CN108118079B - 一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，具体为：将定性滤纸作为细胞培养的支架材料，将滤纸放置24孔板中使滤纸悬浮在培养液中，可进行充分的物质传输和营养成分的交换，从而使细胞在滤纸上进行三维生长，所述基于滤纸的肝模型即在定性滤纸上进行hiHep细胞与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养，实现了一种可体外长期培养并维持肝特异性功能的三维肝组织，利用它可以在体外进行高通量的肝毒性药物测试及评估，本发明所建立的模型可以用于药物筛选、毒性检测以及疾病研究中，为肝病研究领域的新药开发和筛选提供了重要平台。

Description

一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法
技术领域
本发明属组织工程及药物研究领域，具体涉及一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价。
背景技术
药物诱导的肝损伤(DILI)一直是导致急性肝功能衰竭的重要原因，严重威胁着人类健康。研究表明，引起DILI的不同的风险因素包括遗传易感性因素，非基因因素(年龄、性别和疾病)和药物因素(每天剂量、代谢特征和药物相互作用)。目前各种肝脏疾病的研究以及药物筛选、毒性检测方面大多还是依赖于动物实验。然而由于人和其他动物之间肝脏功能的差异性，动物实验的结果难以完全转化到临床中，临床前药物肝毒性预测和新药开发受到严重制约。
目前，用于药物毒性评价的体外肝模型的组织或细胞包括肝微粒体，肝癌细胞系或其他肝细胞系等，然而它们都缺乏许多重要的肝细胞特异性功能，不能有效地用于体外药物肝毒性检测。原代肝细胞或肝切片拥有正常的肝脏结构和功能，但在体外培养环境下会很容易丧失表型和正常的肝功能，因此不适用于体外长期的药物毒性检测。hiHep细胞作为一种由成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞，具有较为完整的正常肝功能，CYP450代谢酶和其他重要肝药酶的表达水平较好，并且在使用过程中不涉及伦理问题。目前，尚未有报道利用该细胞进行体外三维肝模型构建及高通量的药物毒性评价。
在体外构建功能性的肝组织过程中，模拟体内肝细胞复杂微环境并实现体外肝细胞的三维培养，对维持肝细胞的分化表型和改善肝细胞功能尤为重要。然而目前许多三维肝模型或肝反应器拥有许多的局限性，如肝细胞种类和来源有限，生物材料的性能及安全性差，体外细胞生长微环境难以长期维持，培养体系复杂难以扩大等。滤纸作为一种商业化、低成本、生物兼容性好，以及其本身独特的多孔三维结构，非常适合作为细胞三维培养的支架材料。目前尚未有报道利用滤纸材料进行肝细胞的培养，并构建可进行体外长期培养的三维肝组织模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，具体为：一种可用于进行药物肝毒性评价的一种基于定性滤纸的三维肝模型阵列，该模型可在体外长期维持肝细胞结构和功能，并用于对乙酰氨基酚和吡格列酮两种临床口服药的短期和长期诱导肝毒性的检测和评估。
一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，具体步骤为：
(1)定性滤纸的三维肝模型的建立：将滤纸置于细胞培养24孔板中，在其上包被一层100ug/ml浓度的I型鼠尾胶原，然后在其上面先后种上hiHep肝细胞和脐静脉内皮细胞HUVEC，两种细胞共培养10天后，得到具有肝特异性功能的三维肝模型，
(2)药物肝毒性评价：在上述模型分别加入两种临床口服药对进行不同药物浓度和时间点的处理，检测细胞活力和细胞分泌的LDH水平，用于药物引起的肝毒性(急/慢性)评估，并与二维培养的hiHep肝细胞的药物肝毒性检测进行对比。
该定性滤纸的三维肝模型用于研究形成的三维组织表型特征，以扫描电镜和苏木素-伊红染色方法观察组织三维形态。
