CN115947827A - 一种重组胶原蛋白及其在软骨修复基质中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组胶原蛋白及其在软骨修复基质中的用途。本发明提供的重组胶原蛋白包含以SEQ ID No.1所示的序列；所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G‑Xaa1‑Xaa2‑G‑E‑Xaa3”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列。本发明提供的重组胶原蛋白具有较为明显的整合素结合活性，具有促进细胞黏附、增殖、分化，修复软骨组织缺损等的效果，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，特别是涉及一种重组胶原蛋白及其在软骨修复基质中的用途。
背景技术
关节软骨损伤已成为骨科常见疾病，创伤、关节炎和运动相关损伤等均可引起关节软骨损伤或缺损。关节软骨的修复主要靠软骨细胞的增殖分化，产生足够的细胞外基质修复软骨缺损。然而健康成人软骨细胞通常是静止的、具备高度分化的细胞，因其本身血管化程度低，营养主要来源于关节液和软骨下骨，如发生创伤性或病理性损伤，关节软骨的修复再生十分有限。目前，临床上用到的一些治疗方法有微骨折法、骨软骨移植法、软骨细胞移植法等，这些方法能在一定程度上修复软骨缺损，缓解患者的痛苦，但是长期效果并不令人满意，重要的原因就是这些方法重建出来的软骨与正常的透明软骨相比，在组织和结构上有很大的差别，从而导致在组织学和生物力学性能上与人的正常软骨存在着差距。
近年来，组织工程在获得功能性关节软骨方面取得了相当大的进展，一些生物工程治疗策略包括干细胞方法和支架技术已被提出，以提供微创和更有效的方式修复关节软骨。支架材料作为组织工程的三大要素之一，在组织工程软骨的构建中发挥着重要的作用，其力学性能和化学组成将影响细胞的粘附、增殖和细胞表型等。胶原蛋白以其出色的生物相容性、生物活性以及生物降解性，成为组织工程研究较为深入的生物材料。但传统的胶原蛋白大部分来源于动物，动物源胶原蛋白的氨基酸序列与人的胶原蛋白相似度较高，如哺乳动物猪、牛与人的相似度为95％，鱼与人的相似度65％，但将动物源胶原蛋白用于生物材料或医疗器械时，这些差异可能带来明显的免疫排斥、致敏反应以及病毒感染和传播等风险。同时，由于不同亚型的天然胶原在组织、器官中分布不均且以复合形态共存，所以从生物组织提取胶原的效率很大程度取决于其天然丰度，也难以避免的存在不同亚型的混合。因此，动物源胶原蛋白的批次稳定性、纯度、分子量及分布等方面的不足进一步限制了其在生物医学领域的诸多应用。
为了解决上述问题，科研人员把目光聚焦到利用基因工程技术制备重组胶原蛋白的研究。重组胶原蛋白以人天然的胶原蛋白基因序列为基础，选择其中具有特定功能表达的密码子，经适当修饰、编辑后转录至宿主细胞并利用生物发酵技术实现规模化生产得到的重组蛋白材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对动物源胶原蛋白的不足，提供一种重组胶原蛋白及其在软骨修复基质中的用途，提供的重组胶原蛋白具有较为明显的整合素结合活性，可以促进细胞的黏附、增殖、分化，具有修复软骨组织缺损的效果。
整合素结合活性与整合素家族相关，整合素家族是一类分布广泛的跨膜糖蛋白，是连接细胞外基质与细胞内信号传导的纽带。整合素由α亚单位和β亚单位通过非共价键连接成异二聚体，目前已发现18种α亚基和8种β亚基，可组合成至少24种整合素二聚体。细胞黏附分子整合素家族是细胞外基质与炎症细胞、成纤维细胞等实质细胞之间的主要连接物质，与细胞的黏附、铺展、迁移、功能表达以及组织纤维化的发生、维持和发展密切相关，可以调控细胞和细胞之间以及细胞和细胞外基质之间的识别和粘附等相互作用。
本发明的第一目的在于提供一种重组胶原蛋白，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；
其中，N为4以上的整数；n1为3以上的整数。
进一步地，所以N值为4～300以上的整数，进一步为4～200以上的整数。
所述N值的取值能够使重组胶原蛋白的分子量达到1kDa～250kDa，进一步达到3kDa～150kDa。
进一步地，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中。
进一步地，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：
