CN110387060B - 一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用，取微晶纤维素先加入到有机溶剂A中，在130～150℃搅拌预热后冷却至室温，再加入氯化锂和有机溶剂B，在60～80℃搅拌直至微晶纤维素溶解，获得纤维素溶液；向纤维素溶液中加入不溶于有机溶剂A和有机溶剂B的致孔剂，进行预凝胶，然后加入能够溶解致孔剂的溶剂C进行溶剂交换，待致孔剂全部溶入溶剂C后，去除溶剂C并干燥和后处理，得到用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料。本发明通过添加氯化锂，有效促进溶解微晶纤维素，并添加致孔剂，通过控制致孔剂的尺寸可以获得具有不同孔径大小的多孔纤维素纸基材料，在保证孔隙率的同时具有高透光率。

Description

一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及纸基材料领域，具体涉及一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用。
背景技术
近年，纸基材料作为一种新兴的细胞培养支架材料引起了广泛关注，纸基材料不仅具有良好多孔性、柔韧性和生物兼容性，便于调节厚度和表面性质，以及能够模拟细胞外基质(ECM)的纤维状结构，在作为细胞培养平台上显示出巨大的潜力。纸芯片细胞培养技术的一个突出优势是包含不同细胞类型的多个纸基单元可以堆叠起来，得以重现体内的3D结构，也可以层层拆分而不破坏细胞结构，简单地实现3D-2D的转换，从空间上解析不同层面细胞的生长情况。“纸芯片”技术自提出以来，纤维素纸基材料(如滤纸、硝酸纤维素膜等)作为分子扩散的媒介和细胞培养的支撑，可模拟体内生长环境，具有良好的仿真性能，取得了良好效果。基于纸基材料的廉价易得、生物相容性好的特点和优势，在生物医药领域具有广泛应用，包括药物筛选，构建疾病模型，修复组织缺陷等。
然而，传统的细胞培养平台(如培养瓶、水凝胶)多是透明的，而纸基材料本身透光性较差，采用倒置显微镜观察时，无法观察到细胞。同时后期分析采用共聚焦显微镜观察时，由于纤维排布的各向异性，导致细胞图像分辨率不高从而限制了纸基材料在细胞培养中的应用。此外，一个理想的细胞培养支撑材料应该具有能够使营养物质转运和代谢产物排出的足够孔隙率，而纸基透光率和孔隙率往往成反比，因此限制了透明纤维素纸在细胞培养方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用，制得的纸基材料在水下透光率高，能够将其用于培养细胞。
为了达到上述目的，本发明制备方法采用如下技术方案：
包括以下步骤：
(1)取微晶纤维素先加入到有机溶剂A中，在130～150℃搅拌预热后冷却至室温，再加入氯化锂和有机溶剂B，在60～80℃搅拌直至微晶纤维素溶解，获得纤维素溶液；纤维素溶液中，氯化锂的质量与有机溶剂A和有机溶剂B体积之和的比为(6～8)g：100mL，微晶纤维素的质量与有机溶剂A和有机溶剂B体积之和的比为(2～3)g：100mL；
(2)向纤维素溶液中加入不溶于有机溶剂A和有机溶剂B的致孔剂，搅拌均匀后得到混合液，混合液进行预凝胶，然后加入能够溶解致孔剂的溶剂C进行溶剂交换，待致孔剂全部溶入溶剂C后，去除溶剂C并干燥得到多孔纤维素纸基材料，经过后处理，得到用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料。
进一步地，步骤(1)中，有机溶剂A和有机溶剂B均为N,N-二甲基乙酰胺；在60～80℃搅拌0.5～1h微晶纤维素溶解。
进一步地，步骤(1)中，每2～3g微晶纤维素先加入到20～30mL的有机溶剂A中。
进一步地，步骤(2)中，加入的致孔剂粒径小于45μm；每3mL纤维素溶液中加入2～4g的致孔剂。
进一步地，步骤(2)中，致孔剂为氯化钠颗粒。
