CN109082406A - 一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，主要步骤为：微流控芯片的制备；拟胚体EBs的形成；类脑在微流控芯片中的分化和发育。本发明构建的一种新型的工程化的三维类脑发育模型，是一种基于微流控芯片技术的可灌流的微反应器。本发明是将体内脑发育的基本原理和工程化技术结合，更好地模拟了脑早期发育的微环境。本发明具有成本低、操作简单、试剂用量少、可原位追踪和实时监测等优点，可替代动物模型和传统的二维培养方式，在一定程度上模拟脑早期的发育，为体外模拟脑发育、神经发育异常的病理学研究、药物筛选和毒性检测等方面提供了一个强有力的新平台。

Description

一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术和组织工程的领域，具体涉及一种基于微流控芯片的类脑发育模型的构建方法。
背景技术
近几年来各种干细胞来源的类脑发育得到了有效发展，包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞iPSCs。类脑的形成来源于拟胚体EBs，是由干细胞特异性分化并自组装成具有三维结构的多细胞聚集体，在体外进一步发育成具有一定结构和功能特异性的组织，一定程度上模拟了相应脑的发育过程。研究表明iPSCs能定向分化成特异的细胞类型，并具有强大的自组装能力，能形成多种脑类型，目前已有的iPSCs来源的类脑包括肠，肾，视网膜和大脑等。iPSCs来源的类脑技术在模拟人体脑发生，药物筛选和细胞替代疗法以及疾病模型的建立和研究等方面提供了一个独特的平台，弥补了2D细胞培养分化以及动物模型存在种间差异的不足，具有广泛的应用前景。
大脑类脑(类脑)是指发育成的具有不同的独立脑区并相互连接的类脑，主要由大脑皮层构成，产生有特定空间分布结构的前体细胞和多种类型的皮层神经元。最近的研究表明，类脑技术主要是通过干细胞的定向诱导分化，以拟胚体形式自组装并利用基质包埋悬浮培养的方式形成有不同脑区和皮层的类脑。类脑在很大程度上概括了大脑早期发育的特征，可用来模拟大脑发育的过程，研究哺乳动物神经发育的基本机制。尽管这类技术有潜在的优势和应用，仍然面临很多局限和不足。首先，由于3D细胞团的结构特点，使得内部细胞由于缺少氧气和营养，出现中心细胞坏死现象，极大限制了类脑发育的程度，包括体积大小、功能成熟度等，而在生理情况下组织和脑中分布着血管网络用于提供充分的氧气和营养物质，是传统方法很难实现的。其次，传统方法中如使用旋转反应器培养类脑需要消耗大量的培养基和培养空间，成本较高并且可操作性不强，不利于施加不同的条件刺激。最后，传统方法主要是利用细胞自组装和化学因子诱导形成类脑，没有时空上的因素控制及物理因素的参与。因此，结合现有的工程化手段尤其是微流控技术，有望优化类脑技术。
微流控芯片作为细胞培养载体，有几大优势：首先，借助微流控芯片技术可根据实际应用设计不同的通道尺寸，提供一定的空间限制即物理因素控制，并维持细胞的三维生长状态。其次，流体控制有助于促进营养物质和氧气的交换，减少细胞凋亡或细胞团中心坏死现象，为细胞培养提供良好的生存环境。最后，PDMS作为微流控芯片的制作材料，具有良好的透光和透气性，可进行细胞的实时监测和观察并有利于细胞对氧气的充分利用，维持细胞的生长状态。但是目前将微流控技术与类脑技术相结合，优化体外类脑的发育及操作尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，该方法高效地实现了类脑的生长、分化和发育，包括不同脑区和大脑皮层的分化形成。该微流控灌流系统通过三维细胞培养和流体控制等要素，模拟体内脑发育的微环境，不仅保证了发育过程中充分的营养物质和氧气的交换，同时实现了类似早期脑发育过程中的脑组织结构和空间排布形成，并具有低成本、易操作、可原位示踪和实时监测的特点，为模拟脑发育、脑病机制研究、药物筛选和测试提供了一个新的平台。
本发明提供了一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其步骤主要分为三部分：微流控芯片的制备、拟胚体EBs的形成和类脑在微流控芯片中的分化发育。
所述步骤(1)微流控芯片的制备，具体为：
微流控芯片包括：细胞外基质混悬液入口、三维通道、二维灌流通道、二维培养基通道、培养液入口，所述二维灌流通道、二维培养基通道和三维通道交界处有小柱形状的连通处，可用于营养物质传输。
所述微流控芯片结构的宽度不等，二维灌流通道(3)和二维培养基通道(4)的宽度都为0.5mm-1mm，三维通道的宽度为1.5mm-2.5mm。所述微流控芯片的所有通道的高度均为600-800um。
所述微流控芯片的制备方法为：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，然后上下两层聚合物材料经过氧气等离子体处理60-90秒进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
所述步骤(2)拟胚体EBs的形成，具体为：
(1)使用带有坑状结构的PDMS芯片制备EBs：坑状结构的芯片置于24孔板内，小坑结构直径为600-800μm，深度为100-300μm，用于EBs的形成；
