CN117618668A - 一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法及应用，该含胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白最终设计为水凝胶，水凝胶的基质为人源全长或者部分功能域的胶原蛋白COL II，刺激因子为人源全长或者部分功能域的软骨形成蛋白CHM 1，该融合蛋白可携带纯化标签或是不带纯化标签；该融合蛋白的两种蛋白之间通过柔性接头进行整合，融合蛋白可通过外源重组表达并进行纯化可获取；水凝胶可通过自主装或是生物化学或是生物物理化学交联方式获取。本发明的融合胶原蛋白和软骨形成蛋白的水凝胶具备良好的生物相容性，并且在抑制血管方面有显著作用，可实现干细胞向软骨细胞定向诱导，药物递送，可应用于软骨修复及骨关节炎临床治疗等领域，对于防治软骨损伤及关节炎具有重要意义。

Description

一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制 备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法及应用。

背景技术

水凝胶（Hydrogel）作为一种极为亲水的软体材料，因其生物相容性好且结构强度适中，一经发现就在组织工程和医学领域大放异彩，并在骨修复以及伤口敷料等领域得到了广泛的应用。凝胶的聚集态既非完全的固体也非完全的液体。固体行为是一定条件下可维持一定的形状与体积，液体行为是溶质可以从水凝胶中扩散或渗透。水凝胶具备柔韧且多孔的三维结构，允许营养物质和氧气有效扩散，可携带并缓释细胞因子和药物，促进组织修复。因其具有疏松多孔的结构，它提供了足够的空间来容纳各种材料，如小分子、聚合物和颗粒等。由于存在交联网络，水凝胶可以溶胀和保有大量的水，交联度越高，吸水量越低。水凝胶中的水含量可以低到百分之几，也可以高达99%。当水凝胶含水量＞95%，可一定程度模拟天然组织微环境结构。水凝胶的许多关键特性，如机械刚度、弹性、含水量、生物活性和降解，可以通过选择合适的材料和化学成分来合理设计和调整作为支架。通过改变聚合物的种类、交联的类别以及聚合方法，可以轻松地调整水凝胶的性能，如含有细胞黏附位点、降解速率匹配骨生成速率、大孔径、柔软的水凝胶可降低促炎反应并减少纤维包裹厚度，促进骨生成。人工合成的水凝胶通常存在凝胶强度低、韧性差和吸水速度慢等缺点，无法满足使用的要求。研究者针对提高水凝胶的力学性能开展了大量的研究工作，开发了几类具有优异机械性能的新型凝胶，如双网络(DN)水凝胶、互穿网络(IPN)水凝胶、拓扑滑环水凝胶和纳米复合(NC)水凝胶，这些水凝胶被应用于生物医学、柔性电子设备、医药、组织工程以及废水处理等领域。

Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，是软骨细胞外基质（ECM）的重要有机成分之一，是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度,多存在于骨骼、关节、肌腱等组织，在维持软骨的生理功能方面起着关键作用。Ⅱ型胶原蛋白是关节软骨的主要蛋白，占关节软骨干重的60-80%，占软骨纤维网络结构的90-95%，构成了关节软骨抗张强度的结构基础。Ⅱ型胶原蛋白被认为是软骨的特征性胶原蛋白，对细胞的粘附、增殖、细胞表型及活性的维持具有重要作用。在软骨组织工程技术中，由于其具有良好的生物相容性、可降解性、低免疫原性和维持软骨组织的完整性的特点，Ⅱ型胶原蛋白成为软骨组织工程中极具潜力的支架材料。以Ⅱ型胶原蛋白为支架材料可促进间充质干细胞增殖分化为软骨细胞，提高损伤软骨修复效果。Ⅱ型胶原蛋白在细胞存活、生长分化和软骨形成中起着重要的调节作用，是一种理想的生物支架材料。