进一步地，步骤(2)中，预凝胶是将混合液均匀平摊在培养皿中进行的，平摊厚度为2～4mm；预凝胶是在20～60℃下预凝胶0.5～1.5h。
进一步地，步骤(2)中，溶剂C为水；溶剂交换的时间为20～24h；干燥工艺为冷冻干燥。
进一步地，步骤(2)中，后处理是多孔纤维素纸基材料先在120～140℃灭菌处理20～30min，然后滴加明胶溶液并风干；其中明胶溶液的滴加量是直径每15mm的圆片滴加1～2mL质量浓度为0.1％的明胶溶液。
如上任意一项所述的制备方法制得的用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料。
如上所述的水下透明多孔纤维素纸基材料在细胞培养中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过添加氯化锂，有效促进溶解微晶纤维素，并添加致孔剂，通过控制致孔剂的尺寸可以获得具有不同孔径大小的多孔纤维素纸基材料。本发明通过溶解再生-模板法制备了多孔纤维素纸基材料，原材料具有来源丰富、环境友好、无污染、生物相容性好等优点，制备方法简单有效，且孔径和孔隙率可调，在保证孔隙率的同时具有高透光率，可满足不同领域应用的需要。
进一步地，本发明有机溶剂为N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，LiCl中Li+与DMAc的羰基形成络合物，而Cl-与微晶纤维素羟基形成氢键，破坏了微晶纤维素分子间的缔合使其完全溶剂化。
进一步地，所用致孔剂为常见的氯化钠，不溶于DMAC而溶于水，适用范围广，成本低，来源广。
本发明所得多孔纤维素纸基材料孔径能够大于20μm，孔径在23～35μm之间，透光率为88～94％，且孔径尺寸可控，能够满足细胞培养的需求。
本发明多孔纤维素纸基材料在水下具有良好的透明度，可直接用于细胞培养，无需染色洗脱等一系列复杂的步骤，可直接观察细胞生长情况，简化了细胞培养的步骤；且孔径和孔隙率可调，可培养不同尺寸的细胞。
附图说明
图1是为本发明制备的多孔纤维素纸基材料。
图2为宫颈癌细胞在多孔纤维素纸基材料中的图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
本发明提供一种可以用于细胞培养的在水下透明的纤维素纸基材料。通过溶解纤维素，并添加致孔剂，通过控制致孔剂的尺寸可以获得具有不同孔径大小的再生纤维素纸基材料，且由于纤维素本身透明的，其折射率与水较相近，因此在水下具有良好的透明度。
一种用于细胞培养的透明多孔纤维素纸基材料及其应用，包括以下步骤：
(1)称取2～3g微晶纤维素，加入20～30mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，于130～150℃搅拌活化30～60min，后冷却至室温。向冷却后的纤维素中加入6～8g氯化锂和70～80mL的DMAC，于60～80℃下加热搅拌0.5～1h直至微晶纤维素溶解。
(2)用研钵研磨氯化钠(NaCl)，筛选出尺寸小于45μm的NaCl颗粒。
(3)取3mL的溶解好的纤维素溶液，加入2～4g研磨好的NaCl颗粒，搅拌均匀。将混合液均匀平摊在培养皿中约2～4mm，在20～60℃下预凝胶0.5～1.5h，然后用去离子水将溶液中的溶剂和NaCl溶解出来，溶剂交换时间在20～24h；然后冷冻干燥形成多孔的纤维素纸基材料。
(4)将制备的纤维素纸基材料在高压灭菌锅中120～140℃下灭菌20～30min，裁成直径为15mm的圆片，滴加1～2mL质量浓度为0.1％的明胶溶液并风干，以提高细胞与纸基材料的粘附性，获得用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料。
(5)将含有宫颈癌、乳腺癌等细胞的细胞悬液接种到水下透明多孔纤维素纸基材料上，并放入培养基进行培养。每隔1～2天进行传代培养，在倒置显微镜下直接观察细胞生长情况。
实施例1：