所述肝模型形成的三维组织表型特征，分别以扫描电镜和苏木素‐伊红染色方法观察组织的三维形态，具体为：取在滤纸上培养第14天的肝组织(hiHep细胞单独培养和共培养)进行电镜扫描，观察三维组织结构形成；分别取在滤纸上培养7天的肝组织(hiHep细胞单独培养和共培养)和HUVEC细胞进行苏木素‐伊红染色，观察肝细胞和内皮细胞的形态。
本发明的一个优选方案为：
将滤纸用打孔器制成96孔板孔大小的圆片，高压灭菌后，用100ug/ml的I型鼠尾胶原包被过夜，之后用PBS洗掉残留的胶原，将HUVEC细胞按0.4X105个/ml细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100ul细胞悬浮液，在纸上培养两天后，吸去原来的培养液，按HUVEC/hiHep＝1:1的比例接种上hiHep细胞，换hiHep培养基继续培养，从而得到肝细胞功能较好的三维肝模型阵列，之后每隔一天换液。
滤纸上的HUVEC和hiHep两种细胞共培养10天后，得到具有肝特异性功能的三维肝组织，此时分别加入两种临床口服药对乙酰氨基酚(APAP)和吡格列酮(Pioglitazone)，进行不同药物浓度和时间点的处理，检测细胞活力和细胞分泌的LDH水平，用于药物引起的肝毒性(急/慢性)评估，并与二维培养的hiHep肝细胞的药物肝毒性检测进行对比。
所述不同药物浓度为对乙酰氨基酚的浓度梯度：0.5mM,1mM,2mM,4mM；吡格列酮的浓度梯度：1uM,10uM,50uM,100uM。二者均溶于DMSO中，对照组选取含有0.1％DMSO浓度的不含血清的hiHep培养基。
所述不同时间点的药物处理为：两种药物在三维肝组织模型上的处理时间分别是2天、4天和6天；在二维培养的hiHep中的处理时间分别是24小时和48小时。
所述细胞活力检测使用CCK-8试剂盒(DOJINDO)检测。
所述细胞LDH水平检测使用LDH比色法检测试剂盒(Leagene)检测。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型阵列设计合理，用材简单，适用于研究包括化学合成药物、生物药物、天然药物等所有来源的用于人体的口服药物的肝毒性评价及新药开发。
本发明利用一种新的肝细胞hiHep作为肝细胞来源，在滤纸上与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养构建三维肝组织模型。该培养体系能够近似模拟体内肝组织微环境，使肝细胞形态和功能较长时间地维持，并可以作为动物实验的替代方法，在体外进行临床口服药物(对乙酰氨基酚和吡格列酮)作用于肝脏的急慢性毒性的检测和评估。
本发明利用定性滤纸材料首次在体外构建了能长期培养的三维肝模型，并且能较长时间维持肝细胞结构和功能，更好的模拟了体内肝生理环境。相比于传统的二维细胞培养用于毒性检测，本发明所建立的三维肝模型更有效地进行临床口服药的肝毒性评价，近似模拟人体内药物诱导肝损伤的病理生理微环境。因此本发明所建立的模型可以用于药物筛选、毒性检测以及疾病研究中，为肝病研究领域的新药开发和筛选提供了重要平台。
附图说明
图1本发明所述三维肝模型的示意图；
其中1为孔板，2生长培养基，3内皮细胞，4滤纸，5肝细胞，6鼠尾胶原。
图2本发明所述建立三维肝模型阵列流程图；
图3单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型中的电镜扫描和苏木素-伊红染色分析；
图4共培养三维肝模型阵列及二维hiHep用于对乙酰氨基酚诱导的急/慢性肝毒性的细胞活力检测及定量分析；
图5共培养三维肝模型阵列及二维hiHep用于对乙酰氨基酚诱导的急/慢性肝毒性的细胞LDH水平检测及定量分析；
图6共培养三维肝模型阵列及二维hiHep用于吡格列酮诱导的急/慢性肝毒性的细胞活力检测及定量分析；
图7共培养三维肝模型阵列及二维hiHep用于吡格列酮诱导的急/慢性肝毒性的细胞LDH水平检测及定量分析。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
利用定性滤纸构建人源化三维肝模型阵列。
