TWI598830B - Formation and utilization of neural cell networks, and neural cell sowing devices - Google Patents

Description

神經細胞網路之形成及其利用、以及神經細胞播種裝置

本發明係關於神經細胞網路的形成及其用途、以及神經細胞播種裝置。更詳細而言，本發明係關於在培養下藉由以神經細胞的軸突和其他神經細胞的樹突的突觸接合來形成神經細胞網路(neural network)的神經細胞網路形成用培養裝置、和使用該裝置來形成上述神經細胞網路的方法。進而，本發明係關於使用了上述神經細胞網路的高通量篩選(high throughput screening)技術、平面式片膜鉗制(planar patch-clamp)技術、神經細胞成像技術等。

進而，本發明係關於用於將神經細胞有效率地播種於神經細胞網路形成用培養裝置或利用了此培養裝置的平面式片膜鉗制裝置中的複數個選擇區域(細胞固定部)的神經細胞播種裝置。

本發明中，所謂的「神經細胞」係第一方面包括中樞神經細胞、末梢神經細胞等各種神經細胞。作為神經細胞，以軸突或樹突尚未突出的狀態者為宜。另外，所謂的「神經細胞」係第二方面包括例如iPS細胞或ES細胞之可分化成神經細胞的細胞，以處於由iPS細胞或ES細胞可 分化成神經細胞的完成途中的神經幹細胞等狀態者尤佳。進而，所謂的「神經細胞」係第三方面還包括具有在細胞彼此間形成網路的性質的細胞、以及可分化成具有在細胞彼此間形成網路的性質的細胞的細胞。

另外，所謂的「神經細胞的細胞體」是指除了神經細胞中如軸突、樹突之突出部分以外的細胞的主體部分。

進而，所謂的「選擇區域」或「細胞固定部」是指成為神經細胞網路形成的中心，或配置有離子通道電流測量或各種成像中應成為施加電流/電壓等之對象的神經細胞的基板上的區域，所謂的「選擇細胞」是指配置於選擇區域(細胞固定部)的神經細胞。

以往，出於研究目的或實用目的，提出了將神經細胞保持於培養基(特別是液體培養基)中，在神經細胞存活的狀態下在體外構成神經細胞網路。

例如下述非專利文獻1中，如圖2所示，在配置有電晶體的Si基板上設置被多個突起部包圍的區域，在該區域配置作為椎實螺(stagnalis)的末梢神經細胞集合體的大的神經節(ganglion)，檢測出神經細胞的電位變化。下述非專利文獻2中揭示，在基板上形成複數個如圖3所示的稱為「籠(cage)」的大致圓盤形的包圍(高度約9μm)，在各籠的中央部的空間配置神經細胞，同時通過設置於籠的數條通道，使神經細胞的軸突等朝向相鄰的籠中的神經細 胞延伸的神經元晶片。

先前技術文獻 非專利文獻

非專利文獻1：G. Zeck, et al., PNAS 98 (2001) 10457-10462

非專利文獻2：J. Erickson, et al., J. Neurosci. Methods, 175 (2008) 1-16

根據本申請發明人的研究，使用例如哺乳動物的神經細胞的神經細胞網路的形成具有下述問題。

亦即，為了構成具有良好的網孔狀形態的神經細胞網路，需要預先將神經細胞固定於規定的選擇區域(成為網孔的結節點的區域)。但是在液體培養基中處於存活狀態的哺乳動物的神經細胞具有能動性，有可能會隨機地移動，因此需要限制移動。

但是，例如如圖1所示，採用在基板上設置藉由用於引導軸突延伸的細槽連接的圓形的凹部(深度5μm)，在這些凹部中配置神經細胞的結構時，雖然可以限制神經細胞的移動，但配置於凹部中的神經細胞大部分在2~3天後死亡，判明存在無法構成良好的神經細胞網路的問題。

關於該問題，推測神經細胞對於培養條件或細胞附近 的狀況敏感，在形成神經細胞網路時，需要處於相鄰的神經細胞之間相互可容易地認識對方神經細胞的存在的狀態。上述試製結構中，各神經細胞被收納於凹部中，因為相鄰的神經細胞之間具有基板表面的5μm的高度差，因此相互難以確認對方細胞。因此認為神經細胞網路的形成會受到阻礙，會產生神經細胞的死亡率增大、突觸形成的未成熟等不良情況。

非專利文獻1是在被複數個突起部包圍的區域配置神經組織，但對象是不具有能動的移動性的螺的龐大神經節。而且，複數個突起部的相互間隔足足超過50μm，完全不能限制通常的神經細胞的移動。並且是在富含超過5μm高度的凹凸的電晶體基板上所構成的。

接著，非專利文獻2中，各籠中的神經細胞被包圍在相互高度為約9μm的稱為籠的凹凸結構中。而且雖然在籠中設置有寬10μm、高1μm的軸突延伸用通道，但通過這樣狹窄的通道，籠中的神經細胞難以相互認識對方神經細胞。因此，非專利文獻1、2中既未解決上述問題，也未暗示其解決手段。

進而，作為以高通量篩選應用為前提的神經細胞網路的形成方法，如何播種神經細胞的方面也是重要的技術。例如，將測定點設為100點，形成在測定點的周圍具有25點細胞固定部的網路時，需要將規定數目的神經細胞的細胞體在短時間，通常1小時以內接播種於總計2500點的細胞固定部。

但是，非專利文獻1、2中並未揭示用於有效率地將神經細胞播種多個細胞固定部的神經細胞播種系統。另外，使用通常的移液器、附計量功能的移液器、或微量注射器等器具，藉由手動操作將神經細胞播種於各細胞固定部的方法中，因為第1是難以準確地接種於極其微小的細胞固定部，第2是播種效率極其差，因而不符合現實。

因此，需求能夠在短時間、並且大致同時且無損傷地將細胞播種於多個細胞固定部的神經細胞播種用的裝置。此裝置必須以不阻礙裝置基板上的朝平面方向的神經細胞網路的形成的方式來組成。

因此本發明要解決的第一課題係提供可解決上述問題的神經細胞網路形成用的培養裝置和神經細胞網路形成方法。進而，要解決的第二課題係提供利用如此之神經細胞網路的平面式片膜鉗制裝置、高通量篩選技術、神經細胞成像技術等。

進而，要解決的第三課題係提供用於將神經細胞有效率地播種於神經細胞網路形成用培養裝置或利用了此培養裝置的平面式片膜鉗制裝置中的多個細胞固定部的神經細胞播種裝置。

(第1發明的構成)

用以解決上述課題的第1發明的構成是神經細胞網路形成用培養裝置，其中在可填充細胞培養基的平坦基板上 ，形成被多個突起部包圍的細胞固定部，此細胞固定部具備下述(1)~(3)的條件。

(1)在構成細胞固定部的多個突起部間，設定寬的間隔，以不使神經細胞的細胞體通過。

(2)藉由多個突起部所規定的細胞固定部的內徑為可容納1~數個神經細胞的細胞體的尺寸；所謂「數個」是指2~10個，以2~6個為宜，以3~5個尤佳。

(3)構成細胞固定部的底面的基板面係具備以下(A)及(B)中的至少一項要素。

(A)被覆有細胞外基質形成物質。

(B)為藉由前述基板面下部設置的吸引裝置之培養基吸引用的微細貫通孔，且設有不使神經細胞通過的孔徑。

另外，上述第1發明中，所謂的「1~數個神經細胞的細胞體」係指1個以上且10個以下，以1個以上且5個以下尤佳的神經細胞的細胞體。

(第2發明的構成)

用於解決上述課題的第2發明的構成是神經細胞網路形成用培養裝置，其中前述第1發明相關的培養裝置符合以下(1)~(3)中任一項。

(1)在前述基板上形成作為選擇區域的細胞固定部，在此細胞固定部配置1~數個作為選擇細胞的神經細胞，同時，將其他神經細胞僅是播種於基板上。

(2)在前述基板上以適宜的相互間隔來形成複數個細 胞固定部，在這些細胞固定部配置1~數個神經細胞，同時將其中的1個細胞固定部用作為配置了神經細胞的選擇區域使用。

(3)以可以在前述基板上形成複數個或多數個相當於上述(1)或(2)的神經細胞網路的單元的方式，使上述細胞固定部分散於適當的位置而形成的神經細胞網路的高通量解析用培養裝置。

對於上述的第2發明，基於其概念圖的圖4(a)和圖4(b)進行說明。圖4(a)表示第2發明的(1)相關的培養裝置中的基板上的主要部分的平面圖，圖示於中央的神經細胞11(實際為1~數個神經細胞)配置於作為被複數個(6根)圓柱狀的突起部12所包圍的細胞固定部13的選擇區域中，其周圍的神經細胞11僅播種於基板上。接著，藉由這些神經細胞11形成網路。

另一方面，圖4(b)表示第2發明的(2)相關的培養裝置中的基板上的主要部分的平面圖，在基板上以適宜的相互間隔來形成複數個細胞固定部13，在這些細胞固定部13分別配置神經細胞11(實際為1~數個神經細胞)，同時將其中的1個細胞固定部13用作選擇區域。接著，藉由這些神經細胞11形成網路。

另外，第2發明的(3)相關的培養裝置中，如圖4(a)或圖4(b)所示的神經細胞網路的單元，成為相互獨立的網路的單元，分散於基板上的適宜位置而形成複數個或多個。

(第3發明的構成)

用於解決上述課題的第3發明的構成是如前述第1發明或第2發明之神經細胞網路形成用培養裝置，其中，神經細胞網路形成用培養裝置係以神經細胞網路為對象之平面式片膜鉗制裝置， (1)前述基板為電絕緣性基板，設置使構成該電絕緣性基板的細胞固定部的底面的基板面的兩側的表面連通之前述微細貫通孔，(2)微細貫通孔的第一表面側的神經細胞網路形成側、與其相對側的第二表面側，分別設置用以保持前述細胞培養基的導電性液體的貯液部、與配置為可對該貯液部的導電性液體通電的電極部，(3)第一表面側的貯液部被用作為固定於前述細胞固定部的神經細胞用的貯液部。

(第4發明的構成)

用於解決上述課題的第4發明的構成是神經細胞網路形成用培養裝置，其中前述第3發明所述的平面式片膜鉗制裝置中，前述第一表面側及第二表面側的電極部具備以下(a)~(c)的要素。

(a)前述貯液部中導入導電性液體時，接觸該導電性液體的容器壁的至少一部分係由無機多孔材料所構成的電極容器。

(b)容納於上述電極容器內之於貴金屬Nm的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極。

(c)填充於上述電極容器內之以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl及鹼金屬氯化物的電極溶液。

(第5發明的構成)

用於解決上述課題的第5發明的構成是前述第1發明~第4發明中任一項的神經細胞網路形成用培養裝置，其中神經細胞網路形成用培養裝置係使用於以下(A)~(C)中的任一個目的者。

(A)使用於神經細胞網路中的神經細胞離子通道流的测量、解析。

(B)使用於至少包含Ca成像解析、藉由前突觸部位標記物的突觸素(Synaptophysin)或突觸蛋白(Synapsin)的標記的成像解析、藉由樹突標記物的MAP2標記的成像解析、以及藉由標記內體、外泌體的FM1-43或FM4-64的成像解析的成像解析。

(C)使用於神經細胞網路的高通量篩選系統。

(第6發明的構成)

用於解決上述課題的第6發明的構成是前述第5發明中的神經細胞網路形成用培養裝置，當神經細胞網路形成用培養裝置係使用於(B)記載的成像解析的培養裝置時，進一步具備下述(D)~(F)中1者以上的要素。

(D)在前述基板的上部，設置有神經細胞發出的光的受光裝置。

(E)在前述基板的上部，設置有對神經細胞或基板表面照射光的照射裝置。

(F)上述(E)的照射裝置配備有用於僅對指定的單一神經細胞照射光的聚光系統。

(第7發明的構成)

