CN103361269B - 基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法。该浓度梯度产生器中，由于每个源、漏从微沟道具有独立的废液出口，所以溶液不再回流到源、漏主微沟道，确保主沟道的趋化因子的浓度保持不变，实现大序列细胞定向迁移表征。

Description

基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物信息检测技术领域，尤其涉及一种基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法。

背景技术

细胞的体内生长依赖于其内部复杂的微环境，主要包括与周围细胞、细胞外基质和溶液中的细胞因子的相互作用。其中溶液中的趋化因子浓度梯度已经初步证实在肿瘤细胞的迁移、炎症细胞的定向移动、神经细胞的重构等生理过程中具有重要的调节作用。传统的研究方法如趋化小室技术不能在细胞微环境中产生时空可控的趋化因子浓度梯度，限制其在细胞迁移实验中的应用。

微流控技术又称为“芯片实验室”，是在微观尺寸下控制和检测流体的技术。由于其特征尺寸与细胞大小相匹配，可以实现细胞尺寸下流体的精确控制，产生时空可控的趋化因子浓度梯度。基于微流控技术的浓度梯度产生器为体外生长的细胞提供更加贴近体内的局部微环境，为细胞生物学提供新的研究方法。目前，已经发展出多种基于微流控技术的浓度梯度产生器。

哈佛大学的Whitesides教授于2000年首先提出基于微流控技术的浓度梯度产生器的概念。该课题组利用微尺度条件下流体的低雷诺数特征，以及在蛇形微沟道内的流体混合，设计制造出微尺度下的浓度梯度“圣诞树”结构，表征包括神经细胞、嗜中性粒细胞的趋化特性。由于流体运动会带走细胞生长过程中的内分泌、旁分泌及其他细胞生长代谢的产物，并且会对细胞产生剪切力的作用，所以该器件不适用于对流体应力敏感的细胞类型的趋化特性研究。而且该器件只能在同一实验中产生单一的浓度梯度，不适用于高通量的细胞趋化特性研究。

加州大学的Jeon教授于2008年提出新一代的基于微流控技术的浓度梯度产生器，其中细胞培养小室通过高流阻微沟道(如具有横截面积显著减小的微沟道)分别连接“源微沟道”(输运含有细胞趋化因子的细胞培养液)和“漏微沟道”(输运无细胞趋化因子的细胞培养液)。趋化因子从高浓度的源微沟道经过高流阻微沟道、细胞培养小室、高流阻微沟道扩散到漏微沟道，在细胞培养小室内形成趋化因子的浓度梯度。由于细胞培养小室与源漏微流沟道之间由高流阻微沟道相连接，所以小室中的细胞没有受到流体流动的影响，该结构适用于对流体应力敏感的细胞类型(干细胞、神经细胞和细菌等)的定向迁移研究。但是上述方法基于细胞趋化因子在源微沟道与漏微沟道之间的扩散，所以在下游的细胞培养小室两侧，源微沟道中的细胞趋化因子浓度逐渐下降，漏微沟道的细胞趋化因子浓度逐渐上升，直至达到平衡，浓度梯度消失。所以该技术不能用于无限长的细胞培养小室，不能实现高通量的细胞迁移表征。

威斯康辛大学的Beebe教授于2010年提出一种基于微流控技术的大序列浓度梯度产生器。该大序列浓度梯度产生器中，每一个功能单元由“源”储液池(含有细胞趋化因子的细胞培养液)、“漏”储液池(无细胞趋化因子的细胞培养液)和之间的桥型微沟道(浓度梯度区域)组成。该设计通过提高流阻减小甚至消除桥型微沟道中的流体运动，仅仅依靠物质扩散产生浓度梯度。通过调整“源”储液池和“漏”储液池中的细胞趋化因子浓度，该方法可以形成大序列的浓度梯度。但是该技术需要实时补充“源”储液池和“漏”储液池中的趋化因子，所产生的浓度梯度易受到细胞培养溶液蒸发等因素的影响，不能长时间的保持稳定的浓度梯度，限制其在高通量细胞定向迁移领域中的应用。

