CN106834204B

CN106834204B - 一种细胞培养用sfl微载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106834204B
Application number: CN201710028685.4A
Authority: CN
Inventors: 李明生; 龙仕和; 靳冬武; 冯玉萍; 马忠仁
Original assignee: Northwest Minzu University
Current assignee: Northwest Minzu University
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2037-01-16
Also published as: CN106834204A

Abstract

本发明提供一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶；（2）配制纯丝素蛋白溶液；（3）采用W/O/O复乳法制备微球；（4）交联固化成球；（5）除油洗涤；（6）还原脱色；（7）洗涤。本发明还提供应用该方法制备得到的细胞培养用SFL微载体及其应用。本发明原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，得到的微载体表面呈多孔，比表面积大、生物相容性好、适合多种细胞培养使用。整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养，具有广阔的市场前景。

Description

一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用。

背景技术

微载体培养技术是研究动物细胞的结构、功能和分化、以及生产许多重要的生物制品如疫苗、酶类、激素、抗体、干扰素和核酸等所必需的技术。

目前，动物细胞大规模化培养的主要方式为微载体贴壁培养技术和全悬浮培养技术。但全悬浮培养技术尚不成熟，仅限于少数细胞系能实现。而大多数贴壁依赖型动物细胞都可用微载体进行培养。动物细胞的微载体培养技术能把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼具两者的优点，放大容易，培养基利用率较高，培养条件（温度、pH值、CO₂浓度等）易控制，能起到保护细胞抵抗物理和化学压力的作用，且培养过程可实现系统化、自动化，减少劳动力需求，不易被污染。因此，微载体培养技术是当前动物细胞大规模培养的发展趋势。

自1967年Van Wezel第一个用DEAE-Sephadex A50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳素微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。国外商品化的微载体主要有：如GE公司的Cytodex 1、Cytodex 2、Cytodex 3和Cytopore、Cytoline、Biosilon、Cultispher G等，但这些进口产品价格昂贵，目前市场价已达4-10万元/kg(以Cytodex系列为例)，还出现供不应求的现象，国内的市场几乎已被国外公司垄断。

国内对细胞培养用微载体的研究起步较晚，生产规模较小，难以工业化生产，目前尚无商品化的微载体面世，远不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，所有生物疫苗企业都是用进口产品，并且外国公司的产品每年都在涨价。造成此现象的原因很多，如技术难度大，技术和研发人员分散，所需资金投入大，研发周期长等。

目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药行业仍然沿用传统的转瓶（滚瓶）培养工艺，该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数生物制药企业的产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用自主研发的生物反应器微载体大规模培养技术。

微载体原料首选要求：①无毒性；②优良的生物相容性和可生物降解；③天然的高聚物；④价格低廉。

丝素蛋白为天然材料，来源广泛，非哺乳动物源性，生物相容性优良，含有丰富的起细胞粘附作用的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸三肽序列，能支持多种细胞的黏附、增殖和分化。以其为原料制备微载体是当前的研究热点，且目前尚无商品化的丝素蛋白微载体。

我国是产丝大国，家蚕蚕茧和年生丝量分别为68万吨和817万吨，占全世界总产量的70%；柞蚕的总产量占全世界的90%左右。我国蚕丝行业产量区域集中度非常高，据2013年统计数据显示，蚕丝产量主要集中在华东、华南、西南地区，产量分别占同期全国总产量的39.2%、27.1%、26.1%。

近年来，国内外有关丝素蛋白高值化利用的研究颇多，丝素蛋白微球的制备方法层出不穷，但迄今为止仍未有商品化的SFL微载体。在丝绸生产过程中难免产生废丝，其数量可观，廉价易得，从资源节约和综合利用方面出发，开展对SFL微载体的开发研究有着重要的意义。

目前，国内外纯丝素蛋白微球的制备仍存在易成球、难交联且球形不规则等问题，故制备方法层出不穷，有酶法、喷雾干燥法、乳化法、相分离法、电喷法和超临界二氧化碳流体强制分散法等，有的新技术工艺复杂，难以产业化。

如2015年塔夫茨大学戴维·L卡普兰，T·于赛尔等申请的发明专利“用于制备丝微球的方法和组合物”，其采用喷雾-结晶-冷冻-干燥工艺制备丝素蛋白微球，工艺复杂，尺寸难控，形状不规则，难以工业化生产。再如2010年苏州大学王璐，李明忠，吕强等申请的发明专利“一种丝素蛋白微载体及其制备方法”，其制备方法为同轴高压静电技术和冷冻干燥法，这种方法对设备要求高，工业化生产受限；2016年武汉纺织大学卢晨等在进展与述评杂志上发表了“蚕丝蛋白微球制备方法的研究进展”一篇文章，文章阐述了丝素蛋白微球作为药物缓释载体具有巨大潜力。但是在目前丝素蛋白微球的制备过程中仍然存在易成球、难交联和分散性差等问题。