蛋白接头通常分为3种，分别为柔性接头、刚性接头和可剪切接头。其中，柔性接头通常富含小的或亲水的氨基酸，如Gly或Ser，以提供结构灵活性，但可以含有额外的氨基酸，如Thr和Ala以保持柔韧性，Glu和Lys以提高溶解度。柔性接头可以保持相关功能域之间的距离，改善融合蛋白的折叠和稳定性。柔性接头是重组融合蛋白不可或缺的组成部分，在构建稳定的、具有生物活性的融合蛋白中发挥重要作用，可为融合蛋白的生产提供许多其他优势，如改善折叠和稳定性、促进蛋白表达、增加内在生物活性、实现体内靶向特定位点以及改变融合蛋白的药代动力学谱。当连接的域需要一定程度的移动或交互时，通常使用柔性连接。它们通常由小的非极性（如Gly）或极性（如Ser或Thr）氨基酸组成，这些氨基酸的小尺寸提供了灵活性，允许连接功能域的移动性。Ser或Thr的掺入可以通过与水分子形成氢键来保持接头在水溶液中的稳定性，因此减少接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。最常用的柔性连接子的序列主要由Gly和Ser残基（“GS”连接子）组成。最广泛使用的柔性接头是（Gly-Gly-Gly Gly-Ser）n序列。调整拷贝数“n”，可优化该GS接头的长度，以允许适当折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性，或是实现功能域的适当分离，或保持必要的域间相互作用。除了GS连接子，也有许多其他柔性连接子已被设计用于重组融合蛋白，如KESGSVSSEQUELAQFRSLD和EGKSSGSGSESKST，已用于构建生物活性单链可变片段（scFv）。

软骨形成蛋白I（CHM1）是一种软骨特异性糖蛋白，前体是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，在人类和小鼠中由334个氨基酸残基组成。软骨调节素Ⅰ( ChM-Ⅰ) 是软骨调节素家族中效应最强的一种软骨特异性生长因子，成熟的CHM I大小为25kDa左右。在生长板软骨中，CHM1位于静止区、增殖区和早期增生区软骨基质的间质空间，而在晚期增生区和钙化区其表达被消除，这允许血管侵入导致软骨内骨形成。软骨是无血管的，对周围血管丰富的间质的血管入侵表现出抵抗力。已有研究表明ChM1可诱导间充质干细胞分化为软骨细胞，ChM-I在维持关节软骨的无血管性方面具有重要的作用。CHM1作为一种双功能因子，既能在碱性成纤维细胞生长因子（FGF）存在下刺激软骨细胞生长，还能抑制软骨组织中血管生成，其表达仅限于软骨。CHM1在体外和体内具有抗血管生成和抗肿瘤特性，以非锚定的方式抑制多种人类肿瘤细胞的增殖，例如人类脐静脉内皮细胞、人类肝细胞癌HepG2细胞和人类骨原性肉瘤U-2 OS细胞。CHM1的过表达能显著降低细胞迁移和入侵能力，是一种潜在的肿瘤抑制剂。CHM1是治疗和生物工程再生应用的一个有前途的潜在目标，可作为治疗骨关节炎、感染性心内膜炎和癌症等疾病的治疗靶点。基于其抗血管生成和促进软骨细胞生成的作用，CHM1已被广泛应用于组织工程、药学、医学等领域。除了在软骨中，ChM-I在角膜、心脏瓣膜等无血管组织中也表达，它们的表达与各种病理生理状况紧密联系，因此ChM-I是众多领域研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法及应用，将二型胶原和软骨形成蛋白I通过柔性接头融合，并且将获取的融合蛋白交联形成水凝胶，该水凝胶具备抗血管，促软骨分化等多功能，可提高对软骨及关节损伤修复的效率。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，融合蛋白是由胶原蛋白、柔性接头、标签蛋白和软骨形成蛋白进行人工重组及微生物外源表达制备得到，再通过酶或化学交联剂或凝胶粘合剂的交联方式获取水凝胶。

进一步，所述的水凝胶由TG酶或是氧化酶交联融合蛋白后制备所得，为谷氨酰胺转胺酶，使蛋白质交联成大分子，水凝胶的软硬及机械强度可以通过融合蛋白的浓度来调节，氧化酶为酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶或巯基氧化酶中的一种。

进一步，所述水凝胶制备在使用TG酶时，充分混匀后在不同温度下（4℃-37℃）交联均可获得的水凝胶，其中TG酶后作用时间包括：在温度为30-37℃，酶作用时间大于30分钟；或者在温度为20-30℃下，酶作用时间大于120分钟；或者在温度为4-8℃下，酶作用时间大于12小时。