如下图1和图2所示，将滤纸用打孔器制成96孔板孔大小的圆片，高压灭菌后，用100ug/ml的I型鼠尾胶原包被过夜，之后用PBS洗掉残留的胶原，将HUVEC细胞按0.4X105个/ml细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100ul细胞悬浮液，在纸上培养两天后，吸去原来的培养液，按HUVEC/hiHep＝1:1的比例接种上hiHep细胞，换hiHep培养基继续培养，从而得到肝细胞功能较好的三维肝模型，之后每隔一天换液。
模型的设计按图2分别进行单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型的构建，单独培养三维肝模型的构建只需接种同细胞密度的hiHep细胞。通过扫描电镜结果和苏木素-伊红染色实验结果(图3)可以看出该体系显示单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型在培养第7天和第14天时都能保持良好的细胞三维形态，细胞在滤纸上生长会倾向自组装成三维球状组织，并且细胞活性较好，结果表明滤纸可以作为良好的细胞生长的三维支架材料，生物兼容性较好。单独的内皮细胞在滤纸上会依附于微纤维生长，形成类似血管网络的结构，而肝细胞加入后会迅速贴附于内皮细胞生长，与内皮细胞共同自组装成较大的肝组织聚集体。结果表明，共培养三维肝模型比单独培养三维肝模型具有更好的细胞形态结构。
实施例2
利用该三维肝模型阵列用于对乙酰氨基酚诱导的急慢性肝毒性检测和评估。
三维肝模型阵列按前述方法建立，培养期间每隔一天换液，从肝细胞接种孵育直到第10天时，肝细胞功能达到较好状态。用DMSO配制4mol/L的对乙酰氨基酚贮存液，在共培养10天时吸去原来的培养液，加入含不同浓度的对乙酰氨基酚培养液，浓度梯度为0.5mM,1mM,2mM,4mM。对照组选取含有0.1％DMSO浓度的不含血清的hiHep培养基。吸掉上清液，用PBS洗2次，再用CCK-8试剂盒检测细胞活力。按照CCK-8/细胞培养液＝1：10比例稀释，每孔加入100ul CCK-8稀释液，37℃孵育2-3个小时，在450nm处读取吸光值。hiHep细胞按0.2X105个/ml细胞密度接种于96孔板中进行二维培养，第二天加入不同浓度梯度的对乙酰氨基酚溶液，对照组选取含有0.1％DMSO浓度的不含血清的hiHep培养基。二维细胞培养分别在药物处理1天和2天时按上述方法进行细胞活力检测。结果显示(图4)APAP诱导的肝毒性呈明显的剂量和时间依赖性，在三维模型中的长期(6天)药物暴露下细胞活力明显下降，在最大血药浓度(～140uM)处理下的细胞活力水平近似于生理情况，而二维培养中短期(2天)药物暴露下细胞活力则下降更快，不符合生理情况。
三维肝模型阵列分别在对乙酰氨基酚药物处理2天、4天、6天时收集细胞培养上清液，贮存于-20℃备用。二维细胞培养分别在药物处理1天和2天时收集细胞培养上清液，贮存于-20℃备用。上述所收集培养液用于细胞分泌的LDH水平检测。取待测样品20ul加入300ul LDH检测工作液，混匀后37度孵育5分钟，再加入30ul丙酮酸工作液混匀，设置三个重复孔，每孔加入100ul检测液，立即在340nm处读取各孔吸光值，每1分钟进行数值读取，记录每孔待测样品吸光度的每分钟下降速率。结果显示(图5)APAP诱导的肝毒性呈明显的剂量和时间依赖性，表现为细胞分泌的LDH水平随时间和剂量的升高而升高，在三维模型中显示出APAP对肝细胞的长期毒性反应，而二维培养中LDH的分泌显示出APAP对肝细胞的急性毒性反应。
实施例3
利用该三维肝模型用于吡格列酮诱导的急慢性肝毒性检测和评估。