在实现本发明的过程中，申请人发现现有的浓度梯度产生器存在如下缺陷：不能高通量实现无流体应力影响下细胞定向迁移领域的相关研究。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于上述技术问题，本发明提供了一种基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法，以尽可能提高细胞迁移实验通量、提升细胞培养小室内趋化因子浓度的稳定性以及解决浓度梯度环境下的流体应力问题。

(二)技术方案

根据本发明的一个方面，提供了一种基于微流控技术的浓度梯度产生器。该浓度梯度产生器包括：源主微沟道、漏主微沟道、若干个细胞培养单元，和废液排出口。其中，源主微沟道，用于输运含有细胞趋化因子的细胞培养液。漏主微沟道，用于输运无细胞趋化因子的细胞培养液。若干个细胞培养单元，分别与源主微沟道和漏主微沟道相连通，其中，每一细胞培养单元包括：源从微沟道，与源主微沟道相连通，具有废液排出口；漏从微沟道，与漏主微沟道相连通，具有废液排出口；细胞培养小室，通过若干条的源高流阻微沟道与源从微沟道相连通，通过若干条的漏高流阻微沟道与漏从微沟道相连通。废液排出层，位于源主微沟道、漏主微沟道和若干个细胞培养单元所在平面的上方，与源从微沟道和漏从微沟道的废液排出口相连通。源主微沟道中含有细胞趋化因子的细胞培养液进入源从微沟道，通过源高流阻微沟道与细胞培养小室中的细胞培养液进行趋化因子的扩散，而后由源从微沟道的废液排出口排出至废液排出层；漏主微沟道中未含有细胞趋化因子的细胞培养液进入漏从微沟道，通过漏高流阻微沟道与细胞培养小室中的细胞培养液进行趋化因子的扩散，而后由漏从微沟道的废液排出口排出至废液排出层。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种制备方法，用于制备上述的基于微流控技术的浓度梯度产生器，包括：步骤A，浓度梯度产生器主模；步骤B，制作废液通道层主模；步骤C，在浓度梯度产生器主模和废液通道层主模浇注聚合物材料，固化后翻模得到浓度梯度产生器翻模和废液通道层翻模；步骤D，在浓度梯度产生器翻模制作细胞注入口、细胞培养小室出口、源主微沟道入口、源主微沟道出口、源从微沟道废液出口、漏主微沟道入口、漏主微沟道出口和漏从微沟道废液出口，在废液通道层翻模制作废液出口；以及步骤E，将浓度梯度产生器翻模与衬底键合封接，将废液通道层翻模与浓度梯度产生器键合封接，从而完成基于微流控技术的浓度梯度产生器。

(三)有益效果

从上述技术方案可以看出，本发明基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法具有以下有益效果：

(1)由于均具有相应的废液排出口，因此源主微沟道和漏主微沟道中趋化因子的浓度均不变，从而能够保持细胞培养小室中趋化因子浓度的稳定；

(2)由于每个浓度梯度产生单元具有独立的细胞培养小室，细胞培养小室通过高流阻微沟道与源/漏从微沟道连接，高流阻微沟道的数目和长度会显著影响细胞培养小室的浓度梯度，所以，可以通过调整高流阻微沟道的数目和长度产生浓度梯度序列，从而实现高通量的浓度梯度序列，用于细胞分析和研究；

(3)细胞培养小室内浓度梯度的形成是基于细胞趋化因子的扩散，不会引起细胞培养小室内流体的运动，从而消除细胞培养过程中流体应力对细胞产生的不利影响；

(3)基于微流控技术的高通量浓度梯度产生器能够在细胞培养小室内精确产生时空可调的浓度梯度，达到0.11mol/m⁴-2.00mol/m⁴，有助于细胞生长微环境体外重建；

