CN108823227A - 重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶 - Google Patents
重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，主要通过复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料，利用三者之间的化学反应交联形成，相比较从动物中提取的天然胶原蛋白，重组胶原蛋白具有低抗原性，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性，本发明所提供的凝胶的制备过程中没有任何有毒物质的引入，所用的原料均无生物学毒性，因此所制备的凝胶具有良好的生物相容性，同时该种凝胶还具备良好的生物降解特性，具有诱导成骨的作用，可促进骨缺损的修复。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程，医用生物材料制备技术领域，具体为重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶。
背景技术
水凝胶具有良好的生物相容性及生物可降解性，具备类细胞外基质的仿生特性及三维水化网状结构，有利于细胞的迁移和生长，因此是移植细胞或缓释生长因子的适宜载体。因此将水凝胶体系作为一种组织工程骨缺损修复材料具有重要应用前景。
胶原蛋白是动物体中含量最丰富的蛋白质，是细胞外基质的主要组成成分，广泛分布于动物体的各种组织中，占哺乳动物体内蛋白质的25％～30％，相当于体重的6％。对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。除了生物力学方面的以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。胶原蛋白的侧链上含有羟基，羧基，氨基等多种活性基团，易于参与反应制备各种不同的生物材料。由于胶原蛋白具有优良的生物相容性和低抗原性，其在生物以及医学等领域也有着广泛的应用，根据不同的用途，胶原蛋白被制成人工皮肤，人工血管，人工尿道，人工心脏瓣膜，植入人工牙，止血粉剂，手术缝合线，组织工程支架材料，人工软骨，药物载体等。
由于天然胶原蛋白往往带有很多免疫反应位点，会引起生物体的免疫反应，而且天然胶原蛋白在提取过程中会用到强酸强碱等化学药品，最终提取所得到的往往是各种长度和分子量的多肽，不是单一组成的产品，导致其在生物医学应用上收到很大的限制。通过基因工程方法用大肠杆菌所培养出来的重组胶原蛋白，无免疫位点，具有-G-X-Y-周期性序列，胶原蛋白特有的三螺旋结构，良好的生物相容性、以及生物降解性。自动物体提取的胶原蛋白，存在水溶性不佳，可加工性弱，质量不稳定等缺陷。而且,动物来源的胶原蛋白难以排除疯牛病，口蹄疫等病毒风险。重组胶原蛋白没有这些问题
发明内容
本发明的目的在于提供重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶,主要包括复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料。
优选的，其制备方法包括以下步骤：
A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白，包括以下步骤：
a、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；
b、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：
(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；
(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中在37℃环境中继续扩大培养；
(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.6～0.8时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至20℃-25℃继续培养8h-10h诱导蛋白表达。将菌液离心，收集细胞沉淀；
c、重组胶原蛋白的纯化，主要包括以下步骤：
(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，其中缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；
(2)将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，细胞破碎条件：用2s超声2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中；
(3)将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：离心速率为10000-15000r/min,离心温度2℃-6℃，离心时间40min-60min；
(4)收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化；
(5)将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗6～8次后再用高浓度咪唑洗脱液将蛋白洗脱，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；
(6)收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次，紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS透析；
(7)收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到蛋白冻干粉，冻干粉于-10℃--20℃保存；
B、N-琥珀酰基壳聚糖的合成，合成方法包括以下步骤：
配置5％(V/V)的乳酸水溶液180ml，称取3g壳聚糖，加入乳酸水溶液中，搅拌使壳聚糖完全溶解，加入9g丁二酸酐，搅拌，室温下反应24小时；反应完成后，产物用氢氧化钾的乙醇溶液沉淀，抽滤，最后将产物溶于蒸馏水，用蒸馏水透析三天，其中透析袋截留分子量7000，冷冻干燥，得到N-琥珀酰基壳聚糖粉末；
C、氧化硫酸软骨素的合成，合成方法包括以下步骤：
取2g硫酸软骨素溶于200ml蒸馏水，加入0.54g高碘酸钠，在室温条件下避光反应4小时。反应完成后，将反应后的溶液用蒸馏水透析，其中透析袋截留分子量7000，透析三天,冷冻干燥，得到氧化硫酸软骨素；
D、将一定质量氧化硫酸软骨素和重组胶原蛋白混合配置成溶液，配置N-琥珀酰基壳聚糖溶液；其中氧化硫酸软骨素的浓度为100mg/ml，重组胶原蛋白的浓度为60-140mg/ml，N-琥珀酰基壳聚糖浓度为40mg/ml；
E、将步骤D中的两种溶液按体积比1:1混合搅拌均匀后静置于25℃形成凝胶，其中溶剂采用PBS缓冲溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明主要通过复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料，利用三者之间的化学反应交联形成，相比较从动物中提取的天然胶原蛋白，重组胶原蛋白具有低抗原性，，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性，本发明所提供的凝胶的制备过程中没有任何有毒物质的引入，所用的原料均无生物学毒性，因此所制备的凝胶具有良好的生物相容性，同时该种凝胶还具备良好的生物降解特性，具有诱导成骨的作用，可促进骨缺损的修复。
附图说明
图1为本发明的重组胶原蛋白、氧化硫酸软骨素、以及N-琥珀酰壳聚糖复合凝胶形成示意图；
图2为本发明的重组胶原蛋白复合凝胶材料的红外谱图
图3为本发明的重组胶原蛋白复合凝胶的扫描电镜图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶,：主要包括复合重组胶原蛋白、氧化硫酸软骨素、以及N-琥珀酰基壳聚糖三种材料，天然多糖及其衍生物有很好的生物相容性和可降解性，其在生物医学领域的应用非常广泛。壳聚糖是一种碱性多糖，是由甲壳素经过强碱水解或者酶解脱掉乙酰基所得到，甲壳素的主要来源是螃蟹，龙虾等海洋类节肢动物的壳中，是典型的废物再利用所得到的产品，来源非常广泛廉价易得，在可再生天然产物中的产量仅仅小于纤维素。壳聚糖除了生物相容性和可降解性外，还具有良好的抗菌性和抗肿瘤作用，但壳聚糖一个很大的缺陷是其是一种碱性多糖，只溶于酸性溶液中，而生物体中的环境多为中性或者偏弱碱性，这极大地限制了壳聚糖在生物医学中的应用。壳聚糖的侧链含有大量的氨基，可以通过各种与氨基的反应对其进行烷基化，巯基化，叠氮化，羟基化，酰化等修饰。通过利用丁二酸酐和壳聚糖侧链的氨基进行反应，从而增加壳聚糖的水溶性，制备了水溶性的N-琥珀酰基壳聚糖；硫酸软骨素是一种酸性粘性多糖，广泛存在于人和动物的组织中，是构成软骨，肌腱，血管壁，皮肤等结缔组织的主要成分之一，硫酸软骨素是一种无色无臭带有粘性的固体粉末，由氨基己糖和葡萄糖醛酸为基本单位构成的多糖聚合体，其实细胞外基质中主要的粘多糖，所以具有很多种生理活性和生物功能，可以降低血脂，消炎，促进伤口愈合，调节细胞粘附，抗氧化，抗肿瘤等多种功能，是一种非常有研究意义和开发潜力的材料；硫酸软骨素经过氧化生成醛基，N-琥珀酰基壳聚糖和重组胶原蛋白的侧链上具有氨基，醛基和氨基在常温常压下通过席夫碱反应交联，制备出无细胞毒性，具有生物相容性和可降解性的水凝胶。
实施例一：
本发明的制备方法包括以下步骤：
A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白，包括以下步骤：
a、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；
b、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：
(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；
(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中在37℃环境中继续扩大培养；
(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.6时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至20℃继续培养8h诱导蛋白表达。将菌液离心，收集细胞沉淀；
c、重组胶原蛋白的纯化，主要包括以下步骤：
(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，其中缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；
(2)将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，细胞破碎条件：用2s超声2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中；
(3)将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：离心速率为10000r/min,离心温度2℃，离心时间40min；
(4)收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化；
(5)将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗6次后再用高浓度咪唑洗脱液将蛋白洗脱，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；
(6)收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次，紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS透析；
(7)收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到蛋白冻干粉，冻干粉于-10℃保存；
B、N-琥珀酰基壳聚糖的合成，合成方法包括以下步骤：
配置5％(V/V)的乳酸水溶液180ml，称取3g壳聚糖，加入乳酸水溶液中，搅拌使壳聚糖完全溶解，加入9g丁二酸酐，搅拌，室温下反应24小时；反应完成后，产物用氢氧化钾的乙醇溶液沉淀，抽滤，最后将产物溶于蒸馏水，用蒸馏水透析三天，其中透析袋截留分子量7000，冷冻干燥，得到N-琥珀酰基壳聚糖粉末；
C、氧化硫酸软骨素的合成，合成方法包括以下步骤：
取2g硫酸软骨素溶于200ml蒸馏水，加入0.54g高碘酸钠，在室温条件下避光反应4小时。反应完成后，将反应后的溶液用蒸馏水透析，其中透析袋截留分子量7000，透析三天,冷冻干燥，得到氧化硫酸软骨素；
D、将一定质量氧化硫酸软骨素和重组胶原蛋白混合配置成溶液，配置N-琥珀酰基壳聚糖溶液；其中氧化硫酸软骨素的浓度为100mg/ml，重组胶原蛋白的浓度为60-140mg/ml，N-琥珀酰基壳聚糖浓度为40mg/ml；
