CN105126163A - 用于软骨修复的具有组织诱导性的水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于软骨修复的具有组织诱导性的水凝胶的制备方法，其步骤主要是，A、多糖或蛋白的双键化，B、水凝胶的制备，C、生长因子的吸附。该方法以可完全降解的双键化天然多糖/蛋白和甲基丙烯酰胺化的多巴胺为主要成分，通过自由基聚合双键化多糖/蛋白与甲基丙烯酰胺多巴胺两种物质而形成双网络结构水凝胶。随后，水凝胶通过脱水和再溶胀作用吸附生物活性生长因子，且生长因子通过多巴胺组分固定于水凝胶中。该方法制备的水凝胶具备良好的生物可降解性、细胞/组织亲和性，装载的生长因子活性高，缓释性能好，能更好的诱导软骨再生，促进软骨修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于软骨修复的具有组织诱导性的水凝胶的制备方法
背景技术
水凝胶的结构和天然软骨的细胞外基质相似，已被广泛应用于软骨缺损修复的研究，有望成为软骨替换材料。然而，水凝胶的机械性能差，难以适应关节所处的各种力学环境，限制了其作为软骨替换材料的应用。最新研究发现，双网络结构水凝胶具有良好的机械性能，甚至可以使水凝胶的机械性能达到或则超过软骨的机械性能。现有的双网络结构水凝胶的制备方法主要是先聚合一种单体网络，然后再将其放入含第二层网络单体的溶液中溶胀后聚合第二层单体，从而形成双网络结构水凝胶。然而，这种两步制备水凝胶的方法增加了材料的制备难度，制备成本高；同时，这种双网络结构水凝胶大都采用不可降解的合成高分子和另外一种合成高分子或天然大分子交联而成，存在不可完全降解及细胞/组织亲和性不好的问题。
生物活性因子(如TGF-β、BMPs、IGF等)作为软骨组织工程的重要组成部分，可用来调控细胞的分化、诱导和加速软骨的形成。生物活性因子结合到水凝胶中可控制细胞的分化和组织的形成，并能增强水凝胶的生物活性。然而，生长因子药价昂贵、半衰期短、容易变性，直接在水凝胶表面滴加生长因子或用水凝胶直接溶胀含因子的溶液容易产生突释，还会因为局部过量产生毒性和致癌性。通过水凝胶成分中的基团共价固定因子，可以解决突释及局部过量毒性问题，但因子的活性会因共价反应受到破坏。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于软骨修复的具有组织诱导性的水凝胶的制备方法。该方法制备的水凝胶具备良好的生物可降解性、细胞/组织亲和性，装载的生长因子活性高，缓释性能好，能更好的诱导软骨再生，促进软骨修复。
本发明为实现其发明目的，所采用的技术方案是，一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其具体步骤如下：
一种用于软骨修复的具有组织诱导性的水凝胶的制备方法，其具体步骤如下：
A、多糖或蛋白的双键化
将多糖或蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中得到多糖或蛋白的质量浓度为0.5～10％的溶液，然后，向溶液中滴加多糖或蛋白0.16～17.5倍质量的甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸，然后在5℃～60℃下，搅拌反应2～24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的多糖或蛋白；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的多糖或蛋白共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的多糖或蛋白的质量浓度为0.5-20％，甲基丙烯酰胺多巴胺单体的质量浓度为0.5-5％。然后，将光引发剂加入到混合溶液中，加入的光引发剂的质量浓度为0.05～0.5％；再用波长为365nm、强度为2～10mw/cm2的紫外光，对混合液照射5～15分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液或水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50～99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到生长因子浓度为0.02～0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液或水中，溶胀后即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、A步中的天然高分子的多糖/蛋白通过甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸进行改性后，使其侧链带有双键基团，使原本难以聚合的多糖或蛋白能够聚合形成水凝胶。B步中，侧链带有双键基团的多糖/蛋白再与侧链带有双键的甲基丙烯酰胺化多巴胺通过侧链的双键进行自由基聚合生成碳碳共价键第一网络；同时，甲基丙烯酰胺化多巴胺的酚羟基和多糖或蛋白侧链上的氨基、羟基或羧基通过氢键作用形成第二网络，从而使最终制的水凝胶具备双网络结构，力学性能好。并且多巴胺的自粘附性还使水凝胶具备自愈合能力，抵抗破坏的能力强，能更好的满足受损软骨修复的需要。
二、碳碳共价形成的第一网络，氢键作用形成的第二网络，在同一液相环境中一步形成。双网络结构水凝胶一步制备形成，较之于两步法，其制备简便、快捷，成本低，且能更精确的控制水凝胶中各组分的比例。
三、形成水凝胶的主体成分是具有优异的细胞/组织亲和性的多巴胺和天然高分子的多糖或蛋白，且三种物质均可以完全生物降解。因此，本发明制备的水凝胶能够完全生物降解，且细胞/组织亲和性好，有利于软骨组织的生长和修复。
四、双网络结构水凝胶中的多巴胺上的酚羟基在C步的液相环境中与生长因子中的氨基或巯基结合，将因子负载在水凝胶中。这种非共价固定因子的方式既能很好的将生长因子固定在水凝胶上，既解决突释及局部过量毒性问题，同时也避免了生长因子会因共价反应受到的破坏，其活性保持良好，能更好的诱导软骨组织的生长与修复。
进一步，本发明A步中的多糖是壳聚糖，硫酸软骨素和透明质酸，蛋白是明胶。
这几种天然多糖/蛋白都能与甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸通过适当的反应条件而在其侧链上接枝上双键。然后，通过自由基聚合反应使带双键的多糖/蛋白交联，从而形成一层共价交联网络。
进一步，本发明的A步中的多糖是海藻酸钠，蛋白是胶原；在加入甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸的同时，还加入EDC/NHS。
进一步，本发明的B步中的光引发剂是irgacure2959，irgacure184，irgacure127或irgacure500。
进一步，本发明的C步中的生长因子是转化生长因子TGF-β1、TGF-β2、或TGF-β3。
进一步，本发明的C步中的生长因子是骨形态发生蛋白BMP-2或BMP-7。
进一步，本发明的C步中的生长因子是胰岛素生长因子IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ。
上述的转化生长因子和胰岛素生长因子具有良好软骨诱导功能，骨形态发生蛋白能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。
具体实施方式
实施例1
A、明胶的双键化