(4)基于微流控技术的高通量浓度梯度产生器样品消耗在微升量级，节约样品；

(5)选取载玻片和PDMS(聚二甲基硅氧烷)等低成本材料进行加工，可以有效降低成本。

附图说明

图1为本发明实施例基于微流控技术的浓度梯度产生器横切面的示意图；

图2为图1所示浓度梯度产生器中浓度梯度产生单元横切面的放大图；

图3A为细胞培养小室内浓度梯度G与高流阻微沟道数目N的关系示意图；

图3B为细胞培养小室内浓度梯度G与高流阻微沟道长度D的关系示意图；

图4A为利用图1所示浓度梯度产生器进行细胞注入和培养实验时，细胞注入和培养机制示意图；

图4B为利用图1所示浓度梯度产生器进行细胞迁移和分析实验时，细胞趋化因子浓度梯度建立和细胞迁移机制示意图；

图5为本发明实施例基于微流控技术的浓度梯度产生器制备方法的流程图；

图6A为图5所示制备方法中制备梯度产生器微沟道层主模的示意图；

图6B为图5所示制备方法中制备废液通道层主模的示意图；

图6C为图5所示制备方法中高通量浓度梯度产生器的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。此外，以下实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向。因此，使用的方向用语是用来说明并非用来限制本发明。

在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种基于微流控技术的浓度梯度产生器。图1为本发明实施例浓度梯度产生器横切面的示意图。如图1所示，该浓度梯度产生器包括：源主微沟道、漏主微沟道、若干个细胞培养单元和废液排出层。其中，源主微沟道用于输运含有细胞趋化因子的细胞培养液。漏主微沟道用于输运无细胞趋化因子的细胞培养液。对于该若干个细胞培养单元中的每一个细胞培养单元，均包括：源从微沟道、源高流阻微沟道、细胞培养小室、漏高流阻微沟道、漏从微沟道。废液排出层位于所述源主微沟道、漏主微沟道和若干个细胞培养单元所在平面的上方或下方，与源从微沟道和漏从微沟道的废液排出口相连通。

源主微沟道中含有细胞趋化因子的细胞培养液进入源从微沟道，通过源高流阻微沟道与细胞培养小室中的细胞培养液进行趋化因子的扩散，而后由源从微沟道的废液排出口排出；漏主微沟道中未含有细胞趋化因子的细胞培养液进入漏从微沟道，通过漏高流阻微沟道与细胞培养小室中的细胞培养液进行趋化因子的扩散，而后由漏从微沟道的废液排出口排出。

本实施例浓度梯度产生器中，源从微沟道具有相应的废液排出口，进行了细胞趋化因子扩散的细胞培养液不再流回源主微沟道，从而保证了源主微沟道中细胞培养液中趋化因子的浓度不变。同理，漏从微沟道具有相应的废液排出口，进行了细胞趋化因子扩散的细胞培养液不再流回漏主微沟道，从而保证了漏主微沟道中细胞培养液中趋化因子的浓度不变。源主微沟道和漏主微沟道中趋化因子的浓度均不变，从而能够保持细胞培养小室中趋化因子浓度的稳定。

以下分别对本实施例浓度梯度产生器的各个组成部分进行详细说明。

请参照图1，源/漏主微沟道的剖面为矩形的微沟道，其中，该矩形的宽度为500μm，高度为100μm。细胞培养小室的长度和宽度均为1mm，其高度为100μm。

图2为图1所示浓度梯度产生器中细胞培养单元的放大图。请参照图2，源从微沟道呈矩形框结构，宽度为100μm，高度为100μm。其中，矩形框上边的上端连接至源主微沟道，矩形框下边的上端连接至其废液排出口，矩形框下边的下端通过若干条的源高流阻微沟道连接至细胞培养小室。

