（圧力応答性、粘エラスチックタンパク質ベース重合体である）選択
されたバイオエラスチック材料は、妥当な膨潤圧を生じる状態で、枯渇した髄核
における関節鏡下定置により、適当な寸法を回復するように設計される。即ち、
それらは、圧縮された板のその妥当な寸法及び内部圧への機械的回復の目的のた
め、移植時に膨圧を発生させることができるよう設計される。第二に、板が改善
された構造的／機能的状態にある間、組織の再生又は回復を誘導するため、場合
により（そして、好ましくは）生物学的に活性な配列を配列内に含ませることが
でき、即ち、それらは、椎間板の、より天然の状態への組織再生を刺激すること
ができるよう設計される。一時的な機能的足場として作用する機械的に妥当なマ
トリックスへの細胞の複数の接着により、機能的人工的マトリックスにより支持
された機械的圧力は細胞へ適当に伝達されるであろう。細胞はそれらが感知する
力の変化に応答する機械化学的伝達物質であると考えられているため、この細胞
による機械的感知は、これらの力を支持するのに十分な天然組織へのマトリック
スの化学的リモデリング（即ち、必要な細胞外マトリックスの同化）を生じるで
あろう。この適用にとって特に重要な重合体は、限定ではなく例示のため、（Ｇ
ＶＧＩＰ)_n（配列番号５１）及び〔（ＧＶＧＩＰ)₁₀〕_n（配列番号５６）、そし
てさらに〔（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＫＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ〕_n（配列番号５４）、〔（ＧＶＧＩＰ)₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＩＰ)₁₀〕_n（配列番
号５７）、〔（ＧＶＧＩＰ)₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀〕_n（配
列番号５８）、〔｛（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＦＧＶＰ｝₃〕_n（配列番号５９）、及び〔
（ＧＶＧＩＰ)₁₀ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰ
ＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ)₂〕_n（配列番号６０）である。

【００７８】先に示したように、Ｔ_tの値は多数の要因に依存し、従って、椎間板のための内部圧を維持するために必要なエネルギーを含む、多様なエネルギー変換を実施
するためにＴ_t値をシフトさせることができる。

【００７９】張力変化に関連して、この細胞の機械化学的伝達特性は、「細胞テンセグリテ
ィー（cellular tensegrity）」と呼ばれている（Ingber, Int. Rev. Cytol. 15
0:173-224（1994）及びIngber, J. Cell Sci. 104:613-627 (1993)）。しかし、
それは、圧力及び張力の両方を含む、より一般的な概念である。最近の研究は、
椎間板の細胞が機械化学的伝達物質であり、適用された圧力に関する適当な機械
的エネルギーのインプット、及び圧力の揺らぎの時間経緯が、椎間板の細胞の化
学的アウトプットを指図することを示している（Ishihara, et al., J. Appl. P
hysiol. 80(3):839-846 (1996)）。

【００８０】もう一つの重要な側面は、吸湿性粘エラスチックタンパク質ベース重合体の定
置により発生した静水圧を維持する、疾患のある板の能力である。剖検標本にお
ける研究は、板が大きな変性を受けていない限りにおいて、髄核が流体静力学的
に作用することを示している（Nachemson, et al., J. Bone Jt. Surg. Am. 46A
: 1077-1092（1964）及びNachemson, Acta Orthop. Scandinavica, Suppl. 43:1
-104 (1960））。線維輪の外側腱靱帯（tendinous bands）は、静水圧が増加すると、増加した張力を受けるが、内側環は圧力を受ける。さらに、圧縮応力の検
査は、椎間板が液体が充填された圧力管（pressure vessels）として作用するこ
とを示した（Nachemson, et al., J. Bone Jt. Surg. Am. 46A:1077-1092 (1964
)）。これらの２つの観察は、椎間板回復のためのタンパク質ベース重合体を設計するために取られる手段の要因となる。

【００８１】椎間板回復に有用な重合体の設計及び／又は選択において重要な、本明細書に
記載の粘エラスチックタンパク質ベース重合体の２つの圧力感受性面が存在する
。一つは、（ＧＶＧＩＰ)₂₆₀（配列番号５５）により証明され、もう一つは芳香
族残基の存在によるＴ_tによる圧力感受性の導入により証明された。これは、実施例でさらに詳細に説明される。

【００８２】硬組織の修復のため（例えば、骨欠陥修正のための鉱物添加剤、又は石灰化も
しくは骨形成を促進するための骨形成因子を含む骨生成因子）、又は注射の近傍
における細胞成長を増強するため（例えば、細胞成長もしくは細胞誘因因子、宿
主適合性細胞、又は成長因子）、付加的な生物学的に重要な因子が追加されうる
。所望の効果を達成するために組成物に添加される鉱物の適当な量の選択は、医
師により望まれる、かつ／又は傷害もしくは欠陥により必要とされる結果を達成
するため（必要に応じて剖検組織の分析的分析により補助されて）医師により通
常なされるため、医学的実務者にとって明白であり、本発明の要件ではない。そ
のような因子は、本発明そのものにとって補足的であり、多くの場合において必
要とされ望ましいものではなく、場合によるものである。

【００８３】注射されるバイオエラスチック材料は、注射前に薬学的に許容される液体担体
に溶解又は懸濁されうる。適当な液体の例は、生理学的緩衝塩溶液、水、グリセ
ロールなどを含み、例えば、血清、成長因子、ホルモン、糖、アミノ酸、ビタミ
ン、金属タンパク質、リポタンパク質などが追加されていてもよい。担体の大部
分は、上で論じたように注射の前に除去されるであろうが、多少は最終的な注射
可能組成物中に残存してもよい。従って、本発明において用いられる組成物は、
天然組織の治癒又は再成長を補助するための生物学的に活性な一つ又は複数の因
子をさらに含む。例えば、ヘパリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォー
ミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、血小板由来成長因子、線維芽
細胞成長因子、結合組織活性化ペプチド、β−トロンボグロブリン、インスリン
様成長因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリスロポ
エチン、神経成長因子、インターフェロン、骨形成因子を含む骨生成因子などの
ような因子を組み込むことができる。そのよう因子及び因子の適当な組み合わせ
の組み込みは、組織治療を助長することができる。そのような因子の使用の決定
は、典型的には、修復される傷害又は欠陥に関する判断に基づき、治療にあたる
医師によりなされる。

【００８４】同様に、細胞とバイオエラスチック重合体とを含む混合物を増強の必要がある
部位に注射することができる。拒絶を引き起こす移植片／宿主相互作用を回避す
るため、細胞は、好ましくは注射を受ける宿主由来、又は充分に関連した細胞起
源由来の、ヒト細胞を含む生存細胞である。細胞は、自己、同系、同種異系、又
は異種であってよく、より好ましくは自己又は同種異系である。遺伝子工学的細
胞が含まれる。バイオエラスチック組成物は、異なる細胞型を含有することがで
き、それらは、例えば組織の形成において、協調作用するよう選択されうる。細
胞型の例は、筋肉細胞、神経細胞、上皮細胞、結合組織細胞、及び臓器細胞を含
む。細胞の特定の例は、線維芽細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、神経
細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、骨前駆細胞、骨髄細胞、血液細胞、脳細胞
、腎細胞、肝細胞、肺細胞、膵細胞、脾細胞、乳房細胞、包皮細胞、卵巣細胞、
精巣細胞、及び前立腺細胞を含む。他の哺乳動物細胞は、本発明の実施において
有用であり、本明細書における考慮から排除されない。又は、注射可能バイオエ
ラスチック組成物は、非哺乳動物真核細胞、原核細胞、又はウイルスを含みうる
。

【００８５】本発明は、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。そのようなキッ
トは、容易に入手可能な材料及び試薬から調製され、多様な実施態様をとりうる
。例えば、そのようなキットは、少なくとも一つの治療にとって十分な量で、以
下の材料のうちの任意の一つ又は複数を含む：バイオエラスチック重合体、容器
、無菌緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）又は水、方法を実施するために
必要又は有益な他の試薬、及び説明書。典型的には、説明書は、使用者が前記方
法を実施することを可能にするため、試薬濃度、又は用いられる試薬の量、試薬
の維持期限などのような少なくとも一つの方法パラメータを記載した具体的な表
現を含む。本発明の好ましい実施態様において、キットは、バイオエラスチック
重合体が置かれている輸送手段を含み、それら両方はしばしば予め殺菌されてい
る。そのような手段は、限定ではなく例示のため、小型シリンジ（２２から２７
ゲージ）、大型シリンジ（１３から１９ゲージ）、及び内視鏡下又は経皮的椎間
板切除手法において用いられる装置を含みうる。試薬は、独立に、又は使用の容
易性を改善するための成分と混合されて、溶液中に、懸濁液として、又は実質的
に乾燥した粉末として、例えば凍結乾燥形態で提供されうる。分解性試薬が提供
される場合には、試薬を安定化するための条件、例えば低温における貯蔵、安定
剤（例えば、グリセロール又は還元剤）の添加が選択される。不安定な試薬は、
キットのより安定な成分と共に、又は別々に提供されうる。

【００８６】キットの特に好ましい実施態様は、シリンジ（小型又は大型のいずれか）、シ
リンジを包囲し、シリンジのための無菌環境を提供する無菌の包装材、及びシリ
ンジに含まれた重合体（ここで、重合体はノナペプチド、ペンタペプチド、及び
テトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰り返しペプチド単量体単
位を含み、単量体単位はβターン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分
離された一連のβターンを形成し、重合体は組織温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有する）を含む、正常な組織温度を有する組織の増強のためのキットである。重
合体は、付加的な水が実質的に存在しない溶液又は水溶液のいずれかとしてシリ
ンジ内に存在しうる。重合体が溶液で存在する場合、重合体は低温においては通
常コアセルベートの形態ではなく溶液であるため（前記のようにＴ_t値による）、重合体を安定化するため、シリンジ及びそれが含有する重合体は低温で維持さ
れる。そのような場合、コアセルベートは、コアセルベートの注射前に、シリン
ジから過剰水（ここでは、コアセルベートからの分離相）が排出された後、シリ
ンジ及び重合体の温度をＴ_tよりも高く上昇させることにより形成される。そのような使用の例は、以下に記載されている。

【００８７】以下の実施例は、当業者のために本発明を例示し、本方法の説明を提供するた
め、本発明の特定の面を記載している。実施例は、単に、本発明の理解及び実施
において有用な特別な方法論を提供するものであり、本発明を制限するものと解
釈されるべきではない。

【００８８】

【実施例】

エラスチックタンパク質ベース重合体の調製は、下記の特定の実施例について
の記載のようにして、遺伝子構築、発現系の開発、発酵、及び精製を利用する。
遺伝子構築に関しては、（発現に用いられるベクター内に存在する制限部位の考
慮のような、標準的な技術を用いて選択された）適当な制限部位配列を含む適当
な付着末端を有するよう、基本単量体遺伝子を設計した。基本遺伝子の重合は、
制限エンドヌクレアーゼ消化により適合性付着末端を生成させた後、ＤＮＡリガ
ーゼを用いてライゲーションを行い、基本遺伝子の多量体を形成させることによ
り実施した。このプロトコルを用いて、各単量体遺伝子配列を作製することに成
功した。次に、単量体をコンカテマー化（重合）し、多くの異なる繰り返し数を
有する多量体遺伝子を形成させ、多量体遺伝子の多くは以下に簡単に報告するよ
うに高レベルに発現した。

