CN109082405A - 一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其主要步骤分为:(1)微流控芯片的制备;(2)三维类脑在微流控芯片上的发育;(3)施加尼古丁暴露。该方法主要结合了新兴的hiPSCs来源的三维类脑组织和可灌流的微流控芯片,通过加以不同浓度的尼古丁刺激,模拟妊娠期尼古丁暴露对胎儿早期脑发育的影响。该模型作为创新的体外器官发育疾病模型,不仅利于直观观察尼古丁对脑发育的形态学影响,也可以借鉴各种检测方法,研究尼古丁对脑发育影响的分子学和细胞学机制。本发明并且很好地模拟了脑早期发育的微环境,可替代动物模型和传统的二维培养方式,为研究妊娠期尼古丁对胎儿早期脑发育的影响提供了有力的新平台。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术和组织工程的领域,具体涉及一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型构建方法。
背景技术
病理条件下组织和器官的分子和细胞水平机制研究能更好地了解、控制和治疗疾病。传统的生物学方法用于疾病的机制研究或建立疾病模型主要包括二维细胞培养方式和动物模型。二维细胞培养无法模拟生理条件下细胞的微环境,不能完全反映细胞在病理条件下的形态学和分子水平的改变。动物实验目前主要是使用鼠、果蝇、线虫等模式生物,虽然模式生物来源方便、培养条件简单,但由于种属差异,它们很难完全反映各种条件下人体各器官和组织的生理变化。而对于人体的研究在保证最低损伤和方便观察的前提下,较为常用的有核磁共振、CT等,但是这些方法不具实时监测特点,并且很多都无法应用于胎儿发育。
近几年来各种干细胞来源的类脑发育得到了有效发展,包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞iPSCs。类脑的形成来源于拟胚体EBs,是由干细胞特异性分化并自组装成具有三维结构的多细胞聚集体,在体外进一步发育成具有一定结构和功能特异性的组织,一定程度上模拟了早期脑发育的过程。类脑技术在模拟脑发育,药物筛选和细胞替代疗法以及疾病模型的建立和研究等方面提供了一个独特的平台,弥补了二维细胞培养分化以及动物模型存在种间差异的不足,具有广泛的应用前景。
尽管这类技术有潜在的优势和应用,仍然面临很多局限和不足。首先,由于三维细胞团的结构特点,使得内部细胞由于缺少氧气和营养,出现中心细胞坏死现象,极大限制了类脑发育的程度,包括体积大小、功能成熟度等,而在生理情况下组织和脑中分布着血管网络用于提供充分的氧气和营养物质,是传统方法很难实现的。其次,传统方法中如使用旋转反应器培养类脑需要消耗大量的培养基和培养空间,成本较高并且可操作性不强,不利于施加不同的条件刺激。最后,传统方法主要是利用细胞自组装和化学因子诱导形成类脑,没有时空上的因素控制及物理因素的参与。因此,结合现有的工程化手段尤其是微流控技术,有望优化类脑技术。
微流控芯片作为细胞培养载体,有几大优势:首先,借助微流控芯片技术可根据实际应用设计不同的通道尺寸,提供一定的空间限制即物理因素控制,并维持细胞的三维生长状态。其次,流体控制有助于促进营养物质和氧气的交换,减少细胞凋亡或细胞团中心坏死现象,为细胞培养提供良好的生存环境。最后,PDMS作为微流控芯片的制作材料,具有良好的透光和透气性,可进行细胞的实时监测和观察并有利于细胞对氧气的充分利用,维持细胞的生长状态。但是目前将微流控技术与类脑技术相结合,建立人属的疾病模型领域尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,该方法使用微流控芯片灌流系统通过三维培养和流体控制等要素,模拟体内脑发育的微环境,不仅保证了发育过程中充分的营养物质和氧气的交换,实现了脑早期发育特征,并具有低成本、易操作、可原位示踪和实时监测的特点。
本发明一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其步骤主要分为三部分:(1)微流控芯片的制备;(2)三维类脑在微流控芯片上的发育;(3)施加尼古丁暴露。
所述步骤(1)微流控芯片的制备,具体为:
微流控芯片包括:细胞外基质混悬液入口、三维通道、二维灌流通道、二维培养基通道、培养液入口,所述二维灌流通道、二维培养基通道和三维通道交界处有小柱形状的连通处,可用于营养物质传输。
所述微流控芯片结构的宽度不等,二维灌流通道(3)和二维培养基通道(4)的宽度都为0.5mm-1mm,三维通道的宽度为1.5mm-2.5mm。所述微流控芯片的所有通道的高度均为600-800um。
所述微流控芯片的制备方法为:所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成,上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物,然后上下两层聚合物材料经过氧气等离子体处理60-90秒进行不可逆封接;封接之后,经过高温高压灭菌处理备用。