同理，漏从微沟道也呈矩形框结构，其中，矩形框下边的下端连接至漏主微沟道，矩形框上边的下端连接至其废液排出口，矩形框上边的上端通过漏高流阻微沟道连接至细胞培养小室。

本领域技术人员应当清楚，源/漏从微沟道还可以为其他形状的封闭框状结构，例如，椭圆形封闭框等。

本实施例中，由于源主微沟道、漏主微沟道均是通过注射泵注入细胞培养液，因此，废液排出层位于所述源主微沟道、漏主微沟道和若干个细胞培养单元所在平面的上方。但本领域技术人员应当清楚，该废液排出层也可以位于所述源主微沟道、漏主微沟道和若干个细胞培养单元所在平面的下方。

本实施例中，浓度梯度产生器共有75个细胞培养小室。单个细胞培养小室的尺寸是(1mm×1mm)；细胞培养小室的高度为100μm。

每个细胞培养小室中趋化因子的浓度梯度与源/漏高流阻微沟道的数量N和长度D相关。对于一细胞培养小室而言，D1＝D1’，N1＝N1’，其中，D1和N1分别为细胞培养小室与源从微沟道之间的源高流阻微沟道的长度和数目，D1’和N1’分别为细胞培养小室与漏从微沟道之间的漏高流阻微沟道的长度和数目。

每个高流阻微沟道宽度L为5μm，高度H为10μm，高流阻微沟道数目N和长度D根据趋化因子浓度梯度要求进行调节，其中，长度D在20μm～100μm之间可变，其数目在10～100之间变化。

本实施例中，根据高流阻微沟道的尺寸参数，分为15组浓度梯度的细胞培养单元。每组5个浓度梯度产生单元的高流阻微沟道数量N和长度D相同，具有相同的浓度梯度；两组之间的浓度梯度产生单元的高流阻微沟道的数量N或者长度D不同，形成不同的浓度梯度。在同一实验条件下，可以同时产生15种不同的浓度梯度，实现高通量的细胞定向迁移的分析和研究。

图3A是细胞培养小室内浓度梯度G与高流阻微沟道数目N的关系示意图。其中高流阻微沟道长度D为100μm，通过调整高流阻微沟道数目N产生的浓度梯度序列为：

G₁＝2.00mol/m⁴(N＝10，D＝100μm)；

G₂＝1.70mol/m⁴(N＝20，D＝100μm)；

G₃＝1.55mol/m⁴(N＝30，D＝100μm)；

G₄＝1.35mol/m⁴(N＝40，D＝100μm)；

G₅＝1.25mol/m⁴(N＝50，D＝100μm)；

G₆＝1.15mol/m⁴(N＝60，D＝100μm)；

G₇＝1.00mol/m⁴(N＝80，D＝100μm)；

G₈＝0.85mol/m⁴(N＝90，D＝100μm)。

图3B是细胞培养小室内浓度梯度G与高流阻微沟道长度D的关系示意图。其中高流阻微沟道数目N为100，通过调整高流阻微沟道长度D产生的浓度梯度序列为：

G₉＝0.75mol/m⁴(N＝100，D＝90μm)；

G₁₀＝0.60mol/m⁴(N＝100，D＝70μm)；

G₁₁＝0.53mol/m⁴(N＝100，D＝60μm)；

G₁₂＝0.43mol/m⁴(N＝100，D＝50μm)；

G₁₃＝0.33mol/m⁴(N＝100，D＝40μm)；

G₁₄＝0.23mol/m⁴(N＝100，D＝30μm)；

G₁₅＝0.11mol/m⁴(N＝100，D＝20μm)。

本实施例浓度梯度产生器采用浇注方式完成，其材料为聚二甲基硅氧烷。本领域技术人员应当清楚，浓度梯度产生器的材料还可以为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等其他有机聚合物。

