WO2024074120A1

WO2024074120A1 - 一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: WO2024074120A1
Application number: PCT/CN2023/122683
Authority: WO
Inventors: 林海; 邱禾; 王境; 王建; 徐扬; 宋露; 杨霞; 张兴栋
Original assignee: 山西锦波生物医药股份有限公司; 四川大学
Priority date: 2022-10-08
Filing date: 2023-09-28
Publication date: 2024-04-11
Also published as: US20240115763A1; CN115947827A; WO2024074119A1; CN116115831A; CN116115831B

Abstract

一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与应用。所述水凝胶可以释放具有生物活性的重组胶原蛋白，所述的重组胶原蛋白包含SEQ ID No.1所示的序列，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列："G-Xaa1-Xaa2-G-E-Xaa3"；基本重复单元的3'端和5'端连接形成上述特征氨基酸序列。所述重组胶原蛋白具有较为明显的整合素结合活性，具有促进细胞黏附、增殖、分化的效果。水凝胶具有良好的生物相容性，质量稳定，可以在注射后通过透皮光交联的方式原位固化成形，操作简便、可控，满足了临床上对不规则缺损的填充要求，具有更好的软组织填充效果。

Description

一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与应用

本申请要求(1)2022年10月08日提交中国专利局、申请号为2022112245930，(2)2023年04月03日提交中国专利局、申请号为2023103463184的优先权。在先申请的全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

颌面部软组织具有特殊的解剖生理结构，在人体咀嚼、发音、美观等方面起着至关重要的作用，同时很容易受到创伤、感染和先天性疾病等的影响。颌面部软组织形态及容量的异常与不足所表现出的面部凹陷、不对称、衰老等表现在临床上十分常见，不仅给患者造成了功能性的问题，也严重影响着患者的形象和心理健康，给患者的生活带来诸多的困扰。现有的临床修复方法以自体软组织移植修复为主，会导致二次创伤且不利于塑形。近年来人们对美容修复方面的要求越来越高，如何在恢复缺损组织正常功能的情况下尽可能修复缺损组织的外形，对缺损组织进行功能重建并达到良好的美容修复效果，成为颌面软组织修复的重点。

软组织充填术是非手术美容治疗的一个主要项目，通过将软组织充填材料植入体内并占据组织损伤或者病变造成的空腔和缺损部位，替代并行使或增强其原有功能，从而达到组织修复、畸形矫正和面貌年轻化治疗的目的，是适应患者对微创外科技术的需要，也是目前整形外科临床技术发展的趋势之一。应用注射性软组织填充材料进行无创的面部填充成为最流行的操作手段，注射填充技术操作简单，仅几分钟的注射就能马上显出效果，没有痛苦、不影响工作、生活，非常方便，而且不留痕迹，秘密性好，保护了客户的隐私。但是理想的注射性软组织填充材料要同时具有生物相容性、安全性、易操作性、锚定性和持久性，这对于研究和开发整形美容产品的学者来说，一直是一个极具挑战性的课题。

而软组织缺损的临床修复效果与材料的来源和性能紧密相关，为实现缺损组织的功能重建和美学重建，不仅要求注射性充填材料具有良好的生物相容性和即刻填充效果，还要求植入材料具有良好的组织修复与再生功能，同时来源广泛、操作简便。虽然目前透明质酸、羧甲基纤维素等注射性软组织充填剂被广泛研发应用，但其缺乏细胞黏附、增殖和分化所需的各种生物信号分子，自身的抗酶解和自由基降解的能力有限，难以调控细胞行为并促进组织修复。例如，交联透明质酸及其衍生物作为物理体积充填剂，不利于细胞黏附，诱导组织再生的能力有限，在代谢速度快，效果维持有限；同时，交联透明质酸类产品植入后依赖于术者在术中进行塑形，对术者的解剖学理论知识和操作技术有较高的要求，同时充填材料可能会发生移位等并发症，严重影响植入满意度。

