CN108404220A - 一种可生物降解的水凝胶制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合了骨形态发生蛋白‑2(BMP‑2)的可生物降解水凝胶制剂及其制备方法。主要包括重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N‑琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及骨形态发生蛋白‑2(BMP‑2)。通过重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)以及N‑琥珀酰基壳聚糖(NSC)三种材料的化学反应交联形成水凝胶，复合了骨形态发生蛋白‑2(BMP‑2)，制备过程中没有引入任何有毒物质，该凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性，并且具有可促进骨缺损修复的功能。

Description

一种可生物降解的水凝胶制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂及其制备方法。
背景技术
水凝胶是以水为分散介质的凝胶，具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基和水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水基团遇水膨胀的交联聚合物，是一种高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，吸收大量的水。水凝胶具有良好的生物相容性及生物可降解性，具备类细胞外基质的仿生特性及三维水化网状结构。因此将水凝胶体系作为一种组织工程骨缺损修复材料具有重要应用前景。
胶原蛋白是一种广泛存在于生物体中的蛋白，是细胞基质的主要组成成分，主要存在于动物的结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，占哺乳动物体内蛋白质的25％～30％，相当于体重的6％。对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。除了生物力学以外，胶原蛋白还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。胶原蛋白在生物医学领域应用广泛，包括人工皮肤、人工血管、人工心脏瓣膜、植入人工牙、止血粉剂、手术缝合线、人工软骨、药物载体等。天然胶原蛋白往往带有很多免疫反应位点，会引起生物体的免疫反应，而且天然胶原蛋白在提取过程中会用到强酸强碱等化学药品，最终提取所得到的往往是各种长度和分子量的多肽，不是单一组成的产品，导致其在生物医学应用上受到很大的限制。通过基因工程方法用大肠杆菌所培养出来的重组胶原蛋白，无免疫位点，具有胶原蛋白特有的三螺旋结构，良好的生物相容性、以及生物降解性。动物体提取的胶原蛋白，存在水溶性不佳、可加工性弱、质量不稳定等缺陷。而且动物来源的胶原蛋白难以排除疯牛病，口蹄疫等病毒风险。重组胶原蛋白(CL)没有这些问题。
壳聚糖和纤维素都是天然多糖类生物大分子，具有良好的生物相容性。壳聚糖还有一定的抗炎作用，可以促进伤口愈合和组织修复。骨形态发生蛋白(BMP)家族一直是被重点研究的成骨诱导因子之一，至今已鉴定出至少15种不同的骨形态发生蛋白(BMP)。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)有刺激骨和软骨形成的作用，骨形态发生蛋白-3(BMP-3)和骨形态发生蛋白-7(BMP-7)可以促进软骨内骨形成。骨形态发生蛋白(BMP)还被发现有助于造血细胞的生长和上皮分化，具有有很好的生物相容性，且容易获得、制备方便。
颌骨缺损的修复一直以来是颌面部硬组织修复重建、牙槽骨再造成形等临床问题的重要研究方向之一。颌骨缺损常由于肿瘤、外伤、炎症等因素导致骨组织缺损，且其缺损常出现不规则、范围广等特点，因此制备一种可随缺损形态变化、并促使骨组织成形的支架材料，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂及其制备方法，以制备一种可随缺损形态变化、并促使骨组织成形的支架材料。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂,其特征在于，主要包括重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂，其特征在于，所述水凝胶制剂按重量份包括：重组胶原蛋白(CL)20—120份、氧化羧甲基纤维素(OCMC)为10—60份、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)10—60份以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)0.001—0.006份。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂,其特征在于，该水凝胶制剂用于制备治疗骨缺损药物中的应用。
一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白(CL)备用；
B、合成氧化羧甲基纤维素(OCMC)备用；
C、合成N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)备用；
D、配置重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的混合溶液，混合搅拌均匀后于25℃静置即得复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述所述步骤A中重组胶原蛋白(CL)的制备方法包括以下步骤：
a、确定重组胶原蛋白CL的序列为：
GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃。