进一步，所述的水凝胶由化学交联剂交联融合蛋白后制备所得，水凝胶的软硬及机械强度可以通过融合蛋白的浓度以及交联剂的浓度协同调节，其中化学交联剂为花青素或京尼平。

进一步，所述的水凝胶由凝胶粘合剂交联融合蛋白后制备所得，水凝胶的软硬及机械强度可以通过融合蛋白的浓度以及交联剂的浓度协同调节，其中凝胶粘合剂为聚乙烯醇、卡波姆、是壳聚糖、明胶、透明质酸或海藻糖，其中融合蛋白在卡波姆充分混匀交联后，添加氢氧化钠或三乙醇胺中和剂得到水凝胶。

进一步，所述的水凝胶制备在添加聚乙烯醇后，水凝胶流动性随时间变化而变化，但在8%浓度下相对稳定。

进一步，所述的融合蛋白的成分中包括胶原蛋白、柔性接头、标签蛋白和软骨形成蛋白，其中起到纯化作用的标签蛋白为HIS标签、SUMO标签或GST标签中的一种或多种；其中起到连接胶原蛋白和软骨形成蛋白的柔性接头是具有连接、促折叠以及增强活性作用的高重复多肽；其中胶原蛋白和软骨形成蛋白，胶原蛋白为I型，II型，X型中的一种或多种，也可是其具有功能的部分氨基酸序列的一种或多种，来源可以是人源，鼠源及兔源等,软骨形成蛋白为CHM1的全长或是部分功能域或是其功能多肽。

进一步，所述的水凝胶的结构为多孔三维网络结构，其孔径大小为30nm-300um，该孔径大小可适用于递药系统，干细胞共培养，医美填充。

一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：将设计好的融合蛋白，即胶原蛋白、柔性接头、标签蛋白和软骨形成蛋白的基因序列进行合成；

第二步：将合成的融合蛋白基因片段和载体pET28a(+)进行双酶切；

第三步：通过胶回收将双酶切后的目的片段进行回收；

第四步：将回收的目的片段进行连接，随后进行涂板筛选获取阳性克隆，测序以检测完全正确；

第五步：将测序正确的阳性克隆摇菌并提取质粒，并通过热激的方式导入到大肠杆菌的感受态（BL21(DE3)）中进行涂板培养,该感受态能进行融合蛋白的表达；

第六步：挑取转化涂板后的菌落进行培养，待菌液OD600在0.6-0.8添加IPTG诱导剂进行诱导4-6h，随后收集菌液离心获取菌泥备用；

第七步：将菌泥裂解，超声破碎，根据蛋白是否在上清或是沉淀选择不同的纯化方式进行蛋白分离纯化；

第八步：纯化后的蛋白进行脱盐处理，并且通过冷冻干燥获取冻干的融合蛋白。

进一步，体外还可选取其他原核表达载体或是真核表达载体，表达宿主随表达载体的不同选择原核生物细胞和真核生物细胞。

一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶在关节或者软骨中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明基于融合蛋白的水凝胶生物相容性良好，在动物功能性和安全性实验中无死亡病例，且细胞增殖、迁移等相对对照组呈现显著，组织无坏死症状；本发明基于融合蛋白的水凝胶，能促进异位注射成软骨，原位软骨修复，从而提高了软骨或关节炎的修复和治疗潜能；本发明基于融合蛋白的水凝胶，能显著缓解骨关节炎的疼痛症状，并能加快治疗关节炎的进程。本发明水凝胶可实现干细胞向软骨细胞定向诱导，药物递送，可应用于软骨修复及骨关节炎临床治疗等领域，对于防治软骨损伤及关节炎具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中融合胶原蛋白和软骨形成蛋白的水凝胶的结构图；其中1-A包括二型胶原蛋白、柔性接头蛋白以及软骨形成蛋白；1-B包括二型胶原蛋白、柔性接头蛋白以及软骨形成蛋白，外加凝胶粘合剂卡波姆或是聚乙烯醇。

