CN104640971B - 神经细胞网络的形成及其利用、以及神经细胞播种器件 - Google Patents

Abstract

提供一种神经细胞网络形成用培养装置和其利用手段，所述培养装置能够制约在培养基中处于存活状态的神经细胞的移动并构成神经细胞网络。一种神经细胞网络形成用培养装置，在能够填充细胞培养基的平坦基板上形成由复数个突起部包围成的细胞定着部，且(1)在多个突起部之间设定有宽的间隔，其宽度在使神经细胞的细胞体无法通过的限度内，(2)细胞定着部具有能够收纳1～数个神经细胞的细胞体的内径，(3)在作为细胞定着部的底面的基板面包覆细胞外基质形成物质、和/或具有利用基板面下部侧的抽吸装置抽吸培养基用的微细贯通孔。

Description

神经细胞网络的形成及其利用、以及神经细胞播种器件

技术领域

本发明涉及神经细胞网络的形成及其利用、以及神经细胞播种器件。更详细而言，本发明涉及在培养下形成借助于神经细胞的轴突和其它神经细胞的树突的突触联系的神经细胞网络(neural network)的神经细胞网络形成用培养装置、以及使用该装置形成这类神经细胞网络的方法。进而，本发明涉及使用了这样的神经细胞网络的高通量筛选(highthroughput screening)技术、平面膜片钳(planar patch-clamp)技术、神经细胞成像技术等。

进而，本发明涉及用于在神经细胞网络形成用培养装置或利用了该培养装置的平面膜片钳装置中的、多个选择区域(细胞定着部)高效地播种神经细胞的神经细胞播种器件。

本发明中，“神经细胞”首先包含中枢神经细胞、末梢神经细胞等各种神经细胞。作为神经细胞，优选处于尚未形成轴突、树突的状态的神经细胞。此外，“神经细胞”其次还包括例如iPS细胞、ES细胞之类的能够分化成神经细胞的细胞，更优选包含处于由iPS细胞、ES细胞向神经细胞分化的分化完成途中的、处于神经干细胞等状态的细胞。进而，“神经细胞”还包含具有细胞相互间可形成网络的性质的细胞、及具有能够分化成具有细胞相互间可形成网络的性质的细胞的细胞。

此外，“神经细胞的细胞体”是指神经细胞中的除了轴突、树突之类的突出部分以外的细胞主体部分。

进而，“选择区域”或“细胞定着部”是指基板上的、成为神经细胞网络形成的中心的或将会成为离子通道电流计测、各种成像中的电流/电压施加等的对象的神经细胞被配置的区域，“选择细胞”是指被配置在选择区域(细胞定着部)的神经细胞。

背景技术

此前，出于研究目的或实用目的，提出了如下方案：在培养基(特别是液体培养基)中保持神经细胞，在神经细胞存活的状态下在体外构成神经细胞网络。

例如，在下述的非专利文献1中，如图2所示那样，在配置有晶体管的Si基板上设置由复数个突起部包围成的区域，在该区域中配置螺类(stagnalis)的作为末梢神经细胞集合体的大型神经节(ganglion)，检测神经细胞的电位变动。在下述的非专利文献2中，公开了一种神经芯片，其在基板上形成有复数个如图3所示的称为“笼子”的大致圆盘形的围挡(高度约9μm)，在各笼子的中央部的空间配置神经细胞，并且使神经细胞的轴突等通过笼子中设置的几条通道向着相邻的笼子中的神经细胞伸长。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:G.Zeck,et al.,PNAS 98(2001)10457-10462

非专利文献2:J.Erickson,et al.,J.Neurosci.Methods,175(2008)1-16

发明内容

发明要解决的问题

根据本申请发明人的研究，在例如使用哺乳动物的神经细胞形成神经细胞网络时存在以下问题。

即，为了构成具有良好的网眼状形态的神经细胞网络，有必要预先使神经细胞定着在规定的选择区域(成为网眼的结点的区域)。但是，在液体培养基中处于存活状态的哺乳动物的神经细胞具有能动性，有随机移动之虞，因此有必要对其移动加以制约。

然而，使用例如图1所示的、在基板上设置圆形凹部(深度5μm)(这些凹部通过用于引导轴突伸长的细槽而联络)并在这些凹部中配置神经细胞的结构，结果获知存在下述问题：其虽然能够制约神经细胞的移动，但凹部中所配置的神经细胞大多在2～3天后死亡，无法构成良好的神经细胞网络。

对于该问题的产生，推测是由于神经细胞对于培养条件、细胞附近的状况敏感，在形成神经细胞网络时，必须要处于相邻的神经细胞之间能够容易地相互识别对方神经细胞存在这样的状态。在上述试制结构中，各神经细胞被收纳在凹部中，与相邻的神经细胞之间存在基板表面的5μm的高度差，彼此均难以确认对方细胞。因此，妨碍了神经细胞网络的形成，产生了神经细胞的死亡率增大、突触形成得不够成熟等不良情况。

非专利文献1中，虽然在复数个突起部所包围成的区域中配置了神经组织，但对象为不具有能动的移动性的螺类的巨大神经节。并且复数个突起部的相互间隔优选超过50μm，无法完全制约通常的神经细胞的移动。并且，是在富有高度超过5μm的凹凸的晶体管基板上构成的。

其次，非专利文献2中，各笼子中的神经细胞被包围在相互之间的高度为约9μm的称为笼子的凹凸结构中。并且，笼子中虽然设有宽度为10μm、高度为1μm的轴突伸长用的通道，但笼子中的神经细胞通过这样狭窄的通道彼此识别对方神经细胞还是很困难。因此，非专利文献1、2都没有解决上述问题，也没有教导该问题的解决手段。

进而，作为形成以用于高通量筛选为前提的神经细胞网络的方法，如何进行神经细胞的播种也是重要的技术。例如，在形成测定点为100个、测定点的周围具有25个细胞定着部的网络时，必须在短时间内(通常为1小时以内)将规定数量的神经细胞的细胞体播种到总计2500个细胞定着部。

但是，非专利文献1、2中，并没有公开用于在多个细胞定着部高效地播种神经细胞的神经细胞播种系统。此外，就使用通常的移液管、有计量功能的移液管、或微量注射器等器具通过手工操作将神经细胞播种到各个细胞定着部的方法而言，首先准确地播种到极微小的细胞定着部是困难的，其次播种效率极低，因此不实用。

因此，需要一种能够在短时间内、且几乎同时地将细胞无损伤地播种到多个细胞定着部的神经细胞播种用器件。该器件必须按照不妨碍神经细胞网络向着装置基板上的平面方向形成的方式来构成。

因此，本发明想要解决的第一个课题是提供一种能够解决上述问题的神经细胞网络形成用培养装置和神经细胞网络形成方法。进而，想要解决的第二个课题是提供利用这样的神经细胞网络的平面膜片钳装置、高通量筛选技术、神经细胞成像技术等。

进而，想要解决的第三个课题是提供一种神经细胞播种器件，其用于高效地将神经细胞播种到神经细胞网络形成用培养装置或利用了该培养装置的平面膜片钳装置中的多个细胞定着部。

用于解决课题的手段

(第1发明的方案)

用于解决上述课题的第1发明的方案为一种神经细胞网络形成用培养装置，所述装置在能够填充细胞培养基的平坦基板上形成由复数个突起部包围成的细胞定着部，该细胞定着部具有下述(1)～(3)的条件。

(1)在构成细胞定着部的复数个突起部之间设定有宽的间隔，其宽度在使神经细胞的细胞体无法通过的限度内。

(2)由复数个突起部规定的细胞定着部的内径为能够收纳1～数个神经细胞的细胞体的尺寸。“数个”是指2～10个、更优选为2～6个、进而优选为3～5个。

(3)构成细胞定着部的底面的基板面具有以下的(i)及(ii)中的至少一个要素。

(i)包覆有细胞外基质形成物质。

(ii)设置有微细贯通孔，所述微细贯通孔为利用设置在前述基板面的下部的抽吸装置抽吸培养基用的微细贯通孔，具有使神经细胞无法通过的孔径。

需要说明的是，上述第1发明中，“1～数个神经细胞的细胞体”是指1个以上且10个以下、更优选为1个以上且5个以下的神经细胞的细胞体。

(第2发明的方案)

用于解决上述课题的第2发明的方案为一种神经细胞网络形成用培养装置，其中，前述第1发明的培养装置相当于以下(1)～(3)中的任一者。

(1)在前述基板上形成作为选择区域的细胞定着部，在该细胞定着部配置1～数个作为选择细胞的神经细胞，并且，其它神经细胞仅仅播种在基板上。

(2)在前述基板上以适当的相互间隔形成复数个细胞定着部，在这些细胞定着部配置1～数个神经细胞，并且，其中的1个细胞定着部被用作配置神经细胞的选择区域。

(3)按照能够在前述基板上形成复数个或多个相当于上述(1)或(2)的神经细胞网络的单元的方式，在适当位置分散地形成有上述细胞定着部的神经细胞网络的高通量解析用培养装置。

对于上述第2发明，基于作为其示意图的图4的(a)及图4的(b)进行说明。图4的(a)示出第2发明的(1)的培养装置中的基板上的要部的平面图，图中央所示的神经细胞11(实际上为1～数个神经细胞)被配置在由复数根(6根)圆柱状的突起部12包围成的细胞定着部13、即选择区域中，其周围的神经细胞11仅仅播种在基板上。并且，由这些神经细胞11形成网络。

另一方面，图4的(b)示出第2发明的(2)的培养装置中的基板上的要部的平面图，在基板上以适当的相互间隔形成复数个细胞定着部13，这些细胞定着部13中分别配置有神经细胞11(实际上为1～数个神经细胞)，并且，其中的1个细胞定着部13被用作选择区域。并且，由这些神经细胞11形成网络。

需要说明的是，在第2发明的(3)的培养装置中，按照成为相互独立的网络的单元的方式，在基板上的适当位置分散地形成复数个或多个如图4的(a)或图4的(b)所示的神经细胞网络的单元。

(第3发明的方案)

用于解决上述课题的第3发明的方案为一种神经细胞网络形成用培养装置，其中，在前述第1发明或第2发明中，神经细胞网络形成用培养装置是以神经细胞网络为对象的平面膜片钳装置，

(1)前述基板为电绝缘性基板，设置有前述微细贯通孔，所述微细贯通孔使该电绝缘性基板的构成细胞定着部的底面的基板面的两侧的表面连通，(2)在微细贯通孔的第一表面侧、即神经细胞网络形成侧和其相反侧、即第二表面侧分别设置有用于保持作为前述细胞培养基的导电性液体的储液部、和按照能够对该储液部的导电性液体通电的方式配置的电极部，(3)第一表面侧的储液部成为定着在前述细胞定着部的神经细胞用的储液部。

(第4发明的方案)

用于解决上述课题的第4发明的方案为一种神经细胞网络形成用培养装置，其中，在前述第3发明的平面膜片钳装置中，前述第一表面侧及第二表面侧的电极部具有以下的(a)～(c)的要素。

(a)电极容器，所述电极容器的、在前述储液部导入有导电性液体时与该导电性液体接触的容器壁的至少一部分由无机多孔材料构成。

(b)收纳在上述电极容器内的、在贵金属Nm的表层部形成有该贵金属的氯化物NmCl层的电极。

(c)填充在上述电极容器内的、以饱和浓度溶解有前述贵金属的氯化物NmCl及碱金属氯化物的电极溶液。

(第5发明的方案)

用于解决上述课题的第5发明的方案为一种神经细胞网络形成用培养装置，其中，在前述第1发明～第4发明中的任一项中，神经细胞网络形成用培养装置用于以下(A)～(C)中的任一种目的。

(A)在神经细胞网络中的神经细胞离子通道电流的计测·解析中使用。

(B)在至少包含Ca成像解析、基于作为突触前部位的标记物的突触泡蛋白或突触蛋白的标记的成像解析、基于作为树突的标记物的MAP2的标记的成像解析及基于对内体、外来体进行标记的FM1-43或FM4-64的成像解析的成像解析中使用。

(C)在神经细胞网络的高通量筛选系统中使用。

(第6发明的方案)

用于解决上述课题的第6发明的方案为一种神经细胞网络形成用培养装置，其中，在前述第5发明中，神经细胞网络形成用培养装置为用于(B)所述的成像解析的神经细胞网络形成用培养装置时，还具有下述(D)～(F)中的1个以上要素。

(D)在前述基板的上部设置有接受神经细胞所发出的光的受光装置。

(E)在前述基板的上部设置有对神经细胞或基板表面照射光的照射装置。

(F)上述(E)的照射装置装备有用于仅对规定的单个神经细胞照射光的聚光系统。

(第7发明的方案)

用于解决上述课题的第7发明的方案为一种神经细胞网络形成方法，所述方法使用第1发明～第6发明中任一项所述的神经细胞网络形成用培养装置，基于任意的研究目的而形成培养下的神经细胞网络，所述方法包括：

(1)在填充有细胞培养基的前述平坦基板上播种神经细胞的工序、

(2)利用细胞定着部的细胞外基质形成物质、和/或通过从细胞定着部的底面的微细贯通孔抽吸液体培养基，对每一个细胞定着部配置·定着1～数个神经细胞的工序、和

(3)利用复数个突起部制约定着在细胞定着部的神经细胞的移动，并且利用复数个突起部的间隔部分使其相互地识别对方神经细胞的存在，使其形成基于轴突或树突的神经细胞间的突触联系的工序。

(第8发明的方案)

用于解决上述课题的第8发明的方案为一种神经细胞网络形成方法，其中，在前述第7发明的神经细胞网络形成方法中，在(1)的工序中播种神经细胞时，将神经胶质细胞一起播种在细胞定着部以外的部分。

(第9发明的方案)

用于解决上述课题的第9发明的方案为一种神经细胞播种器件，所述神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或利用了该培养装置的平面膜片钳装置中的能够填充细胞培养基的平坦的装置基板上，用于将神经细胞播种到装置基板中的由复数个突起部包围成的多个细胞定着部，

能够设置在前述装置基板上的板状的器件主体在其设置状态下具有覆盖前述多个细胞定着部的广度，并且其的平坦底面能够与多个细胞定着部中的复数个突起部的顶端接触，

器件主体设有：(1)用于从外部供给以一定密度悬浊有神经细胞的神经细胞悬浊液的悬浊液供给口；(2)在器件主体的内部从前述悬浊液供给口呈分枝状延伸设置的多个微细的悬浊液流路；和(3)位于前述各悬浊液流路的末端的、开口于器件主体的底面的、用于将神经细胞悬浊液注入前述各细胞定着部的悬浊液注入口。

(第10发明的方案)

用于解决上述课题的第10发明的方案为一种神经细胞播种器件，其中，在前述第9发明的神经细胞播种器件中，多个前述悬浊液流路被设定为实质上相同的长度，且设计成：在将前述神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上时，各个前述悬浊液注入口的位置准确地对应于各个前述细胞定着部。

(第11发明的方案)

用于解决上述课题的第11发明的方案为一种神经细胞播种器件，其中，前述第9发明或第10发明的神经细胞播种器件中的板状的器件主体是使设置有前述悬浊液供给口的上部板和设置有前述悬浊液注入口的下部板以密合状态接合而成的，且上部板和下部板中的至少一个的接合面形成有构成前述悬浊液流路的槽。

(第12发明的方案)

用于解决上述课题的第12发明的方案为一种神经细胞播种器件，其中，前述第9发明～第11发明中的任一项的神经细胞播种器件中的神经细胞网络形成用培养装置为第1发明所述的神经细胞网络形成用培养装置，和/或前述第9发明～第11发明中的任一项的平面膜片钳装置为第3发明所述的平面膜片钳装置。

(第13发明的方案)

用于解决上述课题的第13发明的方案为一种神经细胞播种器件，其中，前述第9发明～第12发明中的任一项的神经细胞播种器件中的器件主体还具有第2悬浊液流路，所述第2悬浊液流路用于对前述神经细胞网络形成用培养装置或前述平面膜片钳装置的装置基板中的前述细胞定着部以外的区域注入前述神经细胞悬浊液。

发明的效果

(第1发明的效果)

第1发明的神经细胞网络形成用培养装置中具有形成在平坦基板上的、由复数个突起部包围成的细胞定着部，因此被配置在其中的神经细胞的随机移动受到多个突起部的制约。因此，神经细胞的随机移动被制约。

其中，细胞定着部的内侧和外侧处于同一平坦基板面上，它们之间没有高度差(凹凸)。并且，在细胞定着部中的复数个突起部之间设定有宽的间隔，其宽度在使神经细胞的细胞体无法通过的限度内，该间隔部分为上方开放的空间，而不是如前述非专利文献2公开那样的狭窄通道空间。因此，配置在细胞定着部的神经细胞可以容易地相互识别将会形成网络的对方神经细胞，可以构成基于利用了突起部间的间隔而形成轴突和树突的突触联系的良好的神经细胞网络。

进而，由复数个突起部规定的细胞定着部的内径为能够收纳1～数个神经细胞的细胞体的尺寸，因此在细胞定着部配置、定着1～数个神经细胞的细胞体。通常，神经细胞(特别是iPS细胞等)在为数个细胞左右的集合体(团簇)的状态时能够长期、稳定地生存。相反地，在细胞定着部配置有单个神经细胞时，神经细胞间的信号传递变得简单，网络功能的解析变得容易。第1发明中，由于在细胞定着部配置·定着1～数个神经细胞的细胞体，因此能够以良好的平衡性满足上述两种要求。

在使用第1发明的神经细胞网络形成用培养装置时，能够在4周以上的较长时间使神经细胞生存、维持活性的神经细胞网络。

进而，第1发明中，在构成细胞定着部的底面的基板面包覆对神经细胞显示出黏附力的细胞外基质、和/或设置微细贯通孔(所述微细贯通孔为利用设置在基板的下部的抽吸装置抽吸细胞培养基用的微细贯通孔，具有使神经细胞无法通过的孔径)。因此，在播种神经细胞时，1～数个神经细胞的细胞体被可靠地配置且定着在网眼状的神经细胞网络中的成为网眼的结点的细胞定着部。从以上的观点出发，第1发明可以解决前述本发明的课题。

(第2发明的效果)

根据第2发明，提供一种神经细胞网络形成用培养装置，所述神经细胞网络形成用培养装置用于形成如图4的(a)所示的神经细胞网络、和如图4的(b)所示的神经细胞网络，进而，还可以在基板上形成复数个或多个上述的神经细胞网络的单元。因此，还提供一种神经细胞网络的高通量解析用培养装置。

(第3发明的效果)

平面膜片钳装置为如下装置，即在硅芯片之类的电绝缘性的固体基板上构成复数个膜片钳装置从而能够进行多点计测，在各膜片钳装置的细胞配置部位分别设置用于计测离子通道电流的微细的贯通孔。在第3发明的平面膜片钳装置中，前述第1发明中的(3)的(ii)所规定的“利用设置在基板的下部的抽吸装置抽吸培养基用的微细贯通孔”被用作离子通道电流计测用的微细的贯通孔。

此外，当在第二表面侧的细胞培养基中混合具有引诱神经细胞效果的腺苷5－β硫代二磷酸、尿苷5－三磷酸三钠盐水合物、EGF等物质、从而将神经细胞引诱至第二表面侧的细胞培养基时，由于神经细胞被诱导至微细贯通孔，因此可以使神经细胞在培养期内更可靠地停留在微细贯通孔上。

此前的平面膜片钳装置不具有细胞培养功能，因此存在无法用于神经细胞之类的有培养必要的细胞的问题。即，作为测定对象的细胞的寿命在非培养条件下短至1小时或30分钟以下，因此仅能够用于创新药物筛选等有限的用途，但是难以用于利用移液管膜片钳的细胞功能解析等用途中。进而，顺利地将细胞运输、捕捉到设置在基板中的微细的贯通孔部位也是困难的。

但是，根据第3发明可以提供一种平面膜片钳装置，通过将第1发明或第2发明的神经细胞网络形成用培养装置用作以神经细胞网络为对象的平面膜片钳装置，从而以有培养必要的神经细胞的神经细胞网络为对象、且显著延长了作为测定对象的神经细胞的寿命。并且，若利用第2发明的(3)所规定的神经细胞网络形成用培养装置，还可以对神经细胞网络进行高通量的筛选。

(第4发明的效果)

然而，关于上述第3发明这样的平面膜片钳装置，还存在下述课题。

即，在如前述第1发明中的(3)的(i)那样、在对离子通道电流进行计测的微细贯通孔的周缘(细胞定着部)附着有细胞外基质形成物质时，在神经细胞的细胞膜和微细贯通孔周缘的基板表面之间形成少许间隙，导致所谓的薄膜电阻(シール抵抗)下降。流过该间隙的电流以漏电流的形式叠加于离子通道电流，产生这样的变动时会助长噪声。因此在薄膜电阻下降的状态下，相对于少许的施加膜电位的变动，噪声电流也变大，从而难以准确地计测离子通道电流。

为了谋求细胞的离子通道电流的准确计测，在上述的平面膜片钳装置的薄膜电阻低时实施噪声电流对策当然是有效且重要的，即使是薄膜电阻不低时，实施噪声电流对策也是有效且重要的。作为噪声电流对策，除了增大薄膜电阻以外，抑制电极侧的施加膜电位的变动也是有效的。

并且，使用在贵金属Nm(例如银Ag)的表层部形成有该贵金属的氯化物NmCl层(例如AgCl层)的电极作为平面膜片钳装置的电极时，上述那样的施加膜电位的变动主要产生自AgCl/Ag电极的表面与包围该电极的溶液之间的界面电位的变动、液－液界面电位的变动。

因此，如第4发明那样，在电极部的电极容器内，将AgCl/Ag电极浸渍在作为AgCl及碱金属氯化物(例如KCl)的饱和溶液的电极溶液(KCl浓度为一百几十毫摩尔左右)中，若预先介由由无机多孔材料构成的容器壁使它们与细胞培养液之类的导电性液体(KCl浓度为数毫摩尔左右)接触，则电极容器的内部和外部为电导通的状态。但是，由于液体本身无法过多地通过无机多孔材料的细孔，因此电极容器内部的电极溶液和电极容器外部的导电性液体的混合少，为可以无视的程度。其结果是，电极容器的内部和外部中的KCl的较大浓度差保持恒定，AgCl/Ag电极的界面电位、液－液界面电位恒定，不会引起施加膜电位的变动。

(第5发明的效果)

根据第5发明，可以将第1发明～第4发明的神经细胞网络形成用培养装置用于(A)神经细胞网络中的神经细胞离子通道电流的计测·解析、(B)至少包含Ca成像解析、基于作为突触前部位的标记物的突触泡蛋白或突触蛋白的标记的成像解析、基于作为树突的标记物的MAP2的标记的成像解析及基于对内体、外来体进行标记的FM1-43或FM4-64的成像解析的成像解析、(C)神经细胞网络的高通量筛选系统中的任一用途中。

(第6发明的效果)

根据第6发明，在前述第5发明的神经细胞网络形成用培养装置用于(C)所述的成像解析中时还具有上述(D)的受光装置、(E)的照射装置、(F)的聚光系统中的1个以上要素，因此获得如下效果：首先由于大多情况下能够非接触且非破坏地进行计测，因此能够不妨碍神经细胞网络功能地进行解析；其次由于为光计测，因此能够高速地进行解析；第3，即使在细胞定着部配置有复数个神经细胞(细胞团簇)，也可以利用(F)的聚光系统准确地激发单个神经细胞并精密地进行解析。

(第7发明的效果)

根据第7发明的神经细胞网络形成方法，使用第1发明～第6发明中任一项所述的神经细胞网络形成用培养装置，进行前述(1)～(3)的工序。

因此，在将神经细胞播种到填充有细胞培养基的平坦基板上时，利用各细胞定着部的细胞外基质形成物质或通过从细胞定着部的底面的微细贯通孔抽吸细胞培养基，可以在该细胞定着部可靠地配置、定着1～数个神经细胞的细胞体。更具体而言，可以将细胞体配置、定着到细胞定着部的微细贯通孔上。

此外，此时，各细胞定着部的内径与能够收纳1～数个神经细胞的细胞体的尺寸大致对应，因此在各细胞定着部可靠地配置1～数个神经细胞。并且，由于构成细胞定着部的复数个突起部，这些神经细胞的随机移动受到制约。并且，细胞定着部的内侧和外侧处于同一平坦基板面上，它们之间没有高度差(凹凸)，因此配置在细胞定着部的神经细胞通过构成细胞定着部的复数个突起部的间隔而可以容易地相互识别将会形成网络的对方神经细胞。因此，神经细胞可以维持有活性的生存状态，并构成基于利用了突起部间的间隔而形成轴突和树突的突触联系的良好的神经细胞网络。

从以上观点出发，根据第7发明，可以在配置·定着于各细胞定着部的1个神经细胞或数个神经细胞团簇的相互间良好地形成神经细胞网络。在利用该方法时，神经细胞可以以大致100％的概率形成稳定的网络，并持续培养4周以上的长时间。因此，对于神经细胞网络的高通量筛选元件的制作而言是极为有用的技术。

(第8发明的效果)

根据第8发明，在上述第7发明的(1)的工序中播种神经细胞时，将神经细胞播种在选择区域内和选择区域外，并且将神经胶质细胞播种在选择区域外。由此如根据“F.W.Pfrieger et al.,Science 277(1997)1684-1687”等文献所知那样，由于神经胶质细胞存在于突触的附近并且与神经细胞接触，因此神经细胞网络的成熟度提高，可以构成时间空间上功能更均匀的神经细胞网络。

(第9发明的效果)

根据第9发明，提供一种神经细胞播种器件，所述神经细胞播种器件用于高效地将神经细胞播种到神经细胞网络形成用培养装置或利用了该培养装置的平面膜片钳装置中的多个细胞定着部。由此，提供了下述重要课题的解决手段，所述课题为：在形成以用于高通量筛选为前提的神经细胞网络时，如何播种神经细胞。

该器件的板状的器件主体设有：(1)用于从外部供给神经细胞悬浊液的悬浊液供给口；(2)从该悬浊液供给口呈分枝状延伸设置的多个微细的悬浊液流路；和(3)位于各悬浊液流路的末端的、开口于器件主体的底面的悬浊液注入口。因此，即使装置基板上所设置的细胞定着部极多(例如数百个)，也能够将神经细胞悬浊液在短时间内供给至全部的这些细胞定着部。

需要说明的是，神经细胞悬浊液向悬浊液供给口的供给方法没有特别限定，若考虑到多个微细的悬浊液流路中的流体摩擦阻力，则优选利用可以将液体压入悬浊液供给口的器具、装置(例如，注射器、微量注射器、或小的泵式压入装置等)在加压状态下供给神经细胞悬浊液。此时，液体压入用的器具、装置的注口的尺寸通常大于悬浊液供给口的内径，这种情况下，可以将前端侧进行了减径的连接用管线安装到液体压入器具/装置的注口，将其进行了减径的前端侧插入悬浊液供给口。作为连接用管线的前端侧的进行了减径的部分，例如，可以安装不锈钢制的小喷嘴状的管体。

被注入细胞定着部的神经细胞从细胞定着部的流出受到细胞定着部的复数个突起部的阻止，而停留在细胞定着部内。另一方面，悬浊介质液从细胞定着部的多复数个突起部之间流出。因此获得了神经细胞以应激小、无损伤的状态被播种至细胞定着部的结果。并且，这样的神经细胞的播种是一起进行的，因此对于装置基板上的多个细胞定着部播种神经细胞是几乎同时、且在非常短的时间内(数十秒左右)完成的。

进而，重要的是，该神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置中的、能够填充细胞培养基的平坦的装置基板上。因此，是从细胞定着部的上方注入神经细胞悬浊液的结构。由此，不会妨碍沿着装置基板上的平面方向的神经细胞网络的形成。

需要说明的是，虽然也能够将神经细胞播种器件固定设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上，但将神经细胞播种器件按照可拆卸的方式设置时，若在神经细胞播种后将其拆下，则在播种后的神经细胞的培养中不会妨碍氧、二氧化碳的供给，并且也不妨碍从上部观测网络、以及药液的施予。

(第10发明的效果)

根据第10发明，多个前述悬浊液流路被设定为实质上相同的长度，因此能够准确且同时地完成神经细胞在装置基板上的多个细胞定着部中的播种。换言之，这种效果为：若在调节神经细胞悬浊液中的神经细胞的分散密度的基础上，对由悬浊液供给口供给的神经细胞悬浊液的液量进行控制，则可以大致准确地控制神经细胞悬浊液向各个细胞定着部的注入量(甚至播种的神经细胞的个数)，并且，还意味着可以将播种在多个细胞定着部的神经细胞的个数控制得大致均匀。这些效果在形成以高通量筛选用途为前提的神经细胞网络时可以称之为重要的效果。

此外，设计成在将前述神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上时，各个悬浊液注入口的位置准确地对应于各个细胞定着部，因此能够准确地进行神经细胞在多个细胞定着部中的播种。需要说明的是，关于该点，在将神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上时的、使两者的位置对齐用的标识记号，可以设置在装置基板和器件主体中的至少一者，在器件主体由透明度高的材料形成时，由于可以透视这样的标识记号而特别有效。

(第11发明的效果)

根据第11发明，板状的器件主体是使设置有悬浊液供给口的上部板和设置有悬浊液注入口的下部板接合而成的，两板中的至少一个的接合面形成有构成悬浊液流路的槽，因此，在器件主体的内部加工出微细且屈曲形态的多个构成悬浊液流路的操作更为容易。但是，用于构成悬浊液流路的槽的加工方法并非仅限于此。

(第12发明的效果)

根据第12发明，提供神神经细胞网络形成用培养装置为第1发明所述装置、和/或平面膜片钳装置为第3发明所述经细胞播种器件这样的具体且优选的实施方式。

(第13发明的效果)

在将神经细胞仅播种在神经细胞网络形成用培养装置、平面膜片钳装置的装置基板中的细胞定着部的情况下，装置基板中的神经细胞的总体的固体数不足，因此大多不能良好地形成神经细胞网络。为了解决该问题，根据第13发明，器件主体还具有第2悬浊液流路，所述第2悬浊液流路用于对装置基板中的前述细胞定着部以外的区域注入神经细胞悬浊液。因此，可以对装置基板中的细胞定着部以外的区域也适当注入神经细胞悬浊液、播种神经细胞，因此可以特别良好地形成神经细胞网络。

附图说明

图1示出本申请发明人所试制的位于基板上的凹部结构(比较例)。

图2示出非专利文献1公开的Si基板上的结构。

图3示出非专利文献2公开的笼子的结构。

图4示出第2发明的(1)、(2)的神经细胞网络形成用培养装置的要部的示意性平面图。

图5示出第1实施例的剖面图。

图6示出第2实施例的概要。

图7示出第3实施例的概要。

图8示出第4实施例的概要。

图9示出第5实施例的概要。

图10示出第6实施例的概要。

图11示出第7实施例中的神经细胞播种器件主体的概要。

图12示出第7实施例中的第1、第2悬浊液流路系统的概要。

图13示出第7实施例中的第1悬浊液流路系统的要部细节。

图14示出大鼠海马神经细胞的播种时的尺寸。

图15示出大鼠海马神经细胞的培养时的尺寸。

图16为表示用大鼠海马神经细胞进行的其它实验的光学显微镜照片。

符号说明

1 基板

2 细胞定着部

3 神经细胞

4 微细贯通孔

5 电流增幅器

6 微量移液管

7 上部电极

8 下部电极

9 细胞外基质形成物质

11 神经细胞

12 突起部

13 细胞定着部

14 基板

15 微细贯通孔

16 间隔件

17 间隔件

18 培养空间

19 缺口部

20 平板

21 平板

22 主储液

23 储液部

24 液体通路

25 副储液

26 导入用液体通路

27 排出用液体通路

28 电极部

29 电极部

30 细胞外基质形成物质

31 电极容器

32 电极溶液

33 AgCl/Ag电极

34 无机多孔材料

35 电极销

36 外侧细胞定着部

40 器件主体

41 上部板

42 下部板

43 悬浊液供给口

43a 第2悬浊液供给口

44 悬浊液流路

44a 第2悬浊液流路

45 悬浊液注入口

45a 第2悬浊液注入口

46 注入口设定部

具体实施方式

以下对包括最优选方式在内的本发明的实施方式进行说明。本发明的技术范围不受这些实施方式限定。

〔本发明的技术领域〕

本发明的技术领域涉及在使神经细胞稳定的状态下对其进行培养并使其形成神经细胞网络的技术领域。此外，属于对细胞表面的离子通道电流进行计测的技术领域。进而，涉及对细胞进行电流注入或电压施加而对其给予刺激的领域。进而，还属于对离子通道电流进行计测、或者对细胞注入电流或施加电压从而对其给予刺激的类型的高通量筛选技术领域。进而，还属于以神经细胞或神经细胞网络为对象的Ca成像等各种成像技术领域。

〔神经细胞、神经细胞网络〕

神经细胞包含作为细胞主体的细胞体和由该细胞体伸出的轴突及树突。对神经细胞的种类没有限定，首先可以例示出中枢神经细胞、末梢神经细胞等各种神经细胞，特别优选处于尚未形成轴突、树突的状态的神经细胞。此外，其次可以例示出例如iPS细胞、ES细胞之类的能够分化成神经细胞的细胞，更优选处于由iPS细胞、ES细胞向神经细胞分化的分化完成途中的处于神经干细胞等状态的细胞。进而，还可以例示出具有细胞相互间可形成网络的性质的细胞、及具有能够分化成具有细胞相互间可形成网络的性质的细胞的细胞。作为神经细胞，优选动物的神经细胞、特别优选包括人在内的哺乳动物的神经细胞。这些神经细胞中的细胞体的尺寸通常小于20μm，更具体而言为3～18μm左右。

神经细胞网络中，发送信号的触发细胞和接受信号的跟随细胞(フォロワー細胞)这一对神经细胞为结构上的基本单位。本申请发明人发现，在触发细胞和跟随细胞所处平面的高度方面存在有细胞大小程度的高度差时，细胞的死亡概率增大。

〔神经细胞网络形成用培养装置〕

本发明的神经细胞网络形成用培养装置，在能够填充细胞培养基(特别优选为液体培养基)的平坦基板上形成有由复数个突起部包围成的细胞定着部。

“能够填充细胞培养基的平坦基板”为例如对后述平面膜片钳装置进行说明时那样的构成。细胞定着部根据前述第2发明的(1)～(3)的构成在基板上设定复数个或多个。但是，由于在神经细胞网络中触发细胞和跟随细胞这一对神经细胞为基本单位，因此在为以神经细胞的自然点火为触发、通过跟随细胞接受离子通道电流的构成时，作为选择区域的细胞定着部即使为一处也能够作为功能解析元件进行动作。作为选择区域的细胞定着部的相互间隔根据神经细胞网络的种类而不同，不能一概而论，例如，可以设为50～500μm左右。

构成细胞定着部的复数个突起部的形状没有限定，优选为例如栅状或桩状(日语：杭状)的突起。突起部的高度也没有限定，通常，优选为可以有效制约神经细胞的随机移动的10μm左右的高度，例如在小鼠大脑皮质、海马神经细胞的情况下优选为5～10μm左右的高度。

其次，上述细胞定着部具有下述的(1)～(3)的条件。

(1)在构成细胞定着部的复数个突起部之间设定有宽的间隔，其宽度在使神经细胞的细胞体无法通过的限度内。突起部的间隔根据哺乳动物神经细胞的细胞体的大小(所述细胞体的大小具有3～18μm左右的偏差)来决定，难以一概地限定为绝对的值。作为基准之一，在将细胞体的大小设为Xμm时，间隔的上限值优选为0.9Xμm以下、特别优选为0.7Xμm以下，间隔的下限值优选为0.3Xμm以上、特别优选为0.5Xμm以上。在复数个突起部的上端部相互连结时，实质上形成了通道结构，固不优选。此外，在通道结构中，即使在通道内能够形成突触，也不能进行利用该突触的成像观察。

(2)由复数个突起部形成的细胞定着部的内径为可以收纳1～数个神经细胞的细胞体的尺寸。细胞定着部的内径根据神经细胞的细胞体的大小、及细胞定着部中的细胞体的个数而适当设定。例如，在细胞定着部中的细胞体为哺乳动物神经细胞的细胞体、其个数为1个时，细胞定着部的内径优选为10～25μm左右。当细胞定着部的内径与细胞体的尺寸相比过大时，有在一个选择区域中配置太多个细胞体之虞，当细胞定着部的内径与细胞体的大小相比小50％以上时，有细胞体无法稳定地配置在细胞定着部之虞。

(3)构成细胞定着部的底面的基板面具有以下的(i)及(ii)中的至少一个要素。

(i)包覆有细胞外基质形成物质。

(ii)设置有微细贯通孔，所述微细贯通孔为利用设置在前述基板面的下部的抽吸装置抽吸培养基用的微细贯通孔，具有使神经细胞无法通过的孔径。

这样的(3)的条件中，(i)的细胞外基质形成物质为通过对神经细胞显示黏附力而将神经细胞定着到细胞定着部的底面的物质，作为其构成材料，可以例示出聚赖氨酸、胶原(I型、II型、IV型)、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖(多功能蛋白聚糖(versican)、核心蛋白聚糖等)、蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖)、连接蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、蛋白聚糖〔硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(基底膜聚糖等)、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖〕、透明质酸(糖胺聚糖的一种)、弹性蛋白、血纤蛋白、明胶、基质胶(matrigel)等。

(ii)的抽吸细胞培养基用的微细贯通孔，用于通过基板下部侧的抽吸装置抽吸细胞培养基从而使配置在细胞定着部的1～数个神经细胞定着在细胞定着部的底面，其孔径可以设为使神经细胞无法通过的程度，例如1～3μm左右。

〔平面膜片钳装置〕

神经细胞网络形成用培养装置的有效利用例之一是以神经细胞网络为对象的平面膜片钳装置。

(一般的平面膜片钳装置)

构成生命体的细胞的表面存在有各种膜蛋白，在细胞表面的特定位点上发生化学物质(配体等信号传递物质)的结合、电或光的刺激(栅极触发)时，膜蛋白的作为开口部的通道开或关，控制细胞膜的外侧和内侧之间的离子、化学物质的输送。进行该控制的离子通道为对生物系统的信号传递而言重要的膜蛋白，在其功能的计测、功能相关药品的开发中，需要对通道蛋白的电气变化、即离子通道电流进行计测。

对于该需求，迄今为止开发出移液管膜片钳、平面膜片钳等技术。移液管膜片钳具有无法用于基于多点计测的高通量筛选的弱点。与此相对，平面膜片钳为在硅芯片之类的固体基板上构成复数个膜片钳装置、能够对细胞离子通道电流进行多点计测的平面基板型的膜片钳装置，在各膜片钳装置的细胞配置部位分别设置有用于对离子通道电流进行计测的微细的贯通孔。

但是，此前的一般的平面膜片钳装置不具有细胞培养功能，因此存在无法用于神经细胞之类的有培养必要的细胞的问题。即，作为测定对象的细胞的寿命在非培养条件下短至1小时或30分钟以下，因此仅能够用于创新药物筛选等有限的用途，但是难以用于利用移液管膜片钳的细胞功能解析等用途中。进而，顺利地将细胞运输、捕捉至设置在基板中的微细的贯通孔部位也是困难的。

(本发明的平面膜片钳装置)

与此相对，本发明的平面膜片钳装置与上述的一般构成的平面膜片钳装置相比，还具有神经细胞培养功能，是能够有效抑制离子通道电流计测时的噪音电流和稳定进行细胞的位置确定的装置。即，该装置的特征性构成在于，在基板所设置的微细的贯通孔中的神经细胞定着用开口部赋予细胞固定力、且在基板中的贯通孔的两侧的表面部设置能够对电极通电的储液部，在该储液部能够填充导电性液体(例如细胞培养液)。根据该平面膜片钳装置，可以容易地将神经细胞捕捉至微细贯通孔的位置，并且，可以在细胞培养条件下在充分的时间内实施离子通道活性的测定。

具体而言，本发明的平面膜片钳装置中，前述神经细胞网络形成用培养装置按照以下的(1)～(3)的方式来构成。

(1)前述基板为电绝缘性基板，设置有前述微细贯通孔，所述微细贯通孔使该电绝缘性基板的两侧的表面连通。

(2)在微细贯通孔的第一表面侧、即神经细胞网络形成侧和其相反侧、即第二表面侧分别设置有用于保持导电性液体的储液部、和按照能够对该储液部的导电性液体通电的方式配置的电极部。

(3)第一表面侧的储液部成为定着在前述细胞定着部的神经细胞用的储液部。

(本发明的平面膜片钳装置中的主要构成)

因此，本发明的平面膜片钳装置中设置有微细的贯通孔，所述微细的贯通孔使该电绝缘性基板两侧的表面、即第一表面侧(配置细胞的表面侧)和第二表面侧连通。

作为电绝缘性基板，可以优选使用玻璃制、陶瓷制、塑料制等的基板。作为一例，在使用硅基板时，优选为具有由第一表面侧的硅层、中间的氧化硅层和第二表面侧的硅层依次层叠而成的结构的硅基板(SOI基板)。在这样的层叠结构的硅基板中，绝缘性极高的中间层存在于二个硅层之间，因此在测定对象细胞的离子通道关闭时可以建立高阻抗状态，可以减少背景噪声。

基板中的贯通孔的个数没有限定，优选为复数个～多个，例如设为2个～数十个、或更多。微细的贯通孔的内径优选为可以使液体通过但使神经细胞无法通过的程度的内径(例如1～3μm左右)，但并非限于这些内径。

此外，在平面膜片钳装置中，前述贯通孔的第一表面侧和第二表面侧分别设有用于保持导电性液体的储液部和按照能够对该储液部的导电性液体通电的方式配置的电极部。

储液部的构成只要满足“能够按照能够保持导电性液体、且能够通过电极部对导电性液体通电的方式配置”的要求，则对于构成没有特别限定，例如可以如第1实施例所示，在基板的第一表面侧和第二表面侧分别重叠间隔部件、平板部件，对于间隔部件，在与基板的贯通孔对应的区域设置缺口部，从而形成。

第一表面侧的间隔部件及平板部件优选由不透光性的材料形成，第二表面侧的间隔部件及平板部件优选由透光性的材料形成，但并非仅限于此。

储液部本身按照液密方式构成，并且，具有用于将导电性液体(作为分散有神经细胞的细胞培养基的导电性液体)导入或排出的液体通路或能够开或关的开口部。基板的第一表面侧的储液部，其储液部的上部可以用盖玻片之类的盖部件封闭，根据需要也可以拆下盖部件而使储液部开放。

在平面膜片钳装置中，在第一表面侧及第二表面侧具有构成新颖的电极部，该点将在之后的“平面膜片钳装置中的电极部结构”部分叙述。

进而，在平面膜片钳装置中，优选使前述第一表面侧的储液部为下述构成，即包含分别由不透光性的材料构成的、用于配置细胞的主储液、配置有第一表面侧的电极部的副储液、和使这些储液连通的狭窄液体通路。此外优选下述构成，即，前述第二表面侧的储液部与用于将导电性液体导入及排出的液体通路连通、且该液体通路配置有第二表面侧的电极部。

并且，前述第一表面侧的储液部相当于前述神经细胞的选择区域。因此，第一表面侧的储液部在基板上以适当的2维方向的相互间隔设定为复数个或多个，在这些第一表面侧的储液部中，分别构成由复数个突起部包围成的细胞定着部。

第二表面侧的储液部分别设定在与第一表面侧的储液部对应的位置，第一表面侧和第二表面侧的储液部通过基板的微细贯通孔而联络。并且，第二表面侧的储液部与液体抽吸器件联络，通过该液体抽吸器件对第二表面侧的储液部施加负压，通过微细贯通孔进而对第一表面侧的储液部施加负压。该微细贯通孔相当于此前作为(ii)记载的细胞定着部的底面的用于抽吸细胞培养基的微细贯通孔。此外，在微细贯通孔的第一表面侧的开口部周缘附着有具有细胞固定力的细胞外基质形成物质。其相当于此前作为(i)记载的、细胞定着部的底面包覆有细胞外基质形成物质。

〔平面膜片钳装置中的电极部结构〕

进而，在上述平面膜片钳装置中，优选前述第一表面侧及第二表面侧的电极部具有以下的(a)～(c)的要素。

(a)电极容器，所述电极容器的、与导入至前述储液部的导电性液体接触的容器壁的至少一部分由无机多孔材料构成。

(b)收纳在上述电极容器内的、在贵金属Nm的表层部形成有该贵金属的氯化物NmCl层的电极。

(c)填充在上述电极容器内的、以饱和浓度溶解有前述贵金属的氯化物NmCl及碱金属氯化物的电极溶液。

上述电极部结构中的贵金属Nm的种类没有限定，优选为银Ag及铂Pt，特别优选银Ag。因此，作为贵金属的氯化物NmCl，优选银的氯化物AgCl及铂的氯化物AgCl，特别优选银的氯化物AgCl。此外，对碱金属氯化物没有特别限定，优选氯化钾KCl。构成容器壁的至少一部分的无机多孔材料优选为多孔玻璃或多孔陶瓷。

进而，前述电极部中的电极还优选为以下(1)或(2)。

(1)突出至电极容器内部的棒状电极，在包含贵金属Nm的芯材的表层部形成有贵金属氯化物NmCl层。

(2)形成在电极容器的壁部的内周面的筒状电极，容器壁部侧的底层为贵金属Nm的蒸镀层，与电极溶液接触的表面层为贵金属氯化物NmCl的蒸镀层。

〔使用神经细胞网络形成用培养装置的成像解析〕

使用本发明的神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置，可以进行至少包含Ca成像解析、基于作为突触前部位的标记物的突触泡蛋白或突触蛋白的标记的成像解析、基于作为树突的标记物的MAP2的标记的成像解析及基于对内体、外来体进行标记的FM1-43或FM4-64的成像解析等各种成像解析

(Ca成像解析)

Ca成像是如下方法：在神经细胞中预先导入Ca探针(与Ca离子结合并发出荧光的色素)，以荧光形式来捕捉在神经细胞中产生活动电位时Ca离子流入细胞体的现象，可以通过观察活动电位产生时或活动电位传输时所产生的荧光对该细胞的离子通道电流进行解析。

因此，使用导入了Ca探针的神经细胞来构成神经细胞网络，例如对这些细胞中的单个神经细胞进行电流注入或电压施加，由此可以进行复数个或多个神经细胞中的基于前述Ca成像的测定。

根据该方法，可以选择构成神经细胞网络的单个神经细胞(第1神经细胞)，通过电流注入或电压施加对其进行刺激并使其产生活动电位，同时该活动电位通过神经细胞网络传输到相邻的周围的神经细胞(第2神经细胞)中，进而，由第2神经细胞传输至与其相邻的第3神经细胞，这些情形都可以通过Ca成像进行计测。

作为现有技术有例如电极刺激法，但该方法难以选择性地对单个神经细胞进行刺激，解析变得复杂。此外，其它的作为现有技术的利用微量移液管电极进行刺激的情况下，虽然能够选择性地刺激单个神经细胞，但难以实现高通量筛选所必须的多通道化。根据本发明的手法，计测部可以非常小型，因此容易实现多通道化。

(利用突触泡蛋白、突触蛋白的成像解析)

突触泡蛋白、突触蛋白为突触泡的膜蛋白质，为突触前部位的标记物，可以使色素与这些的抗体结合从而利用抗原抗体反应使色素结合在这些蛋白质上，从而可以对突触部位进行标记。

(利用MAP2的成像解析)

MAP2为树突的标记物，可以使色素附加在其的抗体上并反应，由此对树突部位进行标记。

(利用FM1-43、FM4-64的成像解析)

FM1-43、FM4-64可逆地陷入细胞膜但不透过细胞膜，具有仅在与细胞膜结合时才发出荧光的特征，可以对内体、外来体进行标记。具有能够在维持细胞的生命功能的状态下进行标记的特征。

(成像解析的光学系统)

使用本发明的神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置进行上述各种成像解析时，装置中优选具有以下的光学系统要素。

首先，在装置的基板的第1表面侧的上部设置接受神经细胞所发出的光的受光装置。此外，在装置的基板的第1表面侧的上部设置用于对神经细胞或基板表面照射激光等的照射装置。该照射装置特别优选还装备有用于仅对规定的单个细胞照射光的聚光系统。

通过具有以上的光学系统要素，能够非接触、非破坏地进行光的计测，能够不妨碍神经细胞网络功能地进行解析，并且能够高速地进行解析，进而，利用聚光系统能够准确地激发单个神经细胞而进行精密解析。

〔神经细胞播种器件〕

本发明的神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或利用了该培养装置的平面膜片钳装置中的、能够填充细胞培养基的平坦的装置基板上，用于将神经细胞播种到装置基板中的由复数个突起部包围成的多个细胞定着部。

这里所称的“神经细胞网络形成用培养装置”只要在能够填充细胞培养基的平坦的装置基板上形成有由复数个突起部包围成的多个细胞定着部，则对其构成没有限定。此外，“平面膜片钳装置”也是利用神经细胞网络形成用培养装置的装置，只要在能够填充细胞培养基的平坦的装置基板上形成有由复数个突起部包围成的多个细胞定着部，则对其构成没有限定。但是，特别优选的是，“神经细胞网络形成用培养装置”为前述实施方式的本发明的神经细胞网络形成用培养装置，“平面膜片钳装置”为前述实施方式的本发明的平面膜片钳装置。

本发明的神经细胞播种器件中，其器件主体具有能够设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上的板状形态。通常，板状指薄板状或厚板状，大多情况下还意味着平面形状为矩形(正方形或长方形)。但是，本发明中，为能够设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上的形态，为了使底面能够与装置基板上的多个细胞定着部中的复数个突起部的顶端接触，至少底面是平坦的，且具有设置在上述装置基板上时底面覆盖多个细胞定着部的广度，“板状”的具体形态除了这些以外没有限制。

作为“板状”的器件主体，基本上，具有与神经细胞网络形成用培养装置、平面膜片钳装置的装置基板对应的平面形状和广度(面积)者是合适的。器件主体的平面形状不限于矩形，也可以是圆形、椭圆形、其它不定形，其厚度可以设为例如数mm～数cm左右。器件主体的底面面积优选与装置基板的面积对应，例如，可以在2～3cm²左右至数十cm²左右或更大的面积中自由选择。

器件主体的面积、与其对应的装置基板的面积优选考虑装置基板中的细胞定着部的个数、器件主体中的后述的微细加工的密集度等因素而进行适当设定。进而，器件主体的构成材料没有限定，可以优选例示出玻璃等无机材料、塑料等有机材料。特别优选使用透明的材料。

板状的器件主体优选为下述构成，即，优选由设有悬浊液供给口的上部板和设有悬浊液注入口的下部板以密合状态接合而成，在上部板和下部板中的至少一个的接合面形成有构成悬浊液流路的槽。槽的截面形状可以是半圆形、矩形。此时，在上部板和下部板接合后，结果是槽构成悬浊液流路。在上部板和下部板两者均形成有准确对应的截面半圆形的槽时，结果是构成了截面为圆形的悬浊液流路。

但是，作为板状的器件主体，只要能够对其内部进行用于形成多个悬浊液流路的加工，则也能够使用单个板。若使用利用了光固化性树脂的3维光造形法(three-dimensional stereorithography)，则制造效率虽差但能够进行这样的加工。

器件主体设有：(1)用于从外部供给以一定密度悬浊有神经细胞的神经细胞悬浊液的悬浊液供给口；(2)在器件主体的内部从前述悬浊液供给口呈分枝状延伸设置的多个微细的悬浊液流路；(3)位于前述各悬浊液流路的末端的、开口于器件主体的底面的、用于将神经细胞悬浊液注入前述各细胞定着部的悬浊液注入口。

需要说明的是，在将神经细胞播种器件设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上时，各个悬浊液注入口的位置必须与各个细胞定着部准确对应。此外，如前述那样，为了在设置神经细胞播种器件时使悬浊液注入口和细胞定着部的位置准确对齐，优选在包含透明材料的器件主体、或神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上预先标记位置对齐用标记(标记物)。

上述(1)的悬浊液供给口优选开口于器件主体的上表面。但是，即使开口于器件主体的侧面，只要是向着主体内部倾斜向着斜下方的悬浊液供给口则也能够使用。进而，在以加压状态将神经细胞悬浊液供给至悬浊液供给口的前提下，在不关注神经细胞播种操作完成后神经细胞悬浊液从该悬浊液供给口漏出等的情况下，使悬浊液供给口器件在主体的侧面沿着水平方向开口也是可以的。

可以在器件主体上仅设置1个悬浊液供给口，在将下述(2)的微细的悬浊液流路和下述(3)的悬浊液注入口均设置为多个的情况下，从在流路设计上更容易与它们联络的观点出发，优选在器件主体上使悬浊液供给口在适当位置分散设置复数个。在设置复数个悬浊液供给口时，对这些供给口的神经细胞悬浊液的供给可以分别使用不同的注射器等，也可以将基端侧为单个管线、前端侧分支为复数个管线的连接用管线的基端侧连接至单个注射器等，将前端侧的复数个管线分别连接至复数处的悬浊液供给口。

任意情况下，悬浊液供给口的内径大多为例如数mm以下或数百μm左右的小内径，因此如“发明的效果”部分所述，可以将前端侧进行了减径的连接用管线嵌入注射器、微量注射器等液体压入用器具的注口，将前端侧的进行了减径的部分插入悬浊液供给口。作为连接用管线中的“前端侧进行了减径的部分”，例如，可以使用形成为向着前端逐渐变细的锥形形状的不锈钢制的插入用喷嘴。在使用前述“前端侧分支为复数个管线的连接用管线”将神经细胞悬浊液供给至复数个悬浊液供给口时，也可以将上述插入用喷嘴安装在分支出的各管线的前端部。

上述(2)的悬浊液流路可以设为例如内径为50μm～500μm左右的微细流路。悬浊液流路的截面形状可以是圆形，也可以是半圆形、矩形等。该悬浊液流路基本上沿着器件主体内的大致平面方向而形成。悬浊液流路从上述悬浊液供给口呈分枝状延伸设置多数根，其分枝的形态有：由悬浊液供给口直接分支出多个悬浊液流路且延伸设置的情况；从悬浊液供给口分支出1根或2、3根这样的少数干线状悬浊液流路，并由这些干线状悬浊液流路依次分支出联络多个悬浊液注入口的支线状悬浊液流路的情况。

此外，作为从悬浊液供给口至各个悬浊液注入口的直线距离，取决于悬浊液注入口的设定位置，并非必须相同。但是，基于前述第10发明的效果部分所述的理由，极优选将多个悬浊液流路中的从(1)的悬浊液供给口至(3)的悬浊液注入口的长度设为实质上相同。为满足这样的要求，例如，可以在特定的作为干线的悬浊液流路中、和/或特定的作为支线的悬浊液流路中有意地设定用于调节流路长度的迂回路部分。

关于上述(3)的悬浊液注入口，各个悬浊液注入口按照与各个细胞定着部的位置对齐的方式而设定。并且，悬浊液注入口在器件主体的平坦底面向下开口。另一方面，如前所述，在将器件主体设置在神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上时，器件主体的底面与细胞定着部中的复数个突起部的顶端接触。从以上的观点出发，由悬浊液注入口注入的神经细胞悬浊液被可靠地注入到细胞定着部的内侧。从该点出发，优选悬浊液注入口的开口径与由复数个突起部规定的细胞定着部的内径大致相同、或比其稍小的程度、或比其稍大的程度。

基于前述第13发明的效果部分所述的理由，器件主体进而优选还具有用于将神经细胞悬浊液注入神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板中的细胞定着部以外的区域的第2悬浊液流路系统。

作为该第2悬浊液流路系统，可以将例如与前述(1)的构成类似的第2悬浊液供给口设置在板状器件主体的适当个数的部位。这种情况下的第2悬浊液供给口可以不介由微细的悬浊液流路系统而是直接贯通至器件主体的底面，也可以在分支为与前述(2)类似的复数个第2悬浊液流路后，联络开口于器件主体的底面的、与前述(3)类似的第2悬浊液注入口。第2悬浊液流路系统中，复数个第2悬浊液流路可以设置为实质上相同的长度。

实施例

以下对本发明的实施例进行说明。本发明的技术范围不受这些实施例限定。

〔第1实施例〕

第1实施例的装置如图5所示。该装置是将神经细胞网络形成用培养装置构成为作为离子通道生物传感器的培养型的平面膜片钳装置的装置。

作为该装置中的电绝缘性的基板14，使用的是硅基板。基板14设有用于使其第一表面侧(图的上侧)和第二表面侧(图的下侧)连通的、直径为1～3μm的微细贯通孔15。图5中在基板14的中央设置1个微细贯通孔15，但也可以使用更大的基板并设置复数个或多个微细贯通孔15，并且这些各微细贯通孔15可以分别按照以下方式来构成。

在微细贯通孔15的第一表面侧的开口部上的基板面形成由复数个突起部12包围成的细胞定着部13，在该细胞定着部13配置1～数个神经细胞11(为了方便图示，仅示出1个神经细胞)。

基板14，其第一表面侧和第二表面侧被1对间隔件16、17夹持。间隔件16、17的构成材料没有限定，第一表面侧的间隔件16可以优选使用有弹性的不透光性材料，例如硅橡胶、PDMS(polydimethylesiloxane，聚二甲基硅氧烷)等。另一方面，第二表面侧的间隔件17可以优选使用透光性材料。

在间隔件16的中央部分缺失而形成用于构成神经细胞网络的大的培养空间18，在该培养空间18中的基板14面上设置有1处或复数处～多处配置了上述神经细胞11的细胞定着部13(为了方便图示，仅示出1处细胞定着部)。此外，基板14面中的细胞定着部13以外的部分也播种了神经细胞11。

间隔件17中，在与基板14的微细贯通孔15对应的部分设置有例如圆形的缺口部19，因此微细贯通孔15的第二表面侧的开口部开口于该缺口部19。因此，该缺口部19与细胞定着部13及微细贯通孔15对应地设置1处或复数处～多处(为了方便图示，仅示出1处缺口部19)。

并且，形成为上述基板14及1对间隔件16、17的整体被1对结实的平板20、21夹紧的结构。作为平板20、21的材料，只要是能够耐受120℃左右的高压灭菌釜灭菌的材料则没有特别限定。但是，第一表面侧的平板20可以优选使用不透光性材料。另一方面，第二表面侧的平板21可以优选使用透光性材料。

以上的构成中，在第一表面侧的平板20的中央部，在与第一表面侧的间隔件16中的上述培养空间18对应的位置设置有与培养空间18同样大小的、例如圆形的缺口部。在该缺口部的周缘形成平板的厚度小的凹部状的台阶部，在该台阶部设置盖玻片之类的盖部件(省略图示)，由此，使得上述间隔件16中的缺口部的开口能够开放和关闭。由此，在第一表面侧构成主储液22。

另一方面，通过用平板21堵住第二表面侧的间隔件17中的缺口部19的开口，从而形成第二表面侧的储液部23。第一表面侧的主储液22和第二表面侧的储液部23介由微细贯通孔15而连通。

主储液22构成第一表面侧的储液部的第1区域。该主储液22介由间隔件16中设置的狭窄液体通路24而与第一表面侧的构成储液部的第2区域的副储液25连通。副储液25由在间隔件16及平板20中共通设置的孔形成。副储液25配置有后述的第一表面侧的电极部28。

在基于主储液22、液体通路24及副储液25构成的第一表面侧的储液部中导入、并保持作为导电性液体的细胞培养基。导电性液体中可以预先分散有神经细胞。作为导电性液体，可以使用含有140mM NaCl、3mM KCl、10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES)、2.5mM CaCl₂、1.25mM MgCl₂及10mM葡萄糖的pH 7.4(with HCl)等的缓冲液、或添加有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutamaxTM(Gibco)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，DMEM)(Sigma)等细胞培养基。导电性液体的组成可以根据神经细胞的种类适当变更。

在第二表面侧的储液部23中，导入40mM CsCl、80mM CsCH₃SO₄、1mM MgCl₂、10mMHEPES、2.5mM MgATP、0.2mM Na₂EGTA，(pH7.4)等被称为吹打溶液的缓冲液或细胞培养基等。将导电性液体向储液部23导入的操作通过管状的导入用液体通路26来进行，其排出通过排出用液体通路27来进行。本实施例中，作为导入用液体通路26及排出用液体通路27，使用的是外径为1mm、内径为0.5mm的PEEK制管，关于这些液体通路的构成材料，只要是能够耐受120℃左右的高压灭菌釜灭菌的材料则也可以使用其它材料。

在排出用液体通路27中，也设置有与第一表面侧的电极部28同样地构成的第二表面侧的电极部29(通过点划线简单示出)。这些电极部28、29的构成将在后面叙述。通常，使第一表面侧的电极部28的电极接地、对第二表面侧的电极部29的电极施加膜电压。

在将分散有神经细胞11的导电性液体导入主储液22时，通过与排出用液体通路27联络的适当的液体抽吸器件抽吸储液部23的导电性液体时，通过微细贯通孔15，主储液22的导电性液体也被抽吸。利用这样的操作，可以有效地将神经细胞11配置在图5所示的细胞定着部13(即，微细贯通孔15的开口位置)。

进而，此时由于抽吸压力，可以在与微细贯通孔15接触的部分神经细胞11的细胞膜上形成微细的孔。为了在神经细胞11上形成这样的孔，此外还有如下方法，即，将制霉菌素、两性霉素B等细胞膜穿孔性的抗生素的溶液由导入用液体通路26导入到第二表面侧的储液部23。当在细胞膜上形成这样的孔时，神经细胞内和第二表面侧的储液部23呈电导通的状态。

另一方面，作为将神经细胞11配置在细胞定着部13(微细贯通孔15的开口位置)的手段，还可以使具有细胞固定力的细胞外基质形成物质30附着在基板14的微细贯通孔15的第一表面侧的开口部周缘。

以上的构成中，神经细胞11中出现规定的离子通道，当在第一表面侧的储液部添加用于打开该离子通道的刺激物质时，离子通道开放，并流通与施加在第一表面侧的电极部28和第二表面侧的电极部29间的电压相应的通道电流。此时，若神经细胞11的细胞膜和基板14之间存在间隙，则薄膜电阻下降，通道电流上叠加漏电流。

膜电位除了实际施加在电极间的电压以外，还叠加了空间中存在的电磁波所产生的诱导电压、电极金属表面和包围其的缓冲液之间的界面电位、液/液界面电位，因此漏电流会根据诱导噪音、界面电位的变动而相应地变动。因此，对于离子通道电流，会表现为基线变动的噪音形式。

虽然未提交详细数据，在容易获得千兆欧姆以上的薄膜电阻的移液管膜片钳中，即使膜电位的变动比较大，基线变动噪音的影响也很小，为可以忽视的程度。但是，在薄膜电阻比较小的(～10MΩ)培养型平面膜片钳中，必须减少该膜电位的变动。因此，本实施例中开发了膜电位的变动小、稳定的电极。利用这样的电极，可以大幅降低膜电位的变动，即使薄膜电阻小，也可以将噪音电流抑制为较小并进行计测。

以下对第一表面侧及第二表面侧的电极部28、29的结构进行说明，但省略详细的图示。内径为1mm的由Pyrex(注册商标)玻璃构成的筒状电极容器31的内部充满了以饱和浓度溶解有KCl和AgCl的电极溶液32。添加浓度3.3M/L的KCl、约1.1mM/L的AgCl。需要说明的是，KCl的饱和浓度在常温下为约3.3M/L。收纳在电极容器31内的AgCl/Ag电极33，在银线的表面包覆有AgCl。这样的AgCl/Ag电极33可以在银线的表面涂布AgCl粉末而形成，或者也可以在含有次氯酸钠的漂白剂等中浸渍银线而制作。此外，还可以通过在KCl溶液内进行电镀而制作。

电极容器31的前端部填塞有多孔玻璃、多孔陶瓷等无机多孔材料34。作为无机多孔材料34，实际使用的是Vycor玻璃(康宁公司)。由此，构成电极容器31的容器壁的一部分的无机多孔材料34的前端浸渍于导电性液体(细胞培养液、缓冲液)中。导电性液体中的KCl浓度为数毫摩尔，由于无机多孔材料34的效果,电极容器31的容器内和容器外为电导通的状态，但是电极溶液32和容器外的导电性液体的混合小，为可以忽视的程度，因此容器内和容器外的较大KCl浓度差被保持恒定，由此AgCl/Ag电极33的界面电位、液/液界面电位被保持恒定。电极容器31的基端部用密封材料进行密封，电极销35从该处突出。

在使用表达用光打开通道的离子通道的细胞、对通道电流进行控制时，若配置以上的第一表面侧及第二表面侧的电极部28、29，则第一表面侧的储液部由不透光性的间隔件16、平板20形成，因此照射主储液22的照射光不会照射第一表面侧及第二表面侧的电极部28、29的AgCl/Ag电极。此外，在主储液22配置有神经细胞11，细胞外部的导电性液体的钾离子浓度小至数mM左右，因此可以说为微量，抑制由电极部露出的KCl的影响是理想的，因此，关于第一表面侧的储液部，在主储液22的基础上制作副储液25，并用宽度为1mm以下的狭窄液体通路24将这些主储液22及副储液25连结。

〔第2实施例〕

第2实施例如图6所示。该第2实施例及后面的第3实施例是对第1实施例中的要点进行进一步详述的例子。这些实施例中的部件编号虽然与第1实施例不同，但为相同部件名的情况下，其构成实质上是相同的。

在Si基板1的表面，通过旋转涂布以8～10μm的厚度涂布负型光致抗蚀剂SU8，使用预先准备的光掩模按照通常的工序进行显影，形成在图6的(a)、图6的(b)作为一例而示出的包含复数个栅状突起部12的细胞定着部13。

这种情况下的突起部是底面为10μm×10μm、高度为8～10μm的四角柱，突起部间的相互间隔为8～10μm。小鼠、大鼠的大脑皮质以及海马神经细胞的细胞体直径通常在播种时为10μm左右、在定着时为15～20μm，因此配置在包含该复数个突起部的细胞定着部2中的神经细胞3不会移动到细胞定着部2之外。但是，细胞培养基在细胞定着部2的内外移动，但对细胞定着部2内的细胞培养而言没影响。突起部的形状可以为圆柱、椭圆柱，也可以为球状的固态物。

利用包含复数个突起部12的细胞定着部13来进行的神经细胞3的配置在神经细胞网络的形成和利用中是有用的。如图6的(c)中示出的示意图，若将神经细胞3配置在细胞定着部13的内侧，则与位于细胞定着部13的外侧的神经细胞3形成网络。在该网络形成中，神经细胞3从轴突的前端释放神经递质，并向着欲结合的对方进行轴突的伸长，接受侧的神经细胞3也接受该神经递质并进行树突的伸长，形成突触联系。

本发明的特征在于，细胞定着部13内的神经细胞3和细胞定着部13外的神经细胞3存在于基板1的同一平坦面上，因此神经细胞间的通信的进行不受妨碍，能够持续进行稳定的培养，形成稳定的网络。本实施例的情况下，配置在细胞定着部2的内部的神经细胞3能够进行1个月以上的培养。

这样指定了规定的神经细胞的位置地形成网络从各方面出发都是有用的。在应用于图5所示的培养型平面膜片钳装置时，其效果特别显著。

细胞定着部13的内径可以如图6的(a)、图6的(b)所示那样容易地进行变更。其内径根据基于以下考虑的最合适的神经细胞个体数(团簇尺寸)来决定，所述考虑为：设为可以配置复数个(比较多个)神经细胞3的内径以便能够长期进行神经细胞网络的稳定培养、或设为可以配置使得网络的功能解析更容易的1个或少数个神经细胞3的内径。例如，在比较结实的大鼠大脑皮质神经细胞的情况下，可以为1～4个的团簇，在比较脆弱的iPS细胞或由其分化·诱导出的神经球的情况下，为了稳定地培养，优选为包含更多的细胞体的团簇。

〔第3实施例〕

基于图7对第3实施例进行说明。该图中，图7的(A)的右下部分的“c”形圆圈部分所示的图为将细胞定着部2的中央部的微细贯通孔4附近的截面放大的部分图。培养型平面膜片钳为如下构成：在Si、塑料、陶瓷、玻璃等基板1上形成直径为1～数μm的微细贯通孔4，在该微细贯通孔4之上放置神经细胞3，用规定的缓冲液分别将基板1的上部、下部填满，且设置有上部电极7、下部电极8。下部电极8与电流增幅器5联络。

微细贯通孔4中播种的神经细胞3的细胞膜开有微细的孔，形成神经细胞3内和基板1的下侧的缓冲储液电导通的全细胞(ホールセル)状态。作为使该神经细胞3开有微细的孔的方法，有如第1实施例中也言及的、对下部储液施加负压而破坏细胞膜的方法。此外，还存在下述方法：使溶解有制霉菌素、两性霉素等抗生素的缓冲液流入下部储液，在细胞膜中，使这些抗生素埋入细胞膜，形成使细胞内和下部储液电导通的状态。

此时，预先在微细贯通孔4的周边的基板1表面涂布细胞外基质形成物质9对于使神经细胞3长时间存活而言是有效的。作为细胞外基质形成物质9，已知有多种物质，熟知的是聚－L－赖氨酸、层粘连蛋白等。关于神经细胞3向该体系的播种，由于必须将单个细胞或复数个细胞准确无误地播种到细胞定着部2的内部，因此利用图示那样的微量移液管6来进行是特别有效的。

进而，此时，如图7的(A)的右下的要部放大图、即“c”形圆圈部分所示，从微量移液管6中以规定的速度将神经细胞3的悬浊液注入细胞定着部2的上部，与此同时，对该下部储液施加规定的负压，如图7的(B)所示那样，可以将神经细胞3高效地配置在微细贯通孔4之上。但是，若负压过大，则会导致神经细胞3死亡，因此有必要根据细胞种类而设定适当的压力。图7的(B)中，使用HEK293细胞进行抽吸实验，已经确认了为2kPa的负压时神经细胞3不会受损。已经确认，在为5kPa的负压时，8成神经细胞3不会受损。但是也确认到，在利用抽吸将神经细胞3配置到微细贯通孔4之上后，立即开始解除抽吸压力时，损伤会更少。

本实施例中，神经细胞3中预先导入有Ca成像用的探针分子。此外，神经细胞3中，还通过基因导入而表达能够利用激光等光进行刺激的通道视紫红质等光受体离子通道。此时，重要的是通道视紫红质的激励波长和Ca探针分子的激励波长充分远离从而不会发生干扰。本实施例中利用的通道视紫红质的激励波长为470～480nm，作为Ca探针，使用的是激励波长为494nm、发光波长为523nm的Oregon green BAPTA-1。在该第3实施例中实施的动作模式为以下4种。