因此，目前的注射材料存在机械强度不够，注射效果维持的时间短，与人体组织的生物相容性差，注射后效果不自然等问题，已经难以满足实际应用环境的需要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与用途，所述水凝胶具有良好的生物相容性，可以在注射后通过透皮光交联的方式原位固化成形，在实现组织填充目的的同时可以释放具有生物活性的重组胶原蛋白，达到促进组织修复的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶，水凝胶合成原料包含辅料酸酐、天然多糖类物质、活化剂、氨基邻二醇、氧化剂；

所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；

其中，N为4以上的整数；n1为3以上的整数。

进一步的，所以N值为4～300的整数。

更进一步为4～200的整数。包括但不限于，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30.......200。

进一步地，所述N值的取值能够使重组胶原蛋白的分子量达到1kDa～200kDa，进一步为达到3kDa～150kDa。

进一步的，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中；

进一步的，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：

[-G-E-Xaa₃-Yaa₁-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n2-Yaa₂-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n3-Yaa₃-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n3-Yaa₄-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n4-…………-Yaa_n-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n-Yaa_n+1-G-Xaa₁-Xaa₂-]_N

其中，所述Xaa₁为非极性疏水氨基酸；所述Xaa₂为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；所述Xaa₃为碱性氨基酸；

Yaa₁，Yaa₂，Yaa₃，Yaa₄，………，Yaa_n，Yaa_n+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；

n2、n3、n4、………、n为0以上的整数，两者不同时为0；

优选的，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签。

优选的，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.1。

优选的，所述酸酐为环状不饱和酸酐或含羧基的不饱和酸酐或4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐中的一种；进一步地，所述的酸酐是顺丁烯二酸酐(又称马来酸酐)、柠康酸酐、顺-3-羧基戊烯二酸酐(顺式乌头酸酐)、4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐中的一种；更进一步为甲基丙烯酸酐。

优选的，所述天然多糖类物质选自透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐；优选的，这种天然多糖类物质为羧甲基纤维素。

优选的，所述活化剂为NHS和EDC；进一步的，所述氨基邻二醇为3-氨基-1，2丙二醇，通过引入含有邻二醇的侧链基团，可以特异性的氧化生成醛基，有效避免天然多糖主链结构的破坏。

本发明中所述EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺。

进一步的，所述氧化剂选自高碘酸盐、次氯酸盐；优选的，所述氧化剂为高碘酸钠。

第二方面，本发明提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶的制备方法，所述水凝胶是采用透皮光固化得到的；

进一步的，具体步骤如下：

S1.用酸酐对天然多糖类物质进行适度化学改性，得到具有光交联性能的天然多糖衍生物；

S2.将上述具有光交联性能的天然多糖衍生物与活性剂混合反应，反应溶液的pH值为4.65-5.2；

S3.在S2的反应体系中加入氨基邻二醇进行侧链羧基活化反应并通过透析纯化，透析结束后冷冻干燥，得到含邻二醇侧链的天然多糖衍生物；

S4.将上述含邻二醇侧链的天然多糖衍生物溶解后与氧化剂反应并通过透析纯化，透析结束后冷冻干燥，得到含醛侧链的天然多糖衍生物；

S5.将上述含醛侧链的天然多糖衍生物溶解后与前述的重组胶原蛋白、光引发剂混合得到修复基质前驱液，经透皮光照交联后得到水凝胶。

本发明通过适度的化学改性和合理的材料复配调节天然多糖类物质组成与结构，经过化学改性后的天然多糖类物质，使其含有光引发基团，能通过体内皮下注射，透皮光照成型的效果，其力学和降解性能也得到显著改善，这种特殊的结构还可以支持细胞的生存和增殖，最终得到的组织充填剂(水凝胶)具有良好的热稳定性、机械强度、抗酶解性能，且体内维持时间更长。

在软组织填充领域，羧甲基纤维素和其他多糖类高分子化合物一样缺乏细胞粘附位点，细胞难以在水凝胶中粘附铺展，导致细胞难以在水凝胶中迁移生长，只能在原位增殖、聚集生长。本发明充分利用重组胶原蛋白的生物安全性，高黏附活性和生物学效应，有利于细胞在复合水凝胶上粘附生长，并随着羧甲基纤维素的降解持续缓释重组胶原蛋白，调控细胞的生物学行为并诱导细胞外基质的表达，从而达到早期形态维持，后期诱导软组织基质再生的修复效果。