以下介绍本实施例浓度梯度产生器的工作过程。本实施例浓度梯度产生器的工作过程包括：

细胞注入和培养：请参照图4A，使用注射泵以20μl/min的流速从源漏主微沟道和细胞培养小室入口注入细胞培养液，填充高通量浓度梯度产生器。然后将废液通道层废液出口、细胞培养小室入口、细胞培养小室出口和源/漏主微沟道出口封堵，使用注射泵以10μl/min的流速从源/漏主微沟道注入细胞培养液，排除高通量浓度梯度产生器内部的气泡。待高通量浓度梯度产生器内部气泡排除干净后，将高通量浓度梯度产生器放置在培养箱中静置1小时，为接种细胞提供一个相对稳定的微环境。打开细胞培养小室入口和细胞培养小室出口，将源/漏主从微沟道封堵，注射泵以1μl/min的流速将到含有细胞的培培养液(细胞浓度5×10⁵个/毫升)注射进入细胞培养小室。芯片放入细胞培养箱中培养细胞12小时。

细胞趋化因子浓度梯度建立和细胞迁移：请参照图4B，封堵细胞培养小室入口和出口，打开源/漏主从微沟道和废液通道出口，持续注入含有细胞趋化因子和无细胞趋化因子的细胞培养液，在细胞培养小室内建立趋化因子的浓度梯度，在趋化因子浓度梯度下培养细胞，观察细胞的定向迁移情况(图6.B)。

在进行完上述步骤之后，即利用摄像头采集细胞培养单元中细胞在给定浓度梯度条件下的定向迁移信息。

本实施例浓度梯度产生器可以在单一芯片上实现5组15种不同细胞趋化因子浓度梯度下的细胞定向迁移实验，总计实现75组相关实验，降低实验强度，提高实验的通量，达到高通量的技术要求。

至此，已经结合附图对本实施例旋进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明浓度梯度产生器有了清楚的认识。

在本发明的另一个示例性实施例中，还提供了一种上述浓度梯度产生器的制备方法。请参照图5，该制备方法包括：

步骤A，浓度梯度产生器主模；

该制作浓度梯度产生器主模的步骤A又可以包括：

子步骤A1，载玻片(75mm长、25mm宽和1mm厚)在丙酮、乙醇和去离子水中清洗，烘干(150℃，30分钟)，均匀溅射一层铬(300nm厚)，曝光(15mW/cm²，3.8秒)，显影(40秒)，制作后续工艺的对准标记，如图6A中子图A-1所示；

子步骤A2，在对准标记表面均匀旋转涂敷一层SU-85(1500RPM，35秒)，前烘(65℃，2分钟；95℃，5分钟)，曝光(15mW/cm²，5秒)，不显影，后烘(65℃，1分钟；95℃，1分钟)，形成源/漏高流阻微沟道，如图6A中子图A-2所示；

子步骤A3，再均匀旋转涂敷一层SU-82100(3000RPM，35秒)，前烘(65℃，5分钟；95℃，20分钟)，对准曝光(15mW/cm²，11.4秒)，后烘(65℃，3分钟；95℃，10分钟)，不显影，形成细胞培养小室、源主微沟道、源从微沟道、漏主微沟道、漏从微沟道的主模，如图6A中子图A-3所示；

子步骤A4，再均匀旋转涂敷一层SU-82100(1500RPM，35秒)，前烘(65℃，7分钟；95℃，60分钟)，对准曝光(15mW/cm²，25秒)，后烘(65℃，3分钟；95℃，20分钟)，形成源/漏从微沟道废液出口主模，如图6A中子图A-4所示；

子步骤A5，显影(10分钟)，竖膜(175℃，2小时)，得到浓度梯度产生器主模，如图6A中子图A-5所示。

步骤B，制作废液通道层主模；

该制作废液通道层主模的步骤B又可以包括：

子步骤B1，取载玻片(75mm长、25mm宽和1mm厚)在丙酮、乙醇和去离子水中清洗，烘干(150℃，30分钟)，均匀旋转涂覆一层SU-82100(1500RPM，35秒)，如图6B中子图B-1所示；