【００８９】実施例１フェニルアラニン含有テトラマー・バイオエラスチック材料この実施例は、有意な炎症応答なしに線維性被膜形成を誘発することができる
フェニルアラニン含有バイオエラスチック材料を例示する。一般的に、この特定
の構築物のため用いられるプロトコルは、本明細書に記載の他のタンパク質エラ
ストマーに適用可能である。標準的なアミノ酸略記が、本実施例及びこの明細書
の他の部分で用いられる（フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦと略記される）。

【００９０】線維性被膜形成は重合体の移動を阻害し、従って長期的な組織増強を提供する
。この実施例１の重合体は、（ＧＧＶＰ)₃ ＧＧＦＰ（ＧＧＶＰ)₃ ＧＧＦＰ（Ｇ
ＧＶＰ)₃ ＧＧＦＰ（配列番号９）〔ここで、ｎは一般的に１から６０、通常１０から５０、好ましくは２０から４０である〕である。重合体は、約２０℃のＴ _t を有し、従って３７℃におけるコアセルベート形成を確実にする。重合体は３７℃において安定であり、押し出し可能である。

【００９１】ａ．遺伝子構築（ＧＧＶＰ)₃ ＧＧＦＰ（ＧＧＶＰ)₃ ＧＧＦＰ（ＧＧＶＰ)₃ ＧＧＦＰ（配列番号９）の基本単量体遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて構築した。 5′-GAG GAT CCG AAG ACA ACA GGT GGT GTT CCG GGC GGC GTA CCG GGT GGC GTA CCG GGC GGT TTC CCG GGA GGT GTG CCG GG T GGG GTT CCA GGC GGT GTA C-3′ (SEQ ID NO:23) 及び 5′-CTG GAT CCG AAG ACT TCC TGG AAA ACC GCC CGG CAC GCC ACC CGG AAC TCC ACC CGG AAC ACC GCC CGG AAA CCC ACC CG G TAC ACC GCC TGG AAC CCC A-3′ (SEQ ID NO:24)

【００９２】図１に例示された二本鎖単量体遺伝子（配列番号１）を与えるため、３′末の
２０塩基対相補的領域を介してオリゴをアニールし、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ
及び遊離のデオキシヌクレオチドを用いて伸長した。この遺伝子は、両端で、制
限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩ及びＢｓｐＩの両方と隣接している。Ｂａ
ｍＨＩ制限部位を介して、基本単量体遺伝子をｐＵＣ１１８へとクローニングし
た。単量体遺伝子のクローニング及び特徴決定の後、ＢｓｐＩでｐＵＣ１１８から切り出し、重合に十分な量で精製することができた。遺伝子断片を非パリン
ドロームＢｓｐＩ末端を介して、クローニング・アダプターの存在下で、頭部と
尾部で接合するため、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションにより重合を達成
し、このようにして基本遺伝子の多量体が形成された（図３の記載と類似）。

【００９３】選択された遺伝子配列は、遺伝子セグメントが適切なリーディング・フレーム
に維持されるような、基本遺伝子配列のコンカテマー化を可能にした。ライゲー
ション条件は、遺伝子クローニングの当業者により典型的に理解される条件であ
った。基本コンカテマー遺伝子の配列を、アマシャム・ライフ・サイエンス社（
Amersham Life Science, Inc）からのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）を用いた
手法のような、常法を用いて確認した。２０００残基もの大きさのバイオエラス
チック重合体をコードする遺伝子が、この技術を用いて発現された。

【００９４】ｂ．遺伝子発現図３の記載と同様に、コンカテマー遺伝子は、ｐＥＴ−ＩＩｄのようなｐＥＴ
プラスミド（Novagen, Inc., Madison, WI）を用いて発現されうる。これらのプ
ラスミドは、組換え遺伝子発現を駆動するため、Ｔ７プロモーターと共にＴ₇ファージＲＮＡポリメラーゼを利用するＴ₇発現系の一部である（Studier, et al.
, Meth. Enzymol. 185:60-89 (1990)）。ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩでの切断により、プラスミドｐＵＣ１１８から遺伝子断片を開放し、精製した。次に、断片をｐＥＴプラスミドのＮｃｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位にクローニングし、Ｔ₇ プロモーター及びリボソーム結合配列に隣接するコンカテマー遺伝子の開始ＡＴ
Ｇコドンを置いた。

【００９５】 Escherichia coliを当分野で既知の方法によりプラスミドで形質転換し、細胞
を培養した。形質転換されたE.coliの実験台規模の培養物を成長させることによ
り、コンカテマー遺伝子の発現を分析した。イソプロピルチオ−β−ガラクトシ
ダーゼを用いて、又は用いずに、発現は誘導されうる。誘導の前及び後に採取さ
れた培養物の粗製細胞溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、ゲルのＣｕＣｌ₂染色により生成物を可視化した。

【００９６】ｃ．発酵重合体発現ＰＥＴ−ＩＩｄ誘導体で形質転換された宿主細胞を、ルリア・ブロ
ス（Luria broth）（ＬＢ）又はテリフィック・ブロス（Terrific broth）（ＴＢ）培地で成長させることにより、タンパク質ベース重合体を産生させた。タン
パク質ベース重合体の産生は、誘導剤ＩＰＴＧの添加により誘導されうる。適当
な時間数の成長の後、遠心分離により培養物を収集し、フレンチプレスにより細
胞を破壊し、細胞内容物を遊離させた（Daniell et al., Methods in Molecular
Biology Series Entitled Expression and Detection of Recombinant Genes (
1995)）。次に、フェニルアラニン含有ポリペプチド（又は、情況によっては、他のそのようなエラストマー）を、注射可能インプラントとしての使用のため特
徴決定した。

【００９７】ｄ．精製タンパク質ベース重合体は、逆温度転移特性を用いて培養物溶解物から便利に
精製されうる（Urry, et al., Handbook of Biomaterials and Applications, M
arcel Dekker, Inc., New York, 2645-2699頁（1995）；Urry, Angew. Chem. (G
erman) 105:859-883 (1993)；Angew. Chem. Omt. Ed. Engl. 32:819-841 (1993)
；及びMcPherson, et al., Protein Expression and Purification (1995)）。細胞溶解物を４℃に冷却し、高速で遠心分離し、不溶性の材料を除去した。組成
物によって、上清画分を３７℃に加温するか、又は高濃度の塩（ＮａＣｌ）に曝
すか、又はpH変化を与えたとき、タンパク質ベース重合体は大きな凝集物を形成
し、相分離（コアセルベーション）を受けた。次に、タンパク質ベース重合体を
遠心分離により除去し、適当な条件下（例えば、冷却又は塩濃度の低下）で可溶
化した。この過程を数回繰り返すことにより、本質的に全ての他のタンパク質が
除去されたタンパク質ベース重合体が生じた。遠心分離後、試料を透析し、残存
する塩を除去し、次に一次収量を決定するため凍結乾燥した。この段階で、凝集
のための温度プロフィールは下記のようにして得ることができた。

【００９８】次に、コアセルベートを再可溶化するため溶液の温度をそのＴ_tより低くした後、予備濾過工程として圧力下で０．２ミクロンの膜に通し、次に１００kDaらせん状カートリッジ（spiral wound cartridge）を使用した滅菌ベンチトップ型
アミコンプロフラックスＭ１２接線流限外濾過装置（Amicon ProFlux M12 tange
ntial flow ultrafiltration apparatus）を通した。次に、溶液を凍結乾燥させ
、アソシエーツ・オブ・ケープ・コッド社（Associates of Cape Cod,Inc）のピ
ロテル・リムラス変形細胞溶解物（Pyrotell Limulus Amebocyte Lysate）（ＬＡＬ）試験を用いて、１mg／mlの濃度で、内毒素レベルについてタンパク質ベー
ス重合体を試験した。内毒素レベルはこの段階で推奨される指針、例えば、薬物
評価及び研究、生物学的評価及び研究、装置及び放射線学的健康、並びに獣医学
的医薬品のためのセンターにより調製されたヒト及び動物の非経口薬物、生物学
的生成物、及び医療用装置のための最終生成物内毒素試験としてのリムラス変形
細胞溶解物のバリデーションに関する指針（Guideline on Validation of the L
imulus Amebocyte Lysate as an End Product Endotoxin Test for Human and A
nimal Parenteral Drugs,Biological Products,and Medical Devices prepared
by the Centers for Drug Evaluation & Research, Biological Evaluation & R
esearch, Devices & Radiological Health and Veterinary Medicine）の範囲内
であることが見出された。

【００９９】ｄ．バイオエラスチック重合体の特徴決定ｉ．生理的条件下で容量変化を得ないためのＴ_t及び濃度の決定Ｔ_tを決定するため、重合体を４℃で４０mg／mlで溶解した。冷溶液を分光計内に置き、温度を上昇させ、濁度の発生及び発達を観察した。５０％濁度が得ら
れる温度をＴ_tと定義した。

【０１００】哺乳動物への注射時に容量変化が起こらないであろう濃度を得るため、およそ
１２００mgの被検試料を５mlのシリンジ（Ｂ／ＤＲ）中に計量し、バイオエラス
チック重合体４００mg当たり１mlの容量で４℃でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し
た。溶解後、３７℃で試料を平衡化し、コアセルベート相を形成させ、過剰水を
排出させた。水を除去した後は、注射時に有意な容量変化が起こらなかった。コ
アセルベートを含有する密封されたシリンジに、滅菌のため２．５Ｍｒａｄのガ
ンマ線を照射することができる。

【０１０１】 ii．押し出し可能性の決定直前の（ａ）において調製された試料を、３７℃における平衡化の後、２２ゲ
ージ又は２７ゲージの外科用注射針から押し出すことにより、押し出し可能性に
ついてin vitroで試験した。

【０１０２】 iii．in vivo研究押し出し可能性の決定後、バイオエラスチック重合体をラットに皮下注射した
。注射後３週間及び５週間の間隔で、動物を屠殺し、（ｉ）保持された材料のお
よその容量を決定するため、顕微鏡的に、そして（ii）線維性皮膜形成の程度を
特徴決定するため、注射された材料への任意の細胞の移動の発生を決定するため
、かつ任意の炎症応答又は有害組織反応の存在を調べるため、組織学的に検査し
た。

【０１０３】典型的には、５匹のラットに、微細な（２２ゲージ）皮下注射針を用いて、０
．２ml試料コアセルベートの皮下注射により、被検物又は対照を投薬した。一方
の動物群は３週間、もう一方の群は５週間試験した。３週間又は５週間の最後に
、動物を屠殺し、組織を検査した。被検材料の位置を決定し、材料保持の程度、
そして材料のあらゆる容量変化を記録した。適所にインプラントを有する組織を
、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。各動物について試験及び対照のための
組織試料を埋め込み、切除し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。線維性
被膜の形成、及びあらゆる他の組織応答を観察するため、染色されたスライドを
評価した。各インプラントの顕微鏡的評価により、材料へのあらゆる細胞移動の
発生を調べた。動物結果は以下に論じる。