尽管对丝素蛋白微球的研究己取得了很多创新性成果，但至今仍未有真正市场化的产品出现。另外，国内外大部分报道关于“丝素蛋白微球”的文献多半是丝素蛋白与其他材料制成复合材料微球，纯的丝素蛋白微球还未研制成功。因此，综合开发利用蚕茧，开发多元化产品，开发出急需的微载体品种替代国外产品是一件利国利民的事。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种细胞培养用丝素蛋白微载体（简称SFL微载体）及其制备方法和应用。该制备方法具有以下特点：采用天然的蚕茧，原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养。

本发明提供一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）蚕茧脱胶：将蚕茧在Na₂CO₃溶液中进行脱胶，获得丝素蛋白纤维，再用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干；

（2）配制纯丝素蛋白溶液：将步骤（1）得到的丝素蛋白纤维溶于三元溶液或其他溶液中，在75℃下搅拌溶解，离心过滤后，取滤液进行透析，得到纯丝素蛋白溶液，作为水相；所述三元溶液为CaCl₂/H₂O/CH₃ CH₂OH；所述其他溶液为LiBr，CaCl₂，Ca（NO₃）₂或H₃PO₄；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：在搅拌状态下，将步骤（2）获得的水相缓慢加入油相1乳化一定时间，形成W/O混合相，然后再将W/O混合相加入到油相2再乳化一定时间，形成均一稳定的W/O/O混合相，制备得到丝素蛋白微球；

所述油相1选自真空泵油、机油、大豆油、花生油、菜籽油、异辛烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；

所述油相2选自液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、汽油、硅油、玉米油、大豆油、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；

所述水相：油相1：油相2的体积比为1：1-20:1-20；搅拌转速为200-1000rpm；

（4）交联固化成球：向步骤（3）得到的W/O/O混合相中缓慢加入交联剂进行交联，获得微球；

所述交联剂为EDC/NHS、京尼平、环氧硅烷、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、氮丙啶中的一种或几种混合；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，先后用表面活性剂和去离子水反复洗涤步骤（4）获得的微球，抽滤得到丝素蛋白微球；

所述表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、TRITON-100、OP-10、SA-2两性表面活性剂、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或几种混合；

所述表面活性剂溶液的质量百分浓度为0.1-10%；

（6）还原脱色：用还原剂中和多余的交联剂；所述还原剂为硼还原剂或甘氨酸；

（7）洗涤：去除还原剂溶液，再用去离子水反复洗涤丝素蛋白微球，至上清液呈中性为止，洗涤后筛分选择粒径为100-400μm的微载体，得到细胞培养用SFL微载体。

作为优选，步骤（1）中，所述蚕茧来源于天然家蚕、柞蚕或天蚕的一个或任意两个的组合；所述Na₂CO₃溶液的质量浓度为0.01%-5%；所述蚕茧与Na₂CO₃溶液的质量体积百分比为1%-20%。

作为优选，步骤（2）中，所述丝素蛋白纤维与三元溶液或其他溶液的质量体积百分比为1%-30%；所述纯丝素蛋白溶液的质量浓度为1-30%；

作为优选，所述透析是先用自来水进行透析1-2天，再用去离子水进行透析1-2天。

作为优选，步骤（4）中，所述交联剂用量为W/O/O混合相总体积的1%-20%；所述交联时，搅拌转速为50-1000rpm，交联温度为4-60℃，交联时间为1-20小时。

作为优选，步骤（6）中，所述还原剂质量百分比浓度为1-10%，还原脱色时间1-12h；优选采用2%的硼还原剂还原脱色2-8h。

作为优选，步骤（7）中，洗涤后筛分选择粒径为200-300μm的微载体。

本发明提供细胞培养用SFL微载体，是用权利要求1所述方法制备得到的。

本发明还提供细胞培养用SFL微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用。

作为优选，所述应用为：将细胞培养用SFL微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度3-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；在培养96-120小时后，根据实际需要，选择在含有质量百分浓度3-10%新生牛血清的细胞培养液中继续培养，或更换成含3-5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒；

作为优选，将所述微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养，在培养96-120小时后，更换成含3-5%新生牛血清的培养基继续培养；

作为优选，细胞培养时，微载体的浓度为2-10g/L，待培养细胞的接种密度为3-5×10⁵cells/ml；

作为优选，是在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中进行细胞培养。

作为进一步优选，所述细胞为BHK-21细胞、Vero细胞、MDCK细胞、CHO-K1细胞和Marc-145细胞。

本发明采用天然的蚕丝，原料廉价易得，非哺乳动物源性，生物相容性好。通过研究，本发明制备SFL微载体的新工艺，打破SFL微载体易成球，难交联的瓶颈，与国内外同类技术或产品比较，SFL微载体生产周期短，成本低，工艺简单、高效，易于产业化，且微载体能适应多种细胞的粘附生长，具有广阔的市场前景。