将明胶溶于磷酸盐缓冲溶液中得到明胶的质量浓度为10％的溶液，然后，向溶液中滴加明胶0.8倍质量的甲基丙烯酸酐，然后在50℃下，搅拌反应3小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的明胶；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的明胶共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的明胶的质量浓度为20％，甲基丙烯酰胺多巴胺单体的质量浓度为4％。然后，将光引发剂irgacure2959加入到混合溶液中，加入的光引发剂的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为10mw/cm2的紫外光，对混合液照射5分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到转化生长因子TGF-β1浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例2
A、明胶的双键化
将明胶溶于磷酸盐缓冲溶液中得到明胶的质量浓度为10％的溶液，然后，向溶液中滴加明胶17.5倍质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后在50℃下，搅拌反应3小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的明胶；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的明胶共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的明胶的质量浓度为15％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为3％。，将光引发剂irgacure127加入到混合溶液中，加入的光引发剂的质量浓度为0.1％；再用波长为365nm、强度为5mw/cm2的紫外光，对混合液照射10分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为75％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到转化生长因子TGF--β3浓度为0.02μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施例3
A、明胶的双键化
将明胶溶于磷酸盐缓冲溶液中得到明胶的质量浓度为10％的溶液，然后，向溶液中滴加明胶0.16倍质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后在50℃下，搅拌反应3小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的明胶；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的明胶共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的明胶的质量浓度为20％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为5％。，将光引发剂irgacure184加入到混合溶液中，加入的光引发剂的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为5mw/cm2的紫外光，对混合液照射5分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到转化生长因子TGF—β2浓度为0.1μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例4
A、明胶的双键化
将明胶溶于磷酸盐缓冲溶液中得到明胶的质量浓度为10％的溶液，然后，向溶液中滴加明胶6倍质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后在50℃下，搅拌反应3小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的明胶；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的明胶共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的明胶的质量浓度为20％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为5％。，将光引发剂irgacure500加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure500的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为5mw/cm2的紫外光，对混合液照射5分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用氯化钠溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-7浓度为0.1μg/ml的氯化钠溶液中，溶胀后即得。
实施实例5
A、海藻酸钠的双键化
将海藻酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中得到海藻酸钠的质量浓度为1％的溶液，再加入海藻酸钠1倍摩尔量的NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，然后，向溶液中滴加海藻酸钠7倍质量的甲基丙烯酸酯，然后在25℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的海藻酸钠；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的海藻酸钠共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的海藻酸钠的质量浓度为2％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure2959加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure2959的质量浓度为0.5％；再用波长为365nm、强度为10mw/cm2的紫外光，对混合液照射5分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用氯化钠溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为75％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到胰岛素生长因子IGF-Ⅰ浓度为0.2μg/ml的氯化钠溶液中，溶胀后即得。
实施实例6
A、海藻酸钠的双键化
将海藻酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中得到海藻酸钠的质量浓度为1％的溶液，再加入海藻酸钠1倍摩尔量的NHS/EDC,然后，向溶液中滴加海藻酸钠17.5倍质量的甲基丙烯酸酯，然后在25℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的海藻酸钠；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的海藻酸钠共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的海藻酸钠的质量浓度为1％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure500加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure500的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为2mw/cm2的紫外光，对混合液照射10分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为75％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到胰岛素生长因子IGF-Ⅱ浓度为0.02μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例7