【０１０４】実施例２ in situ架橋において効率的なバイオエラスチック材料線維性被膜形成を誘発することができるＰｈｅ（Ｆ）残基に加え、この実施例
に例示される重合体は、３０残基毎に繰り返されるリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）残基も
含有する。天然細胞外酵素、リシルオキシダーゼは、極めて効率的にこの配列内
のリシンをアルデヒドへと酸化し、それによりin situ架橋を可能にする（Kagan
, et al., 前記）。得られたアリシン（allysine）、α−アミノアジピックγ−
セミアルデヒド（α-aminoadipic γ-semialdehyde）残基は、生理的条件下で、
自発的に重合体内又は周囲の組織内（例えば、細胞外マトリックスのコラーゲン
及びエラスチン）の任意の近傍リシン残基とシッフ塩基架橋を形成するか、又は
架橋のため第二のアリシンもしくはグルタルアルデヒドのような他のアルデヒド
とアルドール縮合生成物を形成する。重合体は、〔（ＧＶＧＶＰ)₂ ＧＫＧＶＰ
ＧＶＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ）〕_n ＧＶＧＶＰなる配列〔ここで、ｎは２
１である〕（配列番号２５）を有する。

【０１０５】基本重合体配列（ＧＶＧＶＰ)₂ ＧＫＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦ
Ｐ（配列番号１０）の発現及び試験は、実施例１の記載と本質的に同様に達成す
ることができたが、単量体遺伝子を構築するため以下のオリゴヌクレオチドを用
いた。 5′-GAG GAT CCA GGC GTT GGG GTA CCG GGT GTT GGC GAT CCG GGT AAA GGT GTC CCG GGG TTG GTG TGC -3′ (SEQ ID NO:26) 及び 5′-CTG GAT CCA ACG CCT GGG AAT CCG AAA CCC GGA AAG CCT ACA CCC GGC ACA CCA ACG CCC GGG ACA-3′ (SEQ ID NO:27)

【０１０６】精製過程における差異的な相分離は、本明細書に記載のＬｙｓ（Ｋ）重合体を
含有する溶液のpHを変動させることにより達成されうる。

【０１０７】実施例１に記載の特徴決定に加え、この重合体についてはin situ架橋を調べた。重合体を動物の注射部位から回収し、（実施例１に記載のもののような）回
収された対照重合体と比較した。前記Kagan,et al.,により記載されたような加水分解及びクロマトグラフィーにより、重合体を架橋についてアッセイした。ａ
−アミノ−アジピック−γ−セミアルデヒド及びアルドール縮合生成物に関する
クロマトグラフィー・ピークの観察は、重合体の架橋を示した。

【０１０８】実施例３細胞接着部位を含有するバイオエラスチック材料この実施例は、他の細胞が接着し、伸展し、コンフルエンスに成長することが
できる、繰り返し現れるフィブロネクチン細胞接着部位ＧＲＧＤＳＰ（配列番号
２８）を用いて設計された、およそ２６℃のＴ_tを有するポリペンタペプチドを例示する（Nicol et al., 前記（1992）；Nicol et al.,前記（1994）；及びUrr
y et al., Biotechnological Polymers: Medical, Pharmaceutical and Industr
ial Applications, 82-103 (1993)）。その配列は、細胞侵入によりインプラントの安定化を支援し、弾性線維及びコラーゲン線維の適当な分布を有する天然組
織の生成のためのバイオエラスチック材料の調製において有用である。重合体は
、（ＧＶＧＶＰ)₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀（配列番号１３）
なる配列を有する。

【０１０９】この遺伝子（ＧＶＧＶＰ)₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀ （配列番号１３）、図５のための基本重合体遺伝子の構築は、以下のプロトコルによ
り実施した。（ＧＶＧＶＰ₁₀（配列番号２９）のための基本遺伝子を、細胞接着
部位ＧＲＧＤＳＰを含有する配列が両側で基本（ＧＶＧＶＰ)₁₀遺伝子と隣接するよう構築した。これは、以下のように行った。（ＧＶＧＶＰ)₁₀の基本遺伝子を含有するｐＵＣ１１８からなるプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＰｆｌＭ１で切断し、精製のため遺伝子断片を開放した。さらに、ＰｆｌＭ１末端を有
する得られたｐＵＣ１１８プラスミドを精製し、その後の遺伝子構築物のためのクローニング・ベクターとして用いた。各重合体について、ＰｆｌＭ１遺伝子
断片及びＧＲＧＤＳＰ細胞接着配列をコードする合成二本鎖オリゴヌクレオチド
を含むライゲーション反応を行った。図３に示された配列情報により例示される
ように、ＧＲＧＤＳＰオリゴは遺伝子断片のＰｆｌＭ１末端に相補的な３塩基の
３′伸長を有する。しかし、これらのＰｆｌＭ１末端の相補的末端へのライゲー
ションにより、ＰｆｌＭ１部位はこの接合部に保存されない。ＧＲＧＤＳＰオリ
ゴはＧＶＧＶＰコーディング配列を含むことにも注意されたい。次に、前記のラ
イゲーション混合物を、ＰｆｌＭ１で分解し、連鎖ライゲーション生成物を、両
側に酵素認識部位が存在する最少の単位へと分解した。次に、消化混合物を、ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動し、切り出し及び電気溶出により適当なサイズ
（３３３ｂｐ）の断片を精製した。次に、先に生成したＰｆｌＭ１末端を有する
ｐＵＣ１１８とのライゲーションにより、これらのＰｆｌＭ１断片をクローニングした。（ＧＶＧＶＰ)₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀ （配列番号１３）のためのカテマー遺伝子を表すクローンを単離し特徴決定した。この
カテマー遺伝子は、下記のようなその後の精製及び連鎖を可能にするＰｆｌＭ１
制限部位を、その末端に有する。基本カテマー遺伝子の配列を確認するため、Ｄ
ＮＡ配列決定を実施した。これは、常法となっている、アマシャムライフサイエ
ンス社からの「シーケナーゼ（Sequenase）」キットの標準的な方法論を用いて行った。

【０１１０】前記のＧＲＧＤＳＰを含有する基本単量体遺伝子のコンカテマーを作製するた
め、ＰｆｌＭ１による切断、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離、その
後のゲルからの電気溶出により、プラスミドｐＵＣ１１８から遺伝子を遊離させることにより、必要な大量の基本遺伝子断片を調製した。次に、それらが接合
する末端からのさらなる重合体成長を終結させ、遺伝子重合体のクローニングに
必要な末端制限エンドヌクレアーゼ部位を提供することを目的とする、図８に示
されるような二本鎖オリゴヌクレオチド・アダプターの存在下、ＰｆｌＭ１末端
を介したライゲーションにより遺伝子断片を連結した。

【０１１１】この場合、連結ライゲーション生成物をＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ切断
ｐＵＣ１１８及びリガーゼと混合し、形質転換によりE.coliに挿入した。制限エンドヌクレアーゼ消化、及びコンカテマー・ライゲーション・ラダー（これに
より、複数のこの遺伝子内の基本遺伝子から特定の単離されたコンカテマー・サ
イズまでを計数することが可能であった。）を含む既知のサイズ標準との比較に
おける電気泳動により、コンカテマー・クローンを分析した。このプロトコルに
従い、１８もの大きさのｎを有する、２００３残基であるこの重合体、即ち〔（
ＧＶＧＶＰ)₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀〕₁₈ ＧＶＧＶＰ（配列番号３４）のための遺伝子を構築することに成功した。この重合体は良好なレ
ベルで発現した。しかし、注射可能インプラント研究に用いられた、この構築物
の特定の重合体のｎは、７であった。

【０１１２】ａ．質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（matrix assisted laser desorption ionization-time o
f flight）質量分析により決定した、微生物を用いて調製された重合体の分子量
は以下の通りであった。Ｉ:〔(GVGVP)₃ GKGVP (GVGVP)₂〕₃₆ GVGVP, 90,800 Da (SEQ ID NO:35) II:〔(GVGVP)₂ GKGVP GVGVP GVGFP GFGFP〕₂₁ GVGVP, 55,400 Da (SEQ ID NO:
36) III: 〔(GVGVP)₁₀ GVGVPGRGDSP (GVGVP)₁₀〕₇ GVGVP, 64,300 Da (SEQ ID NO:3
7) IV: 〔(GVGVP)₁₀ (GVGVAP)₈ (GVGVP)₁₀〕₅ GVGVP, 60,300 Da (SEQ ID NO:38) Ｖ: 〔(GVGVP)₃ GEGVP (GVGVP)₂〕₃₆ GVGVP, 〜89,000 Da (SEQ ID NO:39)

【０１１３】重合体III（６４３１４．３ピーク）及びIV（６０３４７．６ピーク）に関する代表的な質量スペクトルを図９に示す。

【０１１４】ｂ．生理食塩水におけるＴ_t pH３において、リン酸緩衝生理食塩液中２０℃、pH７．３において、重合体Ｉ
、３９℃；重合体II、４℃；重合体III、２９℃；重合体IV、２８℃；重合体Ｖ、５８℃。

【０１１５】ｃ．コアセルベート濃度及び押し出し可能性ＩからＶまでの全ての重合体のコアセルベート濃度（生理的条件下での重合体
の天然濃度）は、４００mg／mlのオーダーであった。生物学的負荷（bioburden ）を予防するための２．５Ｍｒａｄ滅菌後に、２３ゲージの皮下注射針から押し
出し可能であった濃度は、Ｉ、３２２mg／ml；II、２４２mg／ml；III、３５０m
g／ml；IV、２３３mg／ml；Ｖ、３００mg／mlであった。これらの高濃度の押し出し可能性の利点は、注射可能インプラントの容量充填結果が、注射後の短期間
に、より限定された、組織への水除去による容量変化を示すであろうことである
。コラーゲン注射は、通常、水取り込みによる実質的な容量損失が起こる５０mg
／ml未満の濃度である。

【０１１６】ｄ．関連したpKa値を決定するための酸塩基滴定潜在的に興味深いpKa値を有する３つの重合体は、重合体Ｉ、II、及びＶである。これらは、それぞれ９．８、９．１、及び４．４である。

【０１１７】ｅ．注射可能インプラントとして調製されたエラスチックタンパク質ベース重
合体のin vivo評価 in vivo試験は、オハイオ州ノースウッド（Northwood）のＮＡｍＳＡにより実
施した。注射可能インプラント動物モデルは、チャールズ・リバー・ラボラトリ
ーズ（Charles River Laboratories）からのＣｒｌ：（ＨＡ）ＢＲ系統のモルモ
ットであった。左右の側腹に沿って毛を刈り取り、動物の両脇に３つの注射部位
を供給し、６種の異なる材料を各動物に用いた。対照は綿実油であり、各被検材
料及び対照の注射容量は１００μLであった。２週間実験及び４週間実験の両方で、全ての部位を、４時間後及び８時間後、そして毎２４時間後に、紅斑及び浮
腫について検査した。２週間実験では浮腫が現れた例はなかった。紅斑の数的尺
度は０、紅斑なし；１、極わずか（かろうじて知覚可能）；２、明確（桃色）；
３、中程度から重度（赤色）；４、重度（深紅色）から微小の焼痂形成（深い傷
害）であった。２週間及び４週間の完了時に、全ての部位を組織学的に検査した
。