用於解決上述課題的第7發明的構成是神經細胞網路形成方法，其係使用第1發明~第6發明中任一項記載的神經細胞網路形成用培養裝置，基於任意的研究目的來形成培養下的神經細胞網路的方法，該方法包括(1)於細胞培養基填充下的前述平坦基板上，播種神經細胞的步驟及(2)藉由細胞固定部的細胞外基質形成物質及/或藉由自細胞固定部的底面的微細貫通孔吸引液體培養基，在每一個細胞固定部，配置/固定1~數個神經細胞的步驟；及(3)藉由複數個突起部限制固定於細胞固定部的神經細胞的移動，同時藉由複數個突起部的間隔部分，使相互認識對方神經細胞的存在，形成利用軸突或樹突的神經細胞間的突觸接合的步驟。

(第8發明的構成)

用於解決上述課題的第8發明的構成是前述第7發明的神經細胞網路形成方法中，於(1)的步驟播種神經細胞時，一併將神經膠質細胞播種於細胞固定部以外的部分之 神經細胞網路形成方法。

(第9發明的構成)

用於解決上述課題的第9發明的構成是神經細胞播種裝置，其是設置於神經細胞網路形成用培養裝置或利用了該培養裝置的平面式片膜鉗制裝置中的可填充細胞培養基的平坦裝置基板上，用於將神經細胞播種於被裝置基板中的多複數個突起部所包圍的多個細胞固定部之神經細胞播種裝置，可設置於前述裝置基板上的板狀裝置本體，在其設置狀態下具有覆蓋前述多數細胞固定部的大小，同時其平坦底面與多數細胞固定部中的多個突起部的頂端接觸，裝置本體設置有(1)用於從外部供給以一定密度懸浮神經細胞的神經細胞懸浮液的懸浮液供給口，(2)在裝置本體的內部，由前述懸浮液供給口成分枝狀延伸設置的多數的微細的懸浮液流路、及(3)在前述各懸浮液流路的末端，開口向裝置本體的底面開口之用於將神經細胞懸浮液注入前述各細胞固定部的懸浮液注入口。

(第10發明的構成)

用於解決上述課題的第10發明的構成是前述第9發明相關的神經細胞播種裝置中，多數的前述懸浮液流路實質上設定成相同的長度，並且在神經細胞網路形成用培養裝置或平面式膜片鉗制裝置的裝置基板上設置前述神經細 胞播種裝置時，各個前述懸浮液注入口被設計成正確地對應各個前述細胞固定部而定位之神經細胞播種裝置。

(第11發明的構成)

用於解決上述課題的第11發明的構成是前述第9發明或第10發明相關的神經細胞播種裝置中，板狀的裝置本體係將設置有前述懸浮液供給口的上部板與設置有前述懸浮液注入口的下部板以密合狀態接合而成，並且在上部板與下部板的至少一者的接合面，形成有構成前述懸浮液流路的溝槽之神經細胞播種裝置。

(第12發明的構成)

用於解決上述課題的第12發明的構成是前述第9發明~第11發明中任一項相關的神經細胞播種裝置中，神經細胞網路形成用培養裝置係第1發明記載的神經細胞網路形成用培養裝置，及/或前述第9發明~第11發明中任一項相關的平面式片膜鉗制裝置為第3發明記載的平面式片膜鉗制裝置之神經細胞播種裝置。

(第13發明的構成)

用於解決上述課題的第13發明的構成是前述第9發明~第12發明中任一項相關的神經細胞播種裝置中，裝置本體進一步具備用於對前述神經細胞網路形成用培養裝置或前述平面式片膜鉗制裝置的裝置基板中的前述細胞固 定部以外的區域，注入前述神經細胞懸浮液用之第2懸浮液流路之神經細胞播種裝置。

(第1發明的效果)

第1發明的神經細胞網路形成用培養裝置中，因為具備形成於平坦基板上，被複數個突起部包圍的細胞固定部，所以配置於其中的神經細胞被複數個突起部限制了隨機的移動。因此，神經細胞的隨機的移動受到限制。

但是，細胞固定部的內側和外側處於同一平坦基板面上，其間沒有高度差(凹凸)。而且，在細胞固定部中的複數個突起部之間，設定有寬的間隔，以不使神經細胞的細胞體通過，此間隔部分的上方是開放的空間，並非如前述非專利文獻2中所揭示之之狹窄通道空間。因此，配置於細胞固定部的神經細胞可以相互容易地認識要形成網路的對方神經細胞，基於利用了突起部間的間隔的軸突和樹突的突觸接合的形成，可構成良好的神經細胞網路。

進而，藉由複數個突起部所規定的細胞固定部的內徑為可以容納1~數個神經細胞的細胞體的尺寸，所以在細胞固定部配置並固定1~數個神經細胞的細胞體。一般神經細胞(特別是iPS細胞等)為數個左右的集合體(簇群)的狀態時，可長期穩定地存活。相反地，在細胞固定部配置單一神經細胞時，神經細胞間的訊號傳遞被簡單化，變得容易解析網路功能。第1發明中，由於在細胞固定部配置 /固定1~數個神經細胞之細胞體，因而可以平衡良好地滿足上述兩方面的要求。

使用第1發明的神經細胞網路形成用培養裝置時，可使神經細胞長期存活4週以上，可以維持活性的神經細胞網路。

進而，在第1發明中，在構成細胞固定部的底面的基板面，被覆對神經細胞表現出黏附力的細胞外基質，及/或設置有藉由設置於基板的下部的吸引裝置的細胞培養基吸引用的微細貫通孔，其具有不使神經細胞通過的孔徑。因此，在接種神經細胞時，1~數個神經細胞的細胞體被確切地配置、並且固定於網孔狀的神經細胞網路中成為網孔的結節點的細胞固定部。就上述各點，根據第1發明可以解決前述本發明的課題。

(第2發明的效果)

藉由第2發明，提供如圖4(a)所示的神經細胞網路、或如圖4(b)所示的用於形成神經細胞網路的神經細胞網路形成用培養裝置，進而，可在基板上形成複數個或多個這些神經細胞網路的單元。因此，亦提供神經細胞網路的高通量解析用培養裝置。

(第3發明的效果)

平面式片膜鉗制裝置是指在如矽晶片之類的電絕緣性的固體基板上構成複數個片膜鉗制裝置，而可多點測量， 各片膜鉗制裝置的細胞配置部位分別設置有用於測量離子通道電流的微細貫穿通孔者。第3發明的平面式片膜鉗制裝置中，前述第1發明中的(3)的(B)中規定的「藉由設置於基板的下部的吸引裝置的細胞培養基吸引用的微細貫通孔」被用作離子通道電流測量用的微細貫通孔。

另外，在第二表面側的細胞培養基中混入具有引誘神經細胞的效果的腺苷5-β硫代二磷酸、尿苷5-三磷酸三鈉鹽水合物、EGF等物質，將神經細胞引誘至第二表面側的細胞培養基時，由於神經細胞被微細貫通孔誘導，因而在培養期間，可以將神經細胞更確實地限制於微細貫通孔上。

因為傳統的平面式片膜鉗制裝置不具有細胞培養的功能，因而有無法適用於如神經細胞之需要培養的細胞的問題。亦即，由於作為測定對象的細胞的壽命在非培養條件下為1小時或30分鐘以下的短時間，因而只能進行創新藥物篩選等有限的應用，難以應用於活用吸管片膜鉗制的細胞的功能解析等。進而，還難以將細胞良好地運輸並捕獲至設置於基板的微細貫穿通孔的部位。

但是，根據第3發明，將第1發明或第2發明相關的神經細胞網路形成用培養裝置，用作以神經細胞網路為對象的平面式片膜鉗制裝置，可提供以需要培養的神經細胞的神經細胞網路為對象，並且測定對象的神經細胞的壽命明顯延長的平面式片膜鉗制裝置。接著，如果利用第2發明的(3)中規定的神經細胞網路形成用培養裝置，則可以 對神經細胞網路進行高通量篩選。

(第4發明的效果)

然而，即使如上述第3發明之平面式片膜鉗制裝置中，也具有如下所述的問題。

亦即，如前述第1發明中的(3)的(A)，使測量離子通道電流的微細貫通孔的周邊(細胞固定部)附著有細胞外基質形成物質時，神經細胞的細胞膜與微細貫通孔周邊的基板表面之間會形成些微的間隙，即所謂的密封電阻降低。流過該間隙的電流相對於離子通道電流是作為漏電流加入，此若變化時，則作為雜訊而起作用。所以，在密封電阻降低的狀態中，即使是相對於輕些微的施加膜電位的變動，雜訊電流也變大，離子通道電流的準確測量變得困難。

在達成細胞的離子通道電流的準確測量上，如上所述，平面式片膜鉗制裝置的密封電阻低的情形自不必說，即使密封電阻不低的情形，預先實施雜訊電流對策是有效並且重要的。作為雜訊電流對策，除了增大密封電阻以外，抑制電極側的施加膜電位的變動也是有效的。

接著，作為平面式片膜鉗制裝置的電極，使用貴金屬Nm(例如銀Ag)的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層(例如AgCl層)的電極時，如上所述的施加膜電位的變動主要是因AgCl/Ag電極的表面與包圍其的溶液之間的界面電位的變動、或液-液界面電位的變動造成者。

因此，如第4發明，在電極部的電極容器內，將 AgCl/Ag電極浸漬於AgCl和鹼金屬氯化物(例如KCl)的飽和溶液的電極溶液(KCl濃度為百數十毫莫耳左右)中，使此等藉由無機多孔材料所構成的容器壁，接觸如細胞培養液之導電性液體(KCl濃度為數莫耳左右)時，電極容器的內部和外部成為通電的狀態。但是，由於液體本身基本無法通過無機多孔材料的細孔，因而電極容器內部的電極溶液與電極容器外部的導電性液體的混合小到可以被忽視的程度。其結果係電極容器的內部與外部的KCl的大濃度差被保持恆定，AgCl/Ag電極的界面電位、或液-液界面電位變得恆定，而不發生施加膜電位的變動。

(第5發明的效果)

根據第5發明，可以將第1發明~第4發明的神經細胞網路形成用培養裝置，使用於下述中任一個：(A)神經細胞網路中的神經細胞離子通道電流的测量、解析；(B)至少包含Ca成像解析、藉由前突觸部位標記物的突触素或突触蛋白標記的成像解析、藉由樹突標記物的MAP2標記的成像解析、以及藉由標記內體、外泌體的FM1-43或FM4-64的成像解析的成像解析；(C)神經細胞網路的高通量篩選系統。

(第6發明的效果)

根據第6發明，在前述第5發明的神經細胞網路形成用培養裝置是用於(C)記載的成像解析的裝置時，由於進 一步具備上述(D)的受光裝置、(E)的照射裝置、(F)的聚光系統的1個以上的要素，所以可獲得下述效果：第一，因為在許多情形下可進行非接觸並且非破壞下的測量，所以可以進行解析而不會阻礙神經細胞網路功能；第二，由於是光測量，所以可高速解析，第三，即使在細胞固定部配置有複數個神經細胞(細胞簇群)，亦可藉由(F)的聚光系統準確地激發單一神經細胞而精密地進行解析。

(第7發明的效果)

根據第7發明的神經細胞網路形成方法，使用第1發明~第6發明中任一項記載的神經細胞網路形成用培養裝置，進行前述(1)~(3)的步驟。

因此，將神經細胞播種於填充有細胞培養基的平坦基板上時，藉由各細胞固定部的細胞外基質形成物質、或藉由自細胞固定部的底面的微細貫通孔吸引細胞培養基，可以使1~數個神經細胞的細胞體確切地配置並固定於該細胞固定部。更具體地，可以將細胞體配置、固定於細胞固定部的微細貫通孔上。

