CN105733943A - 基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法 - Google Patents

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秦建华
石杨
张旭
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Abstract

本发明提供了一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，该微流控芯片主要包括凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层，所述气路控制层包括气阀控制口，气阀控制通道，所述流体液路层包括进样口，分液通道，细胞接种室和废液通道；所述凹陷微结构层为含有凹陷结构的凹陷阵列结构，按照以下步骤进行：(1)细胞三维微球的形成,(2)细胞三维微球的释放；(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察。本发明将体外细胞三维培养与操控功能集成到一块几平方厘米的芯片上，可以用于体外组织模拟及后续应用。本发明在微流控技术中可以加入微通道和集成微阀等功能单元，同时对于细胞进行精确控制并实现营养物质交换。

Description

基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法
技术领域
本发明涉及将微流控芯片技术应用到体内组织工程的模拟与应用领域，具体涉及一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法。
背景技术
在体外三维培养的方式中，多细胞微球的方式由于能模拟体内的细胞之间的相互作用和功能近年来得到很高的关注。上世纪90年代发展起来的微流控技术，又被称为芯片实验室。借助该技术，可以以可控的方式构建复杂，动态的细胞微环境，因此被广泛运用于细胞生物学和细胞生物医学研究中。该平台技术也为细胞三维培养和细胞检测提供了新的思路。微流控芯片可以制作微米尺度的结构，可用于细胞微球的形成，同时由于该技术的条件灵活性，可以构建更加贴近生物环境的仿生结构。尽管目前的研究已经报道了在微流控芯片上利用微结构形成细胞微球研究细胞的行为，但是由于三维细胞球的复杂结构，常规的检测方式如荧光显微镜不能精确的分析，有时需要脱离芯片进行三维结构特征的生物学分析，所以在微流控芯片上进行细胞微球的精确控制和释放是迫切需要的。在微流控技术中可以加入微通道和集成微阀等功能单元，同时对于细胞进行精确控制并实现营养物质交换。
发明内容
本发明提供了基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，利用多层微流控芯片，可实现高通量的多尺寸的细胞微球形成，细胞微球的培养和微球的可控释放。该方法既可用于高通量的细胞微球的产生和操控，又有利于细胞的在线和离线检测，为干细胞分化和药物筛选等应用提供了一种新平台。
一种微流控芯片，该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，
所述气路控制层包括气阀控制口，气阀控制通道，所述气阀控制通道2为Z形状，气阀控制口位于气阀控制通道的右侧端，与废液通道同侧；
所述流体液路层包括进样口，分液通道，细胞接种室和废液通道；进样口连接分液通道，分液通道连接细胞接种室，再连接废液通道；
所述凹陷微结构层为含有凹陷结构的凹陷阵列结构；
所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。
所述气阀控制通道高度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。
凹陷结构阵列为8行，凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。
所述微流控芯片凹陷微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。
气路控制层中的气路控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，数量为8个。
一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：
(1)细胞三维微球的形成
将软骨细胞消化后，以6×106cells/mL密度接种入芯片进样口，细胞悬液经过分液通道到达细胞接种室中，恒温培养箱37度中培养24h后，细胞在重力的作用下聚集成球，芯片每天更换培养基；
(2)细胞三维微球的释放
细胞在培养24h后形成细胞微球后，微流控芯片气阀控制通道被连接上了气阀控制器，芯片入口处利用四氟管连接PBS溶液，利用注射泵推动PBS溶液，流速为1μL/h；在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放；
(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察
软骨微球在微流控上芯片培养7天后，统计软骨细胞微球的直径，同时对软骨细胞微球进行了荧光染色分析，考察了软骨细胞微球II型胶原和蛋白多糖的表达。
在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的可控释放。
微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。
所述的细胞表面蛋白表达检测的方法为常规细胞免疫荧光染色。
本发明提供的微流控芯片，在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放。微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。
利用多层微流控芯片，可实现高通量的多尺寸的细胞微球形成，细胞微球的培养和微球的可控释放。本方法可形成了多尺寸的软骨细胞微球，考察了尺寸对于软骨功能的影响。结果显示该体系可以模拟体内细胞三维环境和细胞密度，研究不同尺寸的软骨微球对于软骨表型维持的影响，三维微球结构有利于软骨细胞表型维持，特异性地表达collagenII和aggrecan蛋白。同时，collagenII和aggrecan蛋白表达也与软骨细胞的数量和细胞紧密程度有关，当细胞微球在150-220μm的直径时，collagenII和aggrecan蛋白表达较强，而在细胞紧密程度高时collagenII和aggrecan蛋白表达也较强。该方法既可用于高通量的细胞微球的产生和操控，又有利于细胞的在线和离线检测，为干细胞分化和药物筛选等应用提供了一种新平台。