本发明所述水凝胶可以用于改善软组织轮廓缺陷，适用于在真皮层(如中层、深层)、皮下浅层至深层的填充，如皱纹、疤痕、凹陷性缺失或损伤等皮肤下陷区域的恢复方面。

优选的，所述步骤S1中天然多糖类物质的光交联改性程度为30～60％；所述具有光交联性能的天然多糖衍生物与活化剂中的NHS、EDC的摩尔比1：(1～3)：(2～5)；

进一步的，所述步骤S2中具有光交联性能的天然多糖衍生物：NHS：EDC的摩尔比1：2：3；

优选的，所述步骤S3中加入氨基邻二醇进行活化反应的溶液pH值为7～7.7，氨基邻二醇：具有光交联性能的天然多糖衍生物的摩尔比为(1～10):1；所述S3、S4中的透析时间为20～72h，透析截留的分子量为8000～14000kDa。

本发明所述天然多糖衍生物含有醛基，可以通过希弗碱反应结合重组胶原蛋白并在水凝胶中逐渐释放。优选的，所述步骤S5中含醛侧链的天然多糖衍生物的质量体积比为1～5％；所述重组胶原蛋白的质量体积比为0.5～2％；所述光引发剂的质量体积比为0.01～0.05％。

第三方面，本发明提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶在软组织填充与修复中的应用。

本发明所述水凝胶还可以根据需要与其他功能性材料配合使用，比如具有抗菌抑菌作用的成分、抗衰老成分、抗凝血成分、抗氧化成分、生长因子等。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

当质量体积比或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首先用不饱和酸酐对天然多糖类物质进行适度的化学改性引入不饱和碳碳双键，然后通过EDC/NHS活化改性后的天然多糖类物质中的羧基，随后加入氨基邻二醇引入相邻羟基，在氧化剂的氧化下获得醛基，最后醛基与重组胶原蛋白中的氨基进行希弗碱反应，通过透皮光照交联获得重组胶原蛋白活化的软组织充填水凝胶；本发明得到的水凝胶具有良好的生物相容性，操作简便，同时具有的可注射、原位固化成型的特性也满足了临床上对不规则缺损组织的填充。

(2)本发明以羧甲基纤维素等天然多糖材料为基础，只需材料预混合、局部注入和光固化三个步骤即可完成构建新型复合组织充填剂，制备方法操作简单，改性反应程度可控，同时克服了羧甲基纤维素等天然多糖类物质缺乏细胞粘附位点的缺陷。

(2)本发明光引发手段操作简单、反应温和，透皮光交联，无需破坏性手术，术中塑形，术后成型。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为具有光交联性能的天然多糖衍生物(CMC-MA)细胞毒性检测结果；

图2为CMC-MA水凝胶的形态和力学强度，A：不同体外透皮光照时间点下2％CMC-MA材料成胶形态，B：不同体外透皮光照时间点下2％CMC-MA材料成胶的储能模量、损耗模量及Tan Delta；

图3为重组胶原蛋白活化的透皮光固化成形软组织充填剂(CMC-MA-AP-CHO-rhCol III)在SD大鼠体内皮下注射、透皮光照前后的成胶情况；

图4为重组胶原蛋白的释放曲线，A：不同时间点CMC-MA/rhCol III水凝胶rhColIII缓释曲线，B：不同时间点CMC-MA-AP-CHO-rhCol III水凝胶rhCol III缓释曲线；

图5为CMC-MA-AP-CHO-rhCol III推挤力测试，Sample1、Sample2、Sample3代表重复3次的样品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

应当明确的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法或制品不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法或制品所固有的要素。