另外，此時各細胞固定部的內徑大致對應於可容納1~數個神經細胞的細胞體的尺寸，所以1~數個神經細胞被確切地配置於各細胞固定部。接著，這些神經細胞被構成細胞固定部的複數個突起部限制了隨機的移動。並且細胞固定部的內側和外側處於同一平坦基板面上，它們之間沒有高度差(凹凸)，所以配置於細胞固定部的神經細胞可 以通過構成細胞固定部的複數個突起部的間隔，相互容易地認識要形成網路的對方神經細胞。因此，神經細胞可以在維持活性的存活狀態，同時基於利用突起部間的間隔的軸突和樹突的突觸接合的形成而構成良好的神經細胞網路。

由以上各點，根據第7發明，可在配置、固定於各細胞固定部的1個神經細胞或數個神經細胞簇群的相互間良好地形成神經細胞網路。依據此方法時，神經細胞能夠以大致100%的概率形成穩定的網路，可以長期持續培養4週以上。因此，是極適用於製作神經細胞網路的高通量篩選元件的技術。

(第8發明的效果)

根據第8發明，在上述第7發明的(1)的步驟，播種神經細胞時，將神經細胞播種於選擇區域內和選擇區域外，同時將神經膠質細胞播種於選擇區域外。因此，如依據「F.W.Pfrieger et al.,Science 277(1997)1684-1687」等文獻可知，因為神經膠質細胞存在於突觸的附近而變得與神經細胞接觸，所以神經細胞網路的成熟度提高，可以構成在時空上功能更均一的神經細胞網路。

(第9發明的效果)

根據第9發明，提供用於將神經細胞有效率地播種於神經細胞網路形成用培養裝置或利用了此培養裝置的平面 式片膜鉗制裝置中多數的細胞固定部的神經細胞播種裝置。因此，提供了在以高通量篩選應用為前提的神經細胞網路的形成中如何播種神經細胞的重要問題的解決方法。

該裝置的板狀的裝置本體設置有：(1)用於從外部供給神經細胞懸浮液的懸浮液供給口、(2)由此懸浮液供給口成分枝狀延伸設置的多數的微細懸浮液流路、及(3)在各懸浮液流路的末端，向裝置本體的底面開口的懸浮液注入口。因此，即使設置於裝置基板上的細胞固定部，例如有數百處的極為多數，也可以在短時間供給神經細胞懸浮液至所有這些細胞固定部。

另外，對懸浮液供給口之神經細胞懸浮液的供給方法沒有限定，但若考慮多數的微細懸浮液流路中的流體摩擦阻力，藉由能夠將液體壓入懸浮液供給口的器具或裝置(例如注射器、微量注射器、或小型唧筒式壓入裝置等)，在加壓狀態下供給神經細胞懸浮液為宜。此時，因為壓入液體的器具或裝置的注入口尺寸在大多數情況下比懸浮液供給口的內徑大，所以於該情形時，可以將前端側直徑經縮小的連接用管，安裝於液體壓入器具/裝置的注入口，並將該直徑經縮小的前端側插入懸浮液供給口。作為連接用管的前端側的直徑經縮小的部分，例如可以安裝不銹鋼製的小型噴嘴狀的管體。

注入細胞固定部的神經細胞係藉由細胞固定部的複數個突起部而被阻止由細胞固定部流出，而停留於細胞固定部內。另一方面，懸浮介質液係由細胞固定部的複數個突 起部之間流出。因此，變成神經細胞以壓力小的無傷狀態被播種於細胞固定部的結果。而且，因為如此的神經細胞的播種是同時進行，所以對於裝置基板上的多數細胞固定部的神經細胞的播種係於大致同時且非常短的時間內(數十秒左右)結束。

作為更重要的方面，此神經細胞播種裝置是設置在神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置中的可填充細胞培養基的平坦裝置基板上者。因此，是從上方對細胞固定部注入神經細胞懸浮液的結構。因此，不會成為裝置基板中朝平面方向的神經細胞網路形成的障礙。

另外，也可以將神經細胞播種裝置固定地設置於神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上，但將其設置為可裝卸時，只要在神經細胞播種後卸除，則在播種後的神經細胞的培養中，除了不會妨礙氧、二氧化碳氣體的供給之外，也不會妨礙從上部觀測網路或給予藥液。

(第10發明的效果)

根據第10發明，因為多數的前述懸浮液流路被設定於實質上相同的長度，因此對裝置基板上的多數細胞固定部的神經細胞的播種會準確地同時完成。換言之，此事係意味著在調節了神經細胞懸浮液中的神經細胞的分散密度後，只要控制由懸浮液供給口供給的神經細胞懸浮液的液量，則可以大致準確地控制神經細胞懸浮液對各細胞固定 部的注入量(甚至播種的神經細胞的個數)的效果，並且亦意味著可以大致均一地控制在多數細胞固定部中所播種的神經細胞個數的效果。這些效果在以高通量篩選應用為前提的神經細胞網路的形成中可以說是重大效果。

另外，在神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上，設置前述神經細胞播種裝置時，因為各個懸浮液注入口被設計成正確地對應各個細胞固定部而定位，所以神經細胞對於大量多數細胞固定部的播種會準確地進行。另外，關於此點，在神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上，可以將設置神經細胞播種裝置時之用於對合兩者位置的標記記號，設置於裝置基板和裝置本體的至少一方，裝置本體由透明度高的材料構成時，因為可以透視如此的標記記號，所以特別有效。

(第11發明的效果)

根據第11發明，板材的裝置本體係將設置有懸浮液供給口的上部板與設置有懸浮液注入口的下部板接合而成，在兩板的至少一者的接合面，形成有構成懸浮液流路的溝槽，所以容易進行加工以在裝置本體的內部構成多數微細並且彎曲形態的懸浮液流路。但是，用於構成懸浮液流路的加工方法並不受此限定。

(第12發明的效果)

根據第12發明，提供神經細胞播種裝置的具體並且適宜的實施型態，其中神經細胞網路形成用培養裝置為第1發明記載者、及/或平面式片膜鉗制裝置為第3發明記載者。

(第13發明的效果)

將神經細胞僅接種於神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板中的細胞固定部時，由於裝置基板中的神經細胞整體的固體數不足，所以亦大多不能良好地形成神經細胞網路。為解決此問題，根據第13發明，裝置本體進一步具備用於對裝置基板中的前述細胞固定部以外的區域，注入神經細胞懸浮液的第2混懸液流路。因此，對於裝置基板中的細胞固定部以外的區域，也可以適當地注入神經細胞懸浮液來接種神經細胞，所以可特別良好地形成神經細胞網路。

用以實施發明之最佳型態

接著，對包含其最佳型態的本發明的實施方式進行說明。本發明的技術的範圍並不局限於這些實施型態。

〔本發明的技術領域〕

本發明的技術領域係關於將神經細胞以穩定狀態進行培養，同時形成神經細胞網路的技術領域。另外，還屬於測量細胞表面的離子通道電流的技術領域。進而，還關於 藉由對細胞注入電流或施加電壓，進行賦予刺激的領域。進而，也屬於測量離子通道電流、或者對細胞注入電流或施加電壓來賦予刺激的類型的高通量篩選技術領域。進而，也屬於以神經細胞或神經細胞網路為對象的Ca成像等各種成像技術領域。

〔神經細胞、神經細胞網路〕

神經細胞係由細胞本體的細胞體以及自此細胞體所延伸的軸突和樹突而成。神經細胞的種類沒有限定，第一可列舉中樞神經細胞、末梢神經細胞等各種神經細胞，特別以軸突、樹突尚未突出的狀態為宜。另外，第二可舉例如iPS細胞或ES細胞般可分化成神經細胞的細胞，以由iPS細胞或ES細胞朝神經細胞分化的完成中途的神經幹細胞等狀態者尤佳。進而，第三可列舉具有在細胞相互間形成網路的性質的細胞、以及可分化成具有在細胞相互間形成網路的性質的細胞的細胞。作為神經細胞，動物的神經細胞，特別以包括人的哺乳動物的神經細胞為宜。這些神經細胞的細胞體的尺寸通常未達20μm，更具體為3~18μm左右。

神經細胞網路中，發送訊號的觸發細胞與接受其之隨動細胞的一對神經細胞是結構上的基本單位。本申請發明者發現若觸發細胞和隨動細胞的存在面的高度具有細胞大小程度的高度差時，細胞的死亡概率會增大。

〔神經細胞網路形成用培養裝置〕

本發明的神經細胞網路形成用培養裝置在可以填充細胞培養基(特別以液體培養基為宜)的平坦基板上形成有被複數個突起部包圍的細胞固定部。

所謂「可填充細胞培養基的平坦基板」是指例如關於後述平面式片膜鉗制裝置所說明的構成。細胞固定部係根據前述第2發明的(1)~(3)的構成，在基板上設定複數個或多個。但是，在神經細胞網路中由於觸發細胞和隨動細胞的一對神經細胞是基本單元，所以在以神經細胞的自動放電為觸發，以隨動細胞接受離子通道電流訊息的構成的情形中，作為選擇區域的細胞固定部即使是一處，也能夠作為功能解析元件運用。因為作為選擇區域的細胞固定部的相互間隔係因應神經細胞網路的種類而不同，所以不能一概而論，但可以為例如50~500μm左右。

構成細胞固定部的複數個突起部的形狀沒有限定，但以例如柵欄或樁子狀的突起為宜。突起部的高度也沒有限定，但通常以能夠有效地限制神經細胞的隨機移動的10μm左右的高度為宜，例如對於小鼠大腦皮質或海馬的神經細胞，以5~10μm左右的高度為宜。

接著，上述細胞固定部具備下述(1)~(3)的條件。

(1)在構成細胞固定部的複數個突起部間，設定有寬的間隔，以不使神經細胞的細胞體通過的。突起部的間隔係對應於具有3~18μm左右偏差的哺乳動物神經細胞的細胞体的大小而決定者，絕對值難以一概而定。作為1個 基準，將細胞體的大小設為Xμm時，間隔的上限值為0.9Xμm以下，特別以0.7Xμm以下為宜，間隔的下限值為0.3Xμm以上，特別以0.5Xμm以上為宜。因為複數個突起部的上端部相互連接時，實質上形成通道結構，所以不適宜。另外，對於通道結構，即使在通道內可形成突觸，也不能進行該突觸中的成像觀察。

(2)由複數個突起部形成的細胞固定部的內徑係可以容納1~數個神經細胞的細胞體的尺寸。細胞固定部的內徑對應於神經細胞的細胞體的大小、及細胞固定部中的細胞體的個數而適當設定。例如，細胞固定部中的細胞體為哺乳動物神經細胞的細胞體，其個數為1個時，細胞固定部的內徑係以10~25μm左右為宜。細胞固定部的內徑比細胞體的尺寸過大時，在一個選擇區域有配置過多個數的細胞體之虞，細胞固定部的內徑比細胞體的尺寸小50%以上時，有細胞體無法在細胞固定部穩定地配置之虞。

(3)構成細胞固定部的底面的基板面具備以下(A)及(B)中至少一項要素。

(A)被覆有細胞外基質形成物質。

(B)為藉由前述基板面下部設置的吸引裝置之培養基吸引用的微細貫通孔，且設有不使神經細胞通過的孔徑者。

如此(3)的條件中，(A)的細胞外基質形成物質係藉由表現出對神經細胞的黏附力，使神經細胞固定於細胞固定部的底面者，作為其構成材料，可列舉聚賴胺酸、膠原蛋 白(I型、II型、IV型)、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖(多功能蛋白質聚糖(versican)、核心蛋白聚糖(decorin)等)、蛋白聚糖(軟骨蛋白聚糖(aggrecan))、連接蛋白、內動素(entactin)、腱生蛋白、蛋白聚糖〔硫酸軟骨素蛋白多糖、硫酸乙醯肝素蛋白多糖(珍珠素等)、硫酸角質素蛋白多糖、硫酸皮膚素蛋白多糖〕、透明質酸(糖胺聚醣的一種)、彈性蛋白、纖維蛋白、明膠、基質膠等。

(B)的細胞培養基吸引用的微細貫通孔係藉由以基板下部側的吸引裝置吸引細胞培養基，使配置於細胞固定部的1~數個神經細胞固定於細胞固定部的底面，其孔徑係可不使神經細胞通過程度的例如1~3μm左右。