附图说明
图1本发明微流控芯片整体结构示意；其中a图为微流控芯片的气路层，b为液路层，c为凹陷微结构层，d图为多层微流控芯片整体结构图，其中1为气阀控制口，2为气阀控制通道，3为进样口，4为分液通道，5细胞接种室，6为废液通道，7为凹陷结构阵列，8为凹陷结构。
图2本发明微流控芯片细胞可控释放原理示意图。
图3微流控芯片可控释放细胞微球实物图。
图4软骨细胞在微流控芯片培养7天后的增殖统计图。
图5不同尺寸的软骨细胞微球型Ⅱ胶原蛋白差异
图6不同尺寸的软骨细胞微球型蛋白多糖蛋白差异
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
一种微流控芯片，如图1所示，该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，
所述气路控制层包括气阀控制口1，气阀控制通道2，所述气阀控制通道2为Z形状，气阀控制口1位于气阀控制通道2的右侧端，与废液通道(6)同侧；
所述流体液路层包括进样口3，分液通道4，细胞接种室5和废液通道6；进样口3连接分液通道4，分液通道4连接细胞接种室5，再连接废液通道6；
所述凹陷微结构层为含有凹陷结构8的凹陷阵列结构7；
所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。
所述气阀控制通道高度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。
凹陷结构阵列为8行，凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。
所述微流控芯片凹陷微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。
气路控制层中的气路控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，数量为8个。
一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：
(1)细胞三维微球的形成
将软骨细胞消化后，以6×106cells/mL密度接种入芯片进样口3，细胞悬液经过分液通道4到达细胞接种室5中，恒温培养箱37度中培养24h后，细胞在重力的作用下聚集成球，芯片每天更换培养基；
(2)细胞三维微球的释放
细胞在培养24h后形成细胞微球后，微流控芯片气阀控制通道被连接上了气阀控制器，芯片入口处利用四氟管连接PBS溶液，利用注射泵推动PBS溶液，流速为1μL/h；在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放；
(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察
软骨微球在微流控上芯片培养7天后，统计软骨细胞微球的直径，同时对软骨细胞微球进行了荧光染色分析，考察了软骨细胞微球II型胶原和蛋白多糖的表达。
在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的可控释放。
微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。
所述的细胞表面蛋白表达检测的方法为常规细胞免疫荧光染色。
实施例1
基于微阀可控微流体微流控芯片的微球操控原理及性能评价
在细胞接种和培养过程中，气阀处于关闭状态，液路通道的高度无变化，当需要释放细胞微球时，芯片入口处利用注射泵联通PBS溶液，开启气阀通道，PDMS膜发生弹性形变，液路通道发生改变，通过精确控制气阀的开启和关闭，可以实现细胞微球的可控释放。基于微阀可控流体微流控芯片的微球操控原理及性能评价结果如图2，3所示。从结果可以看出，在气阀关闭状态下，细胞虽然在溶液的水动力的作用下没有任何变化，在气阀开启2s内，在PBS溶液的水动力作用下，细胞微球被释放出来。通过气阀的开启，可以以整排的形式对于在同一阵列控制单元的微球进行可控释放，由于我们设置了20个凹陷微结构的细胞三维微球的阵列，可以满足后续免疫荧光染色和实时定量PCR实验的要求。现有的微流控上形成三维细胞微球多以为微结构为主，而对于微球的释放的报道很少见。本实验采用的方法可以利用简易的方式实现高通量产生三维细胞微球和三维细胞微球的可控释放。
实施例2
微流控芯片可控高通量细胞微球形成
设计并制作了集成微阀特点的微流控芯片，利用凹陷微结构可控形成不同尺寸的软骨细胞微球。软骨细胞在接种后24h可形成三维的微球结构，在微流控芯片上灌流培养7天。我们统计了软骨细胞微球在培养第1，3，5，7天时的直径，统计结果如图4所示。我们设计了深度为400μm，宽度分别为：300，350，400，450，500，550，600，650μm的凹陷结构，发现在特定的接种密度下，形成的微球大小与凹陷结构的宽度成正相关性。在培养3天后，软骨细胞微球会发生一定的球体收缩，球体变得紧致。第3-7天，软骨细胞直径维持稳定。在检测终点，相对于第一天，软骨细胞微球的直径会变小，球体结构会有一点的收缩。结果如图4所示。
实施例3
高通量多尺寸软骨细胞微球的生物功能评价
CollagenII和Aggrecan是软骨组织的特征性标志，同时也是检测软骨细胞表型维持的重要指标。为了考察不同尺寸的软骨细胞微球对于软骨表型维持的影响，细胞微球在微流控芯片上培养7天后，在原位上进行了collagenII和aggrecan的荧光染色，利用DAPI表征了细胞核质，软骨细胞微球的collagenII的蛋白表达如图5所示。从结果可以看出，所有尺寸的软骨细胞微球都表达了collagenII蛋白，宽度为300，600，650μm凹陷结构中的软骨细胞微球表达较低。我们分析，在300μm凹陷结构中形成的软骨细胞微球在125μm左右，细胞数量最少，细胞群体的分泌行为影响了如软骨细胞微球的collagenII蛋白表达，而大尺寸(600，650μm)的凹陷结构由于曲率小的问题，不能形成比较致密的软骨细胞微球，可能由于细胞-细胞的连接影响了软骨细胞微球的collagenII蛋白表达。不同尺寸软骨细胞微球的aggrecan蛋白表达如图6所示。从结果可以看出，所有尺寸的软骨细胞微球都表达了aggrecan蛋白，并显现出和collagenII蛋白表达相同的趋势。