A、壳聚糖的双键化
将壳聚糖溶于缓冲溶液中得到壳聚糖的质量浓度为1％的溶液，然后，向溶液中滴加壳聚糖15倍质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后在60℃下，搅拌反应6小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的壳聚糖；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的壳聚糖共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的壳聚糖的质量浓度为10％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure2959加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure2959的质量浓度为0.2％；再用波长为365nm、强度为2mw/cm2的紫外光，对混合液照射10分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-2浓度为0.2μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例8
A、壳聚糖的双键化
将壳聚糖溶于缓冲溶液中得到壳聚糖的质量浓度为1％的溶液，然后，向溶液中滴加壳聚糖10倍质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后在60℃下，搅拌反应6小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的壳聚糖；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的壳聚糖共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的壳聚糖的质量浓度为2％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为4％。，将光引发剂irgacure127加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure127的质量浓度为0.25％；再用波长为365nm、强度为5mw/cm2的紫外光，对混合液照射8分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为90％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-2浓度为0.1μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例9
A、硫酸软骨素的双键化
将硫酸软骨素溶于水中得到硫酸软骨素的质量浓度为2％的溶液，然后，向溶液中滴加硫酸软骨素17.5倍质量的甲基丙烯酸酐，然后在6℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的硫酸软骨素；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的硫酸软骨素共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的硫酸软骨素的质量浓度为20％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为2％。，将光引发剂irgacure500加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure500的质量浓度为0.5％；再用波长为365nm、强度为2mw/cm2的紫外光，对混合液照射5分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用氯化钠溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为90％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-7浓度为0.1μg/ml的氯化钠溶液中，溶胀后即得。
实施例10
A、硫酸软骨素的双键化
将硫酸软骨素溶于水中得到硫酸软骨素的质量浓度为2％的溶液，然后，向溶液中滴加硫酸软骨素0.16倍质量的甲基丙烯酸酐，然后在6℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的硫酸软骨素；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的硫酸软骨素共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的硫酸软骨素的质量浓度为20％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure500加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure的质量浓度为0.5％；再用波长为365nm、强度为10mw/cm2的紫外光，对混合液照射15分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为75％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-2浓度为0.2μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例11
A、透明质酸的双键化
将透明质酸溶于水中得到透明质酸的质量浓度为2％的溶液，然后，向溶液中滴加透明质酸0.8倍质量的甲基丙烯酸酐，然后在5℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的透明质酸；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的透明质酸共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的透明质酸的质量浓度为2％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为1％。，将光引发剂irgacure127加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure127的质量浓度为0.5％；再用波长为365nm、强度为2mw/cm2的紫外光，对混合液照射10分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用氯化钠溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-7浓度为0.2μg/ml的氯化钠溶液中，溶胀后即得。
实施例12
A、透明质酸的双键化
