CN102604149A - 三维壳聚糖水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用高温交联法制备三维壳聚糖水凝胶的方法以及所制得的壳聚糖水凝胶。本发明的方法包括如下步骤：(a)将壳聚糖粉末分散于去离子水溶液中；(b)调节上述步骤(a)所得到的壳聚糖分散液的pH至微酸性；(c)将步骤(b)所得的溶液在80-125℃的温度下进行高温交联；(d)交联反应结束后，用后处理液浸泡清洗所得产物，以去除残留酸液。本发明的高温交联法制备工艺简单，反应时间短，原料无需特殊处理，制备过程不引入交联剂等较高毒性的化学物质，最终产品无任何化学毒物残留，孔结构均匀、连通性好、容易成型，非常适合作为皮肤、软骨等软组织工程支架材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医药工程及组织工程技术领域的三维支架材料及其制备方法，该三维支架材料可用于细胞三维培养以及体外扩增，和生物活性物质的控制释放。
背景技术
三维支架材料在组织工程中起关键作用，它可作为细胞体外培养及增殖的载体，细胞随支架材料植入体内后，在体内环境下继续激增，并与宿主细胞和组织发生交互作用，形成新的组织，而材料经降解随新陈代谢排出体外，以达到组织修复的作用。
用于组织工程的三维支架材料包括胶原蛋白、壳聚糖以及聚乙烯醇等。其中，壳聚糖是一种线性多糖，它具有亲水性、pH敏感性、生物相容性以及生物降解性，这些特有的性质使其被广泛应用于组织工程支架材料。
近年来，在组织工程领域，多孔壳聚糖水凝胶三维支架的制备方法包括冷冻干燥法、溶剂置换法、以及气体发泡法。
其中，冷冻干燥法大致包括如下的步骤：(1)溶解：将壳聚糖粉末溶解于酸性溶液如0.2M醋酸水溶液中，制成壳聚糖水溶液；(2)预冻：上述水溶液预冻过夜(至少12小时)，冷冻温度一般控制在-20℃至-196℃；(3)冷冻抽干：上述冷冻壳聚糖溶液置于冷冻干燥器内抽干，抽干时间12-48小时，抽干温度-80℃至℃；(4)碱洗：抽干结束后，得到壳聚糖多孔支架材料用碱液浸如0.1M NaOH泡清洗三遍，再用去离子水浸泡清洗三遍；(5)清洗后壳聚糖支架材料，重复上述步骤(2)和(3)，得到冻干壳聚糖多孔支架材料。
另一种常用的制备多孔壳聚糖水凝胶三维支架的方法为溶剂置换法，其包括：(1)溶解：将壳聚糖粉末溶解于酸性溶液如0.2M醋酸水溶液中，制成壳聚糖水溶液；(2)成膜：将上述水溶液平铺于培养皿中，37℃烘干成薄膜；(3)溶胀：将上述壳聚糖薄膜浸泡于去离子水中，待其溶胀，取出；(4)置换：将上述溶胀壳聚糖薄膜按次序在10％、20％、40％、60％、80％、90％和100％(体积比)有机溶剂中浸泡三次，每次10分钟，将薄膜中水置换成有机溶剂，有机溶剂包括乙醇，二氯甲烷，丙酮，三氯甲烷和甲醇中得一种或多种；(5)干燥：将溶剂置换完毕的壳聚糖置于高温高压反应器，进行二氧化碳临界点干燥一小时，得到壳聚糖多孔支架材料。
制备多孔壳聚糖水凝胶三维支架的气体发泡方法则包括如下步骤：(1)溶解：将壳聚糖粉末溶解于溶剂中，制成壳聚糖溶液；溶剂包括0.2M醋酸、冰醋酸、二氯甲烷、甲酸、丙酮和六氟异丙醇中得一种或多种；(2)交联反应：在上述溶液中，加入交联剂，交联剂包括戊二醛、京尼平、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和六亚甲基二异氰酸酯中得一种或多种；然后，将上述壳聚糖-交联剂混合物置于高温高压反应器，以液体(高温高压)二氧化碳为介质，进行反应，反应时间为1-12小时；(3)排气清洗：反应结束后，降压，排出二氧化碳，降压速率为1-50大气压每分钟；然后，用去离子水清洗去除溶剂残留后，得到壳聚糖多孔支架材料。
另外，中国专利申请200910024842.X则公开了一种制备光交联壳聚糖水凝胶膜的方法，其以生物相容性高分子壳聚糖为起始物，通过对其进行化学修饰，在6-O位和N位分别引入羟丙基和叠氮基团，得到水溶性的光可交联壳聚糖。中国专利200810059134.5则采用预处理的具有一定酰化度的壳聚糖直接与碱溶液混合，不添加任何交联剂，经低温处理，得到壳聚糖物理水凝胶。在中国专利200510061869.8所公开的制备可用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的方法中，采用碳化二亚胺缩合的方法，依次将甲基丙烯酸和乳酸接枝在壳聚糖分子链中，所得的壳聚糖衍生物同时具有可聚合的不饱和碳一碳双键和水溶性。