[-G-E-Xaa3-Yaa1-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n2-Yaa2-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa3-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa4-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n4-..............-Yaan-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n-Yaan+1-G-Xaa1-Xaa2-]N
其中，所述Xaa1为非极性疏水氨基酸；所述Xaa2为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；所述Xaa3为碱性氨基酸；
Yaa1，Yaa2，Yaa3，Yaa4，.........，Yaan，Yaan+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；
n2、n3、n4、........、n为0以上的整数，两者不同时为0。
本发明所述非极性疏水氨基酸包括甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；进一步包括苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种。
所述碱性氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种，进一步为赖氨酸或精氨酸。
进一步地，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签。
在本发明的一实施例中，如前所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的第二目的在于提供前述重组胶原蛋白的制备方法，采用基因重组技术，通过宿主细胞表达、提取、纯化获得重组胶原蛋白；所述重组胶原蛋白的氨基酸序列由多次重复的基本重复单元重复连接获得；
进一步地，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；
其中，N为4以上的整数；n1为3以上的整数；
更进一步地，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中。
所以N值为4～300以上的整数，进一步为4～200以上的整数；所述N值的取值能够使重组胶原蛋白的分子量达到1kDa～200kDa，进一步为达到3kDa～150kDa。
N值的取值可以取自本发明限定的范围值两端的端点值，也可取自范围值里的任一整数，例如，N值可以为1、3、10、50、70、90、95、100、125、150等。
进一步地，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签；
所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：
[-G-E-Xaa3-Yaa1-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n2-Yaa2-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa3-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa4-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n4-............-Yaan-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n-Yaan+1-G-Xaa1-Xaa2-]N
其中，所述Xaa1为非极性疏水氨基酸；所述Xaa2为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；所述Xaa3为碱性氨基酸；
Yaa1，Yaa2，Yaa3，Yaa4，.........，Yaan，Yaan+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；
n2、n3、n4、........、n为0以上的整数，两者不同时为0。
本发明的第三目的在于提供前述重组胶原蛋白在制备用于调控细胞黏附、增殖、分化的产品中的用途。
