CN107308505B - 一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架及其制备方法 - Google Patents

一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海藻酸钠‑改性明胶‑改性多巴胺复合支架及其制备方法。制备方法包括明胶和多巴胺的双键化改性、三维打印浆料的配制和三维打印成型组织工程支架。本发明利用少量的钙离子预交联得到类似于高固含量无机粉体的利于打印成型的浆料，制备所得到的支架能维持其三维多孔结构，优化了打印浆料的制备，无需过多的辅助条件打印，大大节省了材料。本发明制备复合支架的条件温和，方法简单，容易实现。制备所得的复合支架可用于皮肤修复、药物缓释和组织工程等领域。

Description

一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程支架的制备领域，具体涉及一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架及其制备方法。
背景技术
凝胶是一类含有吸湿性的高分子材料，由于其良好的生物相容性引起了研究工作者的关注。成型水凝胶支架的方法有模具法、相分离、冷冻干燥、发泡法、粒子沥滤法和三维打印等方法，相分离法是在一个多组分均相系统里，通过分离以聚合物为连续相和以溶剂为分散相。经过冷冻干燥得到多孔支架。相分离的工艺较为复杂，不能得到精确的控制支架形态。气体发泡法是浸泡在高压二氧化碳的片状聚合物降压到常态，使得气泡增大成核，在聚合物形成多孔结构。虽然气体发泡法避免了使用有机溶剂，但也难以精确控制支架的形状和空隙，孔尺寸。粒子沥滤法是聚合物溶解后加入糖、氯化钠等造孔剂搅拌均匀，然后放入模具成型至溶剂挥发，用去离子水除去造孔剂烘干形成多孔支架。这种方法除有溶剂残留和无法精确控制空隙率外，还有可能导致闭孔、连通性差等问题。相比前几种成型方法，三维打印其可定制化设计及快速成型而无需脱模等工序，大大减少了原料的浪费和节省了成型时间。因此三维打印无疑是近十几年来人们热衷研究的技术，但是由于设备的限制，适用于生物三维成型的材料并不是很广泛，尤其是水凝胶类材料，目前这类材料大多是用热塑性挤出或者是依靠环境刺激响应成型（如光固化和温度响应），但往往外界环境的刺激响应与打印的速度不匹配，所以这就限定了材料在三维打印成型上的应用。
在众多研究的生物材料中，海藻酸钠和明胶是常见的凝胶体系，其中海藻酸钠是一类从褐藻中提出来的聚阴离子多糖，明胶是从胶原中提取的多肽物质，二者也是打印常见的材料，但凝胶材料其机械性能一般较差，通常采用双网络交联提高力学性能。因此对明胶进行双键化得到甲基酰胺明胶，采用光交联和海藻酸钠的离子交联形成水网络水凝胶提高凝胶支架的力学性能。海藻酸钠和明胶的亲水性均较好，不易于细胞粘附，加入改性多巴胺材料可提高细胞相容性。综上所述，本文采用海藻酸钠/甲基丙烯酰胺明胶/甲基丙烯酰胺多巴胺作为三维打印凝胶体系，利用钙离子预交联海藻酸钠和改性明胶的热敏效应提高打印纤维的强度得到类似高固含量的无机材料的打印效果，随后用紫外固化和钙离子二次交联得到具有连通孔的凝胶支架。
发明内容
本发明的目的就是提供了一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架及其制备方法，能够得到类似高固含量无机粉体打印成型的效果。本发明的复合支架可用于皮肤修复、药物缓释和组织工程等领域。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）三维打印浆料的配制：将无水氯化钙溶于水中，再加入海藻酸钠，得混合液a；将改性明胶溶于水中，再加入引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和溶于二甲基亚砜的改性多巴胺，搅拌混合均匀，静止除气泡，得混合液b；将混合液a和混合液b超声混合均匀，得三维打印浆料；
（2）复合支架的三维打印：将步骤（1）所得三维打印浆料加入三维打印机中打印海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架；
（3）复合支架的后处理：将步骤（2）所得海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架进行紫外辐照，再浸渍于氯化钙溶液中交联，得海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架。
优选的，步骤（1）所述改性明胶的合成包括以下步骤：将明胶溶于磷酸盐缓冲液，缓慢加入甲基丙烯酸酐，反应后转移至透析袋透析，冷冻干燥后得到的海绵状物质则为改性明胶。
优选的，步骤（1）所述改性多巴胺的合成包括以下步骤：四硼酸钠和碳酸氢钠溶于去离子水中；氮气保护下，加入多巴胺盐酸盐溶解；随后缓慢滴加溶于四氢呋喃的甲基丙烯酸酐，采用氢氧化钠溶液调节PH，反应后用乙酸乙酯萃取，正己烷重结晶，抽滤，冻干得到的淡黄色粉末即为改性多巴胺。
优选的，步骤（1）所述的改性明胶和改性多巴胺中甲基丙烯酰胺基的取代度均为40%-80%。