(1)称取2g微晶纤维素，加入20mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，于130℃搅拌活化30min，后冷却至室温。向冷却后的纤维素中加入6g氯化锂和80mL的DMAC，于60℃下加热搅拌直至微晶纤维素溶解。
(2)用研钵研磨氯化钠(NaCl)，筛选出尺寸小于45μm的NaCl颗粒。
(3)取3mL的溶解好的纤维素溶液，加入2g研磨好的NaCl颗粒，搅拌均匀。将混合液均匀平摊在培养皿中约2mm，在40℃下预凝胶1h，然后用去离子水将溶液中的溶剂和NaCl溶解出来，溶剂交换时间在20h；然后-20℃冷冻干燥1h形成多孔的纤维素纸基材料。
(5)将制备的纤维素纸基材料在高压灭菌锅中120℃下灭菌20min，裁成直径为15mm的圆片。滴加2mL质量浓度为0.1％的明胶溶液并风干，得到水下透明多孔纤维素纸基材料。
(6)将含有宫颈癌细胞的细胞悬液接种到水下透明多孔纤维素纸基材料上，并放入培养基进行培养。每隔1～2天进行传代培养，在倒置显微镜下直接观察细胞生长情况。
参见图1，本发明制得的水下透明多孔纤维素纸基材料具有均匀分布的孔，平均孔径为23μm，通过紫外分光光度计测得所得纤维素纸基材料在湿态下透光率可达94％。在显微镜下观察细胞，参见图2，细胞粘附于纤维素纸基材料上正常生长，且可以直接观察。
实施例2
(1)称取3g微晶纤维素，加入30mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，于140℃搅拌活化45min，后冷却至室温。向冷却后的纤维素中加入7g氯化锂和70mL的DMAC，于70℃下加热搅拌直至微晶纤维素溶解。
(2)用研钵研磨氯化钠(NaCl)，筛选出尺寸小于45μm的NaCl颗粒。
(3)取3mL溶解好的纤维素溶液，加入3g研磨好的NaCl颗粒，搅拌均匀。将混合液均匀平摊在培养皿中约3mm，在20℃下预凝胶1.5h，然后用去离子水将溶液中的溶剂和NaCl溶解出来，溶剂交换时间在22h；然后冷冻干燥形成多孔的纤维素纸基材料。
(5)将制备的纤维素纸基材料在高压灭菌锅中140℃下灭菌25min，裁成直径为15mm的圆片。滴加1mL质量浓度为0.1％的明胶溶液并风干，以提高细胞与纸基材料的粘附性。
(6)将含有乳腺癌细胞的细胞悬液接种到纸基材料上，并放入培养基进行培养。每隔1～2天进行传代培养，在倒置显微镜下直接观察细胞生长情况。
所得纸基材料具有均匀分布的孔，平均孔径为25μm，通过紫外分光光度计测得所得纤维素纸基材料在湿态下透光率可达92％。在显微镜下观察细胞，细胞粘附于纤维素纸基材料上生长，少数存在于培养液中。
实施例3
(1)称取3g微晶纤维素，加入25mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，于150℃搅拌活化1h，后冷却至室温。向冷却后的纤维素中加入8g氯化锂和75mL的DMAC，于80℃下加热搅拌直至微晶纤维素溶解。
(2)用研钵研磨氯化钠(NaCl)，筛选出尺寸小于45μm的NaCl颗粒。
(3)取3mL溶解好的纤维素溶液，加入3g研磨好的NaCl颗粒，搅拌均匀。将混合液均匀平摊在培养皿中约4mm，在60℃下预凝胶0.5h，然后用去离子水将溶液中的溶剂和NaCl溶解出来，溶剂交换时间在24h；然后冷冻干燥形成多孔的纤维素纸基材料。
(5)将制备的纤维素纸基材料在高压灭菌锅中120℃下灭菌20min，裁成直径为15mm的圆片，滴加1.5mL质量浓度为0.1％的明胶溶液并风干，以提高细胞与纸基材料的粘附性。
(6)将含有宫颈癌细胞的细胞悬液接种到纸基材料上，并放入培养基进行培养。每隔1～2天进行传代培养，在倒置显微镜下直接观察细胞生长情况。
所得纸基材料具有均匀分布的孔，通过压汞仪测试其孔径分布和孔隙率可得，平均孔径为28μm，通过紫外分光光度计测得所得纤维素纸基材料在湿态下透光率可达90％，在显微镜下观察细胞，细胞粘附于纤维素纸基材料上生长，少数存在于培养液中。
实施例4：