b、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；
c、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白；
d、经纯化后即得所述的重组胶原蛋白(CL)。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B中氧化羧甲基纤维素(OCMC)的合成方法为：将羧甲基纤维素溶于水中，,加入高碘酸钠，在室温条件下避光反应，将反应后的溶液用蒸馏水透析3天，其中透析袋截留分子量为7000，冷冻干燥后即得到氧化羧甲基纤维素干粉。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤C中N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)的合成方法为：配置5％(V/V)的乳酸水溶液，称取壳聚糖加入乳酸水溶液中，搅拌使壳聚糖完全溶解，加入丁二酸酐，搅拌，室温下反应，反应完成后，产物用氢氧化钾的乙醇溶液沉淀，抽滤，最后将产物溶于蒸馏水，用蒸馏水透析三天，其中透析袋截留分子量为7000，冷冻干燥，即得到N-琥珀酰基壳聚糖粉末。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中重组胶原蛋白(CL)的浓度为20-120mg/mL、氧化羧甲基纤维素的浓度为10-60mg/mL、N-琥珀酰基壳聚糖浓度为10-60mg/mL，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的浓度为1-6μg/mL。
进一步地，所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，由该制备方法得到的水凝胶制剂用于制备治疗骨缺损药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
①本发明采用重组胶原蛋白(CL)具有低免疫原性，避免了动物来源胶原蛋白的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性。
②本发明采用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)制备的水凝胶制剂可以诱导新的骨组织形成，具有良好的生物相容性和生物降解性，并且具有可促进骨缺损修复的功能。
③本发明将重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)制备成水凝胶制剂，并将成骨作用优良的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)作为有效成分与之复合，植入骨组织缺损部位，使其诱导骨组织成骨的同时，凝胶作为生物屏障可以避免软组织长入缺损部位，对骨组织修复起到很好的效果。
④本发明水凝胶制剂能够逐步释放骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，起到了缓释的作用，可协同刺激周围骨组织的再生，起到修复成骨的作用。
附图说明
图1为本发明的水凝胶制剂制备示意图；
图2为本发明的水凝胶制剂材料的红外谱图；
图3为本发明的水凝胶制剂的扫描电镜图；
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所用的试剂均可以在市场上购买。
实施例1一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法
该制备方法包括以下步骤：
A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白(CL)，包括以下步骤：
a、确定重组胶原蛋白CL的序列为：
GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；
b、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；
c、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白(CL)，主要包括以下步骤：
(1)配制LB培养基，LB培养基由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠配制而成；
(2)将LB培养基加入挡板摇瓶，封口，取一个干净250mL锥形瓶，将LB培养基与瓶子放入灭菌锅120℃高温灭菌30min,灭菌冷却后，在超净台中将氨苄西林加入培养基，终浓度100mg/L,将培养液转移100mL至小锥形瓶，加入菌液进行接菌，在37℃环境下摇床培养过夜；
(3)过夜培养增菌后，将菌液倒入1L含氨苄西林钠100μg/mL的LB培养基继续在37℃环境下摇床培养5～6h；
(4)当OD600达到0.8～1.0时加入IPTG，终浓度0.5～0.75mmol/L，同时降低摇床温度至15℃-25℃继续培养8～24h诱导目标蛋白表达，将菌液离心，收集细胞沉淀；
d、重组胶原蛋白(CL)的纯化，主要包括以下步骤：
(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸氢二钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；
(2)将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，其中细胞破碎条件：用2s超声、2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中，将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，其中离心条件：离心速率10000-15000r/min,离心温度2℃-6℃，离心时间20min-30min；