图2为本发明中获取融合胶原蛋白和软骨形成蛋白的水凝胶的方法示意图；其中2-A为TG酶交联方式；2-B为使用水凝胶粘合剂方式。

图3为本发明中构建融合蛋白的表达质粒酶切图、菌落图及测序比对，以融合全长二型胶原蛋白基因和软骨形成蛋白基因为例；其中3-A为酶切图，泳道1和5为Takara品牌DNA Marker DL10000，2-4为pET28a 空载SalI/NotI双酶切（白色框位置），6-8为pUC57-CC目的基因SalI/NotI双酶切（红色框位置）；其中3-B为转化TOP10感受态后所长菌落；其中3-C为菌落测序比对结果。

图4为本发明中融合蛋白在原核系统中诱导表达的SDS-PAGE及Werstern-Blot图；其中M为蛋白质Marker；其中4-A为诱导表达SDS-PAGE图，1-4诱导后；其中4-B为WB图，上图为内参，1-4诱导后，下图为融合蛋白，1-4诱导后；其中4-C为诱导表达SDS-PAGE图，1诱导前，2诱导后，3超声上清，4超声沉淀；其中4-D为WB图，同4-C；其中A和B为融合全长二型胶原蛋白和软骨形成蛋白，C和D为融合全长二型胶原蛋白和软骨形成蛋白部分的一种情况。

图5为本发明中粗纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中1裂解超声后，2超声后沉淀，3超声后上清，4洗涤液1次后上清，5洗涤液2次后上清，6洗涤液3次后上清，7变性后，8复性后。

图6为本发明中融合蛋白冷冻干燥后样品及其电镜图；其中6-A为形态学；其中6-B为电镜图。

图7为本发明中细胞相容性的试验结果；其中MSCs为兔来源骨髓间充质干细胞；其中Chondrocytes为软骨细胞。

图8为本发明中融合蛋白对血管内皮细胞的抑制成管的试验结果；其中HUVECS为血管内皮细胞。

图9为本发明中融合蛋白凝胶材料的宏观形貌图。

图10为本发明中融合蛋白异位成软骨的形成实验中软骨形成情况。

实施方式

以下结合实施例及附图对本发明进一步叙述，但本发明不局限于以下实施例。

如图1所示：本发明实施例的一种融合胶原蛋白和软骨形成蛋白的水凝胶，其水凝胶的结构为多孔三维网络结构，可在膝关节、髋关节等位置起到润滑和修复骨关节等作用，其孔径大小为30nm-300um，该水凝胶通过酶或是聚乙烯醇等交联方式获取，所述融合蛋白是由COL II、柔性接头、标签蛋白和CHM 1进行人工重组及微生物外源表达制备得到。

如图2所示：本发明实施例中所述融合蛋白不限于原核表达，也可用真核表达，对重组表面蛋白表达的宿主及对应启动子无特殊要求。

如图2所示：本发明实施例中所述交联中酶不限于TG酶，还可是氧化酶 (酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶、巯基氧化酶)、脂氧合酶和谷氨酰内肽酶等。

如图2所示：本发明实施例中所述水凝胶粘合剂不限于聚乙烯醇和卡波姆，还可是壳聚糖、明胶、透明质酸、海藻糖等。

如图2所示：本发明实施例中所述融合蛋白还包括柔性接头，柔性接头不仅限于(GGGGS)n,n=1-4,还可是（G）n,n=6-8等，G为甘氨酸，S为丝氨酸。

本发明实施例中重组表面蛋白的基因序列的前后顺序或蛋白上下游关系可变换。

本发明实施例中对连接两者的连接及其他重组蛋白的序列；对重组表面蛋白纯化方式及对应的纯化连接标签不作限定。

下面结合实施例，更进一步阐述本发明。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原蛋白基因和软骨形成蛋白基因的表达质粒构建。