本发明的第四目的在于提供前述重组胶原蛋白在制备软骨修复基质的产品中的用途。
本发明所述重组胶原蛋白前述用途中应用时，可以与高分子和/或其衍生物配合使用，所述高分子包括天然高分子、合成高分子；进一步地，所述天然高分子包括但不限于透明质酸、壳聚糖、海藻酸、纤维素等；进一步地，所述合成高分子包括但不限于PLA、PGA、PLCL、PVA。
本发明所述重组胶原蛋白在前述用途中应用时，使用浓度为0.01～100mg/mL，例如，可以是0.01mg/mL、0.05mg/mL、2mg/mL、4.5mg/mL、7mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、80mg/mL、100mg/mL等，使用浓度与应用部位和场景有关。
本发明的第五目的在于提供一种软骨修复基质，包括高分子和/或其衍生物、前述的重组胶原蛋白。
进一步地，所述高分子包括天然高分子、合成高分子；更进一步地，所述天然高分子至少选自透明质酸、壳聚糖、海藻酸、纤维素中的任意一种；更进一步地，所述合成高分子至少选自PLA、PGA、PLCL、PVA中的任意一种。
本发明的第六目的在于提供前述软骨修复基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)将透明质酸衍生物溶解在缓冲液中，加入EDC/sNHS溶液反应；
(2)将所述的重组胶原蛋白加入到步骤(1)中的反应体系中反应，对反应后得到的溶液进行透析、干燥，得到复合基质；
(3)将复合基质溶解后，加入光引发剂溶液，即得软骨修复基质；
人源化胶原蛋白由于分子量小，机械性能差，经改性之后也难以成胶，不能满足软骨组织工程的需求。本发明实施例中，首先用甲基丙烯酸酐对透明质酸进行适度的化学改性，引入不饱和碳碳双键，然后通过加入EDC/sNHS活化透明质酸中的羧基，再加入重组人源化胶原蛋白使得蛋白上的氨基与透明质酸上活化的羧基进行酰胺化反应使两者偶联，最终通过光交联制备得到的复合水凝胶不仅具有良好的机械性能以及生物相容性，而且光交联的方式使得操作更加简便，能够满足软骨组织工程的需求，同时也满足了临床上对不规则缺损的填充等。
进一步地，步骤(1)所述的高分子衍生物是采用甲基丙烯酸酐进行改性的透明质酸；
进一步地，改性后的透明质酸分子量为100～1500kDa，优选为300～600kDa，更优选为300kDa；
进一步地，步骤(1)所述的透明质酸改性接枝度为20～60％，优选为30～50％；
进一步地，步骤(1)中，将EDC、sNHS加入后，sNHS浓度为0.5～5mM，EDC浓度为0.5～5mM；更进一步地，sNHS浓度为1～3mM，EDC浓度为2～4mM。
本发明中，步骤(1)中，加入EDC/sNHS溶液后的混合溶液pH值为4～5，优选为4.75；
反应后的混合溶液pH值为7～8，反应时间为2～5h；优选pH值为7.4，反应时间为3h。
本发明中，步骤(2)中，重组胶原蛋白：高分子衍生物的质量比为0.5～30:2～10；进一步为0.5～20:6；更进一步为1～11:6；
进一步地，步骤(2)中的反应时间为5～15h，优选为8～12h；
进一步地，步骤(2)中，将反应后的溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，去离子水透析2～4天后，冷冻干燥，得到复合基质。
本发明采用的光引发剂至少为LAP、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)中的一种，终浓度为质量体积比0.01-0.05％，优选为0.05％。
本发明中，步骤(3)中加入光引发剂后的复合基质浓度为2～30mg/ml，进一步为5～20mg/ml，更进一步为7～17mg/ml。
本发明所述软骨修复基质为一种包含所述重组胶原的产品，可以作为包括但不限于植入材料、组织工程支架材料、软组织填充材料、细胞或其它活性物质载体材料等医疗器械的组成部分。
本发明软骨修复基质在临床引用时可以加细胞后制备成软骨修复水凝胶，或者不加细胞，直接应用在软骨缺损部位。
本发明的第七目的在于提供一种软骨修复水凝胶的制备方法，将前述方法制备得到的软骨修复基质与软骨细胞或骨髓间充质干细胞复合后，注射至软骨损伤部位，光照后形成软骨修复水凝胶。
所述光照的波长根据所用的引发剂进行适应性选择。
本发明所述软骨修复水凝胶还包括生理学上可接受的载体材料。
这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。
所述组合物还可以根据需要与其他功能性材料配合使用，比如具有抗菌抑菌作用的成分、抗衰老成分、抗凝血成分、抗氧化成分、生长因子等。
