CN111175112A - 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 - Google Patents
一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111175112A CN111175112A CN202010033848.XA CN202010033848A CN111175112A CN 111175112 A CN111175112 A CN 111175112A CN 202010033848 A CN202010033848 A CN 202010033848A CN 111175112 A CN111175112 A CN 111175112A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microcarrier
- cells
- cell
- solution
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000007447 staining method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N triethylenediamine Chemical compound C1CN2CCN1CC2 IMNIMPAHZVJRPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000012973 diazabicyclooctane Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 11
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 7
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 4
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- XIAYFENBYCWHGY-UHFFFAOYSA-N 2-[2,7-bis[[bis(carboxymethyl)amino]methyl]-3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl]benzoic acid Chemical compound C=12C=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C(=O)C=C2OC=2C=C(O)C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)=CC=2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O XIAYFENBYCWHGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKWTZACONBQTNK-IVIZKJKWSA-N N-benzyl-7H-purin-6-amine (1R,2R,5R,8R,9S,10R,12S)-12-hydroxy-11-methyl-6-methylidene-16-oxo-15-oxapentacyclo[9.3.2.15,8.01,10.02,8]heptadecane-9-carboxylic acid (1R,2R,5R,8R,9S,10R,12S)-12-hydroxy-11-methyl-6-methylidene-16-oxo-15-oxapentacyclo[9.3.2.15,8.01,10.02,8]heptadec-13-ene-9-carboxylic acid Chemical compound C(Nc1ncnc2nc[nH]c12)c1ccccc1.CC12[C@H]3[C@H](C(O)=O)[C@@]45C[C@@H](CC[C@H]4[C@@]3(CC[C@@H]1O)OC2=O)C(=C)C5.CC12[C@H]3[C@H](C(O)=O)[C@@]45C[C@@H](CC[C@H]4[C@]3(OC1=O)C=C[C@@H]2O)C(=C)C5 GKWTZACONBQTNK-IVIZKJKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 239000005820 Prochloraz Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002660 stem cell treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用微载体技术培养细胞的活细胞荧光染色方法，用来鉴定微载体上细胞的活性。本发明在染色前加入细胞膜通透剂triton X‑100以增强细胞通透性，促进染料进入细胞内与核酸结合；染色时，采用无血清培养基作为缓冲液，配制钙黄绿素‑乙酸甲基酯(Caclein‑AM)活细胞染色液，更接近细胞生长环境，防止细胞脱落；染色后，加入抗荧光衰减剂DABCO即1,4‑二偶氮双环[2,2,2]‑辛烷，有效延长发荧光的时间，从而使检测结果更精准。使用该方法可以根据发绿色荧光的强度判断出微载体上贴壁细胞的活性大小，同时不影响细胞的生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种微载体培养的活细胞荧光染色方法。
背景技术
微载体一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成，能适用于贴壁细胞的生长，其基本类型主要包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体主要有Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline等。微载体细胞培养技术的基本原理是，将对细胞无害的微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。应用微载体技术可以实现干细胞的规模化获取，为干细胞治疗应用于临床提供现实基础。
为了更好地观察微载体培养的细胞的活性，我们需要借助荧光染色技术。细胞荧光染色是观察细胞活性的一项重要技术手段，常用的细胞荧光染色方法有很多，如吖啶橙(AO)染色法、溴化乙锭(EB)染色法、荧光素双醋酸酯(FDA)染色法、异硫氰酸荧光素(FITC)、碘化丙啶(PI)、Hoechst系列染料、SYTOX系列染料及钙黄绿素(Calcein)染色等。钙黄绿素-乙酸甲基酯(Caclein-AM)本身并不是荧光分子，但具有细胞膜透性，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能够脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光，其激发波长为490nm，发射波长为515nm。因此，Calcein-AM仅对活细胞染色。
上述染色方法利用了活死细胞的细胞膜通透性差异以及染料与核酸物质结合能力的差异或者活死细胞代谢差异对活死细胞分别进行染色，然而这些染色方法存在着三个共同的缺点，即一是细胞通透性较低，染色剂与细胞内的物质难以完全结合发出强烈荧光，因而造成细胞活率较低；二是染色剂渗透压与细胞生长环境pH的差异容易导致细胞从微载体表面脱落；三是染色剂与细胞结合后发出的荧光容易淬灭，造成活细胞计数时不准确。
发明内容
为了克服上述缺点，本发明公布了一种既能够增强细胞膜通透性，又能够延缓荧光淬灭的微载体活细胞荧光染色方法，从而让细胞活率检测更精确，使干细胞治疗更好地应用于临床。
本发明采用以下技术方案：
(1)利用微载体技术培养贴壁细胞；
(2)无菌DPBS清洗1-2次，加入细胞膜通透剂triton X-100，室温孵育10min；
(3)去掉孵育液，无血清培养基清洗1-2次；
(4)用无血清培养基配制Calcein-AM染色液，加入微载体中染色30min；
(5)染色完成后，弃掉染液，加入抗荧光衰减剂DABCO；
(6)DPBS清洗1次，荧光显微镜下观察，拍照。
本发明针对常规荧光染色过程中，细胞通透性较低，染料与细胞内物质结合较差，造成荧光强度较弱或荧光较易淬灭的现象以及染料与细胞结合过程中，细胞容易脱落的问题进行创新，即在染色前，使用细胞膜通透剂增加细胞膜的通透性；染色时，选择无血清培养基作为缓冲剂配制染色液，以防止细胞脱落；染色后加入毒性较小的抗荧光衰减剂DABCO，从而大大提高常规荧光染色的准确性。
附图说明
附图1球形微载体上ADSCs经Calcein-AM荧光染色后图片A：40X B：100X
附图2片状微载体上hU-MSCs经Calcein-AM荧光染色后图片A：40X B：100X
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施实例1