Claims (9)

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，
所述流体液路层包括进样口(3)，分液通道(4)，细胞接种室(5)和废液通道(6)；进样口(3)连接分液通道(4)，分液通道(4)连接细胞接种室(5)，再连接废液通道(6)；
所述气路控制层包括气阀控制口(1)和气阀控制通道(2)，所述气阀控制通道(2)为Z形状，气阀控制口(1)位于气阀控制通道(2)的右侧端，与废液通道(6)同侧；
所述凹陷微结构层为含有凹陷结构(8)的凹陷阵列结构(7)；
所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。
2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述气阀控制通道高度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。
3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：凹陷结构阵列为8行，凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。
4.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片凹陷微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。
5.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：气路控制层中的气路控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，数量为8个。
6.一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，其特征在于采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：
(1)细胞三维微球的形成
将软骨细胞消化后，以6×106cells/mL密度接种入芯片进样口，细胞悬液经过分液通道到达细胞接种室中，恒温培养箱37度中培养24h后，细胞在重力的作用下聚集成球，芯片每天更换培养基；
(2)细胞三维微球的释放
细胞在培养24h后形成细胞微球后，微流控芯片气阀控制通道被连接上了气阀控制器，芯片入口处利用四氟管连接PBS溶液，利用注射泵推动PBS溶液，流速为1μL/h；在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放；
(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察
软骨微球在微流控上芯片培养7天后，统计软骨细胞微球的直径，同时对软骨细胞微球进行了荧光染色分析，考察了软骨细胞微球II型胶原和蛋白多糖的表达。
7.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，其特征在于：在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的可控释放。
8.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，其特征在于：微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。
9.按照权利要求6所述的基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，其特征在于：所述的细胞表面蛋白表达检测的方法为常规细胞免疫荧光染色。
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