(1)称取3g微晶纤维素，加入20mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，于130℃搅拌活化30min，后冷却至室温。向冷却后的纤维素中加入6g氯化锂和80mL的DMAC，于60℃下加热搅拌直至微晶纤维素溶解。
(2)用研钵研磨氯化钠(NaCl)，筛选出尺寸小于45μm的NaCl颗粒。
(3)取3mL的溶解好的纤维素溶液，加入4g研磨好的NaCl颗粒，搅拌均匀。将混合液均匀平摊在培养皿中约4mm，在40℃下预凝胶1h，然后用去离子水将溶液中的溶剂和NaCl溶解出来，溶剂交换时间在20h；然后-20℃冷冻干燥1h形成多孔的纤维素纸基材料。
(5)将制备的纤维素纸基材料在高压灭菌锅中120℃下灭菌20min，裁成直径为15mm的圆片。滴加1mL浓度为0.1％wt的明胶溶液并风干，得到水下透明多孔纤维素纸基材料。
(6)将含有宫颈癌细胞的细胞悬液接种到水下透明多孔纤维素纸基材料上，并放入培养基进行培养。每隔1～2天进行传代培养，在倒置显微镜下直接观察细胞生长情况。
所得纸基材料具有均匀分布的孔，通过压汞仪测试其孔径分布和孔隙率可得，平均孔径为35μm，通过紫外分光光度计测得所得纤维素纸基材料在湿态下透光率可达88％，在显微镜下观察细胞，细胞粘附于纤维素纸基材料上生长，少数存在于培养液中。

Claims (8)

1.一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取微晶纤维素先加入到有机溶剂A中，在130～150℃搅拌预热后冷却至室温，再加入氯化锂和有机溶剂B，在60～80℃搅拌直至微晶纤维素溶解，获得纤维素溶液；纤维素溶液中，氯化锂的质量与有机溶剂A和有机溶剂B体积之和的比为(6～8)g：100mL，微晶纤维素的质量与有机溶剂A和有机溶剂B体积之和的比为(2～3)g：100mL；
(2)向纤维素溶液中加入不溶于有机溶剂A和有机溶剂B的致孔剂，搅拌均匀后得到混合液，混合液进行预凝胶，然后加入能够溶解致孔剂的溶剂C进行溶剂交换，待致孔剂全部溶入溶剂C后，去除溶剂C并干燥得到多孔纤维素纸基材料，经过后处理，得到用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料；
步骤(1)中，有机溶剂A和有机溶剂B均为N,N-二甲基乙酰胺；在60～80℃搅拌0.5～1h微晶纤维素溶解；
步骤(2)中，加入的致孔剂粒径小于45μm；每3mL纤维素溶液中加入2～4g的致孔剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，每2～3g微晶纤维素先加入到20～30mL的有机溶剂A中。
3.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，致孔剂为氯化钠颗粒。
4.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，预凝胶是将混合液均匀平摊在培养皿中进行的，平摊厚度为2～4mm；预凝胶是在20～60℃下预凝胶0.5～1.5h。
5.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，溶剂C为水；溶剂交换的时间为20～24h；干燥工艺为冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，后处理是多孔纤维素纸基材料先在120～140℃灭菌处理20～30min，然后滴加明胶溶液并风干；其中明胶溶液的滴加量是直径每15mm的圆片滴加1～2mL质量浓度为0.1％的明胶溶液。
7.如权利要求1-6任意一项所述的制备方法制得的用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料。
8.如权利要求7所述的水下透明多孔纤维素纸基材料在细胞培养中的应用。
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