然而，现有的这些方法存在这样或那样的缺陷，要么操作时间过长，例如冷冻干燥法；要么制备过程中需要大量使用有毒有机溶剂或交联剂，进而需要专门的溶剂去除步骤，并对最终产品的毒性物质残留量需要严格检测和控制，例如溶剂置换法和气体发泡法，而这也会增加了制备过程的时间和成本。因此，本领域迫切需要提供一种快速，简单且无需有机溶剂的支架材料的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简单、无需溶剂的制备壳聚糖水凝胶三维支架材料的方法以及所得到的壳聚糖水凝胶三维支架材料。
本发明的发明人经过广泛而深入地研究，发现可以通过改进制备工艺可以制得一种性能优越的三维多孔壳聚糖水凝胶，该水凝胶形状大小可控，孔的排列、孔径大小分布均匀。具体地，这种三维壳聚糖水凝胶可以用通过高温交联法获得，在该方法中，用酸性溶液，使壳聚糖粉末溶解并形成溶液，通过改变壳聚糖溶液浓度、最终溶液pH、和反应温度等参数，对水凝胶孔径、力学性能、溶胀性、降解时间等性能进行调控，从而本发明所提供的壳聚糖水凝胶在生物医药工程，特别是组织工程中具有很大前景。
一方面，为实现本发明的目的，本发明提供了一种三维壳聚糖水凝胶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)将壳聚糖粉末分散于去离子水溶液中；
(b)调节上述步骤(a)所得到的壳聚糖分散液的pH至微酸性；
(c)将步骤(b)所得的溶液在80-125℃的温度下进行高温交联；
(d)交联反应结束后，用后处理液浸泡清洗所得产物，以去除残留酸液。
在本发明的制备方法中，以重量百分比计，步骤(a)所配制的壳聚糖分散液的浓度优选为0.46-2％，更优选为1.38-1.84％。
在本发明的制备方法中，步骤(b)中pH优选被调节至6.0-7.0，更优选被调节至6.3-6.9。调节pH所采用的溶液可以为选自如下一组中的一种或一种以上：醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液醋酸、柠檬酸、磷酸、盐酸和乙二酸；优选为选自如下一组中的一种或一种以上：醋酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液和盐酸。
优选地，在本发明的制备方法中，步骤(c)中高温交联的温度控制在105-121℃之间；步骤(c)中高温交联的时间控制在15-60分钟之间。
在本发明的一具体实施方式中，步骤(b)中的缓冲溶液为醋酸盐缓冲溶液。
在本发明的另一具体实施方式中，步骤(b)中的溶液为酸性磷酸盐缓冲溶液。
在本发明的再一具体实施方式中，步骤(b)中的溶液为酸性醋酸盐缓冲溶液。
在本发明的另一具体实施方式中，步骤(b)中的最终溶液的pH为6.3。
在本发明的另一具体实施方式中，步骤(b)中的最终溶液的pH为7.0。
在本发明的另一具体实施方式中，步骤(c)中的反应温度为80℃，反应时间为30分钟。
在本发明的另一具体实施方式中，步骤(c)中的反应温度为105℃，反应时间为30分钟。
在本发明的另一具体实施方式中，步骤(c)中的反应温度为121℃，反应时间为30分钟。
作为本发明制备方法的一种优选具体实施方式是：(a)取将壳聚糖粉末分散于去离子水溶液中；(b)在上述壳聚糖悬浮液中滴加酸性溶液，调节pH，使壳聚糖溶解形成无色粘稠溶液；(c)将步骤(b)所得的溶液中放入高温培养箱内培养，获得多孔壳聚糖水凝胶；(d)用后处理液处理多孔水凝胶，去除酸性残留物质。其中，所使用的酸性溶液包括醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸、柠檬酸、磷酸、盐酸、乙二酸中的一种或多种，优选醋酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或盐酸；壳聚糖重量份浓度为0.46-2％，优选1.38-1.84％；高温交联温度为80-125℃，优选105-121℃；交联反应时间15-60分钟；去除酸性残留的后处理液为去离子水、中性磷酸缓冲溶液或中性醋酸缓冲溶液的一种或多种。
另一方面，本发明提供了一种采用上述方法制备的三维壳聚糖水凝胶，其中，以重量百分比计，该水凝胶含有0.46-2％的壳聚糖，孔径范围主要在10-200μm之间，而且孔径在50-80μm范围的孔占全部孔的80％以上。