(2)第1天，制备EBs，将2×105～6×105个干细胞消化成单细胞，并转移至(1)所述的芯片中，离心500-800rpm，3-5min，所用培养基为KSR培养基，并加入5μM Y27632和4ng/mlbFGF；
(3)第2天，将形成的EBs转移至低粘附的培养板中，悬浮培养，所用培养基为KSR培养基；
(4)第5天，诱导EBs向神经上皮方向分化，将KSR培养基替换为神经诱导培养基NIM。
所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞及其他多种细胞类型。
所述诱导多能干细胞为hiPSCs。
所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积20％的KnockOutReplacement(KSR)，占总体积1％NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)，占总体积1％GlutaMax(100×)，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，以及0.1mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF。
所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％NEAA(Non Essential Amino Acid，100×)，1μg/mlheparin，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)。
所述步骤(3)类脑在微流控芯片中的分化和发育，具体为：
(1)拟胚体EBs在诱导培养基NIM中培养到第11天时，将EBs转移到微流控芯片上，使用浓度为2-10mg/ml的Matrigel重悬前期诱导的EBs，并用100ul的去尖枪头将EBs注入微流控芯片的三维通道内，整个过程避免产生气泡，确保冰上操作维持低温，保证Matrigel不凝固；
(2)将含有EBs的微流控芯片置于37℃培养箱30-40min，使Matrigel凝固；
(3)将含有EBs的微流控芯片培养基通道内补加培养基，静止培养6-8h，所用培养基为神经分化培养基NDM。
(4)灌流操作：含有细胞团的微流控芯片静止培养6-8h后，从培养下取出，在二维灌流通道中插入一定长度的PTFE管，连接注射器和注射泵，设置流速25ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养。继续培养15-30天后，并实时追踪，鉴定发现微流控芯片上的EBs可以进行持续的生长和分化，经鉴定可以形成含有不连续的特定脑区及类似大脑皮层结构的类脑，可模拟早期的脑发育过程。
所述NDM培养基，所用培养基为神经分化培养起，其基础成分为体积比为1:1的DMEM/F12和Neuralbasal medium，另外需添加占总体积1％B27(50×)，占总体积0.5％N2(100×)，占总体积0.5％NEAA(100×)，占总体积1％GlutaMAX(100×)，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，0.05mM beta-mercaptoethanol。
本发明建立的基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建，其后续的结构和功能的表征方法如下：
(1)显微镜明场条件下直观监测类脑的生长速度和发育状态；
(2)使用冷冻切片技术，将细胞团切成10-20μm厚度，进行免疫荧光染色鉴定类脑发育过程中不同脑区形成及脑皮层神经元的分化；
(3)TUNEL方法检测类脑发育过程中细胞死活状况；
本发明提供一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，不仅适用于hiPSCs来源的类脑构建，也适用于其他不同类型的干细胞(包括胚胎干细胞)来源的类脑构建。
本发明提供一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，不仅适用于类脑发育模型构建，也适用于其他不同类器官的构建，包括肝、肾等类器官。
本发明提供一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，同时可以应用于构建其他细胞(内皮细胞或胶质细胞)与类脑的共培养，更加接近模拟生理状况，优化类脑发育程度。
本发明提供一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，可以应用于建立各种病理模型，研究病理情况下胎儿类脑发育的状况。
附图说明
图1微流控芯片示意图；
图2为图1中微流控芯片的局部放大示意图；
其中：1细胞外基质混悬液入口、2三维通道、3二维灌流通道、4二维培养基通道、5培养液入口、6拟胚体EBs。
图3明场条件下微流控灌流芯片上的类脑发育情况；
图4免疫荧光染色方法分别检测微流控芯片上静态培养和灌流培养条件下类脑中不同脑区的发育情况；