子步骤B2，曝光(15mW/cm²，25秒)，后烘(65℃，3分钟；95℃，20分钟)，形成废液通道层，显影(8分钟)，竖膜(175℃，2小时)，形成废液通道层主模，如图6B中子图B-2所示。

步骤C，制作高通量浓度梯度产生器；

子步骤C1，在废液通道层主模浇注聚二甲基硅氧烷预聚体和固化剂(12:1)，固化(70℃，10小时)，如图6C中子图C-1所示

子步骤C2，翻模得到废液通道层的PDMS翻模，如图6C中子图C-2所示；

子步骤C3，在浓度梯度产生器微沟道层主模浇注聚二甲基硅氧烷预聚体和固化剂(12:1)，固化(70℃，10小时)，如图6C中子图C-3所示。

子步骤C4，将废液通道层的PDMS翻模与未翻模的浓度梯度产生器微沟道层键合封接，翻模后得到浓度梯度产生器PDMS翻模，使用打孔器(外径1.5mm，内径0.9mm)在浓度梯度产生器的PDMS翻模制作细胞注入口、细胞培养小室出口、源主微沟道入口、源主微沟道出口、源从微沟道废液出口、漏主微沟道入口、漏主微沟道出口和漏从微沟道废液出口，在废液通道层的PDMS翻模制作废液出口，如图6C中子图C-4所示。

子步骤C5，将打孔完毕的高通量浓度梯度产生器的PDMS翻模与载玻片键合封接，得到高通量浓度梯度产生器，完成基于微流控技术的高通量浓度梯度产生器的制作，如图6C中子图C-5所示。

至此，已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明浓度梯度产生器制备方法有了清楚的认识。

此外，上述对各元件的定义并不仅限于实施方式中提到的各种具体结构或形状，本领域的普通技术人员可对其进行简单地熟知地替换，例如：

(1)源/漏主微沟道剖面矩形的宽度应当介于数百微米至数个毫米之内，高度应当介于数十微米至数百微米之内；高流阻微沟道的高度可以在数微米至数十微米之间。

(2)高流阻微沟道的形状并不仅仅局限于矩形结构，可以对其进行必要的变形，例如曲线形沟道和圆形沟道等，还可以其他不规则的微沟道形式。

综上所述，本发明提供一种基于微流控技术的浓度梯度产生器及其制备方法。该浓度梯度产生器中，由于每个源、漏从微沟道具有独立的废液出口，所以溶液不再回流到源、漏主微沟道，确保主沟道的趋化因子的浓度保持不变，实现大序列细胞定向迁移表征。与传统的浓度梯度产生器相比，本发明具有高通量的优势，即在一组试验中，能够同时表征待测细胞在多组浓度梯度作用下的迁移响应，推动生物细胞在浓度梯度作用下的定向迁移领域的研究。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于微流控技术的浓度梯度产生器，其特征在于，包括：

源主微沟道，用于输运含有细胞趋化因子的细胞培养液；

漏主微沟道，用于输运无细胞趋化因子的细胞培养液；

若干个细胞培养单元，分别与所述源主微沟道和漏主微沟道相连通，其中，每一细胞培养单元包括：

源从微沟道，与所述源主微沟道相连通，具有废液排出口；

漏从微沟道，与所述漏主微沟道相连通，具有废液排出口；

细胞培养小室，通过若干条的源高流阻微沟道与所述源从微沟道相连通，通过若干条的漏高流阻微沟道与所述漏从微沟道相连通；

其中，所述源从微沟道和漏从微沟道呈封闭框状结构；对于所述源从微沟道，封闭框状结构的源从微沟道上边的上端连接至所述源主微沟道，下边的上端连接至其废液排出口，下边的下端通过若干条的源高流阻微沟道连接至所述细胞培养小室；对于所述漏从微沟道，封闭框状结构的漏从微沟道下边的下端连接至所述漏主微沟道，上边的下端连接至其废液排出口，上边的上端通过若干条的漏高流阻微沟道连接至所述细胞培养小室；

