CN105462915B - 聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用 - Google Patents

聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用。它是通过反向悬浮将聚乙烯醇溶液在油相中分散成球形小液粒，通过交联剂对聚乙烯醇进行交联，经过固化、洗涤和筛分步骤得到聚乙烯醇微球；微载体的粒径为60~250μm，微载体的密度为1.02~1.07g/cm3。聚乙烯醇价格低廉，对环境友好，生物相容性好，以其制备的微载体适合哺乳动物细胞贴壁生长。本发明的微载体制备工艺更加简单，可广泛应用哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等生物制品的生产。

Description

聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用,具体为以聚乙烯醇为骨架材料的用于贴壁哺乳动物细胞培养用的微载体及其制备方法。将聚乙烯溶液乳化成微米级液滴，经适当交联、筛分得到一定粒径范围的微球，其可不经修饰直接用于贴壁哺乳动物细胞的发酵培养。聚乙烯醇价格低廉，对环境友好，生物相容性好，以其制备的微载体适合哺乳动物细胞贴壁生长。本发明的微载体可广泛应用哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等生物制品，涉及的技术领域包括生物医药、酶工程、发酵工程等。
背景技术
1967年Van Wezel为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了微载体培养系统的新技术概念。经过几十年的研究改进，微载体培养技术现已广泛地应用于哺乳动物细胞的培养，已广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等。
基于微载体适用于贴壁依赖性细胞在其表面贴壁生长,微载体能成为迄今常用而有效的哺乳动物细胞培养载体，除了由于许多工程依赖贴壁细胞系生产的限制外，还因微载体具有以下的优点：兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养；细胞所处环境均一；环境条件（温度、pH、CO2等）容易测量与监控；具有较高的比表面；培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。
目前市面上销售的微载体从材料上可分为：葡聚糖微载体（比如GE的Cytodex系列）、聚苯乙烯微载体（比如Pall公司的Solohill、Corning公司的Synthemax）、明胶微载体（比如Percell Biolytica AB公司的Cultispher）和纤维素微载体（比如Kirin公司的Cellsnow、Pharmacia公司的Cytopore）等。从表面修饰材料可分为：带正电的己二胺（比如GE的Cytodex 1）、哺乳动物胶原（比如GE的Cytodex 、PALL公司的Solohill）、人纤连蛋白（比如PALL公司的Solohill（ProNectin F coated））。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用。将聚乙烯醇溶液乳化成微米级液滴，经适当交联、筛分得到一定粒径范围的微球，其可不经修饰直接用于贴壁哺乳动物细胞的发酵培养。由于聚乙烯醇价格低廉，对环境友好，生物相容性好，以其制备的微载体适合哺乳动物细胞贴壁生长。本发明的微载体可广泛应用哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等生物制品的生产等。
本发明提供的聚乙烯醇微载体是通过反向悬浮将聚乙烯醇溶液在油相中分散成球形小液粒，通过交联剂对聚乙烯醇进行交联，经过固化、洗涤和筛分步骤得到聚乙烯醇微球；微载体的粒径为60~250μm，微载体的密度为1.02~1.07g/cm3。
本发明中所用的聚乙烯醇的醇解度为10%～100%（优选80%～95%），粘度在10～100mPa.s（优选15～50 mPa.s）在常温或加热条件下溶于水中，配制成质量分数为1%～20%（优选5%～15%）的溶液。
本发明中所用的交联剂为双醛类、双环氧类、双酸酐类和双酰氯类化合物。
本发明提供的聚乙烯醇微载体的制备方法包括如下步骤：
1）配制由烷烃、脂肪酸、酯类化物等疏水有机化物和亲水亲油平衡值（HLB值）小于7的乳化剂作为油相；pH为1～2（加入无机酸）聚乙烯醇溶液作为水相；
2）充分搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成稳定的小液滴。
3）然后加入双醛类、双环氧类、双酸酐类或双酰氯类的交联剂，进行反应交联，固化聚乙烯醇微球。
4）待聚乙烯醇微球固化成形后，滤出微球，用5～20倍体积的热水（50～100℃）清洗3次，再用2～20倍体积的乙醇清洗3次，最后用2～20倍体积的石油醚清洗3次。
5）清洗完毕在加热或真空条件下烘干，去除残留的有机溶剂。将聚乙烯醇微载体放入纯水中，充分浸泡，最后，先用100目不锈钢筛网滤掉其中粒径过大的微球，再用180目的不锈钢筛网滤掉其中粒径过小的微球。
6）将得到的微球样品浸泡于pH=7的磷酸缓冲溶液中（如果需长时间保存也可浸泡20%的乙醇溶液中）备用。
通过以上方法制备聚乙烯醇微载体的特点：粒径为60～250 μm，密度为1.02～1.06 g/cm3。
本发明提供的一种聚乙烯醇微载体的制备方法包括如下步骤：
1）将200 g 10%的聚乙烯醇溶液加入含有2 g span-80的300 mL液体石蜡中，用盐酸调pH为1～2，40-65℃下，以200 -280 rpm 速度进行搅拌5-10 min；
2）降温至40℃，以280 rpm速度继续搅拌20-30 min；加入50%的戊二醛3.5 mL，保持温度40℃，以280 rpm速度继续搅拌50-60 min；升温至60℃，继续搅拌50-60 min；