所述组合物可以按照制剂学或化妆品常规技术制备，包括将作为活性成分的本发明的重组胶原蛋白与载体混合，按照常规技术制成所需要的剂型。可以根据需要，将本发明的组合物配制成制成多种剂型，包括但不限于口服施用制剂、黏膜施用制剂、注射制剂、吸入制剂和外用制剂等。
本发明所述产品包括但不限于药物、食品、保健品或化妆品、日用品。
有益效果：
(1)本发明提供的重组胶原蛋白具有较为明显的整合素结合活性，具有促进细胞黏附、增殖、分化，修复软骨组织缺损的效果，具有较好的应用前景。
(2)本发明将透明质酸与人源化胶原蛋白共价交联形成稳定形态复合水凝胶基质具有良好的机械性能，能够很好的维持复合物的形态；具有良好的生物相容性，而且光交联的方式使得操作更加简便，能够满足软骨组织工程的需求，同时也满足了临床上对不规则缺损的填充等。
附图说明
图1为成纤维细胞细胞粘附生长结果；
图2为成纤维细胞细胞粘附的OD值；
图3为软骨细胞粘附生长结果；
图4为软骨细胞粘附的OD值；
图5为不同浓度序列A和序列B对人牙龈成纤维细胞的粘附实验结果；
图6为软骨细胞/水凝胶复合物在体外培养1、7、14、21天后的形态图；
图7为软骨细胞/水凝胶复合物在体外培养1、7、14天后软骨细胞的黏附的OD值；
图8为软骨细胞/水凝胶复合物在体外培养1、7、14天后软骨细胞的CCK-8图；
图9为软骨细胞/水凝胶复合物的染色结果；
图10为软骨细胞/水凝胶复合物的二型胶原免疫组化染色结果；
图11为软骨细胞/水凝胶复合物的GAG定量检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
实施例1
编码所述重组胶原蛋白的核苷酸序列，构建包含该核苷酸序列的载体，构建并筛选包含该载体的宿主细胞(可以是原核细胞或真核细胞)，在适当条件下培养宿主细胞表达蛋白，收集并纯化表达的重组胶原蛋白。
本发明中涉及的基因重组及转录是指合成编码重组胶原的核苷酸序列，通过常规技术将核苷酸序列克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到宿主细胞中，构建并筛选获得工程菌株。转化方法包括但不限于电穿孔、CaCl2转化等；表达载体可以是pET26、pET32、pGEX-6p、pPIC9、pPIC9K等常用载体，可以是质粒、噬菌体、病毒或其它载体；宿主细胞可以是肠杆菌科细胞(例如大肠杆菌BL21、DH5α等)等微生物细胞、酵母(例如毕赤酵母、酿酒酵母等)或CHO细胞等真核细胞。
本发明中涉及的发酵培养是指在无菌发酵罐中，将筛选并经过蛋白高表达鉴定的工程菌株与适宜的发酵培养液在适宜的温度、压力和pH条件下进行诱导发酵培养。
本发明中涉及的蛋白的分离与纯化是指菌体经溶菌、均质、分离等处理后获得菌液，进一步通过常规的蛋白分离和纯化技术获得重组胶原蛋白。分离和纯化技术包括但不限于过滤、离心、盐析、透析、液相层析、离子交换层析、亲和层析等。
在本发明实施例中，基因重组及转录以大肠杆菌为宿主细胞为例，具体为：
1、大肠杆菌发酵制备重组胶原蛋白
基因重组与转录：利用PCR的方法将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，选择pET-32a构建得到表达载体后转入大肠杆菌表达菌株BL21中，经培养、筛选后获得具有蛋白高表达的大肠杆菌基因工程菌。
发酵培养：从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于装有10mLLB培养基的100mL三角瓶中，于37℃、220rpm培养12-16h；将菌液按照1:100的比例接种到装有LB培养基的发酵罐中放大培养，于37℃、220rpm培养3h至OD600约为0.6时，加入0.5mM IPTG，在16℃诱导培养20h后离心收集菌体。
蛋白的分离与纯化：用Tris缓冲液重选菌体后，高速搅拌使菌体完全溶解，离心收集上清液并降温至4℃；上清液采用1μm、0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤后进一步采用亲和层析纯化得到重组胶原蛋白。
2、细胞培养方法
1)试样制备：重组胶原蛋白用PBS配制成一定浓度溶液(如0.5mg/ml)，动物源胶原蛋白溶液用PBS稀释至相同浓度(如0.5mg/ml)，PBS为空白对照组；
2)铺板：将实验溶液分别加入到96孔板中，每孔加入100μL，每组5个复孔，在4℃条件下静置过夜；
3)封闭：待铺板结束后，移除孔板中的液体后用200μL PBS溶液清洗2次，加入100μL经热灭活的1％ BSA-PBS溶液，在37℃、5％ CO2的培养箱中孵育1h；