废液排出层，位于所述源主微沟道、漏主微沟道和若干个细胞培养单元所在平面的上方，与源从微沟道和漏从微沟道的废液排出口相连通；

其中，所述源主微沟道中含有细胞趋化因子的细胞培养液进入所述源从微沟道，通过所述源高流阻微沟道与所述细胞培养小室中的细胞培养液进行趋化因子的扩散，而后由所述源从微沟道的废液排出口排出至所述废液排出层；所述漏主微沟道中未含有细胞趋化因子的细胞培养液进入所述漏从微沟道，通过所述漏高流阻微沟道与所述细胞培养小室中的细胞培养液进行趋化因子的扩散，而后由所述漏从微沟道的废液排出口排出至所述废液排出层。

2.根据权利要求1所述的浓度梯度产生器，其特征在于，所述封闭框状结构为矩形框状结构，其长度、宽度和高度均为100μm。

3.根据权利要求1所述的浓度梯度产生器，其特征在于，通过改变不同细胞培养单元中所述源高流阻微沟道和漏高阻微沟道的数目和尺寸来实现不同细胞培养单元中细胞培养小室细胞趋化因子浓度的梯度变化。

4.根据权利要求3所述的浓度梯度产生器，其特征在于，所述源高流阻微沟道和漏高流阻微沟道的宽度为5μm，高度为10μm，长度D在20μm～100μm之间可变，数目在10～100之间变化。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的浓度梯度产生器，其特征在于：

所述细胞培养小室的长度和宽度均为1mm，其高度为100μm；

所述源主微沟道和漏主微沟道的纵切面均为矩形，其宽度为500μm，高度为100μm。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的浓度梯度产生器，其特征在于，相邻细胞培养单元的细胞培养小室通过微沟道相互连通。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的浓度梯度产生器，其特征在于，该浓度梯度产生器的材料为以下材料中的一种：聚二甲基硅氧烷预聚体、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯。

8.一种制备方法，用于制备权利要求1至7中任一项所述的基于微流控技术的浓度梯度产生器，其特征在于，包括：

步骤A，制作浓度梯度产生器主模，包括：

子步骤A1，在载玻片上均匀旋转涂覆一层正性光刻胶，曝光显影，表面溅射一层铬，制作后续工艺的对准标记；

子步骤A2，在对准标记表面均匀旋转涂敷一层负性光刻胶，对准曝光，但不显影，形成源/漏高流阻微沟道的主模；

子步骤A3，再均匀旋转涂敷一层负性光刻胶，对准曝光，但不显影，形成细胞培养小室、源主微沟道、源从微沟道、漏主微沟道、漏从微沟道的主模；

子步骤A4，再均匀旋转涂敷一层负性光刻胶，对准曝光，形成源/漏从微沟道废液出口；

子步骤A5，显影、竖膜，得到所述浓度梯度产生器主模；

步骤B，制作废液通道层主模，包括：

子步骤B1，在载玻片上均匀旋转涂覆一层负性光刻胶；

子步骤B2，曝光、显影和竖膜，形成所述废液通道层主模；

步骤C，在所述浓度梯度产生器主模和废液通道层主模浇注聚合物材料，固化后翻模得到浓度梯度产生器翻模和废液通道层翻模；

步骤D，在所述浓度梯度产生器翻模制作细胞注入口、细胞培养小室出口、源主微沟道入口、源主微沟道出口、源从微沟道废液出口、漏主微沟道入口、漏主微沟道出口和漏从微沟道废液出口，在所述废液通道层翻模制作废液出口；

步骤E，将所述浓度梯度产生器翻模与衬底键合封接，将所述废液通道层翻模与浓度梯度产生器键合封接，从而完成所述基于微流控技术的浓度梯度产生器的制作。