采用天然的蚕茧，原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，得到的微载体表面呈多孔，比表面积大、生物相容性好、适合多种细胞培养使用。整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的微载体在倒置相差显微镜下的空球图片；

图2为肉眼观察到的本发明的微载体；

图3为本发明的微载体在扫描电镜（JSM-5600LV）1000×下的图片；

图4、图5为本发明的SFL微载体在磁悬浮瓶中悬浮培养BHK-21细胞24h后吉姆萨染色结果；

图6、图7和图8为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养BHK-21细胞120h的图片；

图 9和图 10为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养Vero细胞24h后吉姆萨染色结果；

图 11、图 12、图 13为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养Vero细胞120h的图片。

图 14为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养MDCK细胞24h的图片。

图15为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养CHO-K1细胞24h后吉姆萨染色结果；

图16为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养Marc-145细胞24h后MTT染色结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为0.01%-5%的Na₂CO₃溶液，称取一定量蚕茧溶解在Na₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，将丝素蛋白纤维再次加入到新的Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，再次用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。采用本发明的方法在透析后，不会发生凝胶现象。

其中，所使用的蚕茧来源于天然家蚕、柞蚕或天蚕的一个或任意两个的组合，蚕茧与Na₂CO₃溶液的质量体积百分比为1%-20%；使蚕茧在Na₂CO₃溶液中进行脱胶，再用去离子水清洗干净，主要是为了去除丝胶蛋白，获得丝素蛋白纤维，利于其溶解在CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液或其他溶液中。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取一定量丝素蛋白纤维溶于按摩尔比1:8:2配制的CaCl₂/H₂O/CH₃ CH₂OH的三元溶液或其他溶液（其他溶液包括LiBr，CaCl₂，Ca（NO₃）₂，H₃PO₄）中，丝素蛋白纤维与三元溶液或其他溶液的质量体积百分比为1%-30%，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析1-2天，再换用去离子水透析1-2天，得到质量浓度为1%-30%的纯丝素蛋白溶液，作为水相。采用步骤（2）中的方法获得的水相均匀稳定，浓稠度适合，使其能够完全分散于油相中，便于成球。

仅采用CaCl2溶液溶解，与三元溶液两者相比，结果如下：CaCl2溶液溶解丝素蛋白纤维量相对少，CaCl2用量大且需在100℃左右温度条件下较长时间方能完全溶解。而三元溶液溶解丝素蛋白纤维量多，CaCl2用量少，在75℃左右温度条件下很快能完全溶解。

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：预先配制好无毒高密度油相1（Oil1）和油相2（Oil2），同时设定搅拌罐的搅拌转速，将步骤（2）获得的水相缓慢加入油相1（Oil1）乳化一定时间，形成W/O混合相，然后再将W/O混合相加入到油相2（Oil2）再乳化一定时间，形成均一稳定的W/O/O混合相，制备得到丝素蛋白微球。W/O/O复乳法与W/O法相比，前者可形成稳定均一乳液，不易发生破乳现象，以便水相形成球形，当与交联剂充分发生交联，可形成稳定的微球。后者形成的乳液容易破乳，难交联固化成球。油相2（Oil1）的体积大于油相1（Oil1）的体积；

其中，无毒高密度油相1（Oil1）种类有真空泵油、机油、大豆油、花生油、菜籽油、异辛烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；

无毒高密度油相2（Oil1）种类有液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、汽油、硅油、玉米油、大豆油、Span80和Tween-80等中的一种或几种混合；

水相：油相1（Oil1）：油相2（Oil1）的体积比=1：1-20:1-20，搅拌转速为200-1000rpm。

步骤（3）中，上述条件的效果是：油相1（Oil1）和油相2（Oil2）均一稳定，能够使水相稳定分散于油相中，乳化成球。

（4）交联固化成球：再按一定比例向步骤（3）得到的W/O/O混合相中缓慢加入交联剂，在一定温度下，搅拌交联反应一定时间，获得微球。

其中，交联剂为EDC/NHS、京尼平、环氧硅烷、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、氮丙啶中的一种或几种混合；

交联剂用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的1%-20%，交联固化过程中搅拌转速为50-1000rpm，交联温度为4-60℃，交联时间为1-20小时。

步骤（4）中，上述条件的效果是：交联剂与水相溶液完全反应，固化效果好，微球刚性及耐压程度高，并且该搅拌速度条件下，成球的粒径90%以上都在100-300μm，可应用于微载体培养。

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制一定浓度表面活性剂溶液，反复洗涤微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球数次，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