如图3所示：通过NCBI网站获取及优化天然二型胶原蛋白COL2A1及软骨形成蛋白CHM1完整基因或部分功能基因序列；可以将天然COL2A1蛋白基因的完整或部分功能基因序列与柔性接头的基因序列融合；也可以先将天然CHM1蛋白基因的完整或是部分功能基因序列与柔性接头的基因序列融合；随后将该多种融合后的序列进行相对应的原核或是真核表达偏向性优化，优化后两端选取合适的酶切位点，此处原核选用（SalI/NotI）,送至第三方公司合成，合成后的目的基因存放在pUC57中。通过双酶切空白表达载体和目的基因存放载体，37℃，2h后，DNA凝胶电泳跑胶后切胶回收获取酶切后基因片段，在T4连接酶作用下室温半小时，随后转入TOP10感受态细胞中并且孵育涂板培养12h，挑取单克隆并进行测序，测序成功的单克隆即为携带目的蛋白表达载体的菌株。最后将菌株进行扩培，提取质粒，即可得到多种类（不同长度）融合二型胶原蛋白基因和软骨形成蛋白基因的表达质粒。

本实施例中以对应的二型胶原蛋白基因为对照组构建表达质粒。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白的获取。

如图4所示：实施例1中获取的多种类（不同长度）融合二型胶原蛋白基因和软骨形成蛋白基因的表达质粒分别通过原核热激转化的方式（42℃水浴90秒）导入到大肠杆菌蛋白质表达系统的感受态细胞中，或是通过电转方式导入到酵母表达系统的感受态细胞中。

本实施例中采用大肠杆菌为合成宿主，T7或SP6启动子为被载体的启动子，经1 mMIPTG诱导后，分别获得过量表达的重组蛋白，所述重组蛋白包括：完整COL2A1蛋白或部分功能的COL2A1蛋白片段，融合完整COL2A1蛋白和CHM1蛋白或融合部分功能的COL2A1蛋白和部分功能的CHM1蛋白；

对获得的完整COL2A1蛋白或部分功能的COL2A1蛋白片段SDS-PAGE/WB鉴定，纯化，冷冻干燥，保存；对获得的融合完整COL2A1蛋白和CHM1蛋白或融合部分功能的COL2A1蛋白和部分功能的CHM1蛋白SDS-PAGE/WB鉴定，纯化，冷冻干燥，保存；

采用毕赤酵母为合成宿主，GAP或AOX1启动子为被载体的启动子，经甲醇或低温等方式诱导后，分别获得过量表达的重组蛋白，所述重组蛋白包括：完整COL2A1蛋白或部分功能的COL2A1蛋白片段，融合完整COL2A1蛋白和CHM1蛋白或融合部分功能的COL2A1蛋白和部分功能的CHM1蛋白；

对获得的完整COL2A1蛋白或部分功能的COL2A1蛋白片段进SDS-PAGE/WB鉴定，纯化，冷冻干燥，保存；对获得的融合完整COL2A1蛋白和CHM1蛋白或融合部分功能的COL2A1蛋白和部分功能的CHM1蛋白SDS-PAGE/WB鉴定，纯化，冷冻干燥，保存。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白的纯化

如图5所示：实施例2中大量获取的菌泥，可以通过菌体裂解，裂解之前用纯化水清洗1次菌体，往收集的菌体以1：10-1：20的比例（w/v）加入裂解液，充分悬浮后进行高压均质处理，之后8000转，30min离心，弃上清，收集沉淀，称重，计算包涵体蛋白占菌体的比例。裂解液：50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，pH 8.0.

往上述沉淀中按1：20-1：30的比例（w/v）加入洗涤液1，匀速搅拌30 min，8000 rpm4℃离心30min，弃上清，收集沉淀；相同条件分别进行洗涤2和洗涤3的洗涤，然后称重，测定洗涤后包涵体蛋白的重量。洗涤液1：50 mM Tris，0.1 M NaCl，0.1 mM EDTA，5 %甘油，0.1mM DTT，1 % TritonX-100， pH 8.0；洗涤液2：50 mM Tris，0.1 M NaCl，0.1 mM EDTA，5 %甘油，0.1 mM DTT，1 M 尿素， pH 8.0；洗涤液3：50 mM Tris，0.1 M NaCl，5 %甘油，1 M 尿素，pH 8.0。