优选地，在本发明的三维壳聚糖水凝胶中，含有1.38-1.84％的壳聚糖。
在本发明的一具体实施方式中，所制得的水凝胶的尺寸为1-3厘米直径，0.5厘米高。
在本发明的另一具体实施方式中，水凝胶孔径范围为10-200μm，平均孔径为60μm。
在本发明的再一具体实施方式中，水凝胶孔径范围为10-60μm，平均孔径为30μm。
作为本发明三维壳聚糖水凝胶的一种具体实施方式，其水凝胶含有0.46-2％重量份壳聚糖和84-92％重量份水，并且水凝胶具有以下特性：结构稳定，且尺寸可控；水凝胶的孔径范围为10-200μm；孔的排列以及孔径大小分布均匀，孔间相互连通，孔径为50-80μm范围的孔占全部孔的80％以上。
再一方面，本发明提供了一种用于制备皮肤或软骨组织工程的支架材料，其中，该支架材料是采用上述的三维壳聚糖水凝胶制得的。其中，该水凝胶含有0.46-2％重量份壳聚糖和84-92％重量份水，孔径范围为10-200μm，而且孔径为50-80μm范围的孔占全部孔的80％以上。
又一方面，本发明还提供了上述三维壳聚糖水凝胶在制备皮肤或软骨组织工程之支架材料方面的用途，或者作为药物控释载体方面的用途。本发明的三维壳聚糖水凝胶可作为组织工程的支架材料，适用于软骨、皮肤、肝等组织或器官的修复和再生。
壳聚糖属天然高分子材料，而本发明提供的三维壳聚糖水凝胶可作为组织工程支架材料，具有组织工程材料的一般特性，有良好的生物相容性和生物降解性，又具有特定形状和连通的三维多孔结构。
本发明提供的三维壳聚糖多孔水凝胶，其具有均一的孔型；且孔径大小均匀，孔径范围为10-200μm，优选为50-100μm；孔与孔之间的连通性好，其内表面积大，具有良好的表面活性。
本发明提供的三维壳聚糖支架材料可作成多种规则或不规则形状，易于重复操作，在植入体内一个月后仍能保持原有形状。本发明提供的三维壳聚糖多孔支架材料的机械强度好，便于前期操作。
本发明提供的三维多孔壳聚糖水凝胶的主要优点在于：孔结构均匀、连通性好、孔径范围大；具有较高的机械强度，容易成型，而且性能可控；高温交联法制备工艺简单，反应时间短，原料无需特殊处理，适合各种规模生产；制备过程不引入交联剂等较高毒性的化学物质，最终产品无任何化学毒物，非常适合作为皮肤、软骨等软组织工程支架材料。
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有百分比和分数按重量计。
附图说明
图1是本发明的壳聚糖水凝胶支架材料I的照片：(a)块体照片；(b)扫描电镜图片；
图2是本发明的壳聚糖水凝胶支架材料II的扫描电镜照片；
图3是本发明的壳聚糖水凝胶支架材料III的扫描电镜照片；
图4是本发明中成纤维细胞接种在壳聚糖水凝胶支架材料I上，培养14天后的扫描电镜照片；
图5是本发明中成纤维细胞接种在壳聚糖水凝胶支架材料I上后，MTT吸收值随时间的变化图。
具体实施方案
实施例1
制备壳聚糖多孔水凝胶I
将1.5g壳聚糖放入90ml去离子水，室温下磁力搅拌使壳聚糖均匀分散于水中。于分散液中缓慢滴加入10ml醋酸-磷酸盐缓冲溶液，调节pH至6.5，并使壳聚糖完全溶解后倒入模具，放入高温培养箱，80℃下进行高温交联30分种，得到多孔壳聚糖水凝胶粗产品。
将壳聚糖水凝胶用去离子水浸泡冲洗，去除酸性残留，得到三维多孔壳聚糖水凝胶支架材料I。见附图1a。
所制得的三维壳聚糖水凝胶I形状为圆盘状，平均孔径30μm，见附图1b。
实施例2
制备壳聚糖多孔水凝胶II
将0.2g壳聚糖放入9ml去离子水，室温下磁力搅拌使壳聚糖均匀分散于水中。于分散液中缓慢滴加入1ml盐酸-磷酸盐缓冲溶液，调节pH至7，并使壳聚糖完全溶解后倒入模具，放入高温培养箱，121℃下进行高温交联30分种，得到多孔壳聚糖水凝胶粗产品。
将壳聚糖水凝胶用去离子水浸泡冲洗，去除酸性残留，得到三维多孔壳聚糖水凝胶支架材料I。
所制得的三维壳聚糖水凝胶II形状为圆盘状，平均孔径100μm，见附图2。
实施例3
制备壳聚糖多孔水凝胶III
将0.2g壳聚糖放入9ml去离子水，室温下磁力搅拌使壳聚糖均匀分散于水中。于分散液中缓慢滴加入1ml醋酸盐-磷酸盐缓冲溶液，调节pH至6.3，并使壳聚糖完全溶解后倒入模具，放入高温培养箱，80℃下进行高温交联60分钟，得到多孔壳聚糖水凝胶粗产品。