3）停止反应，滤出微球，用10倍体积的70±10℃热水清洗3-4次，再用5倍体积的乙醇清洗3-5次，最后用4-5倍体积的石油醚清洗2-3次。经80℃烘干后，去除残留的试剂。
4）筛分：将得到的聚乙烯醇微载体放入纯水中，充分浸泡6-8小时，先用用100目的不锈钢筛网进行筛分，去除大于100目筛孔的微载体；余下的微载体用180目不锈钢筛子对微球进行筛分，保留大于180目筛孔的微载体，即可得到所需的微载体。
本发明得到的聚乙烯醇微载体应用哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等生物制品的生产。
将聚乙烯醇微球用于细胞培养前，需将其浸泡液更换为新鲜的pH为7的磷酸缓冲盐溶液，经121℃湿热灭菌30～60℃后，可直接加入培养基中用于细胞的发酵培养。
本发明以聚乙烯醇为原料制备的微载体不需用表面修饰，可直接用于哺乳动物细胞的发酵培养，制备工艺更加简单。聚乙烯醇是一种高分子有机化合物，对人体无毒、无副作用，具有良好的生物相容性。聚乙烯醇在医疗领域具有广泛使用，可以制成水凝胶，制造软性接触眼镜；可以制成口腔膜，贴于患处，治疗细菌感染；还可以制成医用海绵，用于手术中吸液、吸血。聚乙烯醇可通过石油乙烯法、天然气乙炔法和电石乙炔法等成熟方法进行，生产方便，易于获取，价格低廉。另外聚乙烯醇不同于其它乙烯基聚合物（比如聚苯乙烯），其可被细菌作为碳源利用，可降解，是一种环境友好的材料。以聚乙烯醇为基质形成的微载体可不用具有神经毒性的己二胺修饰，更加环保；也不需要用哺乳动物源材料胶原或纤维蛋白修饰，避免生产过程引入哺乳动物源材料所带来的生物安全性风险。
实验证明，哺乳动物贴壁细胞能在上述制备的以聚乙烯醇为骨架材料的微载体上进行良好的贴附，适合于哺乳动物细胞的大规模发酵生产。
附图说明
图1为聚乙烯醇微球照片（×100）。
图2 为湿热灭菌30 min后显微镜下观察（×100）。
图3 为湿热灭菌60 min后显微镜下观察（×100）。
图4 为vero细胞在聚乙烯醇微载体上的贴壁效果（×200）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 聚乙烯醇微载体的制备
制备过程：
反应体系：油相：300 mL液体石蜡，2 g span-80；水相：200 g 10%聚乙烯醇（聚乙烯醇原料原料的粘度为17 mPa.s），2.0 mL 2 M盐酸。
②反应制备过程：将油相加入1 L三口瓶，以200 rpm速度进行搅拌；加入水相，以280 rpm速度进行搅拌，65℃搅拌10 min；降温至40℃，以280 rpm速度继续搅拌30 min；加入50%的戊二醛3.5 mL，保持温度40℃，以280 rpm速度继续搅拌60 min；升温至60℃，继续搅拌60 min；停止反应，滤出微球。
洗涤过程：称量微球的重量，用10倍体积的70±10℃热水清洗3次，再用5倍体积的乙醇清洗3次，最后用5倍体积的石油醚清洗3次。经80℃烘干后，去除残留的试剂。
筛分：将聚乙烯醇微载体放入纯水中，充分浸泡并不断搅拌。先用用100目的不锈钢筛网进行筛分，去除大于100目筛孔的微载体。余下的微载体用180目不锈钢筛子对微球进行筛分，保留大于180目筛孔的微载体，即可得到所需的微载体。将得到的微球样品浸泡于pH=7的磷酸缓冲溶液中备用。微载体的产率约为40%，产率=微载体量/投入的聚乙烯醇干重。
实施例2 聚乙烯醇微载体的粒径分度的测量
微载体半径越小，其比表面积就越大，所能粘附的贴壁细胞就越多，但细胞本身也有一定大小，半径过小也并不利细胞的贴附生长，因此大多数微载体的半径分布都在60～250 μm范围内。我们对其所制的微载体的半径也进行了测量，测量方法如下：将实施例1得到的微载体在pH=7.0的磷酸缓冲溶液中浸泡10 min（以下同），取少量微载体悬液滴于载玻片上，置于普通光学显微镜下进行观察，利用显微镜配备的成像系统进行拍照（见图1，表明按照实施例1制备出的微载体形态均匀，粒径分布在60～250 μm范围内），通过分析软件对微载体的半径分布进行测量，结果见表1。从结果分析来看，微截载体半径分布在60～250 μm范围内。
表1 聚乙烯醇微载体半径分布情况
半径范围 60~100 μm 100~150 μm 150~200 μm 200~250 μm
所占比例 15.2% 34.7% 43.1% 7.0%
实施例3 微载体密度的测定
微载体在实际过程需要悬浮在培养基中，因此其密度应范围在一定范围内，过低微载体会漂浮于液面，过低会沉降于底部。目前已上市的大部分微载体的密度在1.02～1.05 g/cm3范围内。
在20℃条件下，将1 g微球分散在100 mL不同浓度的氯化钠溶液，搅拌，静置5min，当90%以上微载体悬浮在液面时，认定其达到上述悬浮要求的最低氯化钠浓度为微球的密度，结果见表2。从结果来看，聚乙烯醇微载体密度在1.038 g/cm3左右。
表2 聚乙烯醇微载体密度测量
氯化钠浓度 3.0% 3.5% 4.0% 4.5% 5.0% 5.5% 6.0%
相应的氯化钠溶液密度（g/cm3） 1.020 1.024 1.027 1.030 1.034 1.038 1.041
微球悬浮情况 沉于底部 沉于底部 沉于底部 约10%上浮 约50%上浮 大于90%上浮 大于90%上浮
实施例4 湿热灭菌对微载体的影响
细胞发酵是一个无菌过程，所用材料（包括微载体）应保持无菌状态。微载体常用的灭菌方法就是湿热灭菌，我们也对聚乙烯醇微载体是否适合于湿热灭菌进行了测试。将制备好的聚乙烯醇微球在121℃条件下湿热灭菌30 min和60 min，结果见图2和图3，如图所示从形态学观察上来看，湿热灭菌对微载体并没有影响。
实施例5 非洲绿猴肾细胞（Vero）在微载体上贴附效果
将聚乙烯醇微载体在pH=7.0的磷酸缓冲溶液中溶胀10 min后，经121℃湿热灭菌30 min后用于实验。将100 μL微载体悬液加入到24孔细胞培养板的细胞培养孔中，然后加入DMEM（含10%胎牛血清）的培养基，最后加入Vero细胞悬液，其中细胞悬液的浓度为1×106个/mL。将细胞培养板置于37℃，5%CO2的细胞的培养箱中进行培养，48h后观察其生长情况，结果见图4。如图所示，Vero细胞与微载体共培养48h后其不仅在微载体表面进行有效地贴附，并能正常地分裂生长。