往上述洗涤后的包涵体中按大约1：20-1：30的比例（w/v）加入变性液在25±1℃下调节pH至9.00±0.02（加入蛋白后再调节pH）， 25℃匀速搅拌过夜；然后12000rpm 25℃离心30 min，取上清液。测蛋白浓度。变性液：50 mM Tris，8 M 尿素，20mM DTT，pH 9.00±0.02（DTT加蛋白之前加）。

将变性液以约1:20-1：30体积比例稀释到复性液中（变性液体积，pH忽略不计）。把复性蛋白液置4℃复性48小时后，用透析袋进行脱盐。随后冷冻干燥，保存；

复性液：50 mM Tris，150 mM NaCl，0.5 M L-Arg，0.1mM GSSG，1 mM GSH，10%甘油，pH 8.0±0.02；透析液：水。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白冷冻干燥后样品和电镜结果。

如图6所示：实施例2中冷冻干燥的样品，将其使用消毒后的镊子夹出来，进行手机拍照，得宏观图6-A，如图所示，可见多孔疏松结构，呈现三维立体多孔网络状。

取少量样品在导电胶的作用下粘在电镜置物台上，并将其喷金处理，90秒即可充分喷金，随后将其移至电镜中进行拍摄，即可得到如图6-B的电镜照片，观察可知融合蛋白呈现多孔结构，孔径范围在30nm-300um。该结构可以满足细胞的存活，也可达到缓慢释放的效果。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白的细胞生物学评价。

如图7所示：实施例2中冷冻干燥的样品的细胞相容性均进行了试验，试验方法采用现有技术中已知的细胞增殖的试验方法，试验结果如图7所示。可知融合蛋白可促进间充质干细胞以及软骨细胞增殖，有良好的细胞相容性，融合蛋白水凝胶材料能够用于制备生物材料器械，例如制备生物材料支架等。对照组均以相对应的二型胶原蛋白为对照。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白的血管成管抑制试验。

如图8所示：实施例2中冷冻干燥的样品的血管成管均进行了试验，试验方法采用现有技术中已知的血管内皮细胞血管成管试验方法，试验结果如图8所示。可知融合蛋白可抑制血管内皮细胞成管。融合蛋白组相对于PBS和二型胶原组相比，融合蛋白组显著抑制血管成管，在添加了VEGF生长因子组中，融合蛋白质组虽然在血管长度，血管密度，血管面积，血管分支点上有所提升，然而和PBS和二型胶原组相比，依然有显著抑制血管成管的作用。从以上结果可以判定融合蛋白可显著抑制血管内皮细胞成管。对照组均以相对应的二型胶原蛋白为对照。该结果也揭示了融合蛋白在软骨修复以及骨关节炎治疗方面的潜力。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白的细胞生物学评价。

如图9所示：实施例2中冷冻干燥的样品复溶后在添加了8%聚乙烯醇以后，呈现水凝胶状，聚乙烯醇易溶于水。如图所示，1.5mlEP管中水凝胶不会掉落，说明水凝胶成型，并且高低浓度的融合蛋白呈致密的结构。

以上是使用聚乙烯醇得到的水凝胶状态，还有卡波姆，TG酶以及化学交联剂如花青素，京尼平等都是该实施例中的一种。

此处选用聚乙烯醇只是为了阐述该实施例，并非对保护内容进行限制。

实施例

多种类（不同长度）融合二型胶原和软骨形成蛋白的融合蛋白在成软骨方面的潜力试验。

如图10所示：实施例7中得到的水凝胶异位植入裸鼠中。实验中分组情况员如下：将实验动物在SPF鼠房饲养一周适应环境后，进行皮下移植材料手术。实验动物共分为3组，每组6只。用适量1%的水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，麻醉后将裸鼠放至俯卧位，用碘伏消毒裸鼠背部皮肤，使用无菌手术刀和眼科镊在裸鼠背部做1厘米左右小切口，将眼科镊从切口处小心探入皮下部位，向前后左右多个方向扩开，分离皮肤和皮下组织，形成可容纳样品的空间，将样品植入皮下，并远离切口，缝合，用碘伏消毒。将裸鼠放入笼中饲养，每天观察记录裸鼠的生长状况。分别在术后第4周和第8周麻醉、处死裸鼠并取样。取样后石蜡切片进行HE和番红O染色观察软骨形成情况。如图9左结果显示植入物周围有软骨漩涡形成（箭头）；图9右软骨区域红色显示有软骨形成；综合HE和番红O结果可知在第4周植入物可促进软骨形成。