图5免疫荧光染色方法分别检测微流控芯片上静态培养和灌流培养条件下类脑中不同类型的皮层神经元的分化和空间结构。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
HiPSC来源的类脑在微流控芯片上的发育
其步骤主要分为三部分：微流控芯片的制备、拟胚体EBs的形成和类脑在微流控芯片中的发育。
步骤(1)微流控芯片的制备，具体为：微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。然后上下两层聚合物材料经过氧气等离子体处理60秒进行不可逆封接。封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
微流控芯片如图1所示，包括细胞外基质混悬液入口(1)、三维通道(2)、二维灌流通道(3)、二维培养基通道(4)、培养液入口(5)。二维通道(3、4)和三维通道(2)交界处有小柱形状的连通处，可形成二维与三维微环境界面。微流控芯片结构的宽度不等，二维灌流通道(3)和二维培养基通道(4)的宽度都为1mm，三维通道的宽度为2.5mm，所有通道的高度均为600um。微流控芯片结构的局部放大如图2所示。
步骤(2)拟胚体的形成，具体为：使用带有坑状结构的PDMS芯片制备拟胚体：坑状结构的芯片置于24孔板内，小坑结构直径为800μm，深度为300μm，用于拟胚体的形成。第1天，制备拟胚体，将2×105～6×105个hiPSCs消化成单细胞，并转移微流控芯片中，离心800rpm，3min，所用培养基为KSR培养基，并加入5μM Y27632；第2天，将形成的拟胚体转移至低粘附的培养皿中悬浮培养，所用培养基为KSR培养基。第5天，诱导拟胚体向神经上皮方向分化，将KSR培养基替换为神经诱导培养基；拟胚体仍保持悬浮培养。每3天更换一次培养基。
步骤(3)类脑在微流控芯片中的发育，具体为：第11天，使用5mg/ml的Matrigel重悬前期诱导的细胞团，并用100ul的去尖枪头将细胞团注入微流控芯片的三维通道内，整个过程避免产生气泡，确保冰上操作维持低温，保证Matrigel不凝固。将含有细胞团的微流控芯片置于37℃培养箱30-40min，使Matrigel凝固；将含有细胞团的微流控芯片培养基通道内补加培养基，静止培养6-8h，所用培养基为神经分化培养基。之后，在中间二维流体通道中插入一定长度的PTFE管，连接注射器和注射泵，设置流速25ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养。
明场跟踪类脑的发育过程，结果如图3所示，B中Scale bars：100μm；C,D中Scalebars：50μm。结果表明拟胚体在微流控灌流体系下可成功发育成类脑。
实施例2
发育过程中不同脑区相关蛋白的表达。
取在微流控芯片上发育到33天的静态和灌流培养的类脑分别进行冷冻切片，方法如下：4％多聚甲醛进行细胞固定20min，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；30％蔗糖4℃过夜脱水；OCT包埋，室温存放30min，80℃凝固；冷冻切片，厚度为10-20μm，并将其贴附在静电吸附的载玻片上。然后进行免疫荧光染色，方法为：将带有切片的载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5min；0.1％triton X-100致孔剂作用10min，PBS缓冲液冲洗1次，5min；山羊封闭血清室温作用1h；一抗(PAX6，PAX2，NESTIN，TUJ1，SOX2)1:400稀释，4℃过夜孵育，PBS缓冲液冲洗3次。二抗(Fluorescence 488/594标记的山羊抗兔或鼠IgG)1:100稀释，室温孵育1h，PBS缓冲液冲洗3次；冲洗完毕后加入1:4000稀释的DAPI工作液，荧光显微镜下拍照，记录相应蛋白的表达情况，结果如图4所示，Scale bars：50μm。在微流控芯片灌流培养条件下不同脑区的蛋白表达明显高于静态培养条件下的脑区发育，并且形成类似脑室的多分区。结果表明类脑在微流控灌流体系下可进行良好的发育并进行不同脑区的分化表达。
实施例3
发育过程中不同皮层神经元相关蛋白的表达。
取在微流控芯片上发育到33天的静态和灌流培养的类脑分别进行冷冻切片，方法如下：4％多聚甲醛进行细胞固定20min，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；30％蔗糖4℃过夜脱水；OCT包埋，室温存放30min，80℃凝固；冷冻切片，厚度为10-20μm，并将其贴附在静电吸附的载玻片上。然后进行免疫荧光染色，方法为：将带有切片的载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5min；0.1％triton X-100致孔剂作用10min，PBS缓冲液冲洗1次，5min；山羊封闭血清室温作用1h；一抗(TBR1,CTIP2,BRN2)1:400稀释，4℃过夜孵育，PBS缓冲液冲洗3次。二抗(Fluorescence 488/594标记的山羊抗兔或鼠IgG以及Cy3标记的兔抗羊IgG)1:100稀释，室温孵育1h，PBS缓冲液冲洗3次；冲洗完毕后加入1:4000稀释的DAPI工作液，荧光显微镜下拍照，记录相应蛋白的表达情况，结果如图5所示，Scale bars：50μm。在微流控芯片灌流培养条件下不同脑皮层神经元的蛋白表达明显高于静态培养条件下的皮层神经元表达，尤其是在脑发育中后期出现的皮层神经元(CTIP2,BRN2)表达和空间排布有显著差异，各皮层神经元已经出现初步的分离和迁移。结果表明类脑在微流控灌流体系下可进行良好的发育和神经元的成熟、分化、迁移。