〔平面式片膜鉗制裝置〕

神經細胞網路形成用培養裝置的有效利用例之一是以神經細胞網路為物件的平面式片膜鉗制裝置。

(通常的平面式片膜鉗制裝置)

構成生命體的細胞的表面配置有各種膜蛋白質，藉由對於細胞表面的特定位元點，化學物質(配體等訊號傳遞物質)的結合、或者電或光的刺激(門極觸發)，開關膜蛋白質開口部的通道，控制離子、化學物質在細胞膜的外側和內側之間的輸送。進行此控制的離子通道是與生體系統訊號傳遞相關的重要膜蛋白質，其功能測量或與功能相關的藥品的開發中，需要測量通道蛋白質的電氣變化，亦即測 量離子通道電流。

對應於此要求，迄今開發了吸管片膜鉗制或平面式片膜鉗制等技術。吸管片膜鉗制具有無法應用於利用多點測量的高通量篩選的弱點。與此相對，平面式片膜鉗制是在如矽晶片之固體基板上構成複數個片膜鉗制裝置，可多點測量細胞離子通道電流之平面基板型的片膜鉗制裝置，各片膜鉗制裝置的細胞配置部位係分別設置有用於測量離子通道電流的微細貫通孔。

但是，傳統上一般的平面式片膜鉗制裝置，因為不具有細胞培養的功能，因而有無法適用於如神經細胞需要培養的細胞的問題。亦即，因為作為測定對象的細胞壽命在非培養條件下為1小時或30分鐘以下的短時間，因而只能進行創新藥物篩選等有限的應用，難以應用於活用吸管片膜鉗制的細胞功能解析等。進而，還難以將細胞良好地運輸並捕獲至設置於基板的微細貫通孔的部位。

(本發明的平面式片膜鉗制裝置)

相對於此，本發明的平面式片膜鉗制裝置與上述一般構成的平面式片膜鉗制裝置相比，進一步具有神經細胞的培養功能，是可以於離子通道電流測量時，有效地控制雜訊電流的和決定細胞的穩定位置的裝置。亦即，此裝置的特徵性構成在於下述方面：對設置於基板的微細貫通孔中的神經細胞固定用開口部賦予細胞固定力，並且在基板中的貫通孔的兩側的表面部設置可對電極通電的貯液部，此 貯液部中可填充導電性液體(例如細胞培養液)。根據此平面式片膜鉗制裝置，可以容易地將神經細胞捕獲至微細貫通孔的位置，並且可在細胞的培養條件下用充分的時間進行離子通道活性的測定。

具體地，本發明的平面式片膜鉗制裝置中，前述神經細胞網路形成用培養裝置如以下(1)~(3)所構成。

(1)前述基板為電絕緣性基板，設置該電絕緣性基板的兩側的表面連通之前述微細貫通孔。

(2)微細貫通孔的第一表面側的神經細胞網路形成側、與其相對側的第二表面側，分別設置用以保持導電性液體的貯液部、與配置為可對該貯液部的導電性液體通電的電極部。

(3)第一表面側的貯液部被作為固定於前述細胞固定部的神經細胞用的貯液部。

(本發明的平面式片膜鉗制裝置中的主要構成)

因此，本發明相關的平面式片膜鉗制裝置中，設置有使其電絕緣性基板兩側的表面的第一表面側(配置細胞的表面側)和第二表面側連通的微細貫通孔。

作為電絕緣性的基板，可以適合使用玻璃製、陶瓷製、塑膠製等的基板。作為一例，在使用矽基板的情形中，以具有第一表面側的矽層、中間的氧化矽層、與第二表面側的矽層依次層合的結構的矽基板(SOI基板)為宜。這種層合結構的矽基板中，因為絕緣性極高的中間層存在於兩 矽層之間，所以在測定物件細胞的離子通道關閉時可確保高電阻狀態，可降低背景的雜訊。

設置於基板的貫通孔的個數沒有限定，以複數個~多個為宜，例如，設為2個~數十個、或其以上。微細貫通孔的內徑係使液體通過但不使神經細胞通過程度的內徑(例如為1~3μm左右)為宜，但並不限定於這些內徑。

另外，平面式片膜鉗制裝置中，前述貫通孔的第一表面側與第二表面側分別設置用以保持導電性液體的貯液部、與配置為可對該貯液部的導電性液體通電所的電極部。

貯液部的構成只要滿足「保持導電性液體，並且配置可使電極部對導電性液體通電」的要求，則對構成沒有限定，例如可以如第1實施例所示，在基板的第一表面側與第二表面側分別重疊間隔體構件、板構件，在間隔體構件中，在對應於基板貫穿孔的區域設置切槽部而形成。

雖然不必限定，但第一表面側的間隔體構件和板構件係以由光不透射性的材料構成為宜，第二表面側的間隔體構件和板構件係以由光透射性的材料構成為宜。

貯液部係其自身為液密性構成，同時具備用於導入或排出導電性液體(分散有神經細胞的細胞培養基的導電性液體)的液體通路或可開閉的開口部。對於基板的第一表面側的貯液部，將該貯液部的上部用蓋玻璃之類的蓋用構件塞上，也可以根據需要卸除蓋用構件使貯液部開口。

平面式片膜鉗制裝置中，第一表面側和第二表面側具備新穎的構成的電極部，這一點在之後「平面式片膜鉗 制裝置中的電極部結構」一項中進行敍述。

進而，在平面式片膜鉗制裝置中，以前述第一表面側的貯液部係分別由光不透射性的材料構成的用於配置細胞的主貯液池、配置有第一表面側的電極部的副貯液池、與使上述貯液池連通的狹窄液體通路而成的構成為宜。另外，以前述第二表面側的貯液部與用於導入和排出導電性液體的液體通路連通，並且，此液體通路配置有第二表面側的電極部之構成為宜。

接著，前述第一表面側的貯液部相當於前述神經細胞的選擇區域。因此，第一表面側的貯液部以具有適當的二維方向的相互間隔的方式，在基板上設定複數個或多個，在這些第一表面側的貯液部中構成有被複數個突起部包圍的細胞固定部。

第二表面側的貯液部也分別設定於與第一表面側的貯液部對應的位置，第一表面側與第二表面側的貯液部藉由基板的微細貫通孔連接。接著，第二表面側的貯液部與液體吸引裝置連接，藉由此液體吸引裝置對第二表面側的貯液部進行負荷負壓時，亦藉由微細貫通孔對第一表面側的貯液部進行負荷負壓。此微細貫通孔相當於前述(B)中的細胞固定部的底面的細胞培養基吸引用的微細貫通孔。另外，使微細貫通孔中的第一表面側的開口部周邊附著具有細胞固定力的細胞外基質形成物質。這相當於前述(A)中的細胞固定部的底面的細胞外基質形成物質的被覆。

〔平面式片膜鉗制裝置中的電極部結構〕

進而，上述平面式片膜鉗制裝置中，前述第一表面側和第二表面側的電極部係以具備以下(a)~(c)的要素為宜。

(a)與導入前述貯液部的導電性液體接觸的容器壁的至少一部分係由無機多孔材料所構成的電極容器。

(b)容納於上述電極容器內之於貴金屬Nm的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極。

(c)填充於上述電極容器內之以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl及鹼金屬氯化物的電極溶液。

上述電極部結構中的貴金屬Nm的種類沒有限定，但以銀Ag和鉑Pt為宜，特別以銀Ag尤佳。因此，作為貴金屬的氯化物NmCl，亦以銀的氯化物AgCl和鉑的氯化物AgCl為宜，特別以銀的氯化物AgCl尤佳。另外，作為鹼金屬氯化物，沒有限定，以氯化鉀KCl為宜。構成容器壁的至少一部分的無機多孔材料係以多孔玻璃或多孔陶瓷為宜。

進而，前述電極部中的電極亦以以下(1)或(2)為宜。

(1)為電極容器內部突出的棒狀電極，由貴金屬Nm構成的芯材的表層部形成有貴金屬氯化物NmCl層。

(2)為電極容器的壁部的內周面形成的筒狀電極，容器壁部側的底層為貴金屬Nm的蒸鍍層，與電極溶液接觸的表面層為貴金屬氯化物NmCl的蒸鍍層。

〔使用神經細胞網路形成用培養裝置的成像解析〕

使用本發明相關的神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置，至少可以進行Ca成像解析、藉由前突觸部位標記物的突觸素或突觸蛋白標記的成像解析、藉由樹突標記物的MAP2標記的成像解析、以及藉由標記內體、外泌體的FM1-43或FM4-64的成像解析等各種成像解析。

(Ca成像解析)

Ca成像是指預先向神經細胞導入Ca探針(與Ca離子結合而發螢光的色素)，將在神經細胞產生動作電位時Ca離子流入細胞體的現象以螢光形式捕捉的方法，可藉由觀察動作電位產生時或動作電位傳遞時發生的螢光對該細胞的離子通道電流進行解析。

因此，使用導入有Ca探針的神經細胞來構成神經細胞網路，例如藉由對此等中單一神經細胞注入電流或施加電壓，可藉由複數個或多個神經細胞的前述Ca成像來進行測定。

根據此方法，選擇構成神經細胞網路的單一神經細胞(第1神經細胞)，藉由注入電流或施加電壓進行刺激而使動作電位產生，同時可藉由Ca成像來測量該動作電位通過神經細胞網路而傳遞至相鄰的周圍的神經細胞(第2神經細胞)，進而由第2神經細胞傳遞至與其相鄰的第3神經細胞的狀況。

作為傳統的技術，例如有電極刺激法，但此方法的情形係難以選擇性地刺激單一的神經細胞，解析變得複雜。另外，其他傳統的技術之藉由微吸管電極進行刺激，雖然可以選擇性地刺激單一神經細胞，但高通量篩選所需的多通道化困難。根據本發明的方法，因為可以將測量部極小型化，所以多通道化容易。

(利用突觸素、突觸蛋白的成像解析)

突觸素、突觸蛋白是突觸囊泡的膜蛋白質，是前突觸部位的標記物，可以使它們的抗體與色素結合，並利用抗原抗體反應而使這些蛋白質與色素結合，藉此可以標記突觸部位。

(藉由MAP2的成像解析)

MAP2是樹突標記物，藉由在該抗體上添加色素並進行反應，可以標記樹突部位。

(藉由FM1-43、FM4-64的成像解析)

FM1-43或FM4-64具有可逆地進入細胞膜，僅在不透過細胞膜而與細胞膜結合時發出螢光的特徵，可以標記內體或外泌體。具有可以維持細胞的生命功能地進行標記的特徵。

(成像解析的光學系統)

使用本發明所述的神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置進行上述各種成像解析時，裝置係以具備以下光學系統要素為宜。

首先，在裝置基板的第1表面側的上部，設置神經細胞發出的光的受光裝置。另外，在裝置基板的第1表面側的上部，設置用於對神經細胞或基板表面照射鐳射等的照射裝置。此照射裝置進一步配備有用於僅對規定的單一細胞照射光的聚光系統尤佳。

具備以上光學系統要素，可以進行非接觸、非破壞的光測量，可進行解析而不阻礙神經細胞網路功能，同時可高速解析，進而藉由聚光系統準確地激發單一神經細胞而可精密地進行解析。

〔神經細胞播種裝置〕

本發明相關的神經細胞播種裝置是設置於神經細胞網路形成用培養裝置或利用了此培養裝置的平面式片膜鉗制裝置中的可填充細胞培養基的平坦裝置基板上，用於將神經細胞播種於被裝置基板中的複數個突起部包圍的多數細胞固定部。