实施例1

(1)透皮光固化成形软组织充填基质的制备

使用甲基丙烯酸酐(MA)对羧甲基纤维素(CMC,250KD,DS＝0.7)进行改性:称量1g CMC的原料溶于100mL去离子水使其浓度为1％(wt)，用机械搅拌器搅拌6h后置于4℃冰箱中静置24h再室温搅拌2h使CMC充分溶解，分子链充分舒展，这样利于改性反应的进行。将溶解好的1％CMC溶液置于低温循环泵控制的低温水浴中，设置反应温度平衡2h。反应开始时向CMC溶液中逐滴加入甲基丙烯酸酐2mL，反应过程中用5M NaOH调节pH，使反应pH维持在8.0～8.5，待反应液pH稳定后，溶液过夜反应24h。然后将反应液倒入500mL乙醇中，将反应产物沉淀出来，同时去除部分未反应的甲基丙烯酸酐及副产物，过滤得到产物后再用乙醇冲洗三次，将产物装入8000～14000kDa的透析袋中，用去离子水透析4天，每天换水三次。透析结束后用真空冷冻干燥机冻干得到具有光交联性能的天然多糖衍生物CMC-MA，将产物置于4℃保存。

(2)重组胶原蛋白的制备

1、大肠杆菌发酵制备重组胶原蛋白

基因重组与转录：利用PCR的方法将胶原蛋白DNA片段进行密码子优化和拼接重组，选择pET-32a构建得到表达载体后转入大肠杆菌表达菌株BL21中，经培养、筛选后获得具有蛋白高表达的大肠杆菌基因工程菌。

发酵培养：从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于装有10mL LB培养基的100mL三角瓶中，于37℃、220rpm培养12-16h；将菌液按照1:100的比例接种到装有LB培养基的发酵罐中放大培养，于37℃、220rpm培养3h至OD600约为0.6时，加入0.5mM IPTG，在16℃诱导培养20h后离心收集菌体。

蛋白的分离与纯化：用Tris缓冲液重选菌体后，高速搅拌使菌体完全溶解，离心收集上清液并降温至4℃；上清液采用1μm、0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤后进一步采用亲和层析纯化得到重组胶原蛋白。

重组胶原蛋白的氨基酸序列特征：具有多个特征氨基酸序列组合的重复单元，为GER GAP GFR GPA GPN GIP GEK GPA GER GAP，直接重复连接16次获得本发明重组胶原蛋白，氨基酸序列如SEQID NO.1所示：

2、细胞培养方法

1)试样制备：

将重组胶原蛋白用PBS配制成一定浓度溶液(如0.5mg/mL)，动物源胶原蛋白溶液用PBS稀释至相同浓度(如0.5mg/mL)，PBS为空白对照组；

2)铺板：将实验溶液分别加入到96孔板中，每孔加入100μL，每组5个复孔，在4℃条件下静置过夜；

3)封闭：待铺板结束后，移除孔板中的液体后用200μL PBS溶液清洗2次，加入100μL经热灭活的1％BSA-PBS溶液，在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育1h；

4)细胞接种：待孵育结束后，移除孔板中的液体后用200μL PBS溶液清洗2次，每孔加入100μL密度为5×10⁴～1×10⁶个/mL的细胞悬液，在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育1h；

5)检测：待孵育结束后，移除孔板中的液体后用200μLPBS溶液清洗2次，加入150μL CCK-8，在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育1h后，从中吸取100μL检测液加入到新的96孔板中于450nm检测吸光度值(OD)。

(3)重组胶原蛋白活化的透皮光固化成形软组织充填剂的制备

(3.1)将改性程度为30～40％的甲基丙烯酸化的具有光交联性能的天然多糖衍生物羧甲基纤维素CMC-MA，溶解在去离子水中，得到0.5％的甲基丙烯酸化的羧甲基纤维素溶液；

(3.2)将固体形态的NHS和固体形态的EDC依次加入到混合溶液中(CMC-MA，EDC，NHS摩尔比为1:2：3)，并用5.0M NaOH溶液或5.0M HCl溶液将混合溶液的pH维持在4.75～5；

(3.3)室温下搅拌反应2h；

(3.4)用1.0M NaOH溶液调节反应体系pH为7.4；

(3.5)将3-氨基-1，2丙二醇(AP)加入到反应体系中，EDC浓度为5mM，使得混合溶液中3-氨基-1，2丙二醇与甲基丙烯酸化的羧甲基纤维素的摩尔比为5:1，搅拌反应24h；