4)细胞接种：待孵育结束后，移除孔板中的液体后用200μL PBS溶液清洗2次，每孔加入100μL密度为5×104-1×106个/ml的细胞悬液，在37℃、5％ CO2的培养箱中孵育1h；
5)检测：待孵育结束后，移除孔板中的液体后用200μL PBS溶液清洗2次，加入150μL CCK-8，在37℃、5％ CO2的培养箱中孵育1h后，从中吸取100μL检测液加入到新的96孔板中于450nm检测吸光度值(OD)。
试验例1：
采用实施例1的方法，制备下列3种含有不同氨基酸序列的重组胶原蛋白。
具有上述多个特征氨基酸序列组合的重复单元直接重复连接16次获得的重组胶原蛋白，提高细胞的黏附、迁移、功能表达等系列实验；(重复连接序列A16次，序列A：GERGAP GFR GPA GPN GIP GEK GPA GER GAP)
另一种具有不同上述特征氨基酸序列的重复单元直接重复4次获得的重组胶原蛋白，对细胞的粘附、增殖作用有所差异。(重复连接序列B 4次，序列B：GEK GSP GAD GPA GAPGTP GPQ GIA GQR GVV GLP GQR GER GFP GLP GPS GEP GKQ GPS GAS)；
上述重复单元重复连接16次的重组胶原蛋白加入标签后，对细胞的粘附、增殖作用明显降低；(重复连接序列C16次，序列C：HHHHHH GER GAP GFR GPA GPN GIP GEK GPAGER GAP)
采用实施例1中细胞培养方法对上述3种胶原蛋白进行成纤维细胞粘附、软骨细胞粘附实验、人牙龈成纤维细胞促粘附实验，
实验结果如图1～3。
图1结果表明，具有较多特征氨基酸序列组合的序列A重复连接得到的重组胶原实验组中有十分明显的成纤维细胞粘附且细胞形态良好；特征氨基酸序列减少后的序列B重复连接得到的重组胶原实验组和动物胶原组具有类似的成纤维细胞粘附与细胞形态；而添加标签后序列C重复连接得到的重组胶原组的成纤维细胞粘附明显减少，空白对照组的成纤维细胞黏附很少。
图2结果表明，具有较多特征氨基酸序列组合的序列A重复连接得到的重组胶原实验组最能促进成纤维细胞的粘附，其次是动物胶原和序列B重复连接得到的重组胶原，该三组中成纤维细胞的粘附量均显著高于序列C重复连接得到的重组胶原和空白对照；序列C重组胶原组中成纤维细胞的粘附量稍高于空白对照。
图3结果表明，动物胶原组中软骨细胞的粘附最明显，几乎铺满了整个视野；其次是序列A重组胶原组，软骨细胞粘附明显且相对较为集中，细胞形态良好；序列B重组胶原组中粘附的软骨细胞较为分散，仅有少部分集中，细胞形态良好；序列C重组胶原组中粘附的软骨细胞分散分布且数量较少；空白对照组中仅有少量的软骨细胞粘附且分散分布。
图4结果表明，动物胶原最有利于促进软骨细胞的粘附，显著高于其它各组；具有较多特征氨基酸序列组合的序列A重组胶原组显著高于序列B重组胶原组、序列C重组胶原组和空白对照组；序列B重组胶原组显著高于序列C重组胶原组和空白对照组；序列C重组胶原组稍高于空白对照组，但无统计学差异。
图5人牙龈成纤维细胞促粘附实验结果表明，具有较多特征氨基酸序列组合的序列A重组胶原组在不同浓度情况下均比序列B更有利于人牙龈成纤维细胞的粘附；随着重组胶原浓度的提高，人牙龈成纤维细胞的粘附也逐渐增加。
实施例2重组胶原蛋白在促进软骨修复中的应用
采用实施例1的方法，制备符合本发明氨基酸序列特征的重组胶原蛋白，其中重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列核心序列优选为GERGAPGFRGAPGPNGIPGEKGPAGERGAP(序列A)，重复连接16次，将其用于促进软骨修复。具体步骤为：
(1)将分子量为300KDa，改性程度为37％的甲基丙烯酸化透明质酸(HA-MA)，溶解在MES缓冲溶液中，得到1mM的甲基丙烯酸化的透明质酸溶液；
(2)将固体形态的sNHS和固体形态的EDC依次加入到混合溶液中，使得sNHS浓度为2mM，EDC浓度为3mM，并用1.0M NaOH溶液或1.0M HCl溶液将混合溶液的pH维持在4.75；
(3)室温下搅拌反应2h；
(4)用1.0M NaOH溶液调节反应体系pH为7.4；
(5)将重组人源化胶原蛋白加入到反应体系中，使得混合溶液中重组人源化胶原蛋白与甲基丙烯酸化的透明质酸的质量比为1:6，搅拌反应8h；
(6)将反应后的溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，去离子水透析三天后，用冷冻干燥机冻干，得到冻干海绵HA-rhColⅢ；