将透明质酸溶于水中得到透明质酸的质量浓度为2％的溶液，然后，向溶液中滴加透明质酸8倍质量的甲基丙烯酸，然后在5℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的透明质酸；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的透明质酸共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的透明质酸的质量浓度为1％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure184加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure184的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为10mw/cm2的紫外光，对混合液照射10分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到骨形态发生蛋白BMP-2浓度为0.02μg/ml的水溶液中，溶胀后即得。
实施例13
A、胶原的双键化
将胶原溶于磷酸盐缓冲溶液中得到胶原的质量浓度为1％的溶液，再加入胶原1倍摩尔量的NHS/EDC,然后，向溶液中滴加胶原9倍质量的甲基丙烯酰胺，然后在25℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的胶原；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的胶原共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的胶原的质量浓度为1％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure127加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure127的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为10mw/cm2的紫外光，对混合液照射10分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到含转化生长因子TGF-β1浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
实施实例16
A、胶原的双键化
将胶原溶于磷酸盐缓冲溶液中得到胶原的质量浓度为1％的溶液，再加入胶原1倍摩尔量的NHS/EDC,然后，向溶液中滴加胶原0.16倍质量的甲基丙烯酰胺，然后在25℃下，搅拌反应24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的胶原；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的胶原共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的胶原的质量浓度为1％，甲基丙烯酰胺单体的质量浓度为0.5％。，将光引发剂irgacure2959加入到混合溶液中，加入的光引发剂irgacure2959的质量浓度为0.05％；再用波长为365nm、强度为5mw/cm2的紫外光，对混合液照射5分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到含转化生长因子TGF-β3浓度为0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液中，溶胀后即得。
本发明使用的甲基丙烯酰胺化多巴胺为已有的化合物，是多巴胺单体通过与甲基丙烯酸酐的酰胺反应制得。
Claims (7)
1.一种用于软骨修复的具有组织诱导性的水凝胶的制备方法，其具体步骤如下：
A、多糖或蛋白的双键化
将多糖或蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中得到多糖或蛋白的质量浓度为0.5～10％的溶液，然后，向溶液中滴加多糖或蛋白0.16～17.5倍质量的甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸，然后在5℃～60℃下，搅拌反应2～24小时；随后，将溶液稀释5倍，再进行透析、干燥后得到双键化的多糖或蛋白；
B、水凝胶的制备
将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶于二甲亚砜得到甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液，再将甲基丙烯酰胺化多巴胺单体溶液和A步得到的双键化的多糖或蛋白共溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成混合液，混合液中双键化的多糖或蛋白的质量浓度为0.5-20％，甲基丙烯酰胺多巴胺单体的质量浓度为0.5-5％。然后，将光引发剂加入到混合溶液中，加入的光引发剂的质量浓度为0.05～0.5％；再用波长为365nm、强度为2～10mw/cm2的紫外光，对混合液照射5～15分钟，引发溶液聚合形成水凝胶；
C、生长因子的吸附
用磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液或水对水凝胶进行清洗，再用体积浓度为50～99％的乙醇溶液对水凝胶进行脱水；清洗、脱水的操作进行3次；然后将水凝胶转移到生长因子浓度为0.02～0.2μg/ml的磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液或水中，溶胀后即得。
2.根据权利要求1所述的一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的A步中的多糖是硫酸软骨素、透明质酸或壳聚糖，蛋白是明胶。
3.根据权利要求1所述的一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的A步中的多糖是海藻酸钠，蛋白是胶原；在加入甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸前，还先加入海藻酸钠或胶原1倍摩尔量的EDC/NHS。
4.根据权利要求1所述的一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的B步中的光引发剂是irgacure2959，irgacure184，irgacure127或irgacure500。
5.根据权利要求1所述的一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的C步中的生长因子是转化生长因子TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。
6.根据权利要求1所述的一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的C步中的生长因子是骨形态发生蛋白BMP-2或BMP-7。
7.根据权利要求1所述的一种用于软骨修复的具备组织诱导性的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的C步中的生长因子是胰岛素生长因子IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ。
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Granted publication date: 20180817 Termination date: 20210921 |
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