(3.5)将反应后的溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，去离子水透析三天后，用冷冻干燥机冻干，得到含邻二醇侧链的天然多糖衍生物CMC-MA-AP；

(3.6)取步骤(3.5)中的冻干海绵溶解在去离子水中，将0.5M高碘酸钠溶液滴加入到溶液中，0.5M高碘酸钠与CMC-MA-AP的摩尔比为0.2:1，搅拌反应24h；

(3.7)将反应后的溶液装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，去离子水透析三天后，用冷冻干燥机冻干，得到含醛侧链的天然多糖衍生物CMC-MA-AP-CHO；

(3.8)将步骤(3.7)中冻干得到的CMC-MA-AP-CHO材料溶解在去离子水中，配成2％的浓度，加入终浓度为1％的重组人源化III型胶原蛋白(rhCol III)，并加入LAP光引发剂溶液(终浓度为质量体积比0.02％)。

(3.9)取步骤(3.8)中前驱液置于规格为Ф6mm×2.5mm的硅胶模具中，在紫外灯光照下光照1min即得重组胶原蛋白活化的透皮光固化成形软组织充填剂：CMC-MA-AP-CHO-rhCol III水凝胶。

试验例1 CMC-MA及CMC-MA-AP-CHO-rhColIII水凝胶细胞毒性检测

CMC-MA细胞毒性检测

1.材料浸提液的准备：将CMC-MA灭菌后，配置浓度为2％。然后再无菌条件下封装于注射器中，在无菌条件下制备固化材料，尺寸Φ＝8±0.1mm，h＝2.0±0.2mm。将材料置于48孔板内，按照GB/T 16886.12-2017《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料》中推荐的0.2g/mL的浸提比例加入α-MEM培养基完全浸没复合材料，在37℃、5％CO₂的培养箱中静置浸提24h后提取上清液，然后取适量的上清液依次加入10％的新生胎牛血清(FBS)配制成浓度分别为100％、50％、25％和12.5％的浸提液。

2.复苏L929细胞培养传代至P3代，消化细胞，调至细胞浓度为5×10⁴cells/mL，吸取细胞悬液滴加到96孔板中，每孔为100μL，以含10％的新生牛血清的α-MEM为培养基，置于培养箱中培养24h。随后吸弃培养基，加入150μL分别加入150μL浓度为100％、50％、25％和12.5％的样品浸提液，20％DMSO(阳性对照)和含10％FBS的培养基(阴性对照)。此时，外围孔仍滴加含10％FBS的培养基作为空白对照。每组试样设置5个平行样，孵育24h。

3.孵育24h后，将上清吸弃，每孔加入150μL CCK-8溶液，置于培养箱中避光孵育2小时，每孔吸取100μL上清至新的96孔板中，利用酶标仪测定450nm处的吸光度值(Optical density value，OD值)。按照ISO 10993-5：2017附录C中的数据分析计算细胞存活率。结果见图1。

根据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》中关于细胞毒性的规定，CMC-MA复合材料的安全性是可以接受的。

CMC-MA-AP-CHO-rhColIII水凝胶毒性检测

按照“CMC-MA细胞毒性检测”中的方法，对CMC-MA-AP-CHO-rhColIII水凝胶进行毒性检测，根据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》中关于细胞毒性的规定，水凝胶复合材料的安全性是可以接受的。

试验例2 CMC-MA SD大鼠体外皮下透皮光照成胶

1.将2％CMC-MA溶液灌装入1mL的注射器中，将复合材料注射入模具内(d:8mm,h:2mm)。取12周年龄大鼠背部脱毛皮肤，将模具内材料置于离体皮肤下，用5W蓝光手电筒(波长＝405nm)照射不同时间(1，2，3，4，5，7，10，15，20min)。

2.取出磨具，即刻进行拍照和通过DMA测定水凝胶的力学强度(储能模量，损耗模量)。如图2所示，透皮光照1min中，材料即可成胶。随着透皮光照时间的延长，水凝胶的力学强度逐渐增加，当光照时间大于5min,水凝胶强度未见明显的统计学差异。