(7)取步骤(6)中的冻干海绵溶解在0.01M PBS中，并加入LAP光引发剂溶液(终浓度为质量体积比0.05％)，使得HA-rhColⅢ溶液终浓度为7mg/ml；
(8)取步骤(7)中前驱液置于规格为Ф6mm×2.5mm的硅胶模具中，在紫外灯光照下光照1min即得含重组人源化胶原的透明质酸水凝胶(HA-rhCol III)。
实施例3重组胶原蛋白在促进软骨修复中的应用
采用实施例1的方法，制备符合本发明氨基酸序列特征的重组胶原蛋白，其中重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列核心序列优选为GERGAPGFRGAPGPNGIPGEKGPAGERGAP(序列A)，重复连接16次，将其用于促进软骨修复。具体步骤为：
(1)将分子量为100KDa，改性程度为50％的甲基丙烯酸化的透明质酸HA-MA，溶解在MES缓冲溶液中，得到2mM的甲基丙烯酸化的透明质酸溶液；
(2)将固体形态的sNHS和固体形态的EDC依次加入到混合溶液中，使得sNHS浓度为3mM，EDC浓度为5mM，并用0.5M NaOH溶液或0.5M HCl溶液将混合溶液的pH维持在4.75；
(3)室温下搅拌反应2h；
(4)用1.0M NaOH溶液调节反应体系pH为7.4；
(5)将重组人源化胶原蛋白加入到反应体系中，使得混合溶液中重组人源化胶原蛋白与甲基丙烯酸化的透明质酸的质量比为11:6，搅拌反应12h；
(6)将反应后的溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，去离子水透析三天后，用冷冻干燥机冻干，得到产物HA-rhColⅢ；
(7)取步骤(6)中的冻干海绵溶解在0.01M PBS中，并加入LAP光引发剂溶液(终浓度为质量体积比0.01％)，使得HA-rhColⅢ溶液终浓度为17mg/ml；
(8)取步骤(7)中前驱液置于规格为Ф6mm×2.5mm的硅胶模具中，在紫外灯光照下光照1min即得HA-rhColⅢ水凝胶。
实施例4重组胶原蛋白在促进软骨修复中的应用
采用实施例1的方法，制备符合本发明氨基酸序列特征的重组胶原蛋白，其中重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列核心序列优选为GERGAPGFRGAPGPNGIPGEKGPAGERGAP(序列A)，重复连接16次，将其用于促进软骨修复。具体步骤为：
(1)将分子量为600KDa，改性程度为30％的甲基丙烯酸化的透明质酸HA-MA，溶解在MES缓冲溶液中，得到1mM的甲基丙烯酸化的透明质酸溶液；
(2)将sNHS和EDC依次加入到混合溶液中，使得sNHS浓度为1mM，EDC浓度为3mM，并用1.0M NaOH溶液或1.0M HCl溶液将混合溶液的pH维持在4.75；
(3)室温下搅拌反应3h；
(4)用1.0M NaOH溶液调节反应体系pH为7.4；
(5)将重组人源化胶原蛋白加入到反应体系中，使得混合溶液中重组人源化胶原蛋白与甲基丙烯酸化的透明质酸的质量比为0.5:6，搅拌反应8h；
(6)将反应后的溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，去离子水透析三天后，用冷冻干燥机冻干，得到产物HA-rhColⅢ；
(7)取步骤(6)中的冻干海绵溶解在0.01M PBS中，并加入LAP光引发剂溶液(终浓度为质量体积比0.05％)，使得HA-rhColⅢ溶液终浓度为7mg/ml；
(8)取步骤(7)中前驱液置于规格为Ф6mm×2.5mm的硅胶模具中，在紫外灯光照下光照2min即得HA-rhColⅢ水凝胶。
实施例5重组胶原蛋白在促进软骨修复中的应用
采用实施例1的方法，制备符合本发明氨基酸序列特征的重组胶原蛋白，其中重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列核心序列优选为GERGAPGFRGAPGPNGIPGEKGPAGERGAP，重复连接16次，将其用于促进软骨修复。具体步骤为：
(1)将分子量为1000KDa，改性程度为40％的甲基丙烯酸化的透明质酸HA-MA，溶解在MES缓冲溶液中，得到0.6mM的甲基丙烯酸化的透明质酸溶液；
(2)将sNHS和EDC依次加入到混合溶液中，使得sNHS浓度为5mM，EDC浓度为5mM，并用0.2M NaOH溶液或0.2M HCl溶液将混合溶液的pH维持在4.75；
(3)室温下搅拌反应3h；
(4)用0.5M NaOH溶液调节反应体系pH为7.4；
(5)将重组人源化胶原蛋白加入到反应体系中，使得混合溶液中重组人源化胶原蛋白与甲基丙烯酸化的透明质酸的质量比为11:6，搅拌反应12h；