(3)收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化，将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗6～8次后再用高浓度咪唑洗脱液进行洗脱，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4,组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na2HPO4,组成，其pH为7.4，收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次；
(4)紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS缓冲液透析，收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到重组胶原蛋白(CL)冻干粉，冻干粉于-20℃保存；
B、氧化羧甲基纤维素(OCMC)的合成，合成方法为：2g羧甲基纤维素溶于200mL水中，,加入0.61g高碘酸钠，在室温条件下避光反应4hrs，将反应后的溶液用蒸馏水透析(透析袋截留分子量7000)3天，冷冻干燥后得到氧化羧甲基纤维素干粉，于室温保存；
C、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)的合成，合成方法为：配置5％(V/V)的乳酸水溶液180mL，称取3g壳聚糖，加入乳酸水溶液中，搅拌使壳聚糖完全溶解，加入9g丁二酸酐，搅拌，室温下反应24h；反应完成后，产物用氢氧化钾的乙醇溶液沉淀，抽滤，最后将产物溶于蒸馏水，用蒸馏水透析三天，其中透析袋截留分子量7000，冷冻干燥，得到N-琥珀酰基壳聚糖粉末；
D、制备复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂，方法为：配置重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的混合溶液，其中重组胶原蛋白(CL)的浓度为20mg/mL、氧化羧甲基纤维素的浓度为10mg/mL、N-琥珀酰基壳聚糖浓度为10mg/mL，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的浓度为1μg/mL；混合搅拌均匀后静置于25℃即可形成凝胶。
如如图1水凝胶制剂制备示意图所示，制备氧化羧甲基纤维素和N-琥珀酰基壳聚糖，将它们与制备好的重组胶原蛋白(CL)混合，反应即可交联生成凝胶。
实施例2一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法
制备复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂，方法为：配置重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的混合溶液，其中重组胶原蛋白(CL)的浓度为120mg/mL、氧化羧甲基纤维素的浓度为60mg/mL、N-琥珀酰基壳聚糖浓度为60mg/mL，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的浓度为6μg/mL；混合搅拌均匀后静置于25℃即可形成凝胶。
实施例3一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法
制备复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂，方法为：配置重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的混合溶液，其中重组胶原蛋白(CL)的浓度为70mg/mL、氧化羧甲基纤维素的浓度为35mg/mL、N-琥珀酰基壳聚糖浓度为35mg/mL，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的浓度为3.5μg/mL；混合搅拌均匀后静置于25℃即可形成凝胶。
实施例4水凝胶制剂的红外光谱检测
如图2的红外光谱图所示，a，b，c线分别为单独的氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及重组胶原蛋白(CL)的红外光谱，d线为重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)复合形成的凝胶的红外光谱。凝胶样品真空干燥后研碎与KBr混合均匀后，压片制为红外光谱样品。红外光谱图中出现重组胶原蛋白(CL)1658cm-1处的酰胺C＝O的伸缩振动吸收峰，羧甲基纤维素3453cm-1处O-H的伸缩振动吸收峰，N-琥珀酰基壳聚糖2921cm-1处的C-H伸缩振动吸收峰，以及复合凝胶1670cm-1处的席夫碱C-N的特征吸收峰。
实施例5水凝胶制剂的电镜检测
如图3扫描电镜图所示，不同浓度的重组胶原蛋白(CL)与氧化羧甲基纤维素(OCMC)以及N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)的复合凝胶，都可形成良好的孔状结构。氧化羧甲基纤维素和N-琥珀酰基壳聚糖的浓度均保持为15mg/mL。从A-E图中,重组胶原蛋白(CL)的浓度由0mg/mL，增加为20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、以及80mg/mL。当重组胶原蛋白(CL)的浓度增加时，凝胶空隙率减小，层次变多，空间构造更为复杂。所有溶液均用生理盐水配制。将凝胶样品用液氮冷冻，样品切成薄片后冷冻干燥，表面喷金后通过扫描电子显微镜观察形貌。
实施例6一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂作用于骨缺损动物模型的实验
实验材料：SPF级SD大鼠48只、实施例1制备的复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂
实验步骤：
1)选SPF级SD大鼠48只，随机分成三组(空白对照组，CL-OCMC-NSC对照组，CL-OCMC-NSC-BMP2组)，每组16只，待大鼠适应环境5日后制备骨缺损模型。