(第一动作模式)

对微细贯通孔4之上的神经细胞3，预先通过上部电极7、下部电极8施加规定的膜电位(通常－80～+80mV)，在全细胞模式下对由于自然点火等而在神经细胞3内流动的离子通道电流进行观测(图7的(A)中的箭头记号“a”)。此时，观测到周边的神经细胞3的由于自然点火而产生的Ca离子流入、接受了神经递质的Na⁺、K⁺、Cl^－等突触电流(K.S.Wilcox etal.,Synapse 18(1994)128-151)，由此可以获得关于轴突状态、神经细胞3的状态的信息。

(第二动作模式)

对微细贯通孔4之上的神经细胞3，通过上部电极7、下部电极8注入规定的电流或施加电压(图7的(A)中的箭头记号“b”)，对神经细胞3给予刺激，使其产生活动电位。由此，在受到刺激的神经细胞3中发生Ca离子的流入。因此，观测到Ca探针的荧光(图7的(A)中的箭头记号“d1”)，并且，产生的活动电位被传输至周边的神经细胞3，使该周边的神经细胞3的Ca探针发光(图7的(A)中的箭头记号“d2”)。通过对该发光进行观测，可以确认信号的传输。即，可以获得关于神经细胞网络的信号传输特性的信息。

(第三动作模式)

将470～480nm的激光聚光后，对存在于微细贯通孔4之上(细胞定着部2内)的神经细胞3的附近、且表达通道视紫红质的单个神经细胞3进行照射(图7的(A)中的箭头记号“e”)，使该单个神经细胞3产生活动电位。从而，该活动电位信号通过网络传输至微细贯通孔上的神经细胞3，Ca通道开放，引发Ca离子的流入。其结果是，通过对预先设为全细胞模式的微细贯通孔上的神经细胞3施加膜电位的上部电极7、下部电极8，可以观测到离子通道电流。根据第三动作模式，可以在单个细胞水平对神经细胞网络的信号传输特性进行测定和详细解析。

(第四动作模式)

在前述第一～第三动作模式中，只要有至少1处的包括细胞定着部2和微细贯通孔4的组合的图7的(A)所示的结构，则可作为元件进行动作。并且，若在基板1上构成多个该结构，则可作为高通量筛选装置进行动作。与此相对，在以下的第四动作模式中，以与前述触发细胞和跟随细胞分别对应的各一个(共两个)图7的(A)所示的结构体来构成元件。

在基板1之上的复数个位置，形成由图7的(A)所示的微细贯通孔4和细胞定着部2组合的系统。通过电流注入或电压施加，使其中的几个位于微细贯通孔4上的神经细胞3(触发细胞)产生活动电位。并且，通过在全细胞模式下对该跟随细胞中的离子通道电流进行记录，对活动电位向其以外的位于微细贯通孔4上的神经细胞3(跟随细胞)的传输进行解析。在这些装置中，将神经细胞3配置在指定位置极为重要，可知能够指定位置并形成稳定的神经细胞网络的本发明是极为有用的。

此外，在上述第一、第三、第四的动作模式中，通过不仅测定微细贯通孔4中的离子通道电流，而且同时在基板1的上部观测Ca成像，从而可以更精密地进行网络功能解析，这是极为有效的。

〔第4实施例〕

第4实施例如图8的(a)、(b)所示。在作为平面照片的图8的(a)中，在Si基板的表面形成包含12根以小圆形表示的、直径为约10μm、高度为约8μm的圆柱的细胞定着部2，播种由17日龄的大鼠胎仔的大脑皮质采集的神经细胞3，在培养14天后，通过荧光显微镜对神经细胞网络的形成进行确认。在将培养基更换为规定的缓冲液后，在该缓冲液中混入被称为Oregon green Bapta-1的Ca探针，在约2小时后将缓冲液再次更换为不含Ca探针的液体，用荧光显微镜观察神经细胞3。

观察到数个神经细胞3被稳定地设置到细胞定着部2内、细胞定着部2内和细胞定着部2外的神经细胞通过网络相连的情形。此外，图8的(b)为对细胞定着部2内的神经细胞3的荧光强度的时间变化进行观察的结果，观察到神经细胞3活跃地反复自然点火、神经细胞3内的Ca浓度发生变动的情形。在本实施例中，细胞定着部2仅设置了一组，通过将其设为复数组，可以对信号由特定的细胞定着部2向另外的细胞定着部2的传输情形进行观测，可以正确且稳定地实施网络功能解析。

〔第5实施例〕

第5实施例如图9所示。按照将使用Si基板构成的培养型平面膜片钳元件的微细贯通孔包围的方式，使用负型光致抗蚀剂按照与第2实施例～第4实施例相同的方法形成包含复数个突起部的细胞定着部。通过与第4实施例同样的手法播种由大鼠胎仔的大脑皮质采集的神经细胞，培养14天后，确认到细胞定着部中的神经细胞被配置在微细贯通孔之上、及该神经细胞与周边的神经细胞形成了网络。

然后，将培养基在基板的上侧、下侧分别与规定的缓冲液进行交换，在下侧的缓冲液中混入500μg/ml浓度的制霉菌素，放置约10分钟后，在全细胞模式的配置下通过电流增幅器(Axopatch200B)对流入设置于基板1下侧的电极的电流进行检测。

其结果如图9的(A)所示。图9的(A)表示电流的膜电位依赖性。此外，40mV―TTX为在膜电位40mV下、且上侧的缓冲液中混入有作为Na通道阻断剂的河豚毒素(TTX)时观测到的电流。当膜电位由－变为+时，电流的波形方向也由下(－)变为上(+)，表现出来自自然点火的神经细胞的信号的传输、神经递质的自然放出时的突触电流特征。这些波形反映了网络的特征，在拮抗剂、激动剂这些药剂作用下，波形发生变化。细胞定着部和微细贯通孔所占的面积非常小，因此容易进行100点这样的多点计测，能够容易地进行高通量筛选所必须的多点计测。

需要说明的是，图9的(B)、图9的(C)汇总了从基板的上方部对各神经细胞的基于Ca成像的荧光强度的时间变化进行计测的结果。横轴为时间、纵轴为对各神经细胞所赋予的编号。圆的大小表示Ca荧光强度的强弱。图9的(B)所示的情况下，神经细胞的密度小，35mm盘中平均为2×10⁵个，因此来自神经细胞的发光是完全随机的。

与此相对，图9的(C)所示的情况下，神经细胞的密度大，35mm盘中平均为2×10⁶个，因此可知基于Ca成像的发光能够同步发生。这些结果意味着，通过在基板的下侧对离子通道电流进行计测、同时在上侧进行Ca成像，由此可以进行更精密的计测和解析。

〔第6实施例〕

第6实施例涉及细胞定着部13的改良实施例。如图10所示，在微细贯通孔的第一表面侧的开口部上的基板面，与第1实施例的情况同样地形成有由复数个突起部12包围成的细胞定着部13，神经细胞11被配置到该细胞定着部13中。并且，在使细胞定着部13形成环状的复数个突起部12的外侧，进而形成有由多个突起部12包围成的外侧细胞定着部36。即，第6实施例的特征在于，由突起部12构成的环为细胞定着部13的环和外侧细胞定着部36的环、即二重环结构。

由内侧的环包围成的区域、即细胞定着部13中存在微细贯通孔，在该区域定着有1～数个神经细胞11，神经细胞11可靠地存在于微细贯通孔之上。并且，同时，在内侧的环和外侧的环之间的区域、即外侧细胞定着部36中也播种了多个神经细胞11。因此，不仅是细胞定着部13内部的神经细胞11间，在细胞定着部13的神经细胞11和外侧细胞定着部36的神经细胞11之间也形成神经细胞网络。

在这样的包含细胞定着部13和外侧细胞定着部36的构成中，对于例如iPS细胞等之类的、在单个细胞的情况下不稳定、不形成多个细胞的集合就不能稳定培养的神经细胞而言，具有可靠地使一个神经细胞定着在微细贯通孔上并可以长期、稳定地进行培养的优点。

需要说明的是，在下面的第7实施方式中，将简单叙述在第6实施例时将神经细胞11分别播种到细胞定着部13和外侧细胞定着部36的方法的一例。

〔第7实施例〕

第7实施例涉及本发明的神经细胞播种器件。神经细胞播种器件的器件主体设置在上述实施例的神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的装置基板上，用于将神经细胞播种到装置基板中的由复数个突起部包围成的多个细胞定着部。

如图11的(a)的立体图所示，本实施例的神经细胞播种器件的器件主体40为具有4～6mm左右的厚度和2×2cm左右的方形的平面形状的平坦板状，包含上部板41和下部板42。上部板41和下部板42分别包含通过例如等离子体处理等进行了表面清洁的PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)等透明的塑料或硅橡胶，这些构成了在密合状态下加热而接合成的2层结构体。

在上部板41的上表面的中央部的一端侧，形成有用于从外部供给以一定密度悬浊有神经细胞的神经细胞悬浊液的、构成第1悬浊液流路系统的悬浊液供给口43。此外，在其上表面的中央部的另一端侧形成有构成第2悬浊液流路系统的第2悬浊液供给口43a。以下，首先对第1悬浊液流路系统进行说明。第2悬浊液流路系统将在后面叙述。

(第1悬浊液流路系统)

第1悬浊液流路系统包含前述第9发明～第12发明的悬浊液供给口、悬浊液流路、和悬浊液注入口。

首先，图11的(a)的沿着X－X线的剖面图(部分省略)如图11的(b)所示，由图11的(b)可知，在上部板41的下表面(与下部板42接合的面)形成有由悬浊液供给口43呈分枝状延伸设置的、内径和深度分别为50～500μm左右的微细的槽。因此，当使上部板41和下部板42在密合状态下接合时，由这些槽和下部板42的上表面构成用于流通神经细胞悬浊液的复数个微细的悬浊液流路44。

上部板41的下表面图(底面图)如图12的(a)所示。在图11的(b)中仅示出单个悬浊液流路44，实际上，由图12的(a)可知，由图的下侧所示的悬浊液供给口43呈分枝状地延伸设置有复数个悬浊液流路44。这些悬浊液流路44中，分别在适当部位设置多余的迂回流路，由此能够将这些流路的长度调节为彼此相近。

需要说明的是，为了方便图示，在图12的(a)中，悬浊液流路44仅仅以粗实线表示。这些图中所示的后述的第2悬浊液流路44a也仅仅以粗实线表示。

其次，图12的(b)示意性地示出神经细胞网络形成用培养装置或平面膜片钳装置的基板1的上表面图(平面图)，在基板1的上表面中示出5处定着部设定区域，所述定着部设定区域集中设置有多个由复数个突起部包围成的细胞定着部2(简单地以单个点表示)。在图12的(b)中还一并示出后述的第2悬浊液注入口45a，这些实际上形成在下部板42，而不是形成在基板1，但为了明确表示与上述5处定着部设定区域的位置关系，索性在图中示成。

假设处于神经细胞播种器件的器件主体40设置在基板1上的状态，通过与上述图12的(b)的关系，进一步增加基于图12的(a)的说明，从悬浊液供给口43呈分枝状延伸设置的复数个悬浊液流路44分别到达基板1上的、集中设置了多个细胞定着部2的5处定着部设定区域的正上方，在该位置形成有与下部板42所设置的多个悬浊液注入口45联络的5处注入口设定部46。

该注入口设定部46的放大图如图13所示。各注入口设定部46中，悬浊液流路44分支为纵向的5条流路，这5条分枝出的流路分别与下部板42所设置的多个悬浊液注入口45联络。即，如图12的(b)所示，在基板1上的5处定着部设定区域沿着纵向形成有5条细胞定着部2，其中的每1条中包含5个细胞定着部2，悬浊液流路44的纵向的5条流路的位置与全部的这些细胞定着部2完全对应，且下部板42中也与全部的细胞定着部2完全对应地形成有悬浊液注入口45。