(6)将反应后的溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，去离子水透析三天后，用冷冻干燥机冻干，得到产物HA-rhColⅢ；
(7)取步骤(6)中的冻干海绵溶解在0.01M PBS中，并加入I2959光引发剂溶液(终浓度为质量体积比0.03％)，使得HA-rhColⅢ溶液终浓度为17mg/ml；
(8)取步骤(7)中前驱液置于规格为Ф6mm×2.5mm的硅胶模具中，在紫外灯光照下光照1min即得HA-rhColⅢ水凝胶。
试验例2：
实施例2制备的重组人源化胶原蛋白修饰的透明质酸水凝胶，在细胞实验中结果如下：
结合图6和图7结果，HA-MA水凝胶中软骨细胞培养至21天，由于缺乏粘附位点，软骨细胞原位聚集成团生长。而HA-rhColⅢ组水凝胶中软骨细胞在培养至7天时，呈现部分铺展状态，在14和21天时，细胞铺展生长现象更加明显，且分布均匀。说明rhColⅢ有利于细胞的粘附，迁移和增殖，且HA-rhColⅢ组水凝胶较HA-MA组水凝胶更能促进软骨细胞的增殖。
图8结果显示，HA-rhColⅢ组水凝胶中细胞核并未出现变形、固缩等现象，且在培养至7和14天时，两组水凝胶中细胞的肌动蛋白呈梭形，说明细胞在凝胶内部得到较好的铺展，而HA-MA组在各时间点，细胞均以细胞团形态原位增殖。该结果表明rhColⅢ为细胞粘附提供了适宜的位点，可以让软骨细胞更快的粘附并为细胞增殖提供条件。
组织学和二型胶原免疫组化染色(图9-10)结果表明，HA-rhColⅢ凝胶中有更明显的多糖和蛋白易染区域，表明rhCol III的加入可以促进软骨细胞的功能表达。GAG定量检测结果(图11)进一步证实，rhColⅢ的加入更有利于促进软骨细胞外基质的分泌。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；
其中，N为4以上的整数；n1为3以上的整数。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所以N值为4～300以上的整数，进一步为4～200以上的整数。
3.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其特征在于，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中。
4.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：
[-G-E-Xaa3-Yaa1-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n2-Yaa2-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa3-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa4-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n4-…………-Yaan-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n-Yaan+1-G-Xaa1-Xaa2-]N
其中，所述Xaa1为非极性疏水氨基酸；所述Xaa2为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；所述Xaa3为碱性氨基酸；
Yaa1，Yaa2，Yaa3，Yaa4，………，Yaan，Yaan+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；
n2、n3、n4、………、n为0以上的整数，两者不同时为0。
5.如权利要求1所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签。
6.如权利要求1～5任一项所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.权利要求1～6任一项所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，采用基因重组技术，通过宿主细胞表达、提取、纯化获得重组胶原蛋白；所述重组胶原蛋白的氨基酸序列由多次重复的基本重复单元重复连接获得；
进一步地，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；
其中，N为4以上的整数；n1为3以上的整数；