试验例3 CMC-MA-AP-CHO-rhCol III SD大鼠体内皮下光照成胶

1.将2％CMC-MA-AP-CHO-rhCol III溶液灌装入1mL的注射器中，SD大鼠背部脱毛后。将0.2mL的CMC-MA-AP-CHO-rhCol III溶液进行皮下注射，并适当的进行塑形，记录光照前背部皮肤状态的改变，以及关照前皮下材料的状态(图3)。

2.用5W蓝光手电筒(波长＝405nm)照射不同时间(1min)，并记录光照后皮肤的状态以及皮下材料成胶的情况(图3)。

从图3中可以看出，透皮注射后，未进行光照时材料不成胶，呈现粘液状，透皮光照1min后，材料成胶明显，有明显的固定形态。

试验例4 CMC-MA-AP-CHO-rhCol III水凝胶蛋白释放实验

1.将2％CMC-MA-AP-CHO-rhColIII(rhCol III终浓度为10mg/mL)及CMC-MA/rhCol III(rhCol III终浓度为10mg/mL)复合溶液各灌装入1mL的注射器中，将复合材料注射入模具内(d:8mm，h:2mm)。用5W蓝光手电筒(波长＝405nm)照射1min。精确称量CMC-MA-AP-CHO-rhCol III及CMC-MA/rhCol III水凝胶的质量，按照0.2g/mL(参照GB/T 16886.12)的浸提比例确定浸提液(0.01M PBS)的体积。将水凝胶浸入浸提液中置于恒温空气摇床中(37℃，70rpm/min)，每组3个平行样，在预定时间点每个平行样中收集100μl浸提液并补加100μL新鲜浸提液。

2.利用考马斯亮蓝法检测浸提液中rhCol III(1、2、4、6、8、12、24、36、48、72h)的浓度。于紫外可见分光光度计中检测波长在595nm处的吸光度值(Abs)。根据标准蛋白液浓度与对应吸光值做出标准曲线，进一步计算出待测液中蛋白含量。具体操作参考说明书(Solarbio，PC0015)。

结果如图4所示，图4A中CMC-MA/rhCol III水凝胶随着时间的增加，rhCol III的释放量逐渐增加，在24h时，其释放率最高达到了73.59％，且呈现出继续增加的趋势，72h达到80％。图4B中CMC-MA-AP-CHO-rhCol III水凝胶在24h时，其释放率最只有2.73％，随着时间的增加，rhCol III的释放量缓慢增加。可见，本发明方法制备得到的水凝胶可以达到重组胶原蛋白缓释的效果，有效解决单独使用重组胶原蛋白的突释的问题，治疗周期缩短，效果持久。

试验例5 CMC-MA-AP-CHO-rhColIII推挤力测试

可注射材料的可注射性是关系术者使用便捷性，挤出过程是否存在堵塞、不连续等障碍的重要理化指标。为了评估注射性能，使用万能材料试验机测试(AGS-X,SHIMADZU,Japan)测试复合材料在注射器中的推挤力，具体方法如下：

1.制样：按照可注射复合材料的预期技术要求，将2％CMC-MA-AP-CHO-rhColIII前驱液罐装于配备有30号针头的1mL注射器中，4℃低温保存备用；

2.预制备：挤出测试前排尽注射器针头前端的空气直至材料被挤出。

3.测试：将罐装有材料的注射器固定于特殊模具中，通过万能材料试验机垂直压缩载荷推挤，推挤速度恒定为30mm/min，记录推挤力-位移曲线，每个样品重复测试3次。

结果如图5所示，2％CMC-MA-AP-CHO-rhColIII前驱液的推出力在迅速线性增加后达到相对稳定的水平直到将材料推尽为止。在恒定推出阶段，试样的推出力稳定为2.76±0.96N曲线整体平滑，落差较小，由此表明材料体系成分均匀且无明显气泡。同时材料推挤力小，可注射性和术者可操作性好。