【０１１８】ｆ．２週間における被検組成物の比較のための注射可能性浮腫が報告されなかった全ての例において、紅斑の評点は全ての被検組成物で
１、即ち極わずか（かろうじて知覚可能）な紅斑を超えず、結果は対照である綿
実油と類似していた。２週間試料の特徴決定のウェスタンブロット・レベルで検
出可能な不純物を示した重合体IIは、有意な新生線維化（neofibrosis）を示さず、最も顕著な表皮肥厚及び皮膚炎を示し、このため、４週間の移植の後の特徴
決定にはより純粋な重合体IIの試料を選択した。

【０１１９】反応性線維化は、任意の部位において特に顕著でなかったが、重合体III注射部位において最も程度が大きく、そしてさらに重合体Ｖ注射部位は対照（綿実油
）注射部位より炎症が少なかった。重合体Ｖは、微生物を用いて調製されたタン
パク質ベース重合体の中で、最も反応性が低く最も無害であった。

【０１２０】４つの動物試験部位、最初の対照である綿実油；重合体III；重合体IV；及び重合体Ｖの代表的な組織学的写真（低倍率又は高倍率）を評価した。２週間実験
における全ての組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、以下の説明は
、ＮＡｍＳＡ病理学者報告から大部分を採用した。

【０１２１】対照：対照（綿実油）注射部位の真皮深部及び皮下の中倍率（１０８倍）顕微
鏡写真を撮影した。この顕微鏡写真は、脂肪細胞を示す明白な空間を示した。サ
イズがわずかに大きく、わずかに厚い壁を有する空間は、綿実油を含有する注射
部位嚢胞を表していた。同一対照部位の皮下の高倍率（４３０倍）顕微鏡写真も
撮影した。新たに形成されたコラーゲン性結合組織は、中程度に細胞性であり、
成熟コラーゲン性結合組織内に見られるよりも細いコラーゲン線維により特徴付
けられた。おそらく線維芽細胞又は組織球内に、細胞分裂像も存在した。

【０１２２】重合体III：肉様層の深部の浅在筋膜深部の低倍率（４３倍）顕微鏡写真を撮影したところ、これも筋線維帯を示した。重合体IIIの注射の結果として、皮下脂肪組織が、炎症細胞及び紡錘型線維芽細胞又は線維嚢胞細胞の多病巣性からコ
ンフルエントの浸潤物に交換された。同一注射部位の別の層の区域の高倍率（４
３０倍）顕微鏡写真も撮影した。この区域には、最少の程度の炎症のみが存在し
たが、中程度の数の線維芽細胞と一致する紡錘型細胞が認められた。そのとき、
少量のコラーゲンのみが形成され、このコラーゲンは染色性がかなり弱かった。
顕微鏡写真は、血管生成を表す多数の小さな毛細血管も示した。驚くべきことに
、重合体IIIと（ＧＶＧＶＰ)₂₅₁（配列番号１８）との唯一の組成の違いは、線維芽細胞が走化性であり、線維芽細胞が接着するペプチド配列（ＧＲＧＤＳＰ（
配列番号４６)）の付加である。組織応答の劇的な違いは、そのような活性の導入と一致している。

【０１２３】重合体IV：真皮及び浅在筋膜の低倍率（４３倍）顕微鏡写真を撮影したところ
、それは、浅在筋膜及び真皮の両方において、多数の不規則な形状の嚢胞、及び
かなり広範性の炎症を示したが、好中球の数は限定されていた。浅在筋膜の深部
に存在する骨格筋層も示された。浅在筋膜深部の高倍率（４３０倍）顕微鏡写真
は、炎症細胞浸潤物により、及び新生線維化反応の初期の可能性を示す、散在す
る紡錘型細胞及び微小コラーゲン鎖により、特徴付けられた。ここでも、組織は
エラスチックタンパク質ベース重合体に導入された組成の変動に選択的に応答し
ているようであった。

【０１２４】エラスチンの合成は、弾性線維が存在するとしてもほとんど存在しない斑痕組
織ではなく、安定な緩い結合組織の生成又は再構築における重要な要因でありう
る。PeacockのWound Repair（1984）に注意されているように、「弾性線維がほとんど存在せず、コラーゲン線維が主に緊張線に沿って方向付けられている斑痕
においては、ほとんど「弾力性（give）」が存在せず、緊張及び緩和が可能でな
い。これが、斑痕組織の剛性の理由、そして関節又は他の可動部分を覆う皮膚に
おいて必要な変形及び回復の繰り返しに先行できないことの理由である。コラー
ゲン線維が形成されたずっと後まで修復組織に新たな弾性線維が含まれないのは
、正常組織に対して斑痕組織が劣っている点のもう一つの例であり、皮膚欠陥、
靱帯構造、及び大動脈の修復において明白な意味を有する。」腹圧性尿失禁の修
正のための尿道周囲支持容量の発生において、任意の組織修復過程と同様に、目
的は、天然組織の再生又は再構築であるべきである。ヒト体内における弾性線維
の半減期は７０年よりも長いため、修復過程への弾性線維の効率的な導入は先導
的な前提である。従って、組織修復に用いられる重合体が、弾性線維を含有する
組織を生成させることができれば、より長期間の組織増強を達成することができ
る。

【０１２５】重合体Ｖ：エラスチックタンパク質ベース重合体Ｖをおよそ３０mgずつ注射さ
れた４つの異なる部位の真皮及び浅在筋膜の中倍率（１０８倍）顕微鏡写真を撮
影したところ、それぞれが、各部位のほとんどの炎症領域を示した。インプラン
トの残存物がない全ての部位において、正常組織が観察された。部位のうち２つ
においては、炎症細胞が見出されなかった。他の２つの部位においては、見出さ
れた炎症のほとんどが極めて限定された反応であった。

【０１２６】部位１つ当たり注射されたおよそ３０mgのうち、内毒素及び微量E.coli不純物
という完全な負荷を有する材料の全てが、組織へ遊離されたが、有意な炎症応答
は生じなかった。これは、おそらく、精製の最も厳密な試験を表しており、従っ
て、この試料は、選択された組織応答を誘発するため設計された異なる組成物の
各エラスチックタンパク質ベース重合体の精製のための標的レベルになった。組
織応答が特定の組成物によるものであり、様々な組成物の必要な修飾された精製
法から生じる異なる不純物によるのではないことを知るのは重要である。

【０１２７】ｇ．４週間における２つの試験組成物の評価のための注射可能インプラント２週間実験のため用いられたヘマトキシリン・エオシン染色に加え、４週間で
検査された試料には、結合組織発達をよりよく調べるため三色染色及びヴァーヘ
フ−ヴァン・ギーソン（verhoeff-van Gieson）染色を用いた。

【０１２８】対照：４週間目に、いくつかの対照綿実油注射部位の顕微鏡写真を撮影した。
ヘマトキシリン及びエオシンで染色された皮膚の全厚さの低倍率（４３倍）顕微
鏡写真には、病巣は存在しなかった。ヴァーヘフ−ヴァン・ギーソン技術で証明
された、より細い弾性線維の正常パターンを示す真皮の中倍率（２１６倍）顕微
鏡写真と共に、三色染色で染色された顕微鏡的に正常な皮膚の中倍率（１０８倍
）顕微鏡写真を撮影した。真皮深部及び浅在筋膜のもう一つの中−高倍率顕微鏡
写真を撮影したところ、それらは弾性線維のためヴァーヘフ−ヴァン・ギーソン
染色を用いた領域に弾性線維の不足を示した。従って、一般的に、綿実油を注射
された部位は、４週間までに本質的に正常な組織を示すよう回復していた。

【０１２９】重合体Ｉ：２つの異なる染色、ヘマトキシリン・エオシン、及び弾性線維又は
弾性線維様活性を調べることを目的とするヴァーヘフ−ヴァン・ギーソンを用い
て、リシン含有重合体Ｉを注射された部位の４つの顕微鏡写真を撮影した。重合
体Ｉを注射された部位の浅在筋膜の中倍率（１０８倍）顕微鏡写真は、大きな不
規則な形状の好酸性沈積物（おそらく、注射された材料を表す）と関連した顕著
な程度の皮下脂肪組織炎を示した。好酸性顆粒の起源を、さらに３つの切片のヴ
ァーヘフ−ヴァン・ギーソン染色により確認した。浅在筋膜の同一区域の中倍率
（１０８倍）顕微鏡写真を撮影し、ヴァーヘフ−ヴァン・ギーソン技術を用いて
染色した。上に予想されたように、Ｈ＆Ｅ染色切片において好酸性であった材料
は、ヴァーヘフ−ヴァン・ギーソン染色を用いると黒色体として出現した。浅在
筋膜の同一区域の高倍率（４３０倍）顕微鏡写真は、黒色材料を消化／リモデリ
ングしていると思われる巨細胞を示した。同一部位からのヴァーヘフ−ヴァン・
ギーソン染色切片の浅在筋膜のもう一つの高倍率（４３０倍）顕微鏡写真は、黒
染色材料の一部が長い広い線維へとリモデリングされつつあることを示した。

【０１３０】重合体II：リシン／フェニルアラニン含有重合体IIの４つの組織学的切片を採
取した。ヘマトキシリン及びエオシンで染色された重合体IIを注射された部位の
真皮深部及び浅在筋膜の中倍率（１０８倍）顕微鏡写真を撮影したところ、それ
は、肉芽腫及び化膿性肉芽腫（pyogranulomatous）の炎症細胞浸潤物により囲ま
れた大きなエオシン好性沈積物の存在を示した。同一注射部位の真皮／浅在筋膜
の中倍率（１０８倍）顕微鏡写真は、ヴァーヘフ−ヴァン・ギーソン技術を用い
て染色したとき、注射された材料を黒色として示した。沈積物の大部分は、巨細
胞により囲まれており、沈積物の周辺、即ち、材料と巨細胞細胞質との界面には
、この材料のリモデリングの証拠が存在した。高倍率（４３０倍）において、同
視野は、黒色沈積物が、ヴァーヘフ−ヴァン・ギーソン染色を用いたとき弾性線
維と類似に染色される細い線維へとリモデリングされつつあることを示した。重
合体IIを注射された別の部位の浅在筋膜の類似の高倍率顕微鏡写真は、巨細胞内
に存在する黒色沈積物の一部が、伸長し回旋状になりつつあることを示した。

【０１３１】実施例４椎間板修復のためのタンパク質ベースポリマー下記の関連するポリマーVI及びVIIは、ヒト死体の椎間板を用いて容易に調製することができ、ポリマーVII、IX、Ｘ及びXIは、in vivo生体内動物研究及び死
体椎間板を用いるより広範な研究の両者に用いるための、遺伝子構築の組換えＤ
ＮＡ技術、E.coliトランスフォーメーション、発現及び発酵を用いて調製するこ
とができる。

【０１３２】ａ．圧力活性粘弾性充填剤としてのバイオエラスチック材料ポリマーVI：（ＧＶＧＩＰ)₁₀（配列番号５６）ポリマーVII：（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＫＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ（配列番号５４）トランスフォームされたE.coliを上記実施例に記載しているようなポリマーVI及
びVIIの合成のために用いることができる。