采用Cephodex球形微载体(滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东)培养人脂肪间充质干细胞(ADSCs)，按照说明书要求对浓度为3g/L微载体进行膨胀、灭菌、无菌检验等预处理，具体方法如下：
取0.3g微载体加入30-50ml无菌PBS浸泡48h充分膨胀，高压蒸汽法灭菌30min，用无菌PBS清洗3次，加入50ml完全培养基放入特定生物反应器中，于37℃孵育24h，进行无菌检验。确认无菌后，弃去检验液，重新加入100ml完全培养基，将ADSCs按细胞密度为3*105/ml进行接种，利用间歇搅拌的方式进行培养。
待细胞贴壁达80％左右，分别取1ml微载体细胞悬液放入24孔板，记为A组和B组，A组用无菌DPBS清洗1-2次，直接加入1ml由配套缓冲液配制的Calcein-AM染色液避光孵育30min，在荧光显微镜下拍照观察(如附图1A1-B1)；B组用无菌DPBS清洗1-2次，加入细胞膜通透剂1ml 0.1％triton X-100，室温孵育10min后，弃掉通透剂，加入无血清培养基轻轻漂洗1-2次，弃掉培养基，加入1ml由无血清培养基配制的Calcein-AM染色液避光孵育30min，染色完成后，加入抗荧光衰减剂1ml质量浓度为0.5％DABCO溶液，在荧光显微镜下拍照观察(如附图1A2-B2)。
实施实例2
采用固定床Cephodisk片状微载体(滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东)培养人脐带间充质干细胞(hU-MSCs)，具体培养方法为：取100片微载体，加入30-50ml无菌DPBS浸泡30min，高压蒸汽法灭菌30min，用无菌DPBS清洗3次，加入20ml完全培养基放入特定培养瓶中，于37℃孵育24h，进行无菌检验，确认无菌后，弃去检验液，重新加入20ml完全培养基，将hU-MSCs按细胞密度1.5-2.5*104/ml进行接种，利用低速间歇搅拌的方式进行培养。培养第三天，设立A组和B组，分别任取1片微载体进行活细胞荧光染色观察，具体方法如下：
A组用无菌DPBS清洗微载体1-2次，加入2ml由配套缓冲液配制的Calcein-AM染色液避光孵育30min，染色完成后，在荧光显微镜下拍照观察(如附图2A1-B1)；B组用无菌DPBS清洗微载体1-2次，加入2ml细胞膜通透剂0.1％triton X-100，室温孵育10min后，弃掉通透剂，再加入无血清培养基轻轻漂洗1-2次，弃掉培养基，加入2ml由无血清培养基配制的Calcein-AM染色液避光孵育30min，染色完成后，加入抗荧光衰减剂2ml质量浓度为0.5％DABCO溶液，在荧光显微镜下拍照观察(如附图2A2-B2)。
Claims (10)
1.一种新的微载体活细胞荧光染色方法，主要包括以下步骤：
(1)取2ml左右贴壁状态良好的微载体细胞悬液，去掉培养基，用无菌DPBS轻轻清洗1～2次，弃掉DPBS洗涤液；
(2)配制活细胞荧光染色液：取10ul Caclein-AM原液加入到1ml无血清培养基中，混合均匀；
(3)向洗涤好的微载体中加入刚刚制备好的活细胞荧光染色液进行染色，室温孵育10～30min；
(4)染色完成后，加入1ml抗荧光衰减剂DABCO；
(5)将孵育好的微载体放在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜及其配套的活细胞工作站下进行观察拍照。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的微载体为国产或者进口的球形或片状等其他类型的微载体材料，专门用于贴壁细胞的培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞清洗液为DPBS，也可以为PBS、生理盐水或无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的细胞为原代或传代培养的干细胞或其他种类的细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的无血清培养基为培养该细胞的基础培养基(不含血清)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的Caclein-AM原液为浓度为4mM Caclein-AM的DMSO溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的染色液必须是现配现用，因为Caclein-AM对湿度非常敏感，Caclein-AM水溶液不稳定。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的染色液的孵育时间为10～30min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的抗荧光衰减剂为DABCO即1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷，其质量浓度通常为0～1.0％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该种活细胞荧光染色方法适用于但不仅限于微载体培养的贴壁细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010033848.XA CN111175112A (zh) | 2020-01-13 | 2020-01-13 | 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010033848.XA CN111175112A (zh) | 2020-01-13 | 2020-01-13 | 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111175112A true CN111175112A (zh) | 2020-05-19 |
Family
ID=70658088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010033848.XA Pending CN111175112A (zh) | 2020-01-13 | 2020-01-13 | 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111175112A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113029733A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-25 | 姜云瀚 | 基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法 |
| CN113899725A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-01-07 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1754784A2 (en) * | 1999-09-03 | 2007-02-21 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Method for producing a heterologous secreted protein from chinese hamster ovary cells grown on microcarriers |
| CN102288471A (zh) * | 2011-07-27 | 2011-12-21 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法 |
| US20130164269A1 (en) * | 2010-09-02 | 2013-06-27 | Life Technologies Corporation | Cell culture system for bioreactor scale-up of cells |
| WO2016127908A1 (zh) * | 2015-02-11 | 2016-08-18 | 南开大学 | 一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用 |
| CN107003242A (zh) * | 2014-09-16 | 2017-08-01 | 劳伦斯·利弗莫尔国家安全有限责任公司 | 使用荧光剂进行染色之后在紫外激发的情况下使用荧光显微镜控制组织中的成像深度的系统和方法 |
| CN108047482A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-18 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