将壳聚糖水凝胶用去离子水浸泡冲洗，去除酸性残留，得到三维多孔壳聚糖水凝胶支架材料III，平均孔径20μm，见附图3。
实施例4
制备组织工程用支架
通过高温交联的三维壳聚糖多孔水凝胶I经磷酸盐缓冲溶液PBS)浸泡清洗后用于接种皮肤成纤维细胞。培养并收集的人的成纤维细胞，用含10％小牛血清的DMEM培养液配制成细胞悬液，滴加到三维壳聚糖多孔支架材料上，细胞接种密度为1x105cells/cm2，37℃培养箱中培养14天，每2-3天更换一次培养基。培养结束后，用PBS冲洗，2.5％的戊二醛水溶液固定，锇酸后固定，二氧化碳临界点干燥，扫描电镜观察成纤维细胞在三维壳聚糖水凝胶支架材料上得生长情况。见附图4。另外，培养结束后，用PBS冲洗，并MTT试剂盒检测细胞增殖率。见附图5。
结果：
本发明提供的三维壳聚糖多孔水凝胶和成纤维细胞的相容性良好，培养4天后即可见伸展成梭形的成纤维细胞贴附在支架表面和内部，支架的孔结构隐约可见，大部分被细胞所覆盖。MTT试剂吸光值随培养时间较刚接种后的有明显提高，14天后，MTT吸光值增高近6倍。由此可见，成纤维细胞在本发明的三维壳聚糖水凝胶材料上生长良好，该材料对于皮肤或软骨细胞来讲是良好的支架材料，细胞复合壳聚糖支架将可能用于皮肤或软骨修复和再生。
Claims (10)
1.一种采用高温交联法制备三维壳聚糖水凝胶的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将壳聚糖粉末分散于去离子水溶液中；
(b)调节上述步骤(a)所得到的壳聚糖分散液的pH至微酸性；
(c)将步骤(b)所得的溶液在80-125℃的温度下进行高温交联；
(d)交联反应结束后，用后处理液浸泡清洗所得产物，以去除残留酸液。
2.如权利要求1所述的方法，其中，以重量百分比计，步骤(a)中所配制的壳聚糖分散液的浓度为0.46-2％，更优选为1.38-1.84％。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中pH调节至6.0-7.0，更优选调节至6.3-6.9。
4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中所采用的调节pH的溶液为选自如下一组中的一种或一种以上：醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液醋酸、柠檬酸、磷酸、盐酸和乙二酸。
5.如权利要求3所述的方法，其中，步骤(c)中的后处理液为为选自如下一组中的一种或一种以上：去离子水、中性磷酸缓冲溶液和中性醋酸缓冲溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中高温交联的温度控制在105-121℃之间。
7.一种采用如权利要求1-6之一所述的方法制备的三维壳聚糖水凝胶，其中，以重量百分比计，该水凝胶含有0.46-2％的壳聚糖，孔径范围主要在10-200μm之间，而且孔径在50-80μm范围的孔占全部孔的80％以上。
8.如权利要求7所述的水凝胶，其中，所述的三维壳聚糖水凝胶含有1.38-1.84％的壳聚糖。
9.一种用于制备皮肤或软骨组织工程的支架材料，其中，该支架材料是权利要求7或8所述的三维壳聚糖水凝胶制得的。
10.如权利要求7或8所述的三维壳聚糖水凝胶在制备皮肤或软骨组织工程之支架材料或作为药物控释载体的用途。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102921046A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 川北医学院第二临床医学院 | 组织工程用壳聚糖水凝胶支架制备方法 |
| CN105268028A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-01-27 | 北京大学第三医院 | 一种软骨组织工程支架及其制备方法 |
| CN105802916A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-07-27 | 北京化工大学 | 一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备及使用方法 |