所述步骤(2)三维类脑在微流控芯片上的发育,具体为:
(1)使用带有坑状结构的PDMS芯片制备EBs:坑状结构的芯片置于24孔板内,小坑结构直径为600-800μm,深度为100-300μm,用于EBs形成;
(2)第1天,制备EBs,将2×105~6×105个干细胞消化成单细胞,并转移至(1)所述的芯片中,离心500-800rpm,3-5min,所用培养基为KSR培养基,并加入5μM Y27632和4ng/mlbFGF;
(3)第2天,将形成的EBs转移至低粘附的培养板中,悬浮培养,所用培养基为KSR培养基;
(4)第5天,诱导EBs向神经上皮方向分化,将KSR培养基替换为神经诱导培养基NIM。
所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞及其他多种细胞类型。
所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12,另外需添加占总体积20%的KnockOutReplacement(KSR),占总体积1%NEAA(Non Essential Amino Acid,100×),占总体积1%GlutaMax(100×),占总体积1%penicillin-streptomycin(100×),以及0.1mM beta-mercaptoethanol,4ng/ml bFGF。
所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12,另外需添加占总体积1%N2(100×),占总体积1%GlutaMAX(100×),占总体积1%NEAA(Non Essential Amino Acid,100×),1μg/mlheparin,占总体积1%penicillin-streptomycin(100×)。
所述步骤(3)施加尼古丁暴露,具体为:
(1)拟胚体EBs在诱导培养基NIM中培养到第11天时,将EBs转移到微流控芯片上,使用浓度为2-10mg/ml的Matrigel重悬前期诱导的EBs,并用100ul的去尖枪头将EBs注入微流控芯片的三维通道内,整个过程避免产生气泡,确保冰上操作维持低温,保证Matrigel不凝固;
(2)将含有EBs的芯片置于37℃培养箱30-40min,使Matrigel凝固;
(3)将含有EBs的微流控芯片培养基通道内补加培养基,静止培养6-8h,所用培养基为神经分化培养基NDM。
(4)灌流操作:含有细胞团的微流控芯片静止培养6-8h后,从培养下取出,在二维灌流通道中插入一定长度的PTFE管,连接注射器和注射泵,设置流速25ul/h,将芯片放入培养箱中进行灌流培养。对照组使用NDM培养基,样品组使用含尼古丁浓度为0.5-50uM的NDM培养基;样品组的芯片的所有培养基通道均置换为含尼古丁的NDM;尼古丁处理至三维类脑发育16-30天时,进行后续检测。
所述NDM培养基,所用培养基为神经分化培养起,其基础成分为体积比为1:1的DMEM/F12和Neuralbasal medium,另外需添加占总体积1%B27(50×),占总体积0.5%N2(100×),占总体积0.5%NEAA(100×),占总体积1%GlutaMAX(100×),占总体积1%penicillin-streptomycin(100×),0.05mM beta-mercaptoethanol。
本发明建立的妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型,其后续的结构和功能的表征方法如下:
(1)显微镜明场条件下直观监测类脑的生长速度和发育状态;
(2)使用冷冻切片技术,将细胞团切成10-20μm厚度,进行免疫荧光染色鉴定类脑发育过程中不同脑区形成、脑皮层神经元的分化以及尼古丁处理组类脑发育的情况;
(3)RT-PCR方法检测尼古丁处理组类脑发育的异常。
本发明提供一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型构建方法,不仅适用于hiPSCs来源的类脑构建,也适用于其他不同类型的干细胞(包括胚胎干细胞)来源的类脑构建。
本发明中微流控芯片可根据实验要求设计成不同的通道尺寸以适应需求。
本发明提供一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型,也适用于研究尼古丁对其他不同干细胞(包括胚胎干细胞)来源的类器官的发育的影响,类器官包括肝、肾、胃、视网膜、脑等。该模型作为创新的体外器官发育疾病模型,不仅利于直观观察尼古丁对脑发育的形态学影响,也可以借鉴各种检测方法,研究尼古丁对脑发育影响的分子学和细胞学机制,弥补了传统细胞实验和动物实验的不足,为研究妊娠期尼古丁对胎儿早期脑发育的影响提供了有力的工具。
附图说明
图1微流控芯片示意图;
其中:1细胞外基质混悬液入口、2三维通道、3二维灌流通道、4二维培
养基通道、5培养液入口。
图2冷冻切片及免疫组化方法检测对照组和样品组类脑的发育情况;
图3RT-PCR方法检测类脑发育过程中神经及不同脑区基因表达情况。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
实施例1
妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立。
其步骤主要分为三部分:微流控芯片的制备、类脑在微流控芯片中的发育、施加尼古丁暴露。
步骤(1)微流控芯片的制备,具体为:微流控芯片由上下两层不可逆封接而成,上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。然后上下两层聚合物材料经过氧气等离子体处理60秒进行不可逆封接。封接之后,经过高温高压灭菌处理备用。微流控芯片如图1所示,包括细胞外基质混悬液入口(1)、三维通道(2)、二维灌流通道(3)、二维培养基通道(4)、培养液入口(5)。二维通道(3、4)和三维通道(2)交界处有小柱形状的连通处,可形成二维与三维微环境界面。微流控芯片结构的宽度不等,二维灌流通道(3)和二维培养基通道(4)的宽度都为1mm,三维通道的宽度为2.5mm,所有通道的高度均为600um。
步骤(2)类脑在微流控芯片中的发育,具体为:使用带有坑状结构的PDMS芯片制备拟胚体:坑状结构的芯片置于24孔板内,小坑结构直径为800μm,深度为300μm,用于拟胚体的形成。第1天,制备拟胚体,将2×105~6×105个hiPSCs消化成单细胞,并转移微流控芯片中,离心800rpm,3min,所用培养基为KSR培养基,并加入5μM Y27632;第2天,将形成的拟胚体转移至低粘附的培养皿中悬浮培养,所用培养基为KSR培养基。第5天,诱导拟胚体向神经上皮方向分化,将KSR培养基替换为NIM培养基;拟胚体仍保持悬浮培养。每2天更换一次培养基。
第11天,使用5mg/ml的Matrigel重悬前期诱导的细胞团,并用100ul的去尖枪头将细胞团注入微流控芯片的三维通道内,整个过程避免产生气泡,确保冰上操作维持低温,保证Matrigel不凝固。将含有细胞团的微流控芯片置于37℃培养箱30min,使Matrigel凝固;将含有细胞团的微流控芯片培养基通道内补加培养基,静止培养6h,所用培养基为NDM培养基。之后,在中间二维流体通道中插入一定长度的PTFE管,连接注射器和注射泵,设置流速25ul/h,将芯片放入培养箱中进行灌流培养。
步骤(3)施加尼古丁暴露,具体为:
第11天,按步骤(2)将细胞球转移到微流控芯片上后,对照组使用NDM培养基进行灌流培养,样品组分别使用尼古丁浓度为1uM和10uM的NDM培养基进行灌流培养,所用的培养基需现用现配。连续灌注培养类脑发育至25天。
实施例2
免疫组化方法检测对照组和样品组类脑发育情况。
分别收集对照组和样品组培养至第16和25天的类脑进行冷冻切片,方法如下:4%多聚甲醛进行细胞固定20min,PBS缓冲液冲洗三次,每次1min;30%蔗糖4℃过夜脱水;OCT包埋,室温存放30min,80℃凝固;冷冻切片,厚度为10-20μm,并将其贴附在静电吸附的载玻片上。然后进行免疫荧光染色,方法为:将带有切片的载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5min;0.1%triton X-100致孔剂作用5min,PBS缓冲液冲洗1次,1min;山羊封闭血清室温作用1h;一抗(PAX6,PAX2,TUJ1,SOX2)1:400稀释,4℃过夜孵育,PBS缓冲液冲洗3次。二抗(Fluorescence 488/594标记的山羊抗兔或鼠IgG)1:100稀释,室温孵育1h,PBS缓冲液冲洗3次;冲洗完毕后加入1:4000稀释的DAPI工作液,荧光显微镜下拍照,记录相应蛋白的表达情况,结果如图2所示,Scale bars:50μm。在微流控芯片灌流培养条件下尼古丁处理组在发育第16天和25天类脑中的神经元表达明显高于对照组,并且前脑和后脑相关的蛋白表达在不同尼古丁暴露的条件下异常表达。结果表明尼古丁暴露对早期类脑的发育有异常影响,主要表现在尼古丁促进神经元的异常分化并引起不同脑区的发育异常。
实施例3
RT-PCR方法检测对照组和样品组脑发育相关基因表达情况。
分别收集对照组和样品组培养至第16和25天的类脑,PBS缓冲液清洗1次,并离心。使用Trizol法提取全RNA,方法如下:1ml Trizol重悬细胞,上下吹打直至无细胞块,整个溶液澄清;加入200μl氯仿,上下颠倒充分混匀,室温静置3min,12000rpm离心15min;溶液出现分层,取上层液体至新管中,整个过程小心操作尽量避免接触中间层白色沉淀;在吸取液中加入等量异丙醇,上下颠倒混匀,-20℃静置过夜,利于RNA析出;12000rpm离心10min;保留管底部的白色RNA沉淀,小心去上清;75%乙醇清洗白色沉淀,12000rpm离心5min;尽可能去除75%乙醇,室温让其挥发,以免乙醇污染样品,影响后续实验;DEPC水溶解RNA沉淀;测RNA浓度和纯度,并进行相应的稀释,终浓度为500ng/ml。