| CN109554333A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-04-02 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种使用Namocell单细胞分离仪进行单细胞分选的方法 |
-
2020
- 2020-01-13 CN CN202010033848.XA patent/CN111175112A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1754784A2 (en) * | 1999-09-03 | 2007-02-21 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Method for producing a heterologous secreted protein from chinese hamster ovary cells grown on microcarriers |
| US20130164269A1 (en) * | 2010-09-02 | 2013-06-27 | Life Technologies Corporation | Cell culture system for bioreactor scale-up of cells |
| CN102288471A (zh) * | 2011-07-27 | 2011-12-21 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法 |
| CN107003242A (zh) * | 2014-09-16 | 2017-08-01 | 劳伦斯·利弗莫尔国家安全有限责任公司 | 使用荧光剂进行染色之后在紫外激发的情况下使用荧光显微镜控制组织中的成像深度的系统和方法 |
| WO2016127908A1 (zh) * | 2015-02-11 | 2016-08-18 | 南开大学 | 一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用 |
| CN108047482A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-18 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 |
| CN109554333A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-04-02 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种使用Namocell单细胞分离仪进行单细胞分选的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘建福 等: "《细胞工程》", 30 June 2014, 华中科技大学出版社 * |
| 吴燕峰 等: "《实用医学细胞培养技术》", 31 January 2010, 中山大学出版社 * |
| 黄晓峰 等: "《荧光探针技术》", 31 May 2004, 人民军医出版社 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113029733A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-25 | 姜云瀚 | 基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法 |
| CN113029733B (zh) * | 2021-03-30 | 2023-11-14 | 姜云瀚 | 基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法 |
| CN113899725A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-01-07 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200016294A1 (en) | Method for Preparing Porous Scaffold for Tissue Engineering, Cell Culture and Cell Delivery | |
| Bohari et al. | Effect of calcium alginate concentration on viability and proliferation of encapsulated fibroblasts | |
| US20200399431A1 (en) | Covalently Cross-Linked Hyaluronic Acid Aerogel, Hydrogel, and Preparation Method Thereof | |
| KR20200085870A (ko) | 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체 및 그 제조방법 | |
| CN105254917B (zh) | 一种利用海藻酸钠水凝胶制备细胞膜片的方法 | |
| CN111175112A (zh) | 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法 | |
| CN109593704A (zh) | 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 | |
| Bidarra et al. | 3D culture of mesenchymal stem cells in alginate hydrogels | |
| CN105925523A (zh) | 一种赤眼鳍条细胞系及其建立方法与应用 | |
| CN111334469A (zh) | Pbmc体外3d甲基纤维素琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法 | |
| CN103849944A (zh) | 一种宫膜干细胞库的构建方法 | |
| JP2009273444A (ja) | 細胞培養支持体、その製造方法及び該支持体を用いた細胞培養方法 | |
| WO2005014774A1 (ja) | 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法 | |
| CN102861329A (zh) | 一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法 | |
| CN103520715B (zh) | 利用wave波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 | |
| CN105462915A (zh) | 聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用 | |
| US20160264931A1 (en) | Method for cultivating cells in adhesion culture by using a cell culture carrier in capsule form, and cell culture carrier therefor | |
| CN101153317B (zh) | 一种连续检测组织工程支架和组织植入物上活细胞量的方法 | |
| CN105441350B (zh) | 产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN211394494U (zh) | 一种三维细胞培养装置 | |
| CA2006685C (en) | Production of horseshoe crab amebocytes in vitro | |
| CN106754672A (zh) | 一种贴壁细胞的培养方法 | |
| CN111334472A (zh) | Pbmc体外3d胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法 | |
| CN108118079B (zh) | 一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法 | |
| CN111307775A (zh) | 一种应用刃天青试剂检测体外3d培养条件下pbmc活性的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200519 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |