CN103789206A - 基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法 - Google Patents

基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。该成骨细胞电刺激系统包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准微沟道的中部；两弹性密封塞，分别塞住微沟道的入口和出口；以及电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过两弹性密封塞后伸入微沟道内的细胞培养基液面下。本发明成骨细胞电刺激系统可以实现单个成骨细胞的分析，评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果。

Description

基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法
技术领域
本发明涉及细胞体外微环境重建技术领域，尤其涉及一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。
背景技术
骨不愈合或延迟愈合是骨折后的严重并发症，骨形成障碍是其主要原因之一。骨形成是一个复杂现象，是指间充质成骨细胞祖细胞通过募集和复制，进一步分化为前成骨细胞及成熟成骨细胞，最终导致细胞外基质的积聚和矿化的过程。在此过程中成骨细胞起了关键作用，因此研究如何促进成骨细胞的增殖是十分重要的。
近年来，很多学者证实多种刺激方法均可促进成骨细胞的增殖，如电、微波振动、冲击波、磁场作用等。其中，电刺激方法的刺激来源更容易得到，而且已经有许多实验结果证明电刺激可明显促进成骨细胞的增殖及分化，对促进骨愈合的研究有重要作用，因此成骨细胞的电刺激研究是十分必要的。
明斯特大学的Wiesmann教授于2000年证实了电刺激能够促进成骨细胞的生物矿化过程(biomineralization process)。成骨细胞接受电刺激后，矿物质分泌过程明显加强。首尔大学的In Sook Kim等人于2005年研究调查两相电流刺激对鼠颅盖骨的成骨细胞增殖、分化、合成细胞因子的影响。在此研究中，给予成骨细胞1.5μA/cm2、3000Hz的电刺激。结果表明持续电刺激后成骨细胞增殖31％，而间断电刺激没有明显变化。实时监测RT-PCR和ELISA表明血管内皮生长因子(VEGF)于电刺激后明显上调。从而得出结论两相电流刺激可促进细胞增殖，诱导VEGF的产生。该项研究证实了电刺激的有效性。曼彻斯特大学的Griffin教授于2010年利用一种电刺激装置，采用不同的电信号对成骨细胞产生电刺激，证实了不同电信号对成骨细胞的增殖和矿化过程具有不同程度的促进作用。
上述几个发现和结论均通过宏观实验获得，并不能准确评估电刺激对成骨细胞的影响效果，而且电刺激促进成骨细胞增殖的机制尚不完全明确，这也限制了对成骨细胞电刺激影响的进一步研究。
微流控技术又称为“芯片实验室”，是在微观尺寸下控制和检测流体的技术。由于其具有通道尺寸与人体细胞大小相匹配，网络结构与生理状态下细胞的空间特征相接近以及多种单元灵活组合等优点已经广泛用于细胞生物学研究。通过微流控技术研究电成骨细胞更接近于生理状态，更有利于揭示电刺激对成骨细胞的影响及潜在机制。基于微流控技术的成骨细胞电刺激方法为体外生长的细胞提供更加贴近体内的局部微环境，为细胞生物学提供新的研究方法。
东京大学的Kihoon Jang等人于2007年提出一种用于药物筛选的成骨细胞3D微流控芯片。该微流控芯片的微通道呈线形，长6cm，宽200μm，深100μm，每个通道的有效区为0.31cm2。通过此系统用很少量的细胞即获得了预期的实验结果。该研究说明了通过微流控技术研究成骨细胞的可行性。布朗大学的Ercan教授于2009年提出一种在微纳米管内实现成骨细胞电刺激的方法。该方法中，在微纳米管表面镀一层经过阳极化处理的金属钛，连接信号源后给予管内的成骨细胞电刺激。该研究可以说明在该条件下电刺激对成骨细胞行为的影响。
尽管已经有不少学者通过微流控技术对成骨细胞实施刺激并观察细胞反应，但这些实验与方法均无法对单个成骨细胞进行分析，也无法准确评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题，本发明提供了一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。
(二)技术方案
本发明基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准微沟道的中部；两弹性密封塞，分别塞住微沟道的入口和出口；电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过两弹性密封塞后伸入微沟道内的细胞培养基液面下。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述成骨细胞电刺激系统的操作方法。该操作方法包括：步骤S102，对微流控芯片进行灭菌消毒；
步骤S104，将经过灭菌的微流控芯片置于培养皿内，用移液枪将细胞培养基和成骨细胞分别注入微沟道；步骤S106，封堵微流控芯片上微沟道的入口和出口，为成骨细胞培养提供培养环境，将成骨细胞培养至贴壁；以及步骤S108，在微流体沟道入口及出口分别插入电极，确保连接紧密后，连接并打开电刺激信号源，给予相应电刺激。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统具有以下有益效果：
(1)可以实现单个成骨细胞的分析，评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果；
(2)由于在细胞培养及观察过程中，入口及出口均保持密闭，可有效减少液面的波动，为成骨细胞的培养提供稳定的外部环境，从而消除细胞培养过程中流体应力对细胞产生的不利影响；
(3)由于电刺激由信号源通过电极导线提供，可以根据需要提供不同电压、电流及不同类型的电刺激；
(4)基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统样品消耗在微升量级，节约样品；
(5)选取载玻片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等低成本材料进行加工，可以有效降低成本。
附图说明
图1为根据本发明实施例基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统的示意图；
图2为图1所示成骨细胞电刺激系统中微流控芯片制备方法的流程图；
图3A为图2所示制备方法中制备微流控芯片前期各步骤的示意图；
图3B为图2所示制备方法中制备微流控芯片后期各步骤的示意图；
图4为根据本发明实施例成骨细胞电刺激系统操作方法的流程图；
图5A为利用图1所示成骨细胞电刺激系统进行细胞注入步骤时，细胞注入机制示意图；
图5B为利用图1所示成骨细胞电刺激系统进行细胞培养步骤时，细胞培养机制示意图。
【主要元件】
1-电刺激信号源；   2-电极导线；
3、4-弹性密封塞；  5-微沟道；
6-电极；           7-载玻片；
8-成骨细胞；       9-移液枪头；
10-聚四氟乙烯管。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。
本发明将电刺激方法与微流控技术相结合，研究电刺激对成骨细胞的影响，用较少剂量的试剂及细胞即可获得更贴近成骨细胞真实生理状态下的结果。
在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统。图1为根据本发明实施例基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统示意图。请参照图1，本实施例基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道5，该微沟道的两端分别设置入口和出口，其中，该微沟道的直径或等效直径介于50μm～1000μm之间；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准微沟道的中部；两弹性密封塞(3、4)，分别塞住微沟道的入口和出口；电刺激信号源1，用于提供电刺激信号，其两电极6分别穿过两弹性密封塞(3、4)后伸入微沟道内的细胞培养基液面下。
以下分别对本实施例基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统的各个组成部分进行详细说明。
电刺激信号源为NS公司的WF1974型信号发生器。对微流控芯片内成骨细胞施加的电刺激由电刺激信号源通过电极导线提供，可以根据需要提供不同电压、电流及不同类型的电刺激，研究成骨细胞在不同程度电刺激下的反应。
本实施例中，电极采用银电极，按照出口、入口深度设置电极长度，于电极末端以塑胶管加粗，使其能与微沟道的入口及出口的弹性密封塞(3、4)紧密结合，防止微沟道内的细胞培养基振荡，为细胞培养与电刺激实验提供稳定的环境。
弹性密封塞与微沟道入口和出口的尺寸相匹配，其材料可以选用橡胶等材料。通过弹性密封塞将微沟道的入口及出口密闭，可有效减少液面的波动，为成骨细胞的培养提供稳定的外部环境，从而消除细胞培养过程中流体应力对细胞产生的不利影响。
请参照图1，微沟道5的横截面呈矩形，该微沟道的长度为13mm、宽度为800μm、高度为100μm。本领域技术人员应当清楚，微流体沟道的横截面还可以为其他形状的结构，例如，圆形、椭圆形结构等。
本实施例中，倒置显微镜为OLYMPUS公司的IX71型生物倒置显微镜，可以在明场和相差模式下观察成骨细胞的状态，也可以观察细胞的荧光染色结果。
本实施例中，微流控芯片包括：其下方具有微槽道的有机聚合物盖片以及位于该有机聚合物盖片下方的载玻片，该微槽道与位于其下方的载玻片部分构成上述微沟道。盖片采用浇注方式完成，其材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。本领域技术人员应当清楚，该盖片的材料还可以为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等其他有机聚合物。选取载玻片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等低成本材料进行加工，可以有效降低成本。
在本发明的另一个示例性实施例中，还提供了一种基于微流控技术的微流控芯片的制备方法。图2为图1所示成骨细胞电刺激系统中微流控芯片制备方法的流程图。请参照图2，该制备方法包括：
步骤A，制作微流控芯片主模；
该制作微流控芯片主模的步骤A又可以包括：
子步骤A1，将载玻片分别在丙酮中超声清洗(40W，3分钟)、乙醇中超声清洗(40W，3分钟)和去离子水中超声清洗(40W，3分钟)，然后将载玻片置于热板上烘干(150℃，30分钟)，如图3A中子图A-1所示；
子步骤A2，在载玻片表面均匀旋转涂敷一层SU-85光刻胶(1500RPM，35秒)，然后进行前烘(65℃，2分钟；95℃，5分钟)、曝光(15mW/cm2，5秒)及后烘(65℃，1分钟；95℃，1分钟)，如图3A中子图A-2所示；
子步骤A3，在子步骤A2得到的载玻片表面继续均匀旋转涂敷一层SU-82100(3000RPM，35秒)，然后进行前烘(65℃，5分钟；95℃，20分钟)、曝光(15mW/cm2，11.4秒)及后烘(65℃，3分钟；95℃，10分钟)，如图3A中子图A-3所示；
子步骤A4，使用SU-8显影液对子步骤A3得到的载玻片作显影处理，显影完成后将载玻片置于热板上竖膜(175℃，2小时)，得到微流控芯片主模，如图3A中子图A-4所示。
步骤B，利用微流控芯片主模采用模塑法制作具有微沟道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)盖片，该过程包括：
子步骤B1，对步骤A得到的微流控芯片主模浇注体积比为12：1的聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚体和固化剂，固化(70℃，10小时)，如图3B中子图B-1所示；
子步骤B2，翻模得到表面具有微沟道的PDMS盖片，如图3B中子图B-2所示；
子步骤B3，使用打孔器(外径1.5mm，内径0.9mm)在子步骤B2得到的PDMS盖片制作微沟道入口、出口，如图3B中子图B-3所示；
步骤C，将打孔完毕的PDMS盖片与载玻片键合封接，完成微流控芯片的制作，如图3B中子图B-4所示。
至此，本实施例基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统介绍完毕。
以下给出利用上述基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统进行成骨细胞电刺激实验的方法。图4为根据本发明实施例成骨细胞电刺激系统操作方法的流程图。请参照图4，该操作方法包括：
步骤S102，利用紫外光对微流控芯片进行灭菌消毒，一般情况下，该灭菌消毒的时间应当大于12小时；
步骤S104，将经过灭菌的微流控芯片置于培养皿内，用移液枪(100μl)将0.1mg/mL的多聚赖氨酸(polylysine，PLL)溶液和成骨细胞分别注入微沟道；
请参照图5A，移液过程中，200μl移液枪头9插入微沟道的入口；聚四氟乙烯管10接头(长1cm，外径2.5mm，内径2mm)插入可扩张的硅胶管(长5cm，外径2.5mm，内径2mm)，然后插入微沟道的出口，通过移液枪注入细胞培养基及成骨细胞。
请参照图5B，本实施例中，用移液枪将细胞培养基和成骨细胞注入微沟道后，再采用弹性密封塞塞住入口，出口端的聚四氟乙烯管夹紧，防止微沟道内的成骨细胞培养液振荡，为细胞培养提供稳定的环境，同时修饰微沟道表面，避免微流体沟道内产生气泡；
该步骤S104具体包括：
子步骤S104a，在室温条件下，用移液枪将0.1mg/ml的PLL溶液注入微沟道，静置1小时后，再用移液枪吸走微沟道内的PLL溶液，再将芯片于室温条件下静置6-8小时；
子步骤S104b，用移液枪将细胞培养基从微沟道的入口底部缓慢注入微沟道内，防止气泡形成；
子步骤S104c，将芯片放在显微镜下观察，确认微沟道内是否存在气泡，若存在，可轻轻按压芯片，直至微沟道内的气泡完全消失；
子步骤S104d，芯片置于细胞培养箱(37℃)中预热1小时；
子步骤S104e，取培养瓶内生长面积达到70％-80％的成骨细胞，将其配置为细胞浓度约为1×106个/毫升的细胞悬液；
子步骤S104f，用移液枪将细胞吹打均匀，然后吸取100μl细胞悬液，插入微流体沟道入口端的培养基液面以下，将细胞注入微沟道内；
步骤S106，封堵微流控芯片上微沟道的入口和出口，为成骨细胞培养提供培养环境，将成骨细胞培养至贴壁；
本实施例中，该培养成骨细胞至贴壁的过程约6-8小时。
步骤S108，微流体沟道入口及出口分别插入处理后的电极，入口插入阳极，出口插入阴极，确保连接紧密后，连接并打开信号源，根据实验需要给予相应电刺激；
每隔1小时使用倒置显微镜拍摄记录细胞状态，整个电刺激过程持续24小时；
至此，本实施例的成骨细胞电刺激实验方法介绍完毕。