E、将步骤D中的两种溶液按体积比1:1混合搅拌均匀后静置于25℃形成凝胶，其中溶剂采用PBS缓冲溶液。
本发明采用的硫酸软骨素、重组胶原蛋白及壳聚糖的浓度分别为100mg/ml、100mg/ml、40mg/ml。
重组胶原蛋白复合凝胶的制备过程如图1所示。首先制备氧化硫酸软骨素以及N-琥珀酰基壳聚糖，然后将其两者与制备好的重组胶原蛋白混合，反应即可交联形成凝胶。
如图2的红外光谱图所示，a、b、c、d、e线分别为硫酸软骨素、氧化硫酸软骨素、壳聚糖、N-琥珀酰基壳聚糖及重组胶原蛋白CLGPP的红外光谱。凝胶样品真空干燥后研碎与KBr混合均匀后，压片制成红外光谱样品。硫酸软骨素红外光谱中3415cm-1处为-0H伸缩振动吸收峰，2925cm-1处为C-H振动吸收峰，1654cm-1处为酰胺Ⅱ带C＝O伸缩振动吸收峰，1415cm-1处为C-O伸缩振动吸收峰，1376cm-1为-CH3弯曲振动吸收峰，1234cm-1为S＝O伸缩振动吸收峰；在氧化硫酸软骨素的红外图谱中，1737cm-1处出现了一个新的较弱的吸收峰，归属为醛基的C＝O振动吸收峰。在壳聚糖的红外谱图中，3425cm-1处为-0H伸缩振动吸收峰，1654cm-1处为酰胺Ⅱ带C＝O伸缩振动吸收峰，1599cm-1处为-NH2弯曲振动吸收峰，1158cm-1处为C-O-C对称伸缩振动吸收峰，1087cm-1处为C-O伸缩振动吸收峰。在N-琥珀酰基壳聚糖的红外谱图中，1654cm-1处的酰胺Ⅱ带和1403cm-1处的吸收峰明显增强，且1565cm-1出现了-NH-的弯曲振动吸收峰，均表明了琥珀酰衍生反应的发生，即壳聚糖中的氨基被部分取代。在重组胶原蛋白的红外谱图中，1658cm-1处为酰胺Ⅱ带C＝O伸缩振动吸收峰，1160cm-1处为重组胶原蛋白中天冬氨酸和谷氨酸侧链C-O伸缩振动，1076cm-1处为苏氨酸中C-O伸缩振动。
如图3扫描电镜图所示，不同浓度的重组胶原蛋白与氧化硫酸软骨素以及N-琥珀酰基壳聚糖复合的凝胶，都可形成良好的孔状结构。氧化硫酸软骨素和N-琥珀酰基壳聚糖的浓度保持为50mg/ml和20mg/ml。从A-D图中,重组胶原蛋白的浓度由0mg/ml，增加为30mg/ml，50mg/ml以及70mg/ml。当重组胶原蛋白的浓度增加时，凝胶的孔径变大变厚。所有溶液均用Ph＝7.4的PBS缓冲溶液配制。将凝胶样品用液氮冷冻，样品切成薄片后冷冻干燥，表面喷金后通过扫描电子显微镜观察形貌。
如重组胶原蛋白复合凝胶缓释BSA结果图所示，不加重组胶原蛋白的水凝胶缓释曲线和重组胶原蛋白水凝胶缓释曲线，两种凝胶对BSA都有一定的缓释作用，在前25h，同一时间内不加重组胶原蛋白的水凝胶BSA的释放量均高于重组胶原蛋白水凝胶BSA的释放量。25h后随着两种凝胶的完全降解，BSA基本完全释放。
实施例二：
在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：
(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；
(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中在37℃环境中继续扩大培养；
(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.7时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度22℃继续培养9h诱导蛋白表达。将菌液离心，收集细胞沉淀；
重组胶原蛋白的纯化，主要包括以下步骤：
(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，其中缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；
(2)将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，细胞破碎条件：用2s超声2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中；
(3)将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：离心速率为12000r/min,离心温度4℃，离心时间50min；
(4)收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化；
(5)将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗7次后再用高浓度咪唑洗脱液将蛋白洗脱，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；
(6)收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次，紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS透析；
(7)收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到蛋白冻干粉，冻干粉于-20℃保存。
实施例三：
在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：
(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；
(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中在37℃环境中继续扩大培养；
(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.8时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至25℃继续培养10h诱导蛋白表达。将菌液离心，收集细胞沉淀；
重组胶原蛋白的纯化，主要包括以下步骤：
(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，其中缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；
(2)将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，细胞破碎条件：用2s超声2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中；
(3)将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：离心速率为15000r/min,离心温度6℃，离心时间60min；