2)使用10％水合氯醛(1mL/100mg大鼠体重)腹腔注射麻醉大鼠，备皮，消毒后切开分离皮肤、黏膜、骨膜，使用牙科钻在大鼠头部制备2个约8mm大小骨缺损面，制备过程使用生理盐水降温。
3)待大鼠骨缺损创面止血后，CL-OCMC-NSC-BMP2组大鼠植入复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂(CL-OCMC-NSC-BMP2)，CL-OCMC-NSC对照组大鼠植入不含骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂(CL-OCMC-NSC)，空白对照组大鼠不植入任何材料；缝合皮肤黏膜后将大鼠放入饲养盒中，并用SPF的标准饲料进行喂养。
4)密切观察大鼠生理状况，全部48只大鼠无意外死亡，无感染。分别在凝胶植入大鼠体内2周，4周、8周、以及12周时麻醉处死大鼠。
实验结果：观察空白对照组、CL-OCMC-NSC凝胶植入组以及CL-OCMC-NSC-BMP2凝胶植入组大鼠颅骨缺损孔径变化，随着时间的推移，植入CL-OCMC-NSC凝胶和CL-OCMC-NSC-BMP2凝胶的两组骨缺损模型的颅骨缺损孔径呈逐渐减小的趋势。实验进行到第12周时，植入CL-OCMC-NSC-BMP2凝胶的模型组颅骨缺损部位孔径明显减小，而植入CL-OCMC-NSC凝胶的模型组颅骨缺损部位孔径减小程度不如植入CL-OCMC-NSC-BMP2凝胶的模型组，空白对照组基本没有减小。结果表明CL-OCMC-NSC凝胶和CL-OCMC-NSC-BMP2凝胶对骨缺损均具有一定的修复效果，但CL-OCMC-NSC-BMP2凝胶的修复效果更加明显。

Claims (9)

1.一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂,其特征在于，主要包括重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。
2.如权利要求1所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂，其特征在于，所述水凝胶制剂按重量份包括：重组胶原蛋白(CL)20—120份、氧化羧甲基纤维素(OCMC)为10—60份、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)10—60份以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)0.001—0.006份。
3.如权利要求1或2所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂,其特征在于，该水凝胶制剂用于制备治疗骨缺损药物中的应用。
4.如权利要求1所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白(CL)备用；
B、合成氧化羧甲基纤维素(OCMC)备用；
C、合成N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)备用；
D、配置重组胶原蛋白(CL)、氧化羧甲基纤维素(OCMC)、N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的混合溶液，混合搅拌均匀后于25℃静置即得复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的水凝胶制剂。
5.如权利要求4所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤A中重组胶原蛋白(CL)的制备方法包括以下步骤：
a、确定重组胶原蛋白CL的序列为：
GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；
b、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；
c、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白；
d、经纯化后即得所述的重组胶原蛋白(CL)。
6.如权利要求4所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B中氧化羧甲基纤维素(OCMC)的合成方法为：将羧甲基纤维素溶于水中，,加入高碘酸钠，在室温条件下避光反应，将反应后的溶液用蒸馏水透析3天，其中透析袋截留分子量为7000，冷冻干燥后即得到氧化羧甲基纤维素干粉。
7.如权利要求4所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤C中N-琥珀酰基壳聚糖(NSC)的合成方法为：配置5％(V/V)的乳酸水溶液，称取壳聚糖加入乳酸水溶液中，搅拌使壳聚糖完全溶解，加入丁二酸酐，搅拌，室温下反应，反应完成后，产物用氢氧化钾的乙醇溶液沉淀，抽滤，最后将产物溶于蒸馏水，用蒸馏水透析三天，其中透析袋截留分子量为7000，冷冻干燥，即得到N-琥珀酰基壳聚糖粉末。
8.如权利要求4所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中重组胶原蛋白(CL)的浓度为20-120mg/mL、氧化羧甲基纤维素的浓度为10-60mg/mL、N-琥珀酰基壳聚糖浓度为10-60mg/mL，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的浓度为1-6μg/mL。
9.如权利要求4-8中任意一项所述的一种复合了骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的可生物降解水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，由该制备方法得到的水凝胶制剂用于制备治疗骨缺损药物中的应用。
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