三维肝模型阵列按前述方法建立，培养期间每隔一天换液，从肝细胞接种孵育直到第10天时，肝细胞功能达到较好状态。用DMSO配制100mmol/L的吡格列酮贮存液，在共培养10天时吸去原来的培养液，加入含不同浓度的吡格列酮培养液，吡格列酮的浓度梯度为：1uM,10uM,50uM,100uM。对照组选取含有0.1％DMSO浓度的不含血清的hiHep培养基。吸掉上清液，用PBS洗2次，再用CCK-8试剂盒检测细胞活力。按照CCK-8/细胞培养液＝1：10比例稀释，每孔加入100ul CCK-8稀释液，37℃孵育2-3个小时，在450nm处读取吸光值。hiHep细胞按0.2X105个/ml细胞密度接种于96孔板中进行二维培养，第二天加入不同浓度梯度的吡格列酮溶液，对照组选取含有0.1％DMSO浓度的不含血清的hiHep培养基。二维细胞培养分别在药物处理1天和2天时按上述方法进行细胞活力检测。结果显示(图6)在二维培养中，吡格列酮对细胞活力的影响不是很明显，但在三维模型中，肝细胞在吡格列酮的长期(6天)暴露下细胞活力下降到约70％，说明吡格列酮对肝细胞的短期毒性效应不明显，而对肝细胞可能有长期毒性反应。
三维肝模型阵列分别在吡格列酮药物处理2天、4天、6天时收集细胞培养上清液，贮存于-20℃备用。二维细胞培养分别在药物处理1天和2天时收集细胞培养上清液，贮存于-20℃备用。上述所收集培养液用于细胞分泌的LDH水平检测。取待测样品20ul加入300ulLDH检测工作液，混匀后37度孵育5分钟，再加入30ul丙酮酸工作液混匀，设置三个重复孔，每孔加入100ul检测液，立即在340nm处读取各孔吸光值，每1分钟进行数值读取，记录每孔待测样品吸光度的每分钟下降速率。结果(图7)显示在二维培养中，肝细胞LDH分泌水平没有明显升高，说明吡格列酮诱导的肝细胞毒性不明显。在三维模型中，肝细胞在吡格列酮的长期(6天)暴露下LDH有所升高，说明吡格列酮对肝细胞的短期毒性效应不明显，而对肝细胞可能有长期毒性反应。

Claims (6)

1.一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：按照以下步骤进行：
（1）定性滤纸的三维肝模型的建立： 将滤纸置于细胞培养24孔板中，在其上包被一层100 ug/ml浓度的I型鼠尾胶原，然后在其上面先后种上hiHep肝细胞和脐静脉内皮细胞HUVEC，两种细胞共培养10天后，得到具有三维组织表型特征和肝特异性功能的肝模型，
（2）药物肝毒性评价：在上述模型分别加入两种临床口服药对进行不同药物浓度和时间点的处理，检测细胞活力和细胞分泌的LDH水平，用于药物引起的肝毒性急/慢性评估，并与二维培养的hiHep肝细胞的药物肝毒性检测进行对比；
所述肝模型形成的三维组织表型特征，分别以扫描电镜和苏木素-伊红染色方法观察组织的三维形态，具体为：取在滤纸上培养第14天的肝组织进行电镜扫描，观察三维组织结构形成；分别取在滤纸上培养7天的肝组织和HUVEC细胞进行苏木素-伊红染色，观察肝细胞和内皮细胞的形态。
2.按照权利要求1所述一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述两种临床口服药分别为对乙酰氨基酚和吡格列酮。
3.按照权利要求1所述一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述不同药物浓度为：对乙酰氨基酚的浓度梯度：0.5mM, 1mM, 2mM, 4mM；吡格列酮的浓度梯度：1uM, 10uM, 50uM, 100uM；二者均溶于DMSO中，对照组选取含有0.1% DMSO浓度的不含血清的hiHep培养基。
4.按照权利要求1所述一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述不同时间点的处理为：两种药物在三维肝组织模型上的处理时间分别是2天、4天和6天；在二维培养的hiHep中的处理时间分别是24小时和48小时。
5.按照权利要求1所述一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述细胞活力检测使用CCK-8试剂盒检测。
6.按照权利要求1所述一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述细胞LDH水平检测使用LDH比色法检测试剂盒检测。
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