其中，表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、TRITON-100、OP-10、SA-2两性表面活性剂、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或几种混合；

表面活性剂溶液的质量百分浓度为0.1-10%。

（6）还原脱色：用还原剂脱色和中和多余的交联剂和封闭一些官能团；

其中，还原剂为硼还原剂或甘氨酸；

还原剂质量浓度为1-10%，还原脱色时间1-12h；优选采用2%的硼还原剂还原脱色2-8h。

（7）洗涤并筛分：去除还原剂溶液，再用去离子水反复洗涤丝素蛋白微球，至上清液呈中性为止，并筛分，筛分过程中SFL微载体选取粒径为100-400μm，培养细胞时优选粒径在200-300μm，抽滤得到细胞用培养SFL微载体。可以将SFL微载体溶于无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液中，在2-8℃条件下保存。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为80-500μm，100-400μm粒径的微球占比95%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

本发明制备得到的SFL微载体能够用于培养贴壁依赖型细胞，使用时，首先用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液将微载体洗净平衡之后，用高压蒸汽灭菌、75%酒精浸泡灭菌或用Co60辐照灭菌，备用；优先采用高压蒸汽灭菌或Co60辐照灭菌，灭菌更彻底。

制备实施例1

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为0.5%Na₂CO₃溶液，称取100g天然家蚕蚕茧溶解在5000mL Na₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的5000mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取10g丝素蛋白纤维溶于500ml按摩尔比1:8:2配制CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析2天，再换用去离子水透析2天，得到质量浓度为1.5%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取大豆油500ml、正己烷500ml、Span-80 10ml混合搅拌30min，形成均一的油相1（Oil1）后，缓慢加入步骤（2）得到的水相100ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到2000ml液体石蜡（油相2（Oil2））中搅拌1h，搅拌转速为800rpm，形成均一稳定W/O/O混合相；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向该W/O/O混合相中缓慢加入交联剂EDC/NHS ，EDC/NHS的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的8%，搅拌速度为500rpm，40℃下交联反应8小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为4%的壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯溶液，反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用硼还原剂脱色和中和多余的EDC/NHS，还原剂配制质量浓度为2%，还原脱色时间6h；

（7）洗涤：去除还原剂溶液，再用去离子水反复洗涤丝素蛋白微球，至上清液呈中性为止，并用40目-150目筛子筛分，抽滤得到细胞用培养SFL微载体。将得到的SFL微载体溶于无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液中，在2-8℃条件下保存。

利用SFL微载体进行细胞培养时，筛分选取200-300μmSFL微载体用于培养贴壁依赖型细胞，然后对SFL微载体进行灭菌处理，灭菌方法为下述中的一种：

A、将经步骤（8）筛分的SFL微载体用新配制的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液（pH7.0-7.4）洗涤至少5遍以上，121℃，高压灭菌30min；

B、将经步骤（8）筛分的SFL微载体用新配制的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液（pH7.0-7.4）洗涤至少5遍以上，在75%酒精中浸泡灭菌1小时；

C、将经步骤（8）筛分的SFL微载体用新配制的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液（pH7.0-7.4）洗涤至少5遍以上，分装，之后用Co60辐照灭菌，辐照剂量18-20KGy。

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

图 1、图 2和图 3为SFL微载体的空球图片。

在无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液中保存时为白色圆球。SFL微载体圆润光滑，分散性良好。交联之前丝素蛋白主要呈α螺旋结构，经交联剂交联后丝素蛋白变性主要呈β折叠结构，蛋白质二级结构中β折叠结构比较稳定。

A图和B图依次为SFL微载体在倒置相差显微镜（OLYMPUS-CKX41）4×和10×下的图片，显微镜下呈淡黄色，不透明（见图 1），而肉眼观察到的SFL微载体为白色（见图 2）；图3为SFL微载体在扫描电镜（JSM-5600LV）1000×下的图片。从图3可知，SFL微载体呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um，这反映SFL微载体相对于表面光滑的微载体来说拥有更大的比表面积，它能为细胞提供更广阔的生长空间。

大孔微载体非常有利于悬浮培养中细胞的贴壁，主要因为在悬浮培养搅停阶段时，轻微的搅拌速度就会使微载体保持悬浮，产生的剪切力也很小，对细胞的机械损伤就会小；在停止搅拌时，微载体和细胞因重力的作用而沉降，由于细胞的直径约为10μm，比大孔微载体的孔小，细胞容易落入孔内，增加了细胞贴壁的几率。微载体技术的发展趋势是大孔微载体，使得细胞能够进入其中生长。大孔微载体的平均孔径是30-400μm，而悬浮培养中的单个细胞的平均直径约为10μm，因此细胞很容易进入到微载体内生长。除此之外，它更适合固定非贴壁依赖性细胞，因为在这种条件下，细胞被迫进入基质中被捆住。综合可知，本发明的SFL微载体属于多孔微载体，比表面积大，在细胞工程领域中具有重要的潜在应用价值。

制备实施例2

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为1%Na₂CO₃溶液，称取100g柞蚕蚕茧溶解在2000mLNa₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的2000mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取8g丝素蛋白纤维溶于200ml LiBr溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析2天，再换用去离子水透析2天，得到质量浓度为3%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取花生油500ml、异辛烷500ml、Tween-80 10ml、Span80 10ml混合搅拌30min，形成均一的油相1（Oil1）后，缓慢加入步骤（2）得到的水相200ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到3400ml硅油和10ml Span80（油相2（Oil2））中搅拌1h，形成均一稳定W/O/O混合相，搅拌转速为1000rpm；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向该W/O/O混合相中缓慢加入交联剂环氧硅烷，环氧硅烷的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的10%，搅拌速度为800rpm，25℃下交联反应10小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为2%的OP-10溶液，反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用甘氨酸脱色和中和多余的环氧硅烷，还原剂配制质量浓度为6%，还原脱色时间8h；

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为80-400μm，100-400μm粒径的微球占比97%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例3

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为2%Na₂CO₃溶液，称取100g天蚕蚕茧溶解在4000mLNa₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的4000mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取16g丝素蛋白纤维溶于200ml按摩尔比1:8:2配制CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析2天，再换用去离子水透析2天，得到质量浓度为7%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取二氯甲烷500ml、Tween-80 10ml混合搅拌30min，形成均一的油相1（Oil1）后，缓慢加入步骤（2）得到的水相100ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到1000ml硅油、500ml玉米油和10ml Span80（油相2（Oil2））中搅拌1h，搅拌转速为800rpm，形成均一稳定W/O/O混合相；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向该W/O/O混合相中缓慢加入交联剂聚丙二醇二缩水甘油醚，聚丙二醇二缩水甘油醚的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的6%，搅拌速度为800rpm，40℃下交联反应8小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为2%的SA-2两性表面活性剂溶液，反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用硼还原剂脱色和中和多余的聚丙二醇二缩水甘油醚，还原剂配制质量浓度为2%，还原脱色时间1h；

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为100-500μm，100-400μm粒径的微球占比95%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例4

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为4%Na₂CO₃溶液，称取天然家蚕和柞蚕蚕茧各50g溶解在5000mLNa₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的5000mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取40g丝素蛋白纤维溶于200ml按摩尔比1:8:2配制CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析2天，再换用去离子水透析2天，得到质量浓度为20%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取菜籽油500ml、500ml环己烷、异辛烷500ml和Span80 10ml混合搅拌30min，形成均一的油相1（Oil1）后，缓慢加入步骤（2）得到的水相200ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到1000ml乙酸丁酯、1000ml大豆油和10ml Tween-80组成的油相2（Oil2）中搅拌1h，搅拌转速为800rpm，形成均一稳定W/O/O混合相；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向该W/O/O混合相中缓慢加入交联剂京尼平，京尼平的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的10%，搅拌速度为50rpm，25℃下交联反应10小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为0.1%的石油醚，反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用硼还原剂脱色和中和多余的京尼平，还原剂配制质量浓度为10%，还原脱色时间4h；

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为100-450μm，100-400μm粒径的微球占比98%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例5

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为5%Na₂CO₃溶液，称取200g天然家蚕蚕茧和200g柞蚕蚕茧溶解在5000mL Na₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的5000mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取180g丝素蛋白纤维溶于600ml按摩尔比1:8:2配制CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析2天，再换用去离子水透析2天，得到质量浓度为30%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取机油500ml和Tween-80 10ml混合搅拌30min，形成均一的油相1（Oil1）后，缓慢加入水相250ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到3000ml液体石蜡和10ml Span 80组成的油相2（Oil2）中搅拌1h，形成均一稳定W/O/O混合相，搅拌转速为800rpm；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向该W/O/O混合相中缓慢加入交联剂戊二醛，戊二醛的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的20%，搅拌速度为200rpm，60℃下交联反应1小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为10%的聚氧乙烯壬基酚醚溶液，用聚氧乙烯壬基酚醚反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用甘氨酸脱色和中和多余的戊二醛，还原剂质量百分比浓度为8%，还原脱色时间10h；

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为100-420μm，100-400μm粒径的微球占比99%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例6

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为0.01%Na₂CO₃溶液，称取100g柞蚕蚕茧溶解在500mLNa₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的500mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取180g丝素蛋白纤维溶于1800ml按摩尔比1:8:2配制CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，取滤液装入透析袋中室温透析，先用自来水透析2天，再换用去离子水透析2天，得到质量浓度为9%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取真空泵油800ml和二氯甲烷10ml混合搅拌30min，形成均一的油相1（Oil1）后，缓慢加入水相45ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到800ml乙酸丁酯和20ml大豆油组成的油相2（Oil2）中搅拌1h，形成均一稳定W/O/O混合相，搅拌转速为500rpm；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向W/O/O混合相中缓慢加入交联剂氮丙啶，氮丙啶的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的1%，搅拌转速为600rpm，4℃下交联反应20小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为0.1%的Tween-20溶液，用Tween-20反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用甘氨酸脱色和中和多余的氮丙啶，还原剂配制质量浓度为1%，还原脱色时间12h；

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为60-500μm，100-400μm粒径的微球占比89%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例7

本发明的一种细胞培养用SFL微载体的制备方法步骤如下：

（1）蚕茧脱胶：配制质量浓度为2%Na₂CO₃溶液，称取20g天蚕蚕茧溶解在2000mLNa₂CO₃溶液中，搅拌时缓慢加热至80℃脱胶30min，获得丝素蛋白纤维，然后用去离子水洗净丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维再次加入到新的2000mL Na₂CO₃溶液中进行二次脱胶，用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干。

（2）配制纯丝素蛋白溶液：称取6g丝素蛋白纤维溶于600ml按摩尔比1:8:2配制CaCl₂/H₂O/C₂H₅OH的三元溶液中，在75℃条件下搅拌溶解得到的丝素蛋白混合溶液，离心后纱布过滤，最后装入透析袋中，先用自来水透析1天，再换用去离子水透析1天，得到质量浓度为1%的纯丝素蛋白溶液，作为水相溶液；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：量取正己烷500ml作为油相1（Oil1），缓慢加入水相450ml，搅拌1h后，形成W/O乳液，再加入到700ml环己烷作为油相2（Oil2）中搅拌1h，形成均一稳定W/O/O混合相，搅拌转速为200rpm；

（4）交联固化成球：再按一定比例缓慢向W/O/O混合相中缓慢加入交联剂聚乙二醇缩水甘油醚，聚乙二醇缩水甘油醚的用量为水相、油相1（Oil1）和油相2（Oil2）所形成的混合相总体积的15%，搅拌速度为1000rpm，20℃下交联反应5小时；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，配制质量百分浓度为7%的Tween-60溶液，用Tween-60反复洗涤下层的微球，直至油全部被洗净，再用去离子水反复洗涤微球，然后抽滤得到丝素蛋白微球；

（6）还原脱色：用硼还原剂脱色和中和多余的聚乙二醇缩水甘油醚，还原剂配制质量浓度为6%，还原脱色时间12h；

将SFL微载体灭菌后，即可用于细胞培养。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为120-350μm，200-300μm粒径的微球占比98%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例8

本实施例与实施例2的不同之处在于：

步骤（3）中，油相1为异辛烷，油相2为等体积混合的乙酸乙酯和乙酸丁酯，水相：油相1（Oil1）：油相2（Oil1）的体积比=1:8:12；搅拌转速为300rpm；

步骤（4）中，交联剂为戊二酸酐和丁二酸酐，两者的体积比为2:1，交联剂体积为混合相总体积的12%，交联固化过程中搅拌转速为600rpm，交联温度为30℃，交联时间为8小时。

其余步骤均与实施例2相同。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为80-450μm，100-400μm粒径的微球占比96%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

制备实施例9

本实施例与实施例3的不同之处在于：

步骤（3）中，油相1为等体积混合的机油和大豆油，油相2为汽油，水相：油相1（Oil1）：油相2（Oil1）的体积比=1:10:15；搅拌转速为400rpm；

步骤（4）中，交联剂为马来酸酐、环氧硅烷和聚丙二醇二缩水甘油醚，三者的体积比为2：1：2，交联剂体积为混合相总体积的16%，交联固化过程中搅拌转速为800rpm，交联温度为40℃，交联时间为12小时。

其余步骤均与实施例2相同。

采用上述方法制备得到的微载体圆润光滑，分散性良好，筛分前粒径范围为100-450μm，100-400μm粒径的微球占比92%，微球呈球形，表面凹凸不平，充满了褶皱，呈多孔且孔径大于10um。

应用实施例

应用本发明的细胞培养用微载体进行细胞培养：将SFL微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度3-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；在培养96-120小时后，根据实际需要，选择在含有质量百分浓度3-10%新生牛血清的细胞培养液中继续培养，或更换成含3-5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。培养96-120小时后，细胞已经形成致密单层，细胞数量大，可更换成低浓度新生牛血清的培养基继续培养。

优选将所述SFL微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养，较高浓度新生牛血清的细胞培养液有利于细胞的快速增殖；在培养96-120小时后，更换成含3-5%新生牛血清的培养基继续培养。

进行细胞培养时，SFL微载体浓度为2-10g/L，待培养细胞的接种密度为3-5×10⁵cells/ml。

本发明的SFL微载体能够用于培养各种贴壁依赖型细胞，不仅能够培养容易进行培养的细胞，如BHK-21和Vero细胞，还能够培养较难培养的细胞，如MDCK细胞、CHO-K1细胞和Marc-145细胞。见图14、图15和图16。

应用本发明的SFL微载体能够在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中进行细胞培养。磁悬浮瓶体积比方瓶、转瓶大，能够在磁悬浮瓶中进行培养，就能够在小体积的方瓶、转瓶中进行培养。

经试验，应用本发明实施例1-9制备的SFL微载体均能很好的培养各种贴壁依赖性细胞，比如BHK-21、Vero、MDCK细胞、CHO-K1细胞和Marc-145细胞等。其中，以实施例1制备得到的微载体的培养效果最佳。以下为应用本发明实施例1制备的细胞培养用SFL微载体在磁悬浮瓶中培养各种细胞的实验及效果：

用本发明实施例1制备的微载体培养BHK-21和Vero细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度1.0-5.0×10⁵cells/mL，微载体浓度为3g/L，培养液体积为400mL，为含8%新生牛血清（购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清）的DMEM培养液（购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基），培养温度为37℃，搅拌速度为40rpm，培养168h，细胞最大密度1.5-3.0×10⁶cells/mL。细胞培养效果见图 4-图 13。

图 4、图 5为本发明的SFL微载体在磁悬浮瓶中悬浮培养BHK-21细胞24h后吉姆萨染色结果。

悬浮培养BHK-21细胞24h时，在无菌条件下用移液枪吸取1ml微载体培养液移入另一试样管中，待微载体沉降后弃掉上清，加入不含有Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗涤2次，再加入适量的固定液（PBS 缓冲液：甲醇=1：1 混合液）固定2min，弃去上清；再加新的甲醇2ml，摇匀后静置10min，弃掉甲醇。将吉姆萨原液稀释10倍，吸取2ml 加入试样管中，轻轻晃动静置2min，用纯净水冲洗微载体5次，吸取少量滴入凹玻片中，倒置相差显微镜下观察拍照。

从图 4可以清晰的看出，BHK-21细胞在SFL微载体上贴壁良好，细胞被染成紫蓝色，说明SFL微载体与BHK-21细胞的生物相容性好。调节倒置相差显微镜相差，可以清晰看出SFL微载体上的BHK-21细胞成纤维细胞样，细胞圆润饱满，细胞形态结构正常（见图 5）。这说明SFL微载体对BHK-21细胞的增殖生长无明显的影响。同时我们也发现了可以采用吉姆萨染色方法来观察不透明微载体上细胞形态。

图6、图7和图8为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养BHK-21细胞120h的图片。从图 6可看出120h 时BHK-21细胞在SFL 微载体已形成致密单层，SFL微载体已经出现球与球之间黏连的现象，说明此时SFL微载体上的细胞数量大。

同时在无菌条件下用移液枪分别吸取1mlSFL微载体培养液移入试样管中，待微载体沉降后弃掉上清，加入0.9%的生理盐水洗涤3次，再加入2ml固定液（醋酸：甲醇=1：3混合液）固定5min，弃去上清；再加新的2ml固定液固定10min。然后弃掉固定液，再用0.9%的生理盐水洗涤载体3次，加入2ml的Hoechst 33258 染色液，室温下避光静置10-15min，然后弃去染色液，再用0.9%的生理盐水洗涤3次，于荧光倒置显微镜观察拍照。结果发现在SFL微载体上悬浮培养120h时BHK-21细胞贴壁良好均匀，载体表面的小圆点很多，蓝色荧光增强，已形成圆环状，说明此时细胞数量大，增殖速度快（见图 7）。

同时吸取适量的SFL微载体培养液置于试样管中，无菌的PBS缓冲液洗涤3次，再加含4%戊二醛PBS缓冲液固定24h，弃掉固定液，去离子水洗涤微载体3次，用25%、50%、75%、85%和95%的酒精梯度脱水，每次10min。最后将微载体真空干燥后进行表面喷金，用扫描电镜（JSM-5600LV）观察微载体表面上细胞的生长情况。扫描电镜可以清晰的看到BHK-21细胞贴附在SFL微载体上，BHK-21细胞布满了整个SFL微载体，轮廓清晰，细胞形态正常且相当饱满，因生长致密，导致球的形态稍有改变。再从右边还可以看到微载体表面的多孔结构，细胞形态结构良好，这说明SFL微载体很适合BHK-21细胞的生长。说明本发明的SFL微载体与BHK-21细胞具有良好的生物相容性，适合于BHK-21细胞的悬浮贴壁培养（见图 8）。