這裏所說的「神經細胞網路形成用培養裝置」，只要是在可填充細胞培養基的平坦裝置基板上，形成有被複數個突起部包圍的多個細胞固定部者，則不限定其構成。另外，「平面式片膜鉗制裝置」，亦為使用神經細胞網路形成用培養裝置的裝置，只要是在可填充細胞培養基的 平坦裝置基板上，形成有被複數個突起部包圍的多個細胞固定部者，則對其構成沒有限定。但是，特別適宜的是所謂的「神經細胞網路形成用培養裝置」是指前述實施型態相關的本發明的神經細胞網路形成用培養裝置，所謂的「平面式片膜鉗制裝置」是指前述實施型態相關的本發明的平面式片膜鉗制裝置。

本發明的神經細胞播種裝置中，其裝置本體具有可設置於神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上的板狀的形態。通常，板狀意指薄板狀或厚板狀，多數情況也意指平面形狀為矩形(正方形或長方形)。但是本發明中，只要是可設置于神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上的形態，至少底面平坦以使底面與裝置基板上的多個細胞固定部的複數個突起部的頂端相接觸，並且在設置於上述裝置基板上時，底面具有覆蓋多個細胞固定部的大小，則對「板狀」的具體形態沒有限定。

作為「板狀」的裝置本體，基本上，方便的是具有與神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板對應的平面形狀和大小(面積)者。裝置本體的平面形狀不限於矩形，也可以為圓形、橢圓形、其他不定形，其厚度可以為例如數mm~數cm左右。裝置本體的底面的面積係以與裝置基板的面積對應為宜，例如可以從2~3cm²左右至數十cm²左右或者更大面積中自由地選擇。

裝置本體的面積或與之對應的裝置基板的面積係考慮 裝置基板的細胞固定部的個數或裝置本體中後述微細加工的集成度等要素而適當設定為宜。進而，裝置本體的構成材料沒有限定，可列舉玻璃等無機材料或塑膠等有機材料為宜。特別以使用透明的材料尤佳。

板狀的裝置本體係以將設置有懸浮液供給口的上部板和設置有懸浮液注入口的下部板以密合狀態接合而成為宜，以在上部板與下部板中至少一者的接合面形成有構成懸浮液流路的溝槽的構成為宜。溝槽的截面形狀可為半圓形或矩形。此時，在上部板與下部板接合後，結果是溝槽構成懸浮液流路。上部板與下部板兩者形成準確對應的截面半圓形的槽時，結果則會構成截面圓形的懸浮液流路。

但是，作為板狀的裝置本體，只要可進行加工以在其內部形成多個懸浮液流路，則也可以使用單一的板材。若採用使用了光硬化性樹脂的三維光立體光刻法(three-dimensional stereorithography)，則雖然製造效率差，但可進行上述加工。

裝置本體設置有(1)用於從外部供給以一定密度懸浮有神經細胞的神經細胞懸浮液的懸浮液供給口、(2)在裝置本體的內部，由前述懸浮液供給口成分枝狀延伸設置的多個微細的懸浮液流路、及(3)在前述各懸浮液流路的末端，同設備主體的底面開口之用於將神經細胞懸浮液注入前述各細胞固定部的懸浮液注入口。

另外，在神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上設置神經細胞播種裝置時，各懸浮 液注入口需要與各個細胞固定部準確地對應而定位。另外，如前所述，為了確定設置神經細胞播種裝置時的懸浮液注入口和細胞固定部的準確位置，以由透明材料構成的裝置本體、或神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板，預先標示位置對合用的標記(標記物)為宜。

上述(1)的懸浮液供給口係以在裝置本體的上面開口為宜。但是，即使在裝置本體的側面開口時，只要是朝向本體內部向斜下傾斜的懸浮液供給口，就可以利用。進而，在將神經細胞懸浮液以加壓狀態供給至懸浮液供給口的前提下，不在意神經細胞的播種操作結束後的神經細胞懸浮液由該懸浮液供給口漏出等時，也可以在裝置本體的側面將懸浮液供給口以水平方向開口。

懸浮液供給口可以在裝置本體僅設置1處，但在設定相當多個的下述(2)的微細懸浮液流路、和下述(3)的懸浮液注入口時，就在流路設計上容易連接的觀點上，對它們係以將懸浮液供給口在裝置本體分散於適當位置而設置多處為宜。設置多處懸浮液供給口時，相對於它們的神經細胞懸浮液的供給係可以分別使用單獨的注射器等，但也可以將基端側為單一的管而前端側分流為多根管的連接用管的基端側與單一的注射器等連接，將前端側的多根管分別與多處懸浮液供給口連接。

即使在任一種情形中，因為懸浮液供給口的內徑多數情況為例如數mm以下至數百μm左右的小內徑，因此如 前述「發明的效果」一項所述，可以前端側直徑經縮小的連接用管嵌入注射器或微量注射器等液體壓入用器具的注入口，將前端側的直徑經縮小的部分插入懸浮液供給口。作為連接用管的「前端側的直徑經縮小的部分」，例如可以使用以朝向前端逐漸變細的錐形形狀所形成的不銹鋼製的插入用噴嘴。使用前述「前端側分流為多根管的連接用管」向多處懸浮液供給口供給神經細胞懸浮液時，在分流的各管的前端部也可以安裝上述插入用噴嘴。

上述(2)的浮懸液流路可以為例如內徑50μm~500μm左右的微細的流路。懸浮液流路的截面形狀可以為圓形，也可以為半圓形或矩形等。此懸浮液流路基本上係沿裝置本體內的大致平面方向形成者。懸浮液流路由上述懸浮液供給口成分枝狀大量延伸設置，作為該分枝的形態，在從懸浮液供給口直接分枝延伸設置多個懸浮液流路時，有時從懸浮液供給口分支1根或2、3根少數的幹線狀懸浮液流路，再從這些幹線狀懸浮液流路依次分支與多個懸浮液注入口連接的支線狀懸浮液流路。

另外，作為從懸浮液供給口至各懸浮液注入口的直線距離，取決於懸浮液注入口的設定位置而不必相同。但是，就關於前述第10發明的效果所述的理由，將多數個懸浮液流路中的(1)的懸浮液供給口至(3)的懸浮液注入口的長度，設定為實質上相同，係極為適宜的。相對於這樣的要求，例如可以藉由在特定幹線的懸浮液流路中和/或特定支線的懸浮液流路中，特意地設定用於調節流路的長度 的迂回路部分來進行應對。

關於上述(3)的懸浮液注入口，各懸浮液注入口係對合各細胞固定部位置所設定。接著，懸浮液注入口是在裝置本體的平坦底面向下開口。另一方面，如前所述，將裝置本體設置於神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上時，裝置本體的底面與細胞固定部的複數個突起部的頂端接觸。由以上各點，由懸浮液注入口所注入的神經細胞懸浮液係確實地被注入細胞固定部的內側。就此點，懸浮液注入口的開口直徑與藉由複數個突起部所規定的細胞固定部的內徑大致相同，或者比其稍小或稍大的程度為宜。

就前述第13發明的效果一欄中記載的理由，裝置本體係進一步具備用於再對神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板中的細胞固定部以外的區域注入神經細胞懸浮液的第2懸浮液流路系統為宜。

作為該第2懸浮液流路系統，例如可以將與前述(1)類似構成的第2懸浮液供給口設置於板狀裝置本體的適當數量的位置。此時的第2懸浮液供給口可以不通過微細的懸浮液流路系統而直接貫穿至裝置本體的底面者，也可以在分支為與前述(2)類似的多個第2懸浮液流路後，與開口於裝置本體的底面的與前述(3)類似的第2懸浮液注入口連接者。第2懸浮液流路系統中，多個第2懸浮液流路可以設定為實質上相同的長度。

1‧‧‧基板

2‧‧‧細胞固定部

3‧‧‧神經細胞

4‧‧‧微細貫通孔

5‧‧‧電流放大器

6‧‧‧微量移液器

7‧‧‧上部電極

8‧‧‧下部電極

9‧‧‧細胞外基質形成物質

11‧‧‧神經細胞

12‧‧‧突起部

13‧‧‧細胞固定部

14‧‧‧基板

15‧‧‧微細貫通孔

16‧‧‧間隔體

17‧‧‧間隔體

18‧‧‧培養空間

19‧‧‧切槽部

20‧‧‧板

21‧‧‧板

22‧‧‧主貯液池

23‧‧‧貯液部

24‧‧‧液體通路

25‧‧‧副貯液池

26‧‧‧導入用液體通路

27‧‧‧排出用液體通路

28‧‧‧電極部

29‧‧‧電極部

30‧‧‧細胞外基質形成物質

31‧‧‧電極容器

32‧‧‧電極溶液

33‧‧‧AgCl/Ag電極

34‧‧‧無機多孔材料

35‧‧‧電極針

36‧‧‧外側細胞固定部

40‧‧‧裝置本體

41‧‧‧上部板

42‧‧‧下部板

43‧‧‧懸浮液供給口

43a‧‧‧第2懸浮液供給口

44‧‧‧懸浮液流路

44a‧‧‧第2懸浮液流路

45‧‧‧懸浮液注入口

45a‧‧‧第2懸浮液注入口

46‧‧‧注入口設定部

[圖1]表示本申請發明人試製的基板上的凹部結構(比較例)。

[圖2]表示非專利文獻1中所揭示的Si基板上的結構。

[圖3]表示非專利文獻2中所揭示的籠的結構。

[圖4]表示將第2發明的(1)、(2)相關的神經細胞網路形成用培養裝置的主要部分概念化的平面圖。

[圖5]表示第1實施例的截面圖。

[圖6]表示第2實施例的概要。

[圖7]表示第3實施例的概要。

[圖8]表示第4實施例的概要。

[圖9]表示第5實施例的概要。

[圖10]表示第6實施例的概要。

[圖11]表示第7實施例中的神經細胞播種裝置本體的概要。

[圖12]表示第7實施例中的第1、第2懸浮液流路系統的概要。

[圖13]表示第7實施例中的第1懸浮液流路系統的主要部分的細節。

[圖14]表示大鼠海馬的神經細胞的播種時的尺寸。

[圖15]表示大鼠海馬的神經細胞的培養時的尺寸。

[圖16]表示用大鼠海馬的神經細胞進行的其他實驗的光學顯微鏡照片。

實施例

以下說明本發明的實施例。本發明的技術範圍並不受這些實施例所限定。

〔第1實施例〕

第1實施例相關的裝置如圖5所示。該裝置是將神經細胞網路形成用培養裝置作為離子通道生物感測器之培養型平面式片膜鉗制裝置而構成的裝置者。

作為該裝置中的電絕緣性基板14係使用矽基板。基板14中，設置有使其第一表面側(圖的上側)與第二表面側(圖的下側)連通的直徑1~3μm的微細貫穿孔15。圖5中，在基板14的中央設置有1個微細貫穿孔15，但也可以使用更大的基板設置複數個或多個的微細貫穿孔15，相對於這些各微細貫穿孔15，各自可如下述構成。

在微細貫穿孔15的第一表面側的開口部上的基板面形成有被複數個突起部12所包圍的細胞固定部13，在此細胞固定部13配置有1~數個神經細胞11(為了便於圖示，僅表示1個神經細胞)。

基板14係將其第一表面側與第二表面側用1對間隔體16、17包夾著。間隔體16、17的構成材料沒有限定，對於第一表面側的間隔體16，以具有彈性的光不透射性的材料為宜，例如可以使用矽橡膠或PDMS(polydimethylesiloxane，聚二甲基矽氧烷)等。另一 方面，對於第二表面側的間隔體17，以可使用光透射性的材料為宜。

在間隔體16的中央部分，神經細胞網路構成用的大的培養空間18形成切槽，該培養空間18中的基板14面上設置有1處或複數處~多處的配置有上述神經細胞11的細胞固定部13(為了便於圖示，僅表示1處細胞固定部)。另外，基板14面的細胞固定部13以外的部分也播種有神經細胞11。

間隔體17中，在與基板14的微細貫通孔15對應的部分設置有例如圓形的切槽部19，所以微細貫通孔15中的第二表面側的開口部開口於該切槽部19。因此，此切槽部19也對應於細胞固定部13和微細貫通孔15而設置1處或複數處~多處(為了便於圖示，僅表示1處切槽部19)。