更进一步地，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中。
8.如权利要求7所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签；
所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：
[-G-E-Xaa3-Yaa1-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n2-Yaa2-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa3-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n3-Yaa4-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n4-…………-Yaan-(G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3)n-Yaan+1-G-Xaa1-Xaa2-]N
其中，所述Xaa1为非极性疏水氨基酸；所述Xaa2为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；所述Xaa3为碱性氨基酸；
Yaa1，Yaa2，Yaa3，Yaa4，………，Yaan，Yaan+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；
n2、n3、n4、………、n为0以上的整数，两者不同时为0。
9.权利要求1～6任一项所述的重组胶原蛋白在制备用于调控细胞黏附、增殖、分化的产品中的用途。
10.权利要求1～6任一项所述的重组胶原蛋白在制备软骨修复基质的产品中的用途。
11.一种软骨修复基质，其特征在于，包括高分子和/或其衍生物、权利要求1～6任一项所述的重组胶原蛋白；
进一步地，所述高分子包括天然高分子、合成高分子；更进一步地，所述天然高分子至少选自透明质酸、壳聚糖、海藻酸、纤维素中的任意一种；更进一步地，所述合成高分子至少选自PLA、PGA、PLCL、PVA中的任意一种。
12.权利要求11所述的软骨修复基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将高分子衍生物溶解在缓冲液中，加入EDC/sNHS溶液反应；
(2)将权利要求1～6任一项所述的重组胶原蛋白加入到步骤(1)中的反应体系中反应，对反应后得到的溶液进行透析、干燥，得到复合基质；
(3)将复合基质溶解后，加入光引发剂溶液，即得软骨修复基质；
进一步地，步骤(1)所述的高分子衍生物是采用甲基丙烯酸酐进行改性的透明质酸；
进一步地，改性后的透明质酸分子量为100～1500kDa，优选为300～600kDa，更优选为300kDa；
进一步地，步骤(1)所述的透明质酸改性接枝度为20～60％，优选为30～50％；
进一步地，步骤(1)中，将EDC、sNHS加入后，sNHS浓度为0.5～5mM，EDC浓度为0.5～5mM；更进一步地，sNHS浓度为1～3mM，EDC浓度为2～4mM。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入EDC/sNHS溶液后的混合溶液pH值为4～5，优选为4.75；
反应后的混合溶液pH值为7～8，反应时间为2～5h；优选pH值为7.4，反应时间为3h；
进一步地，步骤(2)中，重组胶原蛋白：高分子衍生物的质量比为0.5～30:2～10；进一步为0.5～20:6；更进一步为1～11:6；
进一步地，步骤(2)中的反应时间为5～15h，优选为8～12h；
进一步地，步骤(2)中，将反应后的溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，去离子水透析2～4天后，冷冻干燥，得到复合基质；
进一步地，步骤(3)中加入光引发剂后的复合基质浓度为2～30mg/ml，进一步为5～20mg/ml，更进一步为7～17mg/ml。
14.一种软骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，将权利要求12～13任一项所述方法制备得到的软骨修复基质与软骨细胞或骨髓间充质干细胞复合后，注射至软骨损伤部位，光照后形成软骨修复水凝胶。
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