优选的，步骤（1）所述的三维打印浆料中海藻酸钠的浓度为3-5wt%，改性明胶的浓度为0.1-0.2 g/ml，改性多巴胺的浓度为0.5-1wt%。
优选的，步骤（1）所述的无水氯化钙在三维打印浆料中的浓度为0.1-0.3 wt%。
优选的，步骤（1）所述改性明胶的溶解温度为40-60℃。
优选的，步骤（1）所述超声的温度为30-50℃，时间为30min-120min。
优选的，步骤（2）所述打印中三维打印机为德国的3D-bioplotter，使用200-410μm的针头，打印压力为0.9-1.5bar，打印速度为25-40mm/s，纤维间距为0.8-1.2mm，打印料筒温度为30-45℃，打印平台温度为4-10℃。
优选的，步骤（2）所述的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架为方块网格10mm×10mm×5mm或圆柱网格Φ10mm×H2。
优选的，步骤（3）所述海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架放置在-20℃冰箱中储存。
优选的，步骤（3）所述紫外辐照的紫外光为5-10mW/cm2，照射时间为300s-600s。
优选的，步骤（3）所述氯化钙溶液的浓度为2-3wt%，交联时间为5-10min。
由以上所述的方法制得的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架。
海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的打印成型，通过钙离子预交联海藻酸钠制备打印浆料结合3D-bioplotter实现；复合支架的力学性能，可以通过光交联和离子交联得到双网络来调控。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明制备海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的方法，原料来源广泛，价格低廉；过程简单方便，且无需使用化学交联剂。
（2）本发明制备海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的过程中，利用少量的钙离子预交联得到类似于高固含量无机粉体的利于打印成型的浆料，制备所得到的支架能维持其三维多孔结构，优化了打印浆料的制备，无需过多的辅助条件打印，且复合水凝胶有适当的溶胀度，可保证营养物质和代谢废物的交换运输。
（3）本发明使用的改性明胶和改性多巴胺的生物相容性较好，在紫外照射短时间内即可成胶，可联合骨髓间充质干细胞和抗菌肽等构建功能化的组织工程支架。
附图说明
图1a、图1b分别为实施例1所得复合支架的正面孔和侧面孔的三维显微镜结构图；
图1c、图1d分别为实施例2所得复合支架的正面孔和侧面孔的三维显微镜结构图；
图1e、图1f分别为实施例3所得复合支架的正面孔和侧面孔的三维显微镜结构图；
图2a为实施例1-3所得复合支架的溶胀度曲线图；
图2b为实施例1-3所得复合支架的平衡溶胀度柱状图；
图3为实施例1-3所得复合支架的孔隙率柱状图。
图4为实施例4所得复合支架的SEM图。
图5为实施例5所得复合支架的SEM图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明的具体实施做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）改性明胶和改性多巴胺的合成
在50℃下，将10g明胶溶于100ml磷酸盐缓冲液（PH=7.4）中，逐滴加入6ml甲基丙烯酸酐，反应3h后转移至14000Da透析袋中透析，每天换水2次，7d后冷冻干燥48h得到的海绵状物质则为改性明胶。
将4g四硼酸钠和1.6g碳酸氢钠溶于40ml去离子水中；氮气保护下，加入2g多巴胺盐酸盐溶解；随后滴加溶于四氢呋喃（10ml）的甲基丙烯酸酐（1.88ml），采用1M氢氧化钠溶液调节 PH=9，反应12h后用20ml乙酸乙酯萃取2遍去除有机溶剂 ，得到下层溶液用浓盐酸调节PH= 2，再用50ml乙酸乙酯萃取 3遍，然后加入正己烷重结晶，抽滤，冻干得到的淡黄色粉末即为改性多巴胺。
（2）打印浆料的配制
打印浆料整个体系为20ml的去离子水。其中在常温下，将1g海藻酸钠溶于10ml去离子水中，得海藻酸钠溶液；在50℃下，将2g改性明胶溶于10ml去离子水，再加入0.16g引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和提前溶于200μl二甲基亚砜的0.1g改性多巴胺搅拌混合均匀后，静止除气泡，随后将两种溶液混合搅拌均匀，在50℃下超声30min，得打印浆料。
（3）三维打印无钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架
将打印浆料放入三维打印机中打印无钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力为1bar，打印速度为25mm/s，纤维间距为1mm，打印料筒温度为45℃，打印平台温度为4℃。