接著，上述基板14和1對間隔體16、17的整體形成被1對結實的板20、21所緊固的結構。作為板20、21的材料，只要是能承受120℃左右的高壓釜滅菌的材料，則沒有特別限定。但是，對於第一表面側的板20，以可使用光不透射性的材料為宜。另一方面，對於第二表面側的板21，以可使用光透射性的材料為宜。

以上的構成中，在第一表面側的板20的中央部，在對應於第一表面側的間隔體16中的上述培養空間18的位置，設置有與培養空間18相同大小的例如圓形的切槽部。在此切槽部的周邊，可以形成板厚度為薄的凹狀的階梯 部，藉由在該階梯部設置蓋玻璃之類的蓋用構件(圖示省略)，使上述間隔體16中的切槽部的開口構成為可以開閉。如此一來，在第一表面側構成主貯液池22。

另一方面，將第二表面側的間隔體17中的切槽部19的開口，藉由板21塞上，形成第二表面側的貯液部23。第一表面側的主貯液池22與第二表面側的貯液部23通過微細貫通孔15連通。

主貯液池22構成第一表面側的貯液部的第1區域。此主貯液池22通過設置於間隔體16的狹窄液體通路24而與構成第一表面側的貯液部的第2區域的副貯液池25連通。副貯液池25是由共通地設置於間隔體16和板20的孔所形成的。副貯液池25中配置有後述第一表面側的電極部28。

藉由主貯液池22、液體通路24和副貯液池25所構成的第一表面側的貯液部中，導入並保持有作為導電性液體的細胞培養基。導電性液體中可預先分散有神經細胞。作為導電性液體，使用140mM NaCl、3mM KCl、10mM 4-(2-羥乙基)-1-呱嗪乙磺酸(HEPES)、2.5mM CaCl₂、1.25mM MgCl₂和10mM葡萄糖(用HCl調節為pH 7.4)等的緩衝液、或添加了10%(v/v)FBS、1%(v/v)GlutamaxTM(Gibco)的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM：Sigma)等細胞培養基。導電性液體的組成可根據神經細胞的種類適當改變。

在第二表面側的貯液部23中，導入40mM CsCl、 80mM CsCH₃SO₄、1mM MgCl₂、10mM HEPES、2.5mM MgATP、0.2mM Na₂EGTA，(pH7.4)等被稱為移液器溶液的緩衝溶液或細胞培養基等。對貯液部23的導電性液體的導入係藉由管狀的導入用液體通路26來進行，其排出係藉由排出用液體通路27來進行。本實施例中，作為導入用液體通路26和排出用液體通路27，使用了外徑為1mm、內徑為0.5mm的PEEK製的管，但對於這些液體通路的構成材料，只要是可承受120℃左右下的高壓釜滅菌的材料，亦可使用其他材料。

排出用液體通路27中，設置有與第一表面側的電極部28相同地構成的第二表面側的電極部29(由單點劃線簡化圖示)。這些電極部28、29的構成如後述。通常，使第一表面側的電極部28的電極接地，對第二表面側的電極部29的電極施加膜電壓。

在將分散有神經細胞11的導電性液體導入主貯液池22時，若藉由與排出用液體通路27連接的適宜的液體吸引裝置，吸引貯液部23的導電性液體時，則主貯液池22的導電性液體也會通過微細貫通孔15被吸引。藉由這樣的操作，可以使神經細胞11有效地配置於圖5所示的細胞固定部13(亦即，微細貫通孔15的開口位置)。

進一步地，此時可藉由吸引壓力，在與微細貫通孔15相接的部分的神經細胞11的細胞膜形成微細的孔。在神經細胞11形成這樣的孔時，另外還存在將溶解有耐絲菌素(nystatin)或兩性黴素B(amphotericin B)等細胞膜穿孔 性抗生素的溶液，從導入用液體通路26導入第二表面側的貯液部23的方法。在細胞膜形成這樣的孔時，神經細胞內和第二表面側的貯液部23成為電導通的狀態。

另一方面，作為使神經細胞11配置於細胞固定部13(微細貫通孔15的開口位置)的手段，亦可以使具有細胞固定力的細胞外基質形成物質30附著於基板14的微細貫通孔15中的第一表面側的開口部周邊。

以上的構成中，神經細胞11中表現出規定的離子通道，將打開該離子通道的刺激物質加入第一表面側的貯液部時，離子通道打開，第一表面側的電極部28與第二表面側的電極部29間流通對應於施加電壓的通道電流。此時，若神經細胞11的細胞膜與基板14之間存在間隙，則密封電阻降低，漏電流會重疊於通道電流中。

膜電位由於除了實際上所施加於電極間的電壓，還重疊有空間中存在的電磁波造成的誘導電壓、電極金屬表面與包圍其的緩衝液之間的界面電位、或液/液介面電位，所以由於誘導雜訊或界面電位的變動，漏電流會與之對應地發生變動。因此，相對於離子通道電流，表現為稱作基線變動的雜訊。

雖然省略詳細資料的提示，但在容易獲得千兆歐姆以上的密封電阻的吸管膜片鉗中，即使膜電位的變動較大，基線變動雜訊的影響小，為可忽視的程度。但是，在密封電阻較小的(~10MΩ)培養型平面式片膜鉗制中，需要減小該膜電位的變動。因此，本實施例中開發了膜電位的變 動小而穩定的電極。藉由這樣的電極，大幅減小膜電位的變動，即使密封電阻小，也可以抑制雜訊電流至小而可進行測量。

以下省略詳細的圖示，對第一表面側和第二表面側的電極部28、29的結構進行說明。內徑為1mm的由派熱克斯(註冊商標)玻璃構成的筒狀的電極容器31的內部填滿以飽和濃度溶解有KCl和AgCl的電極溶液32。添加的KCl濃度為3.3M/L、AgCl為約1.1mM/L。另外，KCl的情形係飽和濃度在常溫為約3.3M/L。容納於電極容器31內的AgCl/Ag電極33中，在銀線的表面塗布有AgCl。這樣的AgCl/Ag電極33係可以將AgCl粉末塗布於銀線的表面來形成，或將銀線浸漬於含次氯酸鈉的漂白劑等中來製作。另外，亦可以藉由在KCl溶液中的電鍍來製作。

電極容器31的前端部係用多孔玻璃或多孔陶瓷等之無機多孔材料34塞上。作為無機多孔材料34，實際上使用了維克(Vycor)玻璃(康寧公司)。這樣構成電極容器31的容器壁的一部分的無機多孔材料34的前端浸漬於導電性液體(細胞培養液或緩衝溶液)中。導電性液體中的KCl濃度為數毫莫耳，但由於無機多孔材料34的效果，電極容器31的容器內與容器外為電導通的狀態，同時電極溶液32與容器外的導電性液體的混合小，為可以忽視的程度，所以容器內與容器外的大的KCl濃度差被保持恆定，藉此AgCl/Ag電極33的界面電位、液/液界面電位被保持恆定。電極容器31的基端部被密封材料所密封，電極針 35從此處突出。

在使用表現出以光打開通道的離子通道的細胞，控制通道電流的情形中，若配置以上的第一表面側和第二表面側的電極部28、29時，因為第一表面側的貯液部是藉由光不透射性的間隔體16或板20所形成，所以照射至主貯液池22的照射光不會照射到第一表面側和第二表面側的電極部28、29的AgCl/Ag電極。另外，主貯液池22中配置有神經細胞11，細胞的外部的導電性液體的鉀離子濃度小，為數mM程度，所以可說是微量，理想的是可抑制由電極部漏出的KCl的影響，因此對於第一表面側的貯液部，除了主貯液池22之外還製作副貯液池25，將上述主貯液池22和副貯液池25用寬1mm以下的狹窄液體通路24連接

〔第2實施例〕

第2實施例如圖6所示。此第2實施例和以下第3實施例是對第1實施例中的要點進一步詳細論述。這些實施例中的構件編號與第1實施例不同，但相同構件名者為實質上相同的構成。

藉由旋塗機將負光阻劑SU8以厚度8~10μm被覆於Si基板1的表面，使用預先準備的光罩，藉由通常的步驟來顯影，形成如圖6(a)、圖6(b)中的一例所示的由柵欄狀的複數個突起部12而成的細胞固定部13。

此時的突起部是底面10μm×10μm、高度8~10μm的 四角形柱，突起部間的相互間隔為8~10μm。小鼠或大鼠的大腦皮質或海馬的神經細胞的細胞體的直徑通常在播種時為10μm左右，在固定時為15~20μm，所以由此複數個突起部而成的細胞固定部2中所配置的神經細胞3不會移動至細胞固定部2之外。但細胞培養基會在細胞固定部2的內外移動，對於細胞固定部2內的細胞的培養沒有問題。突起部的形狀可以為圓柱或橢圓柱，也可以為球狀的固體物。

藉由由多個突起部12而成的細胞固定部13進行的神經細胞3的配置，在神經細胞網路的形成和利用上發揮了有用性。如圖6(c)所示概念圖，若在細胞固定部13的內側配置神經細胞3，則會與細胞固定部13的外側的神經細胞3形成網路。此網路形成中，神經細胞3係由軸突的前端釋放神經傳遞物質，同時主動地向要結合的對方進行軸突的延伸，接受側的神經細胞3也接受此神經遞質而將樹突延伸，形成突觸接合。

本發明的特徵在於下述方面：因為細胞固定部13內的神經細胞3與細胞固定部13外的神經細胞3存在於基板1的相同平坦面上，所以神經細胞間的通訊可無阻礙地進行，可繼續穩定的培養，可形成穩定的網路。本實施例的情形中，配置於細胞固定部2的內部的神經細胞3可以進行1個月以上的培養。

這樣指定規定的神經細胞的位置來形成網路，在許多方面有用。應用於如圖5所示的培養型平面式片膜鉗制裝 置中時，其效果特別大。

細胞固定部13的內徑如圖6(a)、圖6(b)所示可以容易地改變。其內徑是藉由基於下述考量的最適合的神經細胞個數(簇群大小)來決定：使之為能夠配置複數個(較多個)神經細胞3的內徑以使神經細胞網路的長期穩定培養成為可能，或者使之為能夠配置1個或少數個神經細胞3的內徑以使網路的功能解析容易。例如，較健康的大鼠大腦皮質神經細胞可以為1~4個的簇群(cluster)，較脆弱的iPS細胞或由其分化、衍生的神經球為了穏定的培養則以由較多的細胞體構成的簇群為宜。

〔第3實施例〕

基於圖7對第3實施例進行說明。同圖中，圖7(A)的右下部分的“c”的圓圈所示的圖是細胞固定部2的中央部的微細貫通孔4附近的截面的放大部分圖。培養型平面式片膜鉗制的構成為：在Si、塑膠、陶瓷、玻璃等的基板1形成直徑為1~數μm的微細貫通孔4，在該微細貫通孔4之上配置神經細胞3，將基板1的上部、下部分別用規定的緩衝液填滿，並且設置上部電極7、下部電極8。下部電極8與電流放大器5連接。

在與微細貫通孔4相接的神經細胞3的細胞膜打開微細的孔，形成神經細胞3內與基板1的下側的緩衝貯液池為電導通的全細胞狀態。作為在該神經細胞3打開微細孔的方法，如第1實施例所述，有對下部貯液池施加負壓而 破壞細胞膜的方法。另外，也有利用下述步驟的方法：將溶解有耐絲菌素、兩性黴素等抗生素的緩衝溶液注入下部貯液池，在細胞膜將這些抗生素埋入細胞膜，使細胞內和下部貯液池形成電導通的狀態。

此時，預先在微細貫通孔4的周邊的基板1表面塗布細胞外基質形成物質9的步驟，對於使神經細胞3長時間存活方面有效。細胞外基質形成物質9多半是已知的，熟知有聚-L-賴胺酸、層黏連蛋白等。對於向該系統播種神經細胞3，由於需要在細胞固定部2的內部準確地播種單一細胞或複數個細胞，因而利用如圖所示的微量移液器6來進行，使特別有效的。