Claims (10)

1.一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：
(1)微流控芯片的制备；
(2)拟胚体EBs的形成；
(3)类脑在微流控芯片中的分化和发育。
2.按照权利要求1所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：所述微流控芯片包括：细胞外基质混悬液入口(1)、三维通道(2)、二维灌流通道(3)、二维培养基通道(4)和培养液入口(5)，所述二维灌流通道(3)、二维培养基通道(4)和三维通道(2)交界处有小柱形状的连通处，可用于营养物质传输。
3.按照权利要求2所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：所述微流控芯片结构的宽度不等，二维灌流通道(3)和二维培养基通道(4)的宽度均为0.5mm-1mm，三维通道的宽度为1.5mm-2.5mm。
4.按照权利要求2所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：微流控芯片的所有通道的高度均为600-800um。
5.按照权利要求2所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)微流控芯片的制备方法为：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，然后上下两层聚合物材料经过氧气等离子体处理60-90秒进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。
6.按照权利要求1所述一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：步骤(2)拟胚体EBs的形成，具体步骤为：
(1)选择带有坑状结构的PDMS芯片：将坑状结构的PDMS芯片置于24 孔板内，小坑结构直径为600-800μm，深度为100-300μm，用于EBs的形成；
(2)使用带有坑状结构的PDMS芯片制备EBs：第1天，制备EBs，将2×105～6×105个干细胞消化成单细胞，并转移至步骤(1)所述的芯片中，离心500-800rpm，3-5min，所用培养基为KSR培养基，并加入5μM Y27632和4ng/mlbFGF；
(3)第2天，将形成的EBs转移至低粘附的培养板中，悬浮培养，所用培养基为KSR培养基；
(4)第5天，诱导EBs向神经上皮方向分化，将KSR培养基替换为神经诱导培养基NIM。
7.按照权利要求6所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于使用坑状结构的PDMS芯片制备EBs，其大小可通过小坑直径和深度的变化以及细胞悬液中细胞的数量来调节，所成拟胚体的大小范围约为50-500μm。
8.按照权利要求6所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于制备EBs的干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞及其他多种细胞类型。
9.按照权利要求8所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于所述诱导多能干细胞为人iPSCs细胞。
10.按照权利要求1所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：步骤(3)类脑在微流控芯片中的分化和发育，具体步骤为：
(1)拟胚体EBs在诱导培养基NIM中培养到第11天时，将EBs转移到微流控芯片上，使用浓度为2-10mg/ml的Matrigel重悬EBs，并用100ul的去尖枪头将EBs注入微流控芯片的三维通道内，整个过程避免产生气泡，确保冰上操作维持低温，保证Matrigel不凝固；
(2)将含有EBs的微流控芯片置于37℃培养箱30-40min，使Matrigel凝固；
(3)将含有EBs的微流控芯片培养基通道内补加培养基，静止培养6-8h，所用培养基为神经分化培养基NDM。
(4)灌流操作：含有细胞团的微流控芯片静止培养6-8h后，从培养下取出，在二维灌流通道中插入一定长度的PTFE管，连接注射器和注射泵，设置流速20-40ul/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，继续培养15-30天后，并实时追踪，鉴定发现微流控芯片上的EBs可以进行持续的生长和分化，经鉴定可以形成含有不连续的特定脑区及类似大脑皮层结构的类脑，可模拟早期的脑发育过程。
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