上述对各元件的定义并不仅限于实施方式中提到的各种具体结构或形状，本领域的普通技术人员可对其进行简单、熟知地替换，例如：
(1)微流体沟道剖面矩形的宽度应当介于数百微米至数个毫米之内，高度应当介于数十微米至数百微米之内；
(2)微流体沟道的形状并不仅仅局限于矩形结构，可以对其进行必要的变形，例如曲线形沟道和圆形沟道等，还可以其他不规则的微流体沟道形式。
综上所述，本发明提供一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激方法。将微流控技术与电刺激方法相结合，为观察成骨细胞对电刺激的反应提供了便利条件。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，包括：
微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；
倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准所述微沟道的中部；
两弹性密封塞，分别塞住所述微沟道的入口和出口；以及
电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过所述两弹性密封塞伸入所述微沟道内的细胞培养基液面下。
2.根据权利要求1所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述微流道的横截面形状为矩形、圆形或椭圆形。
3.根据权利要求2所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述微沟道的横截面形状为矩形，其长度为13mm、宽度为800μm、高度为100μm。
4.根据权利要求1所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述微流控芯片包括：
其下方具有微槽道的有机聚合物盖片；以及
位于该有机聚合物盖片下方的载玻片，其中，该微槽道与位于其下方的载玻片部分构成上述微沟道。
5.根据权利要求4所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述有机聚合物盖片由以下材料其中之一制备：聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯。
6.根据权利要求5所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述微流控芯片采用以下工艺制备：
步骤A，制作微流控芯片主模，包括：
子步骤A1，清洗并烘干载玻片；
子步骤A2，在载玻片表面均匀旋转涂敷SU-85光刻胶，前烘、曝光及后烘；
子步骤A3，在载玻片表面继续旋转涂敷SU-82100光刻胶，前烘、曝光及后烘；以及
子步骤A4，使用SU-8显影液对载玻片作显影处理，显影完成后将载玻片置于热板上竖膜，得到微流控芯片主模；
步骤B，利用微流控芯片主模采用模塑法制作具有微沟道的有机聚合物盖片，包括：
子步骤B1，对微流控芯片主模浇注预设体积比的有机聚合物预聚体和固化剂，固化；
子步骤B2，翻模得到表面具有微槽道的有机聚合物盖片；
子步骤B3，在有机聚合物盖片打孔制作微沟道入口、出口；以及
步骤C，将打孔完毕的有机聚合物盖片与载玻片键合封接，完成微流控芯片的制作。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述电刺激信号源两电极的末端以塑料管加粗，使其与相应的弹性密封塞紧密结合。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的成骨细胞电刺激系统，其特征在于，所述弹性密封塞采用橡胶材料制备，所述电极为银电极。
9.一种权利要求1至8中任一项所述成骨细胞电刺激系统的操作方法，其特征在于，包括：
步骤S102，对所述微流控芯片进行灭菌消毒；
步骤S104，将经过灭菌的微流控芯片置于培养皿内，用移液枪将细胞培养基和成骨细胞分别注入微沟道；
步骤S106，封堵微流控芯片上微沟道的入口和出口，为成骨细胞培养提供培养环境，将成骨细胞培养至贴壁；以及
步骤S108，在微流体沟道入口及出口分别插入电极，确保连接紧密后，连接并打开电刺激信号源，给予相应电刺激。
10.根据权利要求9所述的操作方法，其特征在于，所述步骤S104包括：
子步骤S104a，在室温条件下，将微流控芯片静置预设时间；
子步骤S104b，用移液枪将细胞培养基从微沟道的入口底部缓慢注入微沟道内；
子步骤S104c，确认微沟道内是否存在气泡，若存在，按压微流控芯片，直至微沟道内的气泡完全消失；
子步骤S104d，微流控芯片置于细胞培养箱中预热；
子步骤S104e，取培养瓶内生长面积达到70％-80％的成骨细胞，将其配置为细胞悬液；以及
子步骤S104f，用移液枪将细胞吹打均匀，吸取细胞悬液，插入微流体沟道入口端的培养基液面以下，将成骨细胞注入微沟道内。
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