進而，此時如圖7(A)的右下的主要部分放大圖「c」的圓圈所示，由微量移液器6以規定的速度將神經細胞3的懸浮液注入細胞固定部2的上部，同時對該下部貯液池施加規定的負壓，如圖7(B)所示，可以有效地在微細貫通孔4之上配置神經細胞3。但是，負壓過大時神經細胞3會死掉，所以需要根據細胞種類設定合適的壓力。圖7(B)中係使用HEK293細胞進行吸引的實驗，確認到若2kPa的負壓則神經細胞3不會受到損傷。為5kPa的負壓時，確認到8成的神經細胞3不會受到損傷。但是，藉由吸引將神經細胞3配置於微細貫通孔4之上後，立即開始解除吸引壓力時，也確認到會減少損傷。

本實施例中，預先在神經細胞3中導入有Ca成像用的探針分子。另外，神經細胞3中還藉由基因導入表現可 以用鐳射等光刺激的通道視紫質等光受體離子通道。此時，重要的是通道視紫質的激發波長和Ca探針分子的激發波長以不發生干涉的方式充分遠離。本實施例中利用的通道視紫質的激發波長為470~480nm，作為Ca探針，使用了激發波長494nm、發光波長523nm的Oregon Green BAPTA-1。該第3實施例中實施的運作模式為以下4種。

(第一運作模式)

藉由上部電極7、下部電極8對微細貫通孔4上的神經細胞3施加規定的膜電位(通常-80~+80mV)，通過全細胞模式觀測由於自動放電等在神經細胞3內產生的離子通道電流(圖7(A)中的箭頭記號“a”)。此時，還觀測到周邊的神經細胞3的自動放電導致的Ca離子的流入、或接受神經遞質而產生的Na⁺、K⁺、Cl^-等的突觸電流(K.S.Wilcox et al.,Synapse 18(1994)128-151)，由此可以獲得與軸突的狀態或神經細胞3的狀態相關的資訊。

(第二運作模式)

藉由上部電極7、下部電極8對微細貫通孔4上的神經細胞3注入規定的電流，或施加電壓(圖7(A)中的箭頭記號「b」)，對神經細胞3給予刺激，產生動作電位。藉此，Ca離子會流入接受了刺激的神經細胞3。因此，在觀測到Ca探針的螢光(圖7(A)中的箭頭記號「d1」)，同時產生的動作電位傳遞至周邊的神經細胞3，而產生該周 邊的神經細胞3的Ca探針的發光(圖7(A)中的箭頭記號「d2」)。藉由觀測該發光，可以確認訊號的傳遞。亦即，可以獲得關於神經細胞網路的訊號傳遞特性的資訊。

(第三運作模式)

對於存在於微細貫通孔4之上(細胞固定部2內)的神經細胞3的附近，並且表現有通道視紫質的單一神經細胞3，將470~480nm鐳射集束照射(圖7(A)中的箭頭記號「e」)，使該單一神經細胞3產生動作電位。如此一來，該動作電位訊號通過網路傳遞至微細貫通孔上的神經細胞3，Ca通道打開，誘發Ca離子的流入。結果，藉由預先對成為全細胞模式的微細貫通孔上的神經細胞3施加膜電位的上部電極7、下部電極8，可以觀測離子通道電流。根據第三運作模式，能夠在單一細胞程度上測定並詳細解析神經細胞網路的訊號傳遞特性。

(第四運作模式)

前述第一~第三運作模式中，由細胞固定部2與微細貫通孔4的組合而成的圖7(A)所示的結構，最低有1處即可作為元件運作。接著，只要在基板1上構成多個該結構，則可作為高通量篩選裝置運作。相對於此，以下第四運作模式中，對應於前述觸發細胞和隨動細胞，各自以一個(共計二個)圖7(A)所示的結構體來構成元件。

在基板1之上的多處形成圖7(A)所示的微細貫通孔4 與細胞固定部2的組合的系統。位於其中的數個微細貫通孔4上的神經細胞3(觸發細胞)的動作電位的產生係以注入電流或施加電壓來進行。接著，考慮將動作電位對位於其以外的微細貫通孔4上的神經細胞3(隨動細胞)的傳遞，藉由該隨動細胞中的離子通道電流的全細胞模式下的記錄來進行解析。這些裝置中，極其重要的是指定位置來配置神經細胞3，可知指定位置的同時還可形成穩定的神經細胞網路的本發明是極其有用的。

另外，上述第一、第三、第四運作模式中，不僅微細貫通孔4中的離子通道電流，藉由在基板1的上部同時進行Ca成像的觀察，可以更精密地進行網路的功能解析，因而極其有效。

〔第4實施例〕

第4實施例如圖8(a)、(b)所示。將平面照片圖8(a)中以小的圓形所表示的直徑約10μm、高度約8μm的12根圓柱而成的細胞固定部2，形成於Si基板的表面，播種由17天齡的大鼠胎兒的大腦皮質採集的神經細胞3，培養14天後，藉由螢光顯微鏡確認神經細胞網路的形成。將培養基更換成規定的緩衝溶液後，在該緩衝溶液中混入被稱為Oregon Green Bapta-1的Ca探針，約2小時後再次將緩衝液更換成不含Ca探針的溶液，用螢光顯微鏡觀察神經細胞3。

觀察到細胞固定部2內穩定地設置有數個神經細胞3 以及細胞固定部2內和細胞固定部2外的神經細胞以網路相連的狀況。另外，圖8(b)是觀察細胞固定部2內的神經細胞3的螢光強度的時間變化的結果，觀察到神經細胞3活潑地反覆自動放電，神經細胞3內的Ca濃度發生改變的狀況。本實施例中，細胞固定部2僅設置了一組，但藉由將其設置複數個，可以觀測訊號從特定的細胞固定部2傳遞至其他細胞固定部2的狀況，可以準確並且穩定地實施網路的功能解析。

〔第5實施例〕

第5實施例係如圖9所示。以包圍使用Si基板構成的培養型平面式片膜鉗制元件的微細貫通孔的方式，使用負光阻劑，以與第2實施例~第4實施例相同的方法形成由複數個突起部而成的細胞固定部。以與第4實施例相同的方法，播種由大鼠胎兒的大腦皮質採集的神經細胞，培養14天後，確認到細胞固定部中的神經細胞被配置於微細貫通孔上、及該神經細胞與周邊的神經細胞形成了網路。

之後，將培養基在基板的上側、下側分別更換成規定的緩衝溶液液，在下側的緩衝溶液中以500μg/ml的濃度混入耐絲菌素，放置約10分鐘後，在全細胞模式的配置下，藉由電流放大器(Axopatch200B)檢測出流入設置於基板1的下側的電極的電流。

其結果如圖9(A)所示。圖9(A)係表示電流的膜電位 依賴性。另外，40mV-TTX是在膜電位為40mV，並且上側的緩衝溶液中混入有Na通道阻斷劑河豚毒素(TTX)時所觀測到的電流。膜電位由-變化成+時，電流波形的朝向也由下(-)取代成上(+)，表示來自自動放電神經細胞的訊號傳遞、或神經傳遞物質的自動釋放時的突觸電流的特徵。這些波形反映網路的特徵，藉由拮抗劑或激動劑的藥劑的作用，波形會發生變化。細胞固定部和微細貫通孔所佔的面積非常小，因而容易進行100點程度的多點測量，容易實現高通量篩選所需的多點測量。

另外，圖9(B)、圖9(C)是總結由基板的上方部藉由各神經細胞的Ca成像測量螢光強度的時間變化的結果者。橫軸為時間，縱軸為對各神經細胞賦予的編號。圓的大小表示Ca螢光強度的強弱。圖9(B)所示的情形中，神經細胞的密度小，每35mm培養皿為2×10⁵個，因而來自神經細胞的發光完全隨機。

相對於此，可知圖9(C)所示的情形係神經細胞的密度大，每35mm培養皿為2×10⁶個，所以Ca成像的發光變得如同時期發生。這些結果意味著藉由在基板的下側測量離子通道電流，同時在上側進行Ca成像，可以進行更精密的測量和解析。

〔第6實施例〕

第6實施例係關於細胞固定部13的改良實施例。如圖10所示，在微細貫通孔的第一表面側的開口部上的基 板面係與第1實施例的情形相同地形成以複數個突起部12所包圍的細胞固定部13，此細胞固定部13中配置有神經細胞11。接著，在構成環狀細胞固定部13的複數個突起部12的外側，進而形成以多數個突起部12所包圍的外側細胞固定部36。亦即，第6實施例的特徵係由突起部12所構成的環成為細胞固定部13、和外側細胞固定部36的雙重環結構。

被內側的環所包圍的區域之細胞固定部13係具有微細貫通孔，在此區域固定有1至數個神經細胞11，神經細胞11確切地存在於微細貫通孔上。而且同時，內側的環和外側的環之間的區域之外側細胞固定部36，也播種有多數個神經細胞11。因此，不僅細胞固定部13內部的神經細胞11間，細胞固定部13的神經細胞11與外側細胞固定部36的神經細胞11之間也形成神經細胞網路。

如此之由細胞固定部13和外側細胞固定部36組成的構成中，對於例如iPS細胞等那樣的單一細胞時不穩定，若不集合多數個細胞則無法進行穩定培養的神經細胞具有可以確切地使一個神經細胞固定於微細貫通孔上，同時可長期、穩定地進行培養的優點。

並且，第6實施例的情形中，將神經細胞11分別播種至細胞固定部13和外側細胞固定部36的方法中一例係以下述的第7實施例簡單說明。

〔第7實施例〕

第7實施例係關於本發明的神經細胞播種裝置。神經細胞播種裝置的裝置本體是設置於上述實施例相關的神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上、用於將神經細胞播種於裝置基板中被複數個突起部所包圍的多數個細胞固定部者。

如圖11(a)所示的斜視圖，本實施例相關的神經細胞播種裝置的裝置本體40是具有4~6mm左右的厚度和2×2cm左右的方形平面形狀的平坦板狀，由上部板41和下部板42而成。上部板41和下部板42係分別由例如以電漿處理等對表面進行了清潔化的PDMS(聚二甲基矽氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)等透明性塑膠或矽橡膠而成，它們構成以密合狀態加熱而接合的2層結構體。

在上部板41的上面的中央部的一端側，開口有用於從外部供給以一定密度懸浮有神經細胞的神經細胞懸浮液的構成第1懸浮液流路系統的懸浮液供給口43。另外，在其上面的中央部的另一端側，開口有構成第2懸浮液流路系統的第2懸浮液供給口43a。以下，首先對第1懸浮液流路系統進行說明。關於第2懸浮液流路系統，在以下說明。

(第1懸浮液流路系統)

第1懸浮液流路系統包括：前述第9發明~第12發明所述的懸浮液供給口、懸浮液流路、和懸浮液注入口。

首先，沿圖11(a)的X-X線的截面圖(一部分省略)如 圖11(b)所示，由圖11(b)可知，上部板41的下面(與下部板42的接合面)形成有由懸浮液供給口43以分枝狀延伸設置的內徑和深度分別為50~500μm左右的微細的溝槽。因此，將上部板41和下部板42以密合狀態接合時，藉由這些槽和下部板材42的上面，構成了用於流通神經細胞懸浮液的複數個微細的懸浮液流路44。

上部板41的下面圖(底面圖)如圖12(a)所示。圖11(b)中，僅圖示單一的懸浮液流路44，但實際上，由圖12(a)可知，由圖的下側所示的懸浮液供給口43以分枝狀延伸設置有複數個懸浮液流路44。在這些懸浮液流路44中，藉由分別在適當的部位設置多餘的迂回路，將它們的流路長度調節為相互近似。