| CN106267338A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-01-04 | 苏州正海生物技术有限公司 | 一种高持久性多效自交联流体凝胶及其制备方法与应用 |
| CN110787744A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-02-14 | 南京工业大学 | 一种简易的壳聚糖微球气凝胶的制备方法 |
| CN113699793A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-11-26 | 南通大学 | 一种可凝胶纤维材料及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060153893A1 (en) * | 2002-04-08 | 2006-07-13 | Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Therapeutic composition for bone infectious disease |
-
2012
- 2012-04-12 CN CN201210106857.2A patent/CN102604149B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060153893A1 (en) * | 2002-04-08 | 2006-07-13 | Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Therapeutic composition for bone infectious disease |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《中国组织工程研究与临床康复》 20110618 李偏等 "温敏性壳聚糖水凝胶对大鼠成骨细胞的毒性" 第4602-4606页 1-10 第15卷, 第25期 * |
| 李偏等: ""温敏性壳聚糖水凝胶对大鼠成骨细胞的毒性"", 《中国组织工程研究与临床康复》, vol. 15, no. 25, 18 June 2011 (2011-06-18), pages 4602 - 4606 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102921046A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 川北医学院第二临床医学院 | 组织工程用壳聚糖水凝胶支架制备方法 |
| CN105268028A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-01-27 | 北京大学第三医院 | 一种软骨组织工程支架及其制备方法 |
| CN105802916A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-07-27 | 北京化工大学 | 一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备及使用方法 |
| CN105802916B (zh) * | 2016-04-06 | 2020-05-29 | 北京化工大学 | 一种壳聚糖水凝胶三维细胞培养基的制备及使用方法 |
| CN106267338A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-01-04 | 苏州正海生物技术有限公司 | 一种高持久性多效自交联流体凝胶及其制备方法与应用 |
| CN110787744A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-02-14 | 南京工业大学 | 一种简易的壳聚糖微球气凝胶的制备方法 |
| CN113699793A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-11-26 | 南通大学 | 一种可凝胶纤维材料及其制备方法 |
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