(4)收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化；
(5)将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗8次后再用高浓度咪唑洗脱液将蛋白洗脱，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；
(6)收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次，紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS透析；
(7)收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到蛋白冻干粉，冻干粉于-20℃保存。
本发明主要通过复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料，利用三者之间的化学反应交联形成，相比较从动物中提取的天然胶原蛋白，重组胶原蛋白具有低抗原性，，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性，本发明所提供的凝胶的制备过程中没有任何有毒物质的引入，所用的原料均无生物学毒性，因此所制备的凝胶具有良好的生物相容性，同时该种凝胶还具备良好的生物降解特性，具有诱导成骨的作用，可促进骨缺损的修复。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶,其特征在于：主要包括复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白；
B、合成N-琥珀酰基壳聚糖的；
C、合成氧化硫酸软骨素；
D、将一定质量氧化硫酸软骨素和重组胶原蛋白混合配置成溶液，配置N-琥珀酰基壳聚糖溶液；
E、将步骤D中的两种溶液按体积比1:1混合搅拌均匀后静置于25℃形成凝胶，其中溶剂采用PBS缓冲溶液。
3.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于，制备方法A包括以下步骤：
a、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；
b、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白；
c、将重组胶原蛋白纯化。
4.根据权利要求3所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于，步骤b在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：
(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；
(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中在37℃环境中继续扩大培养；
(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.6～0.8时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至20℃-25℃继续培养8h-10h诱导蛋白表达；将菌液离心，收集细胞沉淀。
5.根据权利要求3所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于，步骤c主要包括以下步骤：
(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，其中缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸氢二钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；
(2)将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，细胞破碎条件：用2s超声2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中；
(3)将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：离心速率为10000-15000r/min,离心温度2℃-6℃，离心时间40min-60min；
(4)收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化；
(5)将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗6～8次后再用高浓度咪唑洗脱液将蛋白洗脱，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4组成,其pH为7.4；
(6)收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次，紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS透析；
(7)收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到蛋白冻干粉，冻干粉于-10℃--20℃保存。
6.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于，制备方法B包括以下步骤：
配置5％(V/V)的乳酸水溶液180ml，称取3g壳聚糖，加入乳酸水溶液中，搅拌使壳聚糖完全溶解，加入9g丁二酸酐，搅拌，室温下反应24小时；反应完成后，产物用氢氧化钾的乙醇溶液沉淀，抽滤，最后将产物溶于蒸馏水，用蒸馏水透析三天，其中透析袋截留分子量7000，冷冻干燥，得到N-琥珀酰基壳聚糖粉末。
7.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于，制备方法C包括以下步骤：
取2g硫酸软骨素溶于200ml蒸馏水,加入0.54g高碘酸钠，在室温条件下避光反应4小时。反应完成后，将反应后的溶液用蒸馏水透析，其中透析袋截留分子量7000，透析三天,冷冻干燥，得到氧化硫酸软骨素。
8.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，其特征在于，步骤D中氧化硫酸软骨素的浓度为100mg/ml，重组胶原蛋白的浓度为60-140mg/ml，N-琥珀酰基壳聚糖浓度为40mg/ml。
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