综上，本发明所制备的天然多糖衍生物在体外，以及体内经透皮注射光照1min后成胶明显，成胶时间快，对皮肤组织没有损伤。具有光交联性能的天然多糖衍生物CMC-MA与3-氨基-1，2丙二醇反应后氧化得到的含醛侧链的天然多糖衍生物CMC-AM-AP-CHO，减少了氧化过程中对糖环主链的破坏，一定程度上可以减少力学强度的下降.同时，试验检测结果还表明，该类改性的天然多糖衍生物的水凝胶安全性良好,也具有良好的可注射性，操作性。随着羧甲基纤维素的降解，重组胶原蛋白活化的CMC-MA-AP-CHO-rhCol III水凝胶，可以持续缓释rhCol III，诱导细胞外基质的表达生物学行为，从而达到早期形态维持，后期诱导软组织基质再生的修复效果，作用时间更持久。

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims

一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶，其特征在于，其原料包含重组胶原蛋白、酸酐、天然多糖类物质、活化剂、氨基邻二醇、氧化剂；

所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括N个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；

其中，N为4以上的整数；n1为3以上的整数。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，N为4～300的整。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，N为4～200的整数。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：
[-G-E-Xaa₃-Yaa₁-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n2-Yaa₂-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)
_n3-Yaa₃-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n3-Yaa₄-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n4-…………-Yaa_n-(G-Xaa₁-Xaa₂-G-E-Xaa₃)_n-Yaa_n+1-G-Xaa₁-Xaa₂-]_N

其中，所述Xaa₁为非极性疏水氨基酸；所述Xaa₂为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)中的一种；所述Xaa₃为碱性氨基酸；

Yaa₁，Yaa₂，Yaa₃，Yaa₄，………，Yaa_n，Yaa_n+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；

n2、n3、n4、………、n为0以上的整数，两者不同时为0。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.1。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述酸酐为环状不饱和酸酐或含羧基的不饱和酸酐或4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐中的一种。
根据权利要求8所述的水凝胶，其特征在于，所述的酸酐是顺丁烯二酸酐、柠康酸酐、顺-3-羧基戊烯二酸酐、4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐中的一种。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述天然多糖类物质选自透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐。
根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述活化剂为NHS和EDC；所述氨基邻二醇为3-氨基-1，2丙二醇；所述氧化剂选自高碘酸盐、次氯酸盐；所述氧化剂为高碘酸钠。
权利要求1～11任一项所述可透皮光固化成形水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶是采用透皮光固化得到的；具体步骤如下：

S1.用酸酐对天然多糖类物质进行适度化学改性，得到具有光交联性能的天然多糖衍生物；

S2.将上述具有光交联性能的天然多糖衍生物与活化剂混合反应，反应溶液的pH值为4.65～5.2；

S3.在S2的反应体系中加入氨基邻二醇进行侧链羧基活化反应并通过透析纯化，透析结束后冷冻干燥，得到含邻二醇侧链的天然多糖衍生物；

S4.将上述含邻二醇侧链的天然多糖衍生物溶解后与氧化剂反应并通过透析纯化，透析结束后冷冻干燥，得到含醛侧链的天然多糖衍生物；

S5.将上述含醛侧链的天然多糖衍生物溶解后与重组胶原蛋白、光引发剂混合得到修复基质前驱液，经透皮光照交联后得到水凝胶。
根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中具有光交联性能的天然多糖衍生物的改性程度为30～60％；所述具有光交联性能的天然多糖衍生物与活化剂中的NHS、EDC的摩尔比1：(1～3)：(2～5)。
根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中具有光交联性能的天然多糖衍生物：NHS：EDC的摩尔比1：2：3。
根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中加入氨基邻二醇进行活化反应的溶液pH值为7～7.7，氨基邻二醇：具有光交联性能的天然多糖衍生物的摩尔比为(1～10):1；所述S3、S4中的透析时间为20～72h，透析截留的分子量为8000～14000kDa。
根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中含醛侧链的天然多糖衍生物的质量体积比为1～5％；所述重组胶原蛋白的质量体积比为0.5～2％；所述光引发剂的终浓度质量体积比为0.01～0.05％。
权利要求1～11任一项所述一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶在软组织填充与修复中的应用。