Claims (3)

1.一种聚乙烯醇微载体，它是通过反向悬浮将聚乙烯醇溶液在油相中分散成球形小液粒，通过交联剂对聚乙烯醇进行交联，经过固化、洗涤和筛分步骤得到聚乙烯醇微球；所述的交联剂为戊二醛；其特征在于：
微载体的粒径为60~250μm，微载体的密度为1.02~1.07g/cm3；
具体制备方法经过如下步骤：
1）将200 g 10%的聚乙烯醇溶液加入含有2 g span-80的300 mL液体石蜡中，用盐酸调pH为1～2，40-65℃下，以200 -280 rpm 速度进行搅拌5-10 min；
2）降温至40℃，以280 rpm速度继续搅拌20-30 min；加入50%的戊二醛3.5 mL，保持温度40℃，以280 rpm速度继续搅拌50-60 min；升温至60℃，继续搅拌50-60 min；
3）停止反应，滤出微球，用10倍体积的70±10℃热水清洗3-4次，再用5倍体积的乙醇清洗3-5次，最后用4-5倍体积的石油醚清洗2-3次；经80℃烘干后，去除残留的试剂；
4）筛分：将得到的聚乙烯醇微载体放入纯水中清洗，先用100目的不锈钢筛网进行筛分，去除大于100目筛孔的微载体；余下的微载体用180目不锈钢筛子对微球进行筛分，保留大于180目筛孔的微载体，即可；
5）将得到的微球样品浸泡于pH=7的磷酸缓冲溶液中备用。
2.一种聚乙烯醇微载体的制备方法，其特征在于经过如下步骤：
1）将200 g 10%的聚乙烯醇溶液加入含有2 g span-80的300 mL液体石蜡中，用盐酸调pH为1～2，40-65℃下，以200 -280 rpm 速度进行搅拌5-10 min；
2）降温至40℃，以280 rpm速度继续搅拌20-30 min；加入50%的戊二醛3.5 mL，保持温度40℃，以280 rpm速度继续搅拌50-60 min；升温至60℃，继续搅拌50-60 min；
3）停止反应，滤出微球，用10倍体积的70±10℃热水清洗3-4次，再用5倍体积的乙醇清洗3-5次，最后用4-5倍体积的石油醚清洗2-3次；经80℃烘干后，去除残留的试剂;
4）筛分：将得到的聚乙烯醇微载体放入纯水中清洗，先用100目的不锈钢筛网进行筛分，去除大于100目筛孔的微载体；余下的微载体用180目不锈钢筛子对微球进行筛分，保留大于180目筛孔的微载体，即可；
5）将得到的微球样品浸泡于pH=7的磷酸缓冲溶液中备用。
3.权利要求1所述的聚乙烯醇微载体在哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体生物制品生产中的应用。
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