图 9和图 10为SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养Vero细胞24h后吉姆萨染色结果。Vero细胞吉姆萨染色方法同BHK-21细胞一样。

从图 9可以看出，Vero细胞紧贴在SFL微载体上，细胞被染成蓝紫色。

再从图 10中可以清晰的看到Vero细胞的形态结构，Vero细胞为铺路石样排列的贴壁细胞，呈点梭形，细胞形态正常。这说明SFL微载体对Vero细胞无明显的不良影响。

Vero细胞Hoechst 33258染色液染色方法和扫描电镜制样方法同BHK-2细胞一样。当培养至120h时，发现Vero细胞在SFL微载体上均已形成致密单层，SFL微载体也有球与球之间黏连的现象，说明此时SFL微载体上的细胞数量已经很多（见图 11）。Hoechst33258染色液染色结果发现SFL微载体上的蓝色荧光小圆点太多，几乎亮成一片，说明此时SFL微载体布满了Vero细胞，细胞生长致密（见图 12）。另外，由于SFL微载体为多孔状且不透明，细胞难以全部观察到，因此，我们可以推测SFL微载体上的Vero细胞数量很多。扫描电镜发现Vero细胞已经严实的裹附在整个SFL微载体上，细胞生长致密，形态饱满正常（见图 13）。综合可知，SFL微载体适合Vero细胞的悬浮贴壁培养，对Vero细胞的增殖生长无明显的不良影响。说明本发明的SFL微载体对Vero细胞也具有良好的生物相容性，适合于Vero细胞的悬浮贴壁培养。

图 14为用本发明实施例1制备的SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养MDCK细胞24h的图片。MDCK细胞Hoechst 33258染色液染色方法同BHK-21细胞一样。从图 14可以清晰的看出，MDCK细胞在SFL微载体上贴壁良好，细胞被染成紫蓝色，说明SFL微载体与MDCK细胞的生物相容性好。

图15为用本发明实施例1制备的SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养CHO-K1细胞24h后吉姆萨染色结果。CHO-K1细胞吉姆萨染色方法同BHK-21细胞一样。从图 15可以看出，CHO-K1细胞紧贴在SFL微载体上，细胞被染成蓝紫色，说明SFL微载体与CHO-K1细胞的生物相容性好。

图16为用本发明实施例1制备的SFL微载体磁悬浮瓶中悬浮培养Marc-145细胞24h后MTT染色结果。

先配制MTT溶液（5mg/ml），取1gMTT粉末溶于200ml的PBS（pH=7.4），0.22um的无菌过滤膜过滤分装，然后封口，并用锡箔纸包裹，于-20℃避光保存。取50 ul在磁悬浮瓶中悬浮培养24h Marc-145细胞置于96孔板，然后加MTT溶液50 ul，置于37℃二氧化碳孵育1-2小时，然后取样品在倒置相差显微镜下观察。从图 16可以看出，SFL微载体上Marc-145细胞变成结晶状，紧贴在SFL微载体上。这是由于MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶。说明SFL微载体与Marc-145细胞的生物相容性好。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（2）配制纯丝素蛋白溶液：将步骤（1）得到的丝素蛋白纤维溶于三元溶液或其他溶液中，在75℃下搅拌溶解，离心过滤后，取滤液进行透析，得到纯丝素蛋白溶液，作为水相；所述三元溶液为CaCl₂/H₂O/CH₃CH₂OH；所述其他溶液为LiBr，CaCl₂，Ca（NO₃）₂或H₃PO₄；

所述表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、OP-10、SA-2两性表面活性剂、Tween-20、Tween-60中的一种或几种混合；

所述表面活性剂溶液的质量百分浓度为0.1-10%；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述蚕茧来源于天然家蚕、柞蚕或天蚕的一个或任意两个的组合；所述Na₂CO₃溶液的质量浓度为0.01%-5%；所述蚕茧与Na₂CO₃溶液的质量体积百分比为1%-20%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述丝素蛋白纤维与三元溶液或其他溶液的质量体积百分比为1%-30%；所述纯丝素蛋白溶液的质量浓度为1-30%；

所述透析是先用自来水进行透析1-2天，再用去离子水进行透析1-2天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述交联剂用量为W/O/O混合相总体积的1%-20%；所述交联时，搅拌转速为50-1000rpm，交联温度为4-60℃，交联时间为1-20小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，采用2%的硼还原剂还原脱色2-8h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）中，洗涤后筛分选择粒径为200-300μm的微载体。

7.细胞培养用SFL微载体，其特征在于：是用权利要求1所述方法制备得到的。

8.权利要求7所述的细胞培养用SFL微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述细胞为BHK-21细胞、Vero细胞、MDCK细胞、CHO-K1细胞和Marc-145细胞。