【０１３３】ｉ．圧力下の圧縮及び平衡圧に膨潤することによる膨張約１０℃のＴ_tでの、約１０ｇの〔（ＧＶＧＩＰ)₁₀〕_n（式中、ｎ＝２６）、即ち（ＧＶＧＩＰ)₂₆₀（配列番号５５）を、１０℃未満の温度で３０mLに溶解す
ることができ、２℃で冷却遠心にかけることができ、そして８時間の間に２５℃
に上昇しそして１６時間２５℃に保つ間に４４０MPaの平均圧力で遠心することができる。この段階で、相分離したコアセルベート状態の１０ｇは６．５mLを占
める。大気圧で１時間半静置し、コアセルベート相をゆっくりと１０mLまで膨張
させる。この（ＧＶＧＩＰ)₂₆₀のコアセルベート相分離状態の圧縮／膨張特性は
、再現可能であり、遠心中に適用される時間長及び力によって変えることができ
る。この特性が（ＧＶＧＶＰ）₂₅₁（配列番号１８）によっては示されないことを理解すべきである。このように、適切な圧力セルを用いて、ポリマーVIの圧縮
されたコアセルベート状態の関節鏡下定置の容量を・定置後の展開及び髄核の静
水学的に適格な空間の状態に所望される圧力を得るように選択するすることがで
きる。

【０１３４】 ii．Ｐｈｅ（Ｆ）残基によって与えられる圧力感受性フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）残基が存在するとき、圧力の適用はＴ_tの値を上昇させる（Urry, et al., Chem. Phys. Letters 182:101-106(1991))。これは、圧力差によって、折り畳みから折りたたまれていないでかつ疎水的な水和状態へ平衡状態がシフトすることができるＰｈｅ含有組成物に関して、圧力の適用
が容量変化を制限し、そして水流のチャネリングを防止する背圧をもたらすこと
を意味する。圧力の周期的な適用による水流のチャネリングは、構造破壊を導く
ことができる。多分、これは大きくかつ不定の圧縮力を支える、２弁の内転筋の
主要タンパク質が、主要な反復配列中の重要な残基としてのＰｈｅ残基を含むこ
とが理由であろう。ポリマーVII（配列番号５４）を選択するが、死体研究でのグルタルアルデヒドによってか又はin vivo研究での天然架橋酵素であるリシルオキシダーゼのいずれかによって架橋することを可能にするリシン残基の存在も
選択することは、この理由及び特性があるからである。ポリ〔４（ＧＶＧＶＰ）
、ＧＫＧＶＰ〕（配列番号６１）は、天然エラスチン又はコラーゲン基質ではな
い、リシルオキシダーゼについて見出された最初のペプチド基質であった（Kaga
n, etal., J. Biol. Chem. 255:3656-3659(1980))。このように、上記ホポリマーVI I（配列番号５４）及び下記ポリマーXI（配列番号６０）は、天然生体外架橋酵素であるリシルオキシダーゼによって生体内で、ある程度架橋されることが期待
される。

【０１３５】ｂ．板回復のバイオエラスチック材料ポリマーは以下の配列を有する： VIII：（ＧＶＧＩＰ）₁₀ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＩＰ）₁₀（配列番号５
７） IX：（ＧＶＧＩＰ)₁₀ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ)₁₀（配列番号５８）
Ｘ：〔（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＦＧＶＰ〕₃（配列番号５９） XI：（ＧＶＧＩＰ)₁₀ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ)₂（配列番号６０）

【０１３６】ポリマーVIII、IX及びXIは、細胞接着配列ＧＲＧＤＳＰを含み、モルモットの
皮下に移植されたときの組織発生を刺激することを示す成分のファミリーである
（Urry, et al., J. Biomaterials Science. Polymer Edition 9(10):1015-1114
(1998)）。それらは、架橋した場合、刺激された細胞成長の基質及び細胞外基質
形成に用いる張力によって尿路上皮性細胞の細胞接着部位を提供する成分でもあ
る。ポリマーVIIIからポリマーIXへ進行する変化は、より温和な圧縮／膨張反応
でポリマーと働くことを可能にする。ポリマーＸの目的は、ポリマーVIIのＫ残基の存在無しでＦ残基の効果を観察することである。最後にポリマーXIを、全４
つの変異種：圧縮／膨張効果のための（ＧＶＧＩＰ)₁₀、細胞接着特性のためのＧＲＧＤＳＰ、架橋可能性のためのＫ、圧力で変化するＴ、を導入する芳香族残
基の効果のためのＦ残基、を組み合わせる。

【０１３７】実施例５遺伝子構築、E.coliトランスフォーメーション、発現、発酵及びポリマー精製ａ．ポリマーXI（配列番号６０）のモノマー遺伝子の構築ポリマーXI（配列番号６０）の遺伝子の構築の方法を研究したポリマーの最も
複雑な構築物としてここに示す。これは、最初に、ポリマーVII（配列番号５４）の基本モノマー遺伝子の２個の反復をコードする〔（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＫＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ〕₂（配列番号６２）の遺伝子の構築を必要とする。これは図１０に示すように、遺伝子のそれぞれ３′及び５′末端に位置するＨｉ
ｎｆＩ及びＫｐｎＩ部位を介して２本鎖合成オリゴヌクレオチドリンカーを用い
てポリマーVIIモノマー遺伝子の２個のコピーを結合することによって達成することができる。

【０１３８】これは、続く遺伝子の連環化（concatanation）に必要な、５′及び３′末端のＰｆｌＭ１部位を有する直列遺伝子反復を作成する。また、リンカー配列は、
ＫｐｎＩ部位がライゲーションで修復されないように構成する。

【０１３９】次は、ポリマーXI（配列番号６０）の基本モノマー遺伝子をコードする遺伝子
である。これは、現在ある遺伝子（ＧＶＧＩＰ)₁₀（配列番号５６）及びＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（配列番号２０及び４６）をコードするリンカーを結合して
〔（ＧＶＧＶＰ)₂ＧＫＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ〕₂（配列番号６２）をコードする上記遺伝子を用いて実施する。リンカーは、両遺伝子の末端ＰｆｌＭ
１末端と適合性のある付着末端を有する。しかし、リンカーでのライゲーション
で、ＰｆｌＭ１部位は回復されず、これによって遺伝子連環化のためのＰｆｌＭ
１末端部位だけを維持する。

【０１４０】ｂ．ポリマーXI（配列番号６０）のコンカテマー遺伝子構築及びE.coliトラン
スフォーメーション大量のカラマー遺伝子フラグメントをＰｆｌＭ１での切断によってプラスミド
ｐＵＣ１１８からの遺伝子を遊離することによって調製し、ポリヌクレオチドア
クリルアミドゲルの電気泳動によって分離し、続いてゲルから溶出した。次に遺
伝子フラグメントを２本鎖オリゴヌクレオチドアダプターの存在下でＰｆｌＭ１
のうイゲーションによって連環化した。これらのアダプターは、隣接しそして遺
伝子ポリマーのクローニングに必要な末端制限エンドヌクレアーゼ部位を提供す
る末端からの別のポリマー成長を終結する。この場合は、連環化ライゲーション
産物をＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨ１切断ｐＵＣ１１８及びリガーゼと混合し
、そしてトランスフォーメーションによってE.coliに挿入した。コンカテマーク
ローンを制限エンドヌクレアーゼ消化、及びコンカテマーライゲーションラダー
を含有する、サイズ既知のストランドと対比した電気泳動によって解析した。

【０１４１】ｃ．E.coli発現及び発酵ｉ．発現ｐＥＴ−ＩＩｄのようなｐＥＴプラスミド（Novagen）を上記コンカテマー遺伝子の発現のために用いた。各コンカテマー遺伝子について、遺伝子フラグメン
トをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを用いた切断によってｐＵＣ１１８プラスミドから
遊離し、精製した。これをＴ７プロモーター及びリボソーム結合配列に直ぐ隣接
するコンカテマー遺伝子の開始ＡＴＧコドンが位置するＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ
部位でｐＥＴプラスミド内にクローニングした。

【０１４２】次に、コンカテマー遺伝子の発現を続くベンチスケール培養及び誘導物質であ
るイソプロピルチオ−β−ガラクロシダーゼ（ＩＰＴＧ）の有無での誘導で解析
することができる。誘導前及び誘導後に採取した培養粗細胞溶菌液をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上で電気泳動し、そしてＣｕＣｌ₂でのゲルの染色に続いて調べた。更に、この小規模培養で発現したタンパク質を下記の方法にしたがって精製した。

【０１４３】 ii．発酵発酵をルリアブロス又はテリフィックブロスのいずれかを用いて実施した。タ
ンパク質ベースポリマーの産物を誘導剤ＩＰＴＧの添加によって誘導することが
できる。適正な時間の成長後、培養物を遠心によって回収し、細胞を細胞含有物
を放出させるためにフレンチプレスを用いて破壊した。

【０１４４】ｄ．精製ポリマーを、上記実施例１ｄに記載したように、これらの逆温度遷移特性を用
いて培養溶菌液から有利に精製することができる。Ｌｙｓ（Ｋ）含有及びＧＲＧ
ＤＳＰ含有ポリマーであるVII、VIII、IX及びXIについて、pHの変化は、精製過程の主要部である差動位相分離（differential phase separation）を達成することを用いる。

【０１４５】実施例６有効性の測定のモデルａ．ヒト死体脊柱を用いる試験それぞれ２個の選択されるディスク部位を有する、１０個の全体腰椎セグメン
ト（Ｌ１〜Ｌ５）から実験用の総数２０個のディスク部位が得られる。２種の異
なるバイオエラスチック成分を、成分当たり１０部位あるように用いる。更に、
２つの異なる変性度を２つの変性度のそれぞれについて成分当たり５部位あるよ
うに考慮する。バイオエラスチックポリマー約２mLの容量を、ヌクレオトミーに
したがって各ディスクに設置し、各成分当たり総量約２５ｇを必要とする。

【０１４６】ｉ．標本調製１０個の全体腰椎セグメント（Ｌ１〜Ｌ５）を新鮮な凍結ヒト死体から入手し
、各標本ごとに年齢、性別及び死因を記録する。到着次第、腰椎ディスクを生理
食塩液（水４Ｌ当たりＮａＣ１３６ｇ）で満たした浴中に８時間浸して融解する
。次に、セグメントを骨及び靭帯脊髄構造を無傷のままで、軟筋肉組織がないよ
うに解体する。脊椎を作業の間中含水し続けておく。

【０１４７】 ii．ディスク変性の評価の予備試験方法脊椎セグメントを２個の分離レベル、即ちＬ２〜Ｌ３及びＬ４〜Ｌ５脊椎機能
単位（ＦＳＵ）に分割する。各腰椎部のＸ線像を撮影し、そして研究から拒絶さ
れる転移性欠損の存在する椎骨、既存の骨折及び骨棘形成を有する椎骨の病理状
態を常に確認する。関節炎面関節を示す腰椎ＦＳＵを、解析段階で別々に処理す
ることができる。Ｘ線像はBrickmann et al., Clinical Biomechanics 22(Suppl
1):1-63(1997)で提案されているプロコールにしたがって各椎間板の高さの測定
にも用いる。