（4）复合支架的后处理
将无钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架在365nm，5mW/cm2下紫外辐照600s 后，浸泡于浓度为2.5wt%钙离子溶液中交联7min，得到的复合支架放置-20℃冰箱储存。
实施例2
（1）按实施例1步骤（1）的方法合成改性明胶和改性多巴胺。
（2）打印浆料的配制
打印浆料整个体系为20ml的去离子水。其中在常温下，将0.03g无水氯化钙溶于10ml去离子水中，随后加入1g海藻酸钠，得混合溶液a。在50℃下，将2g改性明胶溶于10ml的去离子水中，再加入0.16g引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和提前溶于200μl二甲基亚砜的0.1g改性多巴胺搅拌混合均匀后，静止除气泡，随后将两种溶液混合搅拌均匀，在50℃下超声30min即可，得打印浆料。
（3）三维打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架
将打印浆料放入三维打印机中打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力1bar，打印速度为25mm/s，纤维间距为1mm，打印料筒温度为45℃，打印平台温度为4℃。
（4）复合支架的后处理
将含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架在365nm，5mW/cm2下紫外辐照600s 后，浸泡于浓度为2.5wt%钙离子溶液中交联7min，得到的复合支架放置-20℃冰箱储存。
实施例3
（1）按实施例1步骤（1）的方法合成改性明胶。
（2）打印浆料的配制
打印浆料整个体系为20ml的去离子水。其中在常温下，将0.03g无水氯化钙溶于10ml去离子水中，随后加入1g海藻酸钠，得混合溶液a。在50℃下，将2g改性明胶溶于10ml的去离子水中，再加入0.16g引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮搅拌混合均匀后，静止除气泡，随后将两种溶液混合搅拌均匀，在50℃下超声30min，得打印浆料。
（3）三维打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶复合支架
将打印浆料放入三维打印机中打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力1bar，打印速度为25mm/s，纤维间距为1mm，打印料筒温度为45℃，打印平台温度为4℃。
（4）复合支架的后处理
将含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶复合支架在365nm，5mW/cm2下紫外辐照600s 后，浸泡于浓度为2.5wt%钙离子溶液中交联7min，得到的复合支架放置-20℃冰箱储存。
实施例4
（1）按实施例1步骤（1）的方法合成改性明胶和改性多巴胺。
（2）打印浆料的配制
打印浆料整个体系为20ml的去离子水。其中在常温下，将0.02g无水氯化钙溶于10ml去离子水中，随后加入0.6g海藻酸钠，得混合溶液a。在60℃下，将4g改性明胶溶于10ml的去离子水中，再加入0.16g引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和提前溶于200μl二甲基亚砜的0.2g改性多巴胺搅拌混合均匀后，静止除气泡，随后将两种溶液混合搅拌均匀，在40℃下超声120min即可，得打印浆料。
（3）三维打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架
将打印浆料放入三维打印机中打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用200μm，打印压力1.2bar，打印速度为30mm/s，纤维间距为0.8mm，打印料筒温度为40℃，打印平台温度为7℃。
（4）复合支架的后处理
将含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架在365nm，8mW/cm2下紫外辐照500s 后，浸泡于浓度为3wt%钙离子溶液中交联5min，得到的复合支架放置-20℃冰箱储存。
实施例5
（1）按实施例1步骤（1）的方法合成改性明胶和改性多巴胺。
（2）打印浆料的配制
打印浆料整个体系为20ml的去离子水。其中在常温下，将0.06g无水氯化钙溶于10ml去离子水中，随后加入0.8g海藻酸钠，得混合溶液a。在50℃下，将3g改性明胶溶于10ml的去离子水中，再加入0.12g引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和提前溶于200μl二甲基亚砜的0.15g改性多巴胺搅拌混合均匀后，静止除气泡，随后将两种溶液混合搅拌均匀，在30℃下超声120min即可，得打印浆料。
（3）三维打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架