另外，圖12(a)中，為了方便圖示，懸浮液流路44僅以粗實線表示。這些圖中所示的後述第2懸浮液流路44a也僅以粗實線表示。

接著，圖12(b)係概念性地表示神經細胞網路形成用培養裝置或平面式片膜鉗制裝置的基板1的上面圖(平面圖)，圖示了在基板1的上面集合地設定多數個有被複數個突起部所包圍的細胞固定部2(簡化而以單一的圓點表示)的5處固定部設定區域。圖12(b)中，雖然亦合併表示了後述第2懸浮液注入口45a，但它們實際上是形成於下部板42者，並非形成於基板1者，是為了表示與上述5處固定部設定區域的位置關係才特意圖示的。

假定為基板1上設置有神經細胞播種裝置的裝置本體 40的狀態，基於圖12(a)進一步加以說明與上述圖12(b)的關係時，由懸浮液供給口43以分枝狀延伸設置的複數個懸浮液流路44係分別到達基板1上的集合地設定多數個細胞固定部2的5處固定部設定區域的正上方，在該位置，形成有與設置於下部板42的多數個懸浮液注入口45連接的5處注入口設定部46。

該注入口設定部46的放大圖如圖13所示。各注入口設定部46中，懸浮液流路44分支成縱向朝向的5條流路，這些5條分枝的流路分別與設置於下部板42的多數個懸浮液注入口45連接。亦即，如圖12(b)所示，在基板1上的5處固定部設定區域中，在縱向形成有5條細胞固定部2，其中的各1條包含5個細胞固定部2，與這些全部的細胞固定部2完全對應，定位有懸浮液流路44的縱向朝向的5條流路，並且在下部板42上，也與全部的細胞固定部2完全對應地形成有懸浮液注入口45。

懸浮液注入口45的內徑與細胞固定部2的內部區域的大小大致相同或者稍大，但是比包含突起部12的細胞固定部2的外形小。因此，形成突起部12不會進入懸浮液注入口45的內部的構成。

因此，將神經細胞懸浮液以例如加壓狀態供給至構成第1懸浮液流路系統的懸浮液供給口43時，通過懸浮液流路44和懸浮液注入口45，對於設置於基板1上的5處固定部設定區域的總計250處細胞固定部2的全部，在極短時間內，並且注入幾乎相同量的神經細胞懸浮液。該結 果係以「發明的效果」一項中所述的適合型態對細胞固定部2播種了神經細胞。

(第2懸浮液流路系統)

第2懸浮液流路系統是前述第13發明相關的用於對裝置基板中的細胞固定部以外的區域注入神經細胞懸浮液的懸浮液流路系統，包括圖11(a)所示的第2懸浮液供給口43a、由該第2懸浮液供給口43a如圖12(a)所示以分枝狀延伸設置的複數個第2懸浮液流路44a、以及在這些第2懸浮液流路44a的各末端形成於下部板42的第2懸浮液注入口45a。各第2懸浮液注入口45a在圖12(a)中以虛線表示，在圖12(b)中以實現表示。

第2懸浮液供給口43a、第2懸浮液流路44a和第2懸浮液注入口45a的結構關係，與關於第1懸浮液流路系統而表示於圖11(b)中的懸浮液供給口43、懸浮液流路44和懸浮液注入口45的情形相同。但是，第2懸浮液流路系統中，複數個第2懸浮液流路44a的流路長度可以不同，另外，第2懸浮液注入口45a如圖12(b)所示，對基板1上的細胞固定部以外的區域開口。

因此，將神經細胞懸浮液以例如加壓狀態供給至構成第2懸浮液流路系統的第2懸浮液供給口43a時，通過第2懸浮液流路44a和第2懸浮液注入口45a，將神經細胞播種於基板1上的細胞固定部以外的區域。

另外，如第6實施例形成有細胞固定部13和外側細 胞固定部36時，在裝置本體40中，為了將神經細胞播種於外側細胞固定部36，除了懸浮液流路44和第2懸浮液流路44a之外，可以在裝置本體40形成用於將神經細胞播種於外側細胞固定部36的第3懸浮液流路(圖示省略)。或者，也可以將基板1上的裝置本體40的位置稍微移開後，利用懸浮液流路44，將神經細胞播種於外側細胞固定部36。

〔第8實施例〕

如上所述，利用設置於神經細胞播種裝置的裝置本體40的第1懸浮液流路系統，對各細胞固定部2注入規定濃度的神經細胞懸浮液。接著，因為細胞固定部2的複數個突起部12的相互間隔要比播種時的神經細胞的細胞體的尺寸小，並且寬度可足以使神經細胞懸浮液的介質液(例如神經細胞的培養液)容易流出，所以由上部對細胞固定部2導入神經細胞懸浮液，介質液會流出而神經細胞會停留於細胞固定部2的內部而播種於其中。

所以，可以在短時間並且大致同時且無損傷地將細胞播種於大量細胞固定部2。其結果係可以穩定並且容易地形成由多數個細胞固定部(平面式片膜鉗制裝置的多數個通道電流測量點)而成的神經細胞網路。

如此地利用在突起部12間具有間隙以進行播種時，重要的是更詳細地探討該間隙和細胞體的尺寸的關係。亦即，神經細胞的細胞體在播種時和培養中，大多數的情況 下形狀大不相同。另外，細胞體的形狀也並非正圓，而呈細長的橢圓狀。

因此，需要使突起部12的相互間隔為播種時的細胞體的尺寸最小值(短軸方向的尺寸)和培養中的細胞體的尺寸最小值中的任一個較小的值以下，並且形成儘可能大的值，以使神經細胞懸浮液的介質液可容易地流出、或者神經細胞的軸突或樹突可以容易地出入細胞固定部2。

作為一例，基於圖14、圖15對以大鼠海馬的神經細胞進行實驗所得的結果進行說明。圖14中，將大鼠海馬的多數個神經細胞體於播種時尺寸最大值(長軸方向的尺寸)的分佈表示於左側的圖，其尺寸最小值(短軸方向的尺寸)的分佈表示於右側的圖。如圖14所示，播種時細胞體的尺寸最小值為約7.5μm。

另一方面，在圖15中，將同上的細胞體於培養時尺寸最大值(長軸方向的尺寸)的分佈表示於左側的圖，將其尺寸最小值(短軸方向的尺寸)的分佈表示於右側的圖。如圖15所示，在培養時，細胞體變得細長，細胞體的尺寸最小值為約8μm。

進而，對於以大鼠海馬的神經細胞進行的其他實驗，基於圖16進行說明。圖16是表示培養第4天的神經細胞狀況的光學顯微鏡照片，照片中的4個大圓形是構成細胞固定部2的4個突起部12，以空白實線表示的輪廓是表示神經細胞。如圖16所示，神經細胞正欲由外部通過突起部12間的間隙而侵入細胞固定部2。結果是該神經細 胞無法侵入，不久即後退。突起部12間的間隙為11μm，神經細胞的細胞體的短軸方向的尺寸為8.5μm。因此，圖16的情形表示突起部12間的間隙稍微再縮小則更安全。

〔第9實施例〕

第9實施例係關於播種中使用的大鼠神經細胞懸浮液的製備方法。該懸浮液的製備如下述進行。亦即，由17~18天齡的Wistar大鼠胎兒的腦中採集大腦皮質或海馬，經由使用了0.25%胰蛋白酶溶液的酵素處理(37℃、20分鐘)，將組織分解。接著，使用將極限必需培養基(MEM)作為基本培養基的含血清培養基，製備1.0×10⁷細胞/ml的細胞懸浮液。接著，將該細胞懸浮液使用微流路或微量注射器導入細胞固定部進行播種。

〔第10實施例〕

第10實施例係關於播種iPS細胞的製備。亦即，通過獨立行政法人理化學研究所(日本)的細胞庫(CELL BANK)獲得人誘導多功能幹細胞(iPS細胞)株201B7，將來源於利用絲裂黴素C對增殖能力進行了失活處理的STO細胞的細胞(SNL)培養作為飼養細胞。飼養細胞係指發揮輔助iPS細胞的自我複製的功能的其他細胞。

作為培養液，使用含有替代血清KSR、L-穀胺醯胺、非必需胺基酸、2-巰基乙醇的哺乳動物細胞培養用培養基(DMEM/F12培養基)，進而在臨用前添加重組人鹼性成纖 維細胞生長因子(bFGF)。使飼養細胞為3×10⁴細胞/cm²的濃度，播種於施加了適合飼養細胞的被覆的6cm的培養皿，該1天後將iPS細胞播種於飼養細胞上。良好狀態的iPS細胞係群落輪廓清晰且內部的細胞密度變高。iPS細胞的繼代通常以3~4天1次的頻率來進行繼代。進行3~4代的傳代後，以分化誘導成運動神經元為目的，將細胞從有飼養培養轉移至表面被覆有明膠或基質膠的6cm培養皿中，改變成無飼養培養。

以無飼養培養進行3~4代的繼代後，開始分化誘導成運動神經元。經無飼養培養的iPS細胞藉由在增殖因子的存在下進行懸浮培養，分化誘導成神經幹細胞。分化誘導培養基是添加了葡萄糖、穀胺醯胺、胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、氯化硒的DMEM/F12培養基。作為分化誘導的懸浮培養步驟，以5×10⁴細胞/ml的密度進行2天懸浮培養。之後，更換成添加了視黃酸(10^-8M)的分化誘導培養基，進行4天的懸浮培養。之後，進一步更換成添加了FGF2(20ng/ml)、SHH-N(30nM)的分化誘導培養基，進行7天培養。藉由此處理，細胞的形態形成神經幹細胞。

分解此神經幹細胞，用被覆有聚-L-賴胺酸的培養皿進行黏附培養，黏附培養開始5週後分化為成熟的運動神經元。在感測器基板上形成神經細胞網路時，將基板表面用聚-L-賴胺酸被覆，在其上播種已分解的神經幹細胞，在黏附培養開始5週後形成含有運動神經元的網路。在基 板上形成神經細胞網路時，將基板表面用聚-L-賴胺酸被覆，在其上播種已分解的神經幹細胞，在黏附培養開始5週後形成含有運動神經元的網路。

產業上利用性

根據本發明，提供可以在限制細胞培養基中處於存活狀態的神經細胞的移動，同時可構成良好的神經細胞網路的神經細胞網路形成用培養裝置以及其利用手段。

11‧‧‧神經細胞

12‧‧‧突起部

13‧‧‧細胞固定部

14‧‧‧基板

15‧‧‧微細貫通孔

16‧‧‧間隔體

17‧‧‧間隔體

18‧‧‧培養空間

19‧‧‧切槽部

20‧‧‧板

21‧‧‧板

22‧‧‧主貯液池

23‧‧‧貯液部

24‧‧‧液體通路

25‧‧‧副貯液池

26‧‧‧導入用液體通路

27‧‧‧排出用液體通路

28‧‧‧電極部

29‧‧‧電極部

30‧‧‧細胞外基質形成物質

31‧‧‧電極容器

32‧‧‧電極溶液

33‧‧‧AgCl/Ag電極

34‧‧‧無機多孔材料

Claims (11)

1. 一種神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其係包含具有貫通孔之電絕緣性基板、形成於該電絕緣性基板之第一表面側的第一貯液部、形成於其相反側之第二表面側的第二貯液部、與配置為可對導入於第一貯液部及第二貯液部之導電性液體分別通電的電極部之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其特徵係(1)於電絕緣性基板之第一表面側的貫通孔之周邊具備被多個突起部包圍的細胞固定部，此處，多個突起部具有不使神經細胞的細胞體通過之間隔；(2)於細胞固定部上被覆有細胞外基質形成物質，及(3)電極部具備以下之(a)~(c)：(a)前述貯液部中導入導電性液體時，接觸該導電性液體的容器壁的至少一部分係由無機多孔材料所構成的電極容器；(b)容納於上述電極容器內之於貴金屬Nm的表層部形成有該貴金屬的氯化物NmCl層的電極；(c)填充於上述電極容器內之以飽和濃度溶解有前述貴金屬的氯化物NmCl及鹼金屬氯化物的電極溶液。
2. 如申請專利