【０１４８】脊髄セグメント椎体の骨塩含量（ＢＭＣ）及び骨塩量（ＢＭＤ）を、例えば、
ＤＸＡ測定装置（Hologic QDR 2000+, Hologic Co., Waltham, MA)を用いて測定
する。椎体BMCは、椎間板の粘弾性特性と強く関連することが報告されている(Kell
er, et al., J. Orthopedic research 5:467-478(1978))。ＢＭＣ及び幅修正ＢＭＤデータは、標本の機械的な特性の被験者内及び被験者間のありうる可変性を部分的に説明することができる。

【０１４９】次に各脊髄セグメントの椎間板を例えばＭＲ１装置（SIEMENS Vision 1.5T, S
iemens Co., CO）を用いて画像化し、次いで得られた画像を椎間板の変性及び水
和状態の確立された臨床的方法にしたがって等級を付ける。ＭＲＩデータは椎間
板の粘弾性特性の両指標の起こり得る効果の評価も可能にする。

【０１５０】これらの手順の終わりに、脊椎を生理食塩液に浸漬したガーゼでラップし、袋
に詰め、次いで試験日まで−２５℃で凍結する。

【０１５１】 iii．試験テストに先立ち、脊椎を冷蔵で８時間、そして更に室温で６時間解凍する。頭
部及び底部椎体の前端板及び後端板切片それぞれを位置付け、固定し、そして環
状アルミニウム型リングの内側にＰＭＭＡで包埋する。ＦＳＵを、末端キャップ
が椎間板の水平方向の平面中央と平行に並ぶように位置づける。操作を通して、
脊椎を含水し続けておく。

【０１５２】（１）標本マウンティング及び登録上部アルミニウム末端キャップを、テストシステムの長軸に整列させたセグメ
ントの回転中心で２軸動水材料テストシステム（Interlaken, ＵＳＡ）の上部駆
動部に固定する。回転中心の位置は、試験前に見出す（Liu, et al., Spine 13:
1129-1134(1988))。

【０１５３】 MacReflex Optical system(Qualisys, USA)をＦＳＵに沿った結果として起きる動きを得るために用いる。３mmのヒ゜ンを埋め込んだ７mmの直径を有する１０個の円筒状のマーカーを脊椎標本に位置づける。ＦＳＵ運動の較正、測定及び解析
を確立した実験室プロトコールを用いて実施する。操作を通して、脊椎を含水し
続けておく。

【０１５４】（２）試験方法予め等級を付けた得られた椎間板を２つのグループに分ける。ディスクグレー
ドＩ及びIIは中程度の変性の１つのグループを示し、ディスクグレードIII及び IVは重症の変性を示す。以下の各テストを、ディスク空間ヘバイオエラスチック
ポリマーを注入する前後にそれぞれのディスクグループで実施する。グレードＩ
及びIIディスクについては、髄核の除去を、関節鏡を用いる確立された臨床的方
法を用いて実施する。バイオエラスチックポリマーを両グループの髄核腔に関節
鏡を用いて導入する。染料を、試験中ポリマーの漏出を示すためにポリマーに含
有させる。以下の試験順序を選択し、そのようにして各試験を試験進行の順化サ
イクルの一部として計画した。この順序はＦＳＵ、特に最小限の椎間板に対する
継続的なそして累積的なダメージの両者を保持するためである。

【０１５５】（ａ）解剖学的関連の測定負荷コントロールで、２５Ｎ／秒の速度で、値域５〜４４０Ｎの３種のランプ
型の負荷及び非負荷の圧縮負荷サイクルをＦＳＵの順化に適用する。順化サイク
ルの終わりに、種々のマーカー間の空間的関係を、ＦＳＵ空間的関係の参照値を
確立するためにMac Reflex systemを用いて取得する。圧縮負荷を２５Ｎ／秒の速度で、４４０Ｎの値で適用し、負荷レベルを２秒間持続し、そして続いて５Ｎ
の負荷が記録されるまで同様の負荷速度を用いて取り除く。駆動部の圧縮負荷及
び軸押しのけ容積を１秒間隔で試験期間を通して取得するマーカー位置を、材料
試験変換器を用いて記録する。底部椎体に関する上部椎体の相対的押しのけ容積
及び神経腔容積の垂直方向変化をMac Reflexソフトウエアーを用いて算出する。

【０１５６】（ｂ）クリープ試験種々のマーカー間の空間的関係を、Mac Reflexシステムを用いて最初に取得す
る。圧縮負荷は４４０Ｎの値が記録されるまで２５Ｎ／秒の速度でＦＳＵに適用
する。次に、負荷を３０分間一定レベルに維持する。この時間の終わりに、負荷
を２Ｎの圧縮負荷が記録されるまで同様の速度で除去する。次に、ディスクを３
０分間回復させておく。圧縮負荷、駆動部軸押しのけ容積及び時間の関数として
のマーカー位置をテストの間中記録する。３要素のケルビンモデル、即ち、Kell
er, et al.,上記で提案されるプロトコールにしたがって弾性(Ｅ１）及び粘性の
（Ｅ２）剛度及び粘度（η）をディスクの粘弾性作用を記載する流体力学的パラ
メーターを測定するために用いる。

【０１５７】（Ｃ）力学的テスト２５Ｎ／秒の速度で、値域５〜４４０Ｎの３種のランプ型の負荷及び非負荷の
圧縮負荷サイクルを、第１の手順と同様の方法でＦＳＵに適用する。次に、ＦＳ
Ｕを０．５〜４０Hzの値域の振動数で軸圧縮正弦波力に付す。テストを、近直線
状応答を維持するため２０Ｎの値を保つ負荷振幅で、種々の前負荷振幅、即ち６
０、２００、３４０、４８０及び６２０Ｎを用いて実施する。次に、ディスク圧
縮データを、セグメント共鳴振動数から離れた振動数で２〜３Hzの間隔で、そし
て共鳴振動数に近づく振動数で０．５Hzの間隔で記録する。適用する力、適用の
振動数及び標本応答振幅を、材料テストシステム変換器を用いて記録する。椎間
板減衰、ヒステリシス、動バネ定数を標準手技を用いる振幅曲線に対する振動数
から算出する（Clough, et al., Dynamic Structures 2nd edition, McGraw Hil
l, 1993)。

【０１５８】（ｄ）可動性テスト運動セグメントを、Panjabi, et al., Spine 8(8):857-865(1983)で提案されるプロトコールにしたがったカップルモーメントを用いて屈曲及び伸長で負荷す
る。この目的のため、屈曲／伸長治具を、MacReflex systemを用いて測定する結
果として得られる変形で一定のモーメントの下で標本を負荷するために用いる。
次に、負荷−偏向曲線を、セグメント安定性の変化の指標としてセグメントの中
性及び弾性域を確立するために用いる。

【０１５９】 iv．解析種々の粘弾性及び動的変数間で生じ得る相互作用及び異なるテスト下のディス
クの応答での共変形の効果を、予備的及び画像解析手技を用いて評価する。

【０１６０】ｂ．生体内動物モデル変性椎間板はマイクロブタの経皮核摘出を実施することによって作成すること
ができる。全身麻酔下で、脊椎後側方固定経皮アプローチを、核摘出を実施する
ため用いる。皮下核摘出の器具は、ヒト臨床使用のため今日入手可能である。関
節鏡ポ一夕ルは、約直径３mmである。１つのレベルでは、テストするポリマー核
を再生するため関節鏡的装置を通して挿入する。他のレベルは、生体内コントロ
ールとしてポリマー無しで維持する。ポリマーの挿入部位は、解剖学的レベルに
関する結果のあらゆる斜行を防止するため無作為化することができる。動物を手
術後４及び８週間でＭＲＩ研究に付し、ディスクの状態を評価する。３月で、動
物を含有動作セグメントの組織学的評価のために屠殺した。

【０１６１】配列表の簡単な説明配列番号１は、配列番号９の重合体単位を作製するための５′オリゴマー構築
物を描写する。

【０１６２】配列番号２は、配列番号１０及び重合体II（配列番号３６）の重合体単位を作
製するための３′オリゴマー構築物を描写する。

【０１６３】配列番号３及び４は、配列番号IIの重合体単位を作製するための３′オリゴマ
ー構築物を描写する。

【０１６４】配列番号５は、配列番号１２及び重合体Ｉ（配列番号３５）の重合体単位を作
製するための３′オリゴマー構築物を描写する。

【０１６５】配列番号６は、配列番号１３及び重合体III（配列番号３７）をコードする合成遺伝子配列である。

【０１６６】配列番号７は、配列番号１４及び重合体IV（配列番号３８）をコードする合成
遺伝子配列である。

【０１６７】配列番号８は、配列番号１５及び重合体Ｖ（配列番号３９）をコードする合成
遺伝子配列である。

【０１６８】配列番号９は、テトラマー・エラストマーのタンパク質配列である。

【０１６９】配列番号１０は、リシン及びフェニルアラニンを含有するエラストマーのタン
パク質配列である。

【０１７０】配列番号１１は、ＧＲＧＤＳＰ細胞接着含有配列のタンパク質配列である。

【０１７１】配列番号１２は、リシン含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１７２】配列番号１３は、ＧＲＧＤＳＰ含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１７３】配列番号１４は、アラニン含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１７４】配列番号１５は、グルタミン酸含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１７５】配列番号１６及び１７は、それぞれ、テトラペプチド及びペンタペプチド単量
体である。

【０１７６】配列番号１８は、ポリペンタペプチド・エラストマーである。

【０１７７】配列番号１９は、ペンタペプチド単量体である。

【０１７８】配列番号２０は、ペンタペプチド単量体からなる重合体である。

【０１７９】配列番号２１は、ＧＲＧＤＳＰ含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１８０】配列番号２２は、グルタミン酸含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１８１】配列番号２３及び２４は、フェニルアラニン含有エラストマー（配列番号９）
を作製するためのオリゴヌクレオチドである。

【０１８２】配列番号２５は、リシン及びフェニルアラニンを含有するエラストマーのタン
パク質配列である。

【０１８３】配列番号２６及び２７は、リシン及びフェニルアラニンを含有するエラストマ
ー（配列番号１０）を作製するためのオリゴヌクレオチドである。

【０１８４】配列番号２８は、細胞接着配列のタンパク質配列である。

【０１８５】配列番号２９は、ペンタペプチド単量体からなるエラストマーのタンパク質配
列である。

【０１８６】配列番号３０、３１、３２、及び３３は、様々なエラストマー遺伝子のコンカ
テマーをクローニングするために用いられるアダプター・オリゴマーをコードす
る合成遺伝子配列である。

【０１８７】配列番号３４は、ＧＲＧＤＳＰ含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０１８８】配列番号３５は、Ｌｙｓを含有する重合体Ｉのタンパク質配列である。