将打印浆料放入三维打印机中打印含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力1.5bar，打印速度为40mm/s，纤维间距为1.2mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
（4）复合支架的后处理
将含钙离子预交联的海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架在365nm，10mW/cm2下紫外辐照300s 后，浸泡于浓度为2wt%钙离子溶液中交联10min，得到的复合支架放置-20℃冰箱储存。
对实施例1、2、3所得的复合支架进行性能表征，图1a-图1f为复合支架在三维显微镜下观察的结构，实施例1所得复合支架的结构由于打印预凝胶的纤维强度不足，导致结构坍塌不能维持三维通孔结构，解决这类问题，大多方案是将打印预凝胶的成分含量提高或者是利用环境条件来控制成型，而本发明中的实施例2和实施例3预凝胶用了少量的氯化钙溶液预交联，使得预凝胶的弹性增强，与高固含量的无机打印浆料一样具有较高的支撑强度，所以，得到是连通的三维孔径。图2a、图2b分别为实施例1-3所得复合支架的溶胀曲线和平衡溶胀度图，从复合支架溶胀曲线图可以看出支架在吸水溶胀前3h的吸水性较强，吸水12h后趋于平衡，三种复合支架的平衡溶胀度无显著性差异，平衡溶胀度在2~4之间，纯明胶的溶胀度在5~10范围。复合支架的溶胀度与其交联结构有着联系，对于交联度高的复合支架而言，由于网络结构紧密，分子链间运动困难，进而导致水合作用弱，所以结果说明，三种复合支架的交联度较高，而且预凝胶的不同配置方法对支架的溶胀性能没有影响。其中，实施例1的复合支架得到吸水溶胀度比实施例2和实施例3的复合支架弱，这是由于实施例1复合支架打印交联后结构坍塌，导致复合支架的孔隙率降低，故而吸水性能较弱。这与图3显示的孔隙率结果图一致，其中实施例1复合支架的孔隙率为32.9%，实施例2复合支架的孔隙率为55.5%，实施例3复合支架的孔隙率为60.9%。图4和图5分别为实施例4和实施例5的扫描电子显微镜（SEM）图片。

Claims (7)

1.一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）三维打印浆料的配制：将无水氯化钙溶于水中，再加入海藻酸钠，得混合液a；将改性明胶溶于水中，再加入引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮和溶于二甲基亚砜的改性多巴胺，搅拌混合均匀，静止除气泡，得混合液b；将混合液a和混合液b超声混合均匀，得三维打印浆料； 所述的改性明胶和改性多巴胺中甲基丙烯酰胺基的取代度均为40%-80%；所述的三维打印浆料中海藻酸钠的浓度为3-5wt%，改性明胶的浓度为0.1-0.2 g/ml，改性多巴胺的浓度为0.5-1wt%；
（2）复合支架的三维打印：将步骤（1）所得三维打印浆料加入三维打印机中打印海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架；
（3）复合支架的后处理：将步骤（2）所得海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架进行紫外辐照，再浸渍于氯化钙溶液中交联，得海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架；所述紫外辐照的紫外光为5-10mW/cm2，照射时间为300s-600s。
2.如权利要求1所述的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的无水氯化钙在三维打印浆料中的浓度为0.1-0.3 wt%。
3.如权利要求1所述的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述改性明胶的溶解温度为40-60℃。
4.如权利要求1所述的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述超声的温度为30-50℃，时间为30min-120min。
5.如权利要求1所述的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述打印中三维打印机为德国的3D-bioplotter，使用200-410μm的针头，打印压力为0.9-1.5bar，打印速度为25-40mm/s，纤维间距为0.8-1.2mm，纤维角度为0-90°，打印料筒温度为30-45℃，打印平台温度为4-10℃。
6.如权利要求1所述的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述氯化钙溶液的浓度为2-3wt%，交联时间为5-10min。
7.由权利要求1-6任一项所述的方法制得的一种海藻酸钠-改性明胶-改性多巴胺复合支架。
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