悬浊液注入口45的内径与细胞定着部2的内部区域的大小大致相同或稍大，但是，比包括突起部12在内的细胞定着2的外形小。因此，成为突起部12不会进入悬浊液注入口45的内部的构成。

因此，在例如加压状态下将神经细胞悬浊液供给至构成第1悬浊液流路系统的悬浊液供给口43时，通过悬浊液流路44和悬浊液注入口45，在极短时间内将大致相同量的神经细胞悬浊液注入基板1上的5处定着部设定区域中所设置的总计250处细胞定着部2的每一处中。其结果是，以“发明的效果”部分所述的优选形态，对细胞定着部2播种神经细胞。

(第2悬浊液流路系统)

第2悬浊液流路系统为前述第13发明的、用于对装置基板中的细胞定着部以外的区域注入神经细胞悬浊液的悬浊液流路系统，包含图11的(a)所示的第2悬浊液供给口43a、由该第2悬浊液供给口43a如图12的(a)所示那样呈分枝状延伸设置的复数个第2悬浊液流路44a、和在这些第2悬浊液流路44a的各末端形成于下部板42的第2悬浊液注入口45a。各第2悬浊液注入口45a在图12的(a)中以虚线表示，在图12的(b)中以实线表示。

在第2悬浊液供给口43a、第2悬浊液流路44a及第2悬浊液注入口45a的结构关系中，与关于第1悬浊液流路系统的图11的(b)所示的悬浊液供给口43、悬浊液流路44及悬浊液注入口45的情况相同。但是，在第2悬浊液流路系统中，复数个第2悬浊液流路44a的流路长度即使不同也是可以的，此外，第2悬浊液注入口45a如图12的(b)所示那样开口在基板1上的细胞定着部以外的区域。

因此，在例如以加压状态将神经细胞悬浊液供给至构成第2悬浊液流路系统的第2悬浊液供给口43a时，通过第2悬浊液流路44a及第2悬浊液注入口45a将神经细胞播种到基板1上的细胞定着部以外的区域。

需要说明的是，如第6实施例那样形成有细胞定着部13和外侧细胞定着部36时，在器件主体40中，为了将神经细胞播种到外侧细胞定着部36中，器件主体40除了悬浊液流路44和第2悬浊液流路44a以外还可以形成用于将神经细胞播种到外侧细胞定着部36的第3悬浊液流路(省略图示)。或者，也可以使其与基板1上的器件主体40的位置稍稍错开后，利用悬浊液流路44将神经细胞播种到外侧细胞定着部36。

〔第8实施例〕

按照上述方式，利用神经细胞播种器件的器件主体40中所设置的第1悬浊液流路系统，将规定的浓度的神经细胞悬浊液注入各细胞定着部2。并且，细胞定着部2的复数个突起部12的相互间隔比播种时的神经细胞的细胞体的尺寸小，且足够宽以使得神经细胞悬浊液的介质液(例如神经细胞的培养液)可以容易地流出，因此通过将神经细胞悬浊液从上部导入细胞定着部2，从而介质液流出、神经细胞停留在细胞定着部2的内部而被播种在其中。

由此，可以将细胞在短时间内、且几乎同时地无损伤地播种到多个细胞定着部2。其结果是，可以稳定且容易地形成包含多个细胞定着部(平面膜片钳装置的多个通道电流计测点)的神经细胞网络。

从而，当利用在突起部12间存在间隙这一点进行播种时，对该间隙和细胞体尺寸间的关系进行更详细的研究是重要的。即，神经细胞的细胞体的形状在播种时和培养中通常差别较大。此外，细胞体的形状也不是正圆，而是细长的椭圆形。

因此，有必要使突起部12的相互间隔形成为：播种时的细胞体的尺寸最小值(短轴方向的尺寸)与培养中的细胞体的尺寸最小值中任一较小的值以下、且能够使神经细胞悬浊液的介质液可以容易地流出或能够使神经细胞的轴突、树突容易地在细胞定着部2中进出的尽量大的值。

作为一例，基于图14、图15对利用大鼠海马神经细胞进行实验的结果进行叙述。在图14中，将大鼠海马的多个神经细胞体的播种时的尺寸最大值(长轴方向的尺寸)的分布示于左侧的图，将其尺寸最小值(短轴方向的尺寸)的分布示于右侧的图。如图14所示，播种时的细胞体的尺寸最小值为约7.5μm。

另一方面，在图15中，将同上的细胞体培养时的尺寸最大值(长轴方向的尺寸)的分布示于左侧的图，将其尺寸最小值(短轴方向的尺寸)的分布示于右侧的图。如图15所示，培养时，细胞体变得细长，细胞体的尺寸最小值为约8μm。

进而，基于图16对利用大鼠海马神经细胞进行的其它实验进行叙述。图16为表示培养第4天的神经细胞情形的光学显微镜照片，照片中的4个大圆形为构成细胞定着部2的4个突起部12，白色线所示的轮廓表示神经细胞。如图16所示，神经细胞欲从外部通过突起部12间的间隙而侵入细胞定着部2。结果，该神经细胞无法侵入而在不久后后退。突起部12间的间隙为11μm、神经细胞的细胞体的短轴方向的尺寸为8.5μm。因此表明，图16的情况下，使突起部12间的间隙更窄些更为安全。

〔第9实施例〕

第9实施例涉及播种中使用的大鼠神经细胞悬浊液的调制方法。该悬浊液的调制如下进行。即，从17～18日龄的Wistar大鼠胎仔的脑部采集大脑皮质或海马，经过使用0.25％的胰蛋白酶溶液的酶处理(37℃、20分钟)将组织打散。然后，使用以最小必须培养基Minimum Essential Medium(MEM)为基本培养基的含血清培养基调制1.0×10⁷cells/ml的细胞悬浊液。然后，将该细胞悬浊液使用微型流路或微量注射器导入细胞定着部而进行播种。

〔第10实施例〕

第10实施例涉及所播种的iPS细胞的调制。即，由独立行政法人理化学研究所(日本)的细胞银行(CELL BANK)获得人诱导多能性干细胞(iPS细胞)株201B7，并将利用丝裂霉素C进行了增殖能力失活处理的源自STO细胞的细胞(SNL)作为饲养细胞，来进行培养。饲养细胞是指发挥辅助iPS细胞的自我复制作用的其它细胞。

作为培养液，使用包含作为血清替代物的KSR、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巯基乙醇的哺乳动物细胞培养用培养基(DMEM/F12培养基)，进而，在即将使用前添加重组人碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factorb，FGF)。将饲养细胞制成3×10⁴cells/cm²的浓度，将其播种在实施了适合于饲养细胞的包覆的6cm的盘中，在该操作1天后将iPS细胞播种到饲养细胞上。处于良好状态的iPS细胞，其集落的轮廓清晰，内部的细胞密度变高。iPS细胞的传代通常每3～4天进行1次传代。在进行3～4次的传代后，为了进行向运动神经元的分化诱导，将细胞从有饲养细胞的培养转移至表面包覆有明胶或基质胶的6cm的盘中，进入无饲养细胞培养。

在无饲养细胞培养下进行3～4代的传代后，开始进行向运动神经元的分化诱导。将进行了无饲养细胞培养的iPS细胞在增殖因子存在下进行悬浮培养，由此，对其进行向神经干细胞的分化诱导。分化诱导培养基为添加了葡萄糖、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、氯化硒的DMEM/F12培养基。作为分化诱导的悬浮培养工序，以5×10⁴cells/ml的密度进行2天的悬浮培养。然后，更换为添加了维甲酸(10^-8M)的分化诱导培养基，进行4天的悬浮培养。进而，此后更换为添加了FGF2(20ng/ml)、SHH-N(30nM)的分化诱导培养基，培养7天。通过该处理，细胞的形态变为神经干细胞。

将该神经干细胞打散，在包覆有聚L-赖氨酸的培养盘中进行黏附培养，由此在黏附培养开始5周后进行向成熟的运动神经元的分化。在传感器基板上形成神经细胞网络的情况下，将基板表面用聚L-赖氨酸包覆，将打散的神经干细胞播种在其上，在黏附培养开始5周后，形成包含运动神经元的网络。当在基板上形成神经细胞网络时，将基板表面用聚L-赖氨酸包覆，将打散的神经干细胞播种在其上，在黏附培养开始5周后，形成包含运动神经元的网络。

产业上的可利用性

根据本发明，可以提供可以制约在细胞培养基中处于存活状态的神经细胞的移动并构成良好的神经细胞网络的神经细胞网络形成用培养装置、和其利用手段。

Claims (8)

1.一种神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，其特征在于，包含：具有贯通孔的电绝缘性基板、形成在该电绝缘性基板的第一表面侧的第一储液部、形成在其相反侧即第二表面侧的第二储液部、以及按照能够分别对导入到第一储液部和第二储液部的导电性液体通电的方式配置的电极部，

电绝缘性基板的第一表面侧的贯通孔的周围具备由多个突起部围成的细胞定着部，其中，多个突起部具有使神经细胞的细胞体无法通过的间隔，

所述贯通孔为具有使神经细胞无法通过的孔径的微细贯通孔，

所述电极部具有以下的(a)～(c)的要素，

(a)电极容器，在所述储液部导入有导电性液体时与该导电性液体接触的容器壁的至少一部分由无机多孔材料构成，

(b)收纳在上述电极容器内的、在贵金属Nm的表层部形成有该贵金属的氯化物NmCl层的电极，

(c)填充在上述电极容器内的、以饱和浓度溶解有所述贵金属的氯化物NmCl及碱金属氯化物的电极溶液。

2.根据权利要求1所述的神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，其中，由所述多个突起部规定的细胞定着部的内径为能够收纳1～数个神经细胞的细胞体的尺寸。

3.根据权利要求1或2所述的神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，其中，构成前述细胞定着部的底面的基板面被细胞外基质形成物质包覆。

4.根据权利要求1或2所述的神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，其中，在所述电绝缘性基板上，具备多个贯通孔和细胞定着部。

5.根据权利要求1或2所述的神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，其特征在于，所述神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置用于以下(A)～(C)中的任一种目的，

(A)在神经细胞网络中的神经细胞离子通道电流的计测、解析中使用，

(B)在至少包含Ca成像解析、基于作为突触前部位的标记物的突触泡蛋白或突触蛋白的标记的成像解析、基于作为树突的标记物的MAP2的标记的成像解析及基于对内体、外来体进行标记的FM1-43或FM4-64的成像解析的成像解析中使用，

(C)在神经细胞网络的高通量筛选系统中使用。

6.根据权利要求5所述的神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，其特征在于，所述神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置用于(B)所述的成像解析时，还具有下述(D)～(F)中的1个以上要素，

(D)在所述基板的上部设置有接受神经细胞所发出的光的受光装置，

(E)在所述基板的上部设置有对神经细胞或基板表面照射光的照射装置，

(F)上述(E)的照射装置装备有用于仅对规定的单个神经细胞照射光的聚光系统。

7.一种神经细胞网络形成方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1～权利要求6中任一项所述的神经细胞网络用培养型平面膜片钳装置，基于任意的研究目的而形成培养下的神经细胞网络，所述方法包括：

(1)在填充有细胞培养基的所述电绝缘性基板上播种神经细胞的工序、

(2)利用细胞定着部的细胞外基质形成物质、和/或通过从细胞定着部的底面的微细贯通孔抽吸液体培养基，对每一个细胞定着部配置、定着1～数个神经细胞的工序、和

(3)利用多个突起部制约定着在细胞定着部的神经细胞的移动，并且利用多个突起部的间隔部分使其相互地识别对方神经细胞的存在，使其形成基于轴突或树突的神经细胞间的突触联系的工序。

8.根据权利要求7所述的神经细胞网络形成方法，其特征在于，在所述神经细胞网络形成方法中，在(1)的工序中播种神经细胞时，将神经胶质细胞一起播种在细胞定着部以外的部分。