第二步,将mRNA反转录为cDNA,体系为50μl,具体配比如下:500ng/ml RNA 10μl,Buffer 10μl,Oligo dT 2.5μl,Random 6mers 2.5μl,Enzyme 2.5μl,DEPC水27.5μl,37℃反应30min,4℃保存。
第三步,Real-time PCR,按照试剂盒要求配体溶液,终体系为5ul,退火温度Tm值统一为58℃。
最后统计对照组和样品组脑发育相关基因的表达,结果如图3所示。结果显示尼古丁处理组在发育第16天和25天类脑中的神经元的基因标志物TUBIII表达明显高于对照组,并且前脑基因标志物PAX6和FOXG1的表达明显降低,后脑基因标志物KROX20的表达明显升高。表明尼古丁暴露会促进早期类脑发育过程中的神经元过度分化并引起不同脑区的发育异常。
Claims (8)
1.一种妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于其该方法主要步骤分为:
(1)微流控芯片的制备;
(2)三维类脑在微流控芯片上的发育;
(3)施加尼古丁暴露。
2.按照权利要求1所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于:步骤(1)中所述微流控芯片包括:细胞外基质混悬液入口(1)、三维通道(2)、二维灌流通道(3)、二维培养基通道(4)、培养液入口(5),所述二维灌流通道(3)、二维培养基通道(4)和三维通道(2)交界处有小柱形状的连通处,可用于营养物质传输。
3.按照权利要求2所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于所述微流控芯片的二维灌流通道(3)和二维培养基通道(4)的宽度都为0.5mm-1mm,三维通道的宽度为1.5mm-2.5mm,所有通道的高度均为600-800um。
4.按照权利要求2或3所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于步骤(1)所述微流控芯片制备:由上下两层不可逆封接而成,上下层材料均为聚二甲基硅氧烷的聚合物,封接之后,经过高温高压灭菌处理备用。
5.按照权利要求1所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于:步骤(2)三维类脑在微流控芯片上的发育,具体为:
(1)将2×105~6×105个干细胞消化成单细胞加入带有坑状结构的PDMS芯片中形成拟胚体EBs,,并加入神经诱导培养基NIM进行诱导;EBs在NIM中培养到第11天时,将EBs转移到微流控芯片上,使用浓度为2-10mg/ml的Matrigel重悬EBs,并用100ul的去尖枪头将EBs注入微流控芯片的三维通道内,将含有EBs的微流控芯片置于37℃培养箱30-40min,使Matrigel凝固;将培养基通道内补加神经分化培养基NDM,静止培养6-8h;
(2)静止培养后进行灌流操作,将微流控芯片的二维灌流通道连接注射器和注射泵,设置流速20-40ul/h,将芯片放入培养箱中进行灌流培养,继续培养15-30天后,并实时追踪,鉴定发现微流控芯片上的EBs可以进行持续的生长和分化,经鉴定可以形成含有不连续的特定脑区及类似大脑皮层结构的类脑,可模拟早期的脑发育过程。
6.按照权利要求5所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于:所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞及其他多种细胞类型。
7.按照权利要求1所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于:步骤(3)施加尼古丁暴露,具体为:
(1)类脑发育第11天时,转移到微流控芯片上,并进行灌流操作,此时施加尼古丁暴露;
(2)对照组使用NDM培养基,样品组使用含尼古丁浓度为0.5-50uM的NDM培养基;
(3)样品组的芯片的所有培养基通道均置换为含尼古丁的NDM;
(4)尼古丁处理至三维类脑发育16-30天时,进行后续检测。
8.按照权利要求7所述妊娠期尼古丁暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立,其特征在于:尼古丁的浓度范围为0.5-50uM,以模拟生理情况下的尼古丁浓度。
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