【０１８９】配列番号３６は、Ｐｈｅ及びＬｙｓを含有する重合体IIのタンパク質配列であ
る。

【０１９０】配列番号３７は、細胞接着配列を含有する重合体IIIのタンパク質配列である。

【０１９１】配列番号３８は、重合体IVのタンパク質配列である。

【０１９２】配列番号３９は、Ｇｌｕを含有する重合体Ｖのタンパク質配列である。

【０１９３】配列番号４０は、ポリペンタペプチド・エラストマーである。

【０１９４】配列番号４１及び４２は、テトラペプチド単量体である。

【０１９５】配列番号４３、４４、及び４５は、ペンタペプチド単量体である。

【０１９６】配列番号４６は、ＧＲＧＤＳＰ細胞接着配列である。

【０１９７】配列番号４７は、ＧＶＧＶＡＰである。

【０１９８】配列番号４８及び４９は、ペンタペプチド単量体である。

【０１９９】配列番号５０は、テトラペプチド単量体である。

【０２００】配列番号５１は、ペンタペプチド単量体である。

【０２０１】配列番号５２は、ＶＧＶＡＰＧである。

【０２０２】配列番号５３は、ＧＲＧＤＳＰ含有エラストマーのタンパク質配列である。

【０２０３】配列番号５４、５５、及び５６は、ペンタペプチド単量体からなるエラストマ
ーのタンパク質配列であり、配列番号５４は重合体VIIであり、配列番号５６は重合体VIである。

【０２０４】配列番号５７及び５８は、ＧＲＧＤＳＰ含有エラストマー、それぞれ重合体VI
II及びIXのタンパク質配列である。

【０２０５】配列番号５９は、ペンタペプチド単量体からなるエラストマー、重合体Ｘのタ
ンパク質配列である。

【０２０６】配列番号６０は、ＧＲＧＤＳＰ含有エラストマー、重合体XIのタンパク質配列
である。

【０２０７】配列番号６１は、ペンタペプチド単量体からなるエラストマーのタンパク質配
列である。

【０２０８】配列番号６２は、重合体XIの断片のタンパク質配列である。

【０２０９】配列番号６３及び６４は、重合体XIの遺伝子をクローニングするために用いら
れるアダプター・オリゴマーをコードする合成遺伝子配列である。

【０２１０】配列番号６５は、重合体XIの断片のタンパク質配列である。

【０２１１】この明細書において言及された全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物及
び特許出願が、引用された場所において参照として組み込まれると特別に個別に
示されているのと同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。

【０２１２】本発明は今や充分に記載され、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、
本発明に多くの変化及び修飾がなされうることは、当業者には明らかであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、繰り返し〔（ＧＧＶＰ）₃ ＧＧＦＰ（ＧＧＶＰ）₃ ＧＧＦＰ（ＧＧＶ
Ｐ）₃ ＧＧＦＰ〕（配列番号９）単位からなるバイオエラスチック重合体タンパ
ク質配列をコードするオリゴヌクレオチド配列（配列番号１）を例示し、コード
されたタンパク質配列及び制限酵素部位を示す。

【図２】図２は、バイオエラスチック重合体タンパク質配列（ＧＶＧＶＰ）₃ ＧＫＧＶ
ＰＧＶＧＶＰＧＶＧＦＰＧＦＧＦＰ（配列番号１０）をコードするオリゴヌクレオチド配列（配列番号２）及び制限酵素部位を例示している。

【図３】図３は、バイオエラスチック重合体タンパク質配列ＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰＧ
（配列番号１１）をコードするオリゴヌクレオチド配列（配列番号３及び４）を
例示している。

【図４】図４は、バイオエラスチック重合体タンパク質配列（ＧＶＧＶＰ）₃ ＧＫＧＶ
Ｐ（ＧＶＧＶＰ）₂（配列番号１２）をコードするオリゴヌクレオチド配列（配列番号５）を例示している。

【図５】図５は、バイオエラスチック重合体タンパク質配列（ＧＶＧＶＰ）₁₀ ＧＶＧＶＰＧＲＧＤＳＰ（ＧＶＧＶＰ）₁₀（配列番号１３）をコードするオリゴヌクレ
オチド配列（配列番号６）を例示している。

【図６】図６は、バイオエラスチック重合体タンパク質配列（ＧＶＧＶＰ）₃ （ＧＶＧ
ＶＡＰ）₈ （ＧＶＧＶＰ）₁₀ （配列番号１４）をコードするオリゴヌクレオチド配列（配列番号７）を例示している。

【図７】図７は、バイオエラスチック重合体タンパク質配列（ＧＶＧＶＰ）₃ ＧＥＧＶ
Ｐ（ＧＶＧＶＰ）₂ （配列番号１５）をコードするオリゴヌクレオチド配列（配
列番号８）を例示している。

【図８】図８は、バイオエラスチック重合体遺伝子のクローニングにおいて有用であり
、配列番号３０、３１、３２、及び３３として同定されるオリゴヌクレオチド・
アダプターの配列を例示している。