Claims (11)

1.一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，融合蛋白由胶原蛋白、柔性接头、标签蛋白和软骨形成蛋白进行人工重组及微生物外源表达制备得到，再通过酶或化学交联剂或凝胶粘合剂的交联方式获取水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶由TG酶或是氧化酶交联融合蛋白后制备所得，为谷氨酰胺转胺酶，使蛋白质交联成大分子，水凝胶的软硬及机械强度可以通过融合蛋白的浓度来调节，氧化酶为酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶或巯基氧化酶中的一种。

3.根据权利要求2所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶制备在使用TG酶时，充分混匀后在不同温度下（4℃-37℃）交联均可获得的水凝胶，其中TG酶后作用时间包括：在温度为30-37℃，酶作用时间大于30分钟；或者在温度为20-30℃下，酶作用时间大于120分钟；或者在温度为4-8℃下，酶作用时间大于12小时。

4.根据权利要求1所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶由化学交联剂交联融合蛋白后制备所得，水凝胶的软硬及机械强度可以通过融合蛋白的浓度以及交联剂的浓度协同调节，其中化学交联剂为花青素或京尼平。

5.根据权利要求1所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶由凝胶粘合剂交联融合蛋白后制备所得，水凝胶的软硬及机械强度可以通过融合蛋白的浓度以及交联剂的浓度协同调节，其中凝胶粘合剂为聚乙烯醇、卡波姆、是壳聚糖、明胶、透明质酸或海藻糖，其中融合蛋白在卡波姆充分混匀交联后，添加氢氧化钠或三乙醇胺中和剂得到水凝胶。

6.根据权利要求5所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶制备在添加聚乙烯醇后，水凝胶流动性随时间变化而变化，但在8%浓度下相对稳定。

7.根据权利要求1所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的融合蛋白的成分中包括胶原蛋白、柔性接头、标签蛋白和软骨形成蛋白，其中起到纯化作用的标签蛋白为HIS标签、SUMO标签或GST标签中的一种或多种；其中起到连接胶原蛋白和软骨形成蛋白的柔性接头是具有连接、促折叠以及增强活性作用的高重复多肽；其中胶原蛋白和软骨形成蛋白，胶原蛋白为I型，II型，X型中的一种或多种，也可是其具有功能的部分氨基酸序列的一种或多种，软骨形成蛋白为CHM1的全长或是部分功能域或是其功能多肽。

8.根据权利要求1所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶的结构为多孔三维网络结构，其孔径大小为30nm-300um，该孔径大小可适用于递药系统，干细胞共培养，医美填充。

9.一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步：将设计好的融合蛋白，即胶原蛋白、柔性接头、标签蛋白和软骨形成蛋白的基因序列进行合成；

第二步：将合成的融合蛋白基因片段和载体pET28a(+)进行双酶切；

第三步：通过胶回收将双酶切后的目的片段进行回收；

第四步：将回收的目的片段进行连接，随后进行涂板筛选获取阳性克隆，测序以检测完全正确；

第五步：将测序正确的阳性克隆摇菌并提取质粒，并通过热激的方式导入到大肠杆菌的感受态（BL21(DE3)）中进行涂板培养,该感受态能进行融合蛋白的表达；

第六步：挑取转化涂板后的菌落进行培养，待菌液OD600在0.6-0.8添加IPTG诱导剂进行诱导4-6h，随后收集菌液离心获取菌泥备用；

第七步：将菌泥裂解，超声破碎，根据蛋白是否在上清或是沉淀选择不同的纯化方式进行蛋白分离纯化；

第八步：纯化后的蛋白进行脱盐处理，并且通过冷冻干燥获取冻干的融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征在于，体外还可选取其他原核表达载体或是真核表达载体，表达宿主随表达载体的不同选择原核生物细胞和真核生物细胞。

11.根据权利要求1所述的一种基于胶原蛋白和软骨形成蛋白的融合蛋白的水凝胶在关节或者软骨中的应用。