【図９】図９は、重合体III及びIVの質量スペクトル・プロットである。

【図１０】図１０は、バイオエラスチック重合体遺伝子のクローニングにおいて有用であ
り、配列番号６３及び６４として同定されるオリゴヌクレオチド・アダプターの
配列を例示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０８Ｆ 38/00 Ｃ０８Ｆ 283/00 283/00 Ｄ０２Ｇ 3/00 Ｄ０２Ｇ 3/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パーカー，ティモシー・エムアメリカ合衆国、アラバマ 35120 オーデンヴィル、プレザント・バリー・ロード 3735 (72)発明者グレーザー，ポール・エーアメリカ合衆国、マサチューセッツ 02446、ブルックリン、チャペル・ストリート 20 ナンバー・ビー709 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 BA02 BA05 BA44 CA53 CA59 DA12 DA19 DA21 DA25 DA38 DB53 DB54 DB56 DB58 DB59 DB60 MA02 MA05 MA16 MA63 MA66 MA67 NA05 NA10 ZA941 ZB011 ZB012 ZB021 ZB022 ZB051 ZB052 ZB071 ZB072 ZB221 ZB222 ZC031 ZC032 4C087 BB63 CA04 CA05 MA02 MA05 MA16 MA63 MA66 MA67 NA05 NA10 ZA94 ZA96 ZB01 ZB02 ZB05 ZB07 ZB22 ZC03 4C097 BB01 DD05 EE18 FF02 4L036 MA08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物における組織の増強又は回復のための方法であって
、該方法が、増強が必要であり、かつ組織温度を有する組織部位に重合体を注射
することを含み、該重合体がノナペプチド、ペンタペプチド、及びテトラペプチ
ド単量体単位からなる群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を含み、該
単量体単位がβターン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離されてい
る一連のβターンを形成し、該重合体が該組織温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有し、該重合体が付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液と
して注射されることを特徴とする方法。
【請求項２】該コアセルベート濃度が、該組織温度で１〜１００，０００
ミリポアズの粘性を有する、請求項１の方法。
【請求項３】該重合体が、架橋されているが、押し出し可能である、請求
項１の方法。
【請求項４】該重合体が、該単量体単位のうちの一つ及び１〜１００アミ
ノ酸を含有する第二のペプチド単位から形成される共重合体である、請求項１の
方法。
【請求項５】該第二のペプチド単位が１〜２０アミノ酸を含有する、請求
項４の方法。
【請求項６】該重合体が、該単量体単位のうちの少なくとも２つを含む、
ブロック共重合体又はランダム共重合体を含む、請求項１の方法。
【請求項７】該重合体が、エラストマー様のポリテトラペプチド又はポリ
ペンタペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項８】該重合体が、ＶＰＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＶＰ（配列番
号４１）、ＧＧＦＰ（配列番号４２）、及びＧＧＡＰ（配列番号５０）からなる
群より選択されるテトラペプチド単位を含む、請求項７の方法。
【請求項９】該重合体が、ＶＰＧＶＧ（配列番号１７）、ＧＶＧＶＰ（配
列番号２０）、ＧＫＧＶＰ（配列番号４３）、ＧＶＧＦＰ（配列番号４４）、Ｇ
ＦＧＦＰ（配列番号４５）、ＧＥＧＶＰ（配列番号４８）、ＧＦＧＶＰ（配列番
号４９）、及び（ＧＶＧＩＰ）（配列番号５１）からなる群より選択されるペン
タペプチド単位を含む、請求項７の方法。
【請求項１０】該重合体が、テトラペプチド単位及びペンタペプチド単位
からなる共重合体である、請求項１の方法。
【請求項１１】該第二のペプチド単位が、細胞接着配列ＧＲＧＤＳＰ（配
列番号４６）を含む、請求項５の方法。
【請求項１２】該第二のペプチド単位が、ＧＶＧＶＡＰ（配列番号４７）
又はＶＧＶＡＰＧ（配列番号５２）を含む、請求項５の方法。
【請求項１３】該第二のペプチド単位が、フィブロネクチン、ビトロネク
チン、テネイシン、タイチン及び他の関連細胞接着タンパク質の、III型ドメイン由来の細胞接着配列を含む、請求項４の方法。
【請求項１４】該重合体が塑性ポリペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項１５】該重合体を、宿主適合性細胞及び成長因子からなる群より
選択されるさらなる成分と組み合わせて注射する、請求項１の方法。
【請求項１６】該部位に骨生成因子を注射することをさらに含む、請求項
１の方法。
【請求項１７】天然組織の治癒又は再成長を補助するための一つ又は複数
の生物学的に活性な因子をさらに含む薬学的に許容される液状担体に、該重合体
が含有される、請求項１の方法。
【請求項１８】該因子が、ヘパリン、上皮成長因子、トランスフォーミン
グ成長因子−α、トランスフォーミング成長因子−β、血小板由来成長因子、線
維芽細胞成長因子、結合組織活性化ペプチド、β−トロンボグロブリン、インス
リン様成長因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリス
ロポエチン、神経成長因子、インターフェロン、骨生成因子、及び骨形成因子か
らなる群より選択される、請求項１７の方法。
【請求項１９】該組織部位が尿道周囲である、請求項１の方法。
【請求項２０】該組織部位が皮下である、請求項１の方法。
【請求項２１】該組織部位が軟組織である、請求項１の方法。
【請求項２２】該組織部位が硬組織である、請求項１の方法。
【請求項２３】哺乳動物における組織の増強又は回復のための方法であっ
て、下記工程、ａ）組織の増強又は回復を必要とする組織部位を同定する工程（該部位は、部位
温度（Ｔ_s）を有する）、及びｂ）重合体を部位に注射する工程であって、該ポリマーは、ペンタペプチド及び
テトラペプチド単量体単位からなる群より選択される繰り返しペプチド単量体単
位を、単独又は組み合わせて、含む（ここで、該単量体単位はβターン間にかけ
られた可動性架橋セグメントにより分離されている一連のβターンを形成し、（
ｉ）該重合体は、Ｔ_sより低い逆温度転移Ｔ_tを有し、（ii）該重合体を、付加的
な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液として注射し、かつ（ii
i）該コアセルベートは、１〜１００，０００ミリポアズのＴ_sにおける粘性を有
する）を含む、方法。
【請求項２４】該重合体が、架橋されているが、押し出し可能である、請
求項２３の方法。
【請求項２５】該重合体が、該単量体単位のうちの一つと１〜２０アミノ
酸を含有する第二のペプチド単位とから形成される共重合体である、請求項２３
の方法。
【請求項２６】該重合体が、少なくとも２つの異なる単量体単位を含む、
ブロック共重合体又はランダム共重合体を含む、請求項２３の方法。
【請求項２７】該重合体が、エラストマー様のポリテトラペプチド又はポ
リペンタペプチドを含む、請求項２３の方法。
【請求項２８】該重合体が、ＶＰＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＶＰ（配列
番号４１）、ＧＧＦＰ（配列番号４２）、及びＧＧＡＰ（配列番号５０）からな
る群より選択されるテトラペプチド単位を含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】該重合体が、ＶＰＧＶＧ（配列番号１７）、ＧＶＧＶＰ（
配列番号２０）、ＧＫＧＶＰ（配列番号４３）、ＧＶＧＦＰ（配列番号４４）、
ＧＦＧＦＰ（配列番号４５）、ＧＥＧＶＰ（配列番号４８）、ＧＦＧＶＰ（配列
番号４９）、及び（ＧＶＧＩＰ）（配列番号５１）からなる群より選択されるペ
ンタペプチド単位を含む、請求項２７の方法。
【請求項３０】該重合体が、テトラペプチド単位及びペンタペプチド単位
からなる共重合体である、請求項２３の方法。
【請求項３１】該第二のペプチド単位が、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４６）
、ＧＶＧＶＡＰ（配列番号４７）、及びＶＧＶＡＰＧ（配列番号５２）からなる
群より選択される、請求項２５の方法。
【請求項３２】該重合体を、宿主適合性細胞及び成長因子からなる群より
選択されるさらなる成分と組み合わせて注射する、請求項２３の方法。
【請求項３３】天然組織の治癒又は再成長を補助するための一つ又は複数
の生物学的に活性な因子をさらに含む薬学的に許容される液状担体に、該重合体
が含有される、請求項２３の方法。
【請求項３４】該組織部位が尿道周囲、皮下、腱、又は軟骨である、請求
項２３の方法。
【請求項３５】哺乳動物における椎間板の組織回復のための方法であって
、該方法が、部位温度を有する枯渇した髄核部位に、重合体を注射することを含
み、該重合体がノナペプチド、ペンタペプチド、及びテトラペプチド単量体単位
からなる群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を含み、該単量体単位が
βターン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された一連のβターン
を形成し、該重合体が該部位温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有し、そして該重合体が付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水溶液として注射さ
れ、膨潤して該板内の圧力を増加させる、方法。
【請求項３６】該コアセルベートが、該部位において５×１０⁴〜５×１０⁶Ｎ／ｍ²の弾性率を有する、請求項３５の方法。
【請求項３７】該重合体が架橋されている、請求項３５の方法。
【請求項３８】該重合体が、該単量体単位のうちの一つ及び１〜１００ア
ミノ酸を含有する第二のペプチド単位から形成される共重合体である、請求項３
５の方法。
【請求項３９】該第二のペプチド単位が１〜２０アミノ酸を含有する、請
求項３８の方法。
【請求項４０】該重合体が、該単量体単位のうちの少なくとも２つを含む
、ブロック共重合体又はランダム共重合体を含む、請求項３５の方法。
【請求項４１】該重合体が、エラストマー様のポリテトラペプチド又はポ
リペンタペプチドを含む、請求項３５の方法。
【請求項４２】該重合体が、ＶＰＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＶＰ（配列
番号４１）、ＧＧＦＰ（配列番号４２）、及びＧＧＡＰ（配列番号５０）からな
る群より選択されるテトラペプチド単位を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】該重合体が、ＶＰＧＶＧ（配列番号１７）、ＧＶＧＶＰ（
配列番号２０）、ＧＫＧＶＰ（配列番号４３）、ＧＶＧＦＰ（配列番号４４）、
ＧＦＧＦＰ（配列番号４５）、ＧＥＧＶＰ（配列番号４８）、ＧＦＧＶＰ（配列
番号４９）、及び（ＧＶＧＩＰ）（配列番号５１）からなる群より選択されるペ
ンタペプチド単位を含む、請求項４１の方法。
【請求項４４】該重合体が、少なくとも一つの（ＧＶＧＩＰ）（配列番号
５１）であるペンタペプチド単位を含む、請求項３５の方法。
【請求項４５】該単量体単位の少なくとも一つが芳香族残基を含む、請求
項３５の方法。
【請求項４６】該芳香族残基がフェニルアラニンである、請求項４５の方
法。
【請求項４７】該重合体が、テトラペプチド単位又はペンタペプチド単位
からなる共重合体である、請求項３５の方法。
【請求項４８】該第二のペプチド単位が、細胞接着配列であるＧＲＧＤＳ
Ｐ（配列番号４６）を含む、請求項３９の方法。
【請求項４９】該第二のペプチド単位が、ＧＶＧＶＡＰ（配列番号４７）
又はＶＧＶＡＰＧ（配列番号５２）を含む、請求項３９の方法。
【請求項５０】該第二のペプチド単位が、フィブロネクチン、ビトロネク
チン、テネイシン、タイチン、及び他の関連細胞接着タンパク質のIII型ドメイン由来の細胞接着配列を含む、請求項３８の方法。
【請求項５１】該重合体が塑性ポリペプチドを含む、請求項３５の方法。
【請求項５２】天然組織の治癒又は再成長を補助するための一つ又は複数
の生物学的に活性な因子をさらに含む薬学的に許容される液状担体に、該重合体
が含有される、請求項３５の方法。
【請求項５３】哺乳動物における椎間板の組織回復のための方法であって
、該方法が部位温度（Ｔ_s）を有する枯渇した髄核部位に、重合体を注射する工程を含み、該重合体が、ペンタペプチド及びテトラペプチド単量体単位からなる
群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を、単独で又は組み合わせて、含
み、該単量体単位がβターン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離さ
れた一連のβターンを形成し、（ｉ）該重合体がＴ_sより低い逆温度転移Ｔ_tを有
し、（ii）該重合体が付加的な水が実質的に存在しないコアセルベート濃度の水
溶液として注射され、膨潤して該板内の圧力を増加させ、（iii）該コアセルベートがＴ_sにおける５×１０⁴〜５×１０⁶Ｎ／ｍ²の剛性率を有する、方法。
【請求項５４】該重合体が架橋されている、請求項５３の方法。
【請求項５５】該重合体が、該単量体単位と１〜２０アミノ酸を含有する
第二のペプチド単位とから形成される共重合体である、請求項５３の方法。
【請求項５６】該重合体が、少なくとも２つの異なる単量体単位を含むブ
ロック共重合体又はランダム共重合体を含む、請求項５３の方法。
【請求項５７】該重合体が、エラストマー様のポリテトラペプチド又はポ
リペンタペプチドを含む、請求項５３の方法。
【請求項５８】該重合体が、ＶＰＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＶＰ（配列
番号４１）、ＧＧＦＰ（配列番号４２）、及びＧＧＡＰ（配列番号５０）からな
る群より選択されるテトラペプチド単位を含む、請求項５７の方法。
【請求項５９】該重合体が、ＶＰＧＶＧ（配列番号１７）、ＧＶＧＶＰ（
配列番号２０）、ＧＫＧＶＰ（配列番号４３）、ＧＶＧＦＰ（配列番号４４）、
ＧＦＧＦＰ（配列番号４５）、ＧＥＧＶＰ（配列番号４８）、ＧＦＧＶＰ（配列
番号４９）、及び（ＧＶＧＩＰ）（配列番号５１）からなる群より選択されるペ
ンタペプチド単位を含む、請求項５７の方法。
【請求項６０】該重合体が、少なくとも一つの（ＧＶＧＩＰ）（配列番号
５１）であるペンタペプチド単位を含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】該単量体単位のうちの少なくとも一つがフェニルアラニン
残基を含む、請求項５３の方法。
【請求項６２】該重合体が、テトラペプチド単位及びペンタペプチド単位
からなる共重合体である、請求項５３の方法。
【請求項６３】該第二のペプチド単位が、ＧＲＧＤＳＰ（配列番号４６）
、ＧＶＧＶＡＰ（配列番号４７）、及びＶＧＶＡＰＧ（配列番号５２）からなる
群より選択される、請求項５５の方法。
【請求項６４】天然組織の治癒又は再成長を補助するための一つ又は複数
の生物学的に活性な因子をさらに含む薬学的に許容される液状担体に、該重合体
が含有される、請求項５３の方法。
【請求項６５】組織の組織増強のためのキットであって、該組織は、正常
な組織温度を有し、シリンジと、該シリンジを包囲し該シリンジのための無菌環
境を提供する無菌の包装材と、該シリンジに含有されている重合体（ここで、該
重合体はノナペプチド、ペンタペプチド、及びテトラペプチド単量体単位からな
る群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を含み、該単量体単位はβター
ン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された一連のβターンを形成
し、該重合体は該組織温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有する）とを含むキット。
【請求項６６】該重合体が、付加的な水が実質的に存在しないコアセルベ
ート濃度の水溶液として該シリンジ内に存在する、請求項６５のキット。
【請求項６７】天然組織の治癒又は再成長を補助するための一つ又は複数
の生物学的に活性な因子をさらに含む薬学的に許容される液状担体に、該重合体
が含有される、請求項６５のキット。
【請求項６８】該因子が、ヘパリン、上皮成長因子、トランスフォーミン
グ成長因子−α、トランスフォーミング成長因子−β、血小板由来成長因子、線
維芽細胞成長因子、結合組織活性化ペプチド、β−トロンボグロブリン、インス
リン様成長因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリス
ロポエチン、神経成長因子、インターフェロン、骨生成因子、及び骨形成因子か
らなる群より選択される、請求項６７のキット。
【請求項６９】椎間板の組織回復のためのキットであって、該板部位は正
常な組織温度を有し、１３〜１９ゲージのシリンジと、該シリンジを包囲し該シ
リンジのための無菌環境を提供する無菌の包装材と、該シリンジに含有された重
合体（ここで、該重合体はノナペプチド、ペンタペプチド、及びテトラペプチド
単量体単位からなる群より選択される繰り返しペプチド単量体単位を含み、該単
量体単位はβターン間にかけられた可動性架橋セグメントにより分離された一連
のβターンを形成し、該重合体は該組織温度より低い逆温度転移Ｔ_tを有する）とを含むキット。
【請求項７０】該重合体が付加的な水が実質的に存在しないコアセルベー
ト濃度の水溶液として該シリンジ内に存在する、請求項６９のキット。
【請求項７１】天然組織の治癒又は再成長を補助するための一つ又は複数
の生物学的に活性な因子をさらに含む薬学的に許容される液状担体に、該重合体
が含有される、請求項６９のキット。
【請求項７２】配列番号９、１０、１２〜１５、１８、２１、２２、２５
〜２７、２９、３４〜４０、及び５３〜６１のタンパク質式からなる群より選択
される重合体を含む、組織の増強又は回復における使用のためのタンパク質ベー
ス重合体。
【請求項７３】配列番号３５、３６、３７、３８、及び３９のタンパク質
式からなる群より選択される重合体を含む、請求項７２のタンパク質ベース重合
体。
【請求項７４】配列番号９、１０、１２〜１５、１８、２１、２２、２５
〜２７、２９、３４〜４０、及び５３〜６１のタンパク質式からなる群より選択
される重合体を含む、椎間板の組織回復における使用のためのタンパク質ベース
重合体。
【請求項７５】配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、及び６０
のタンパク質式からなる群より選択される重合体を含む、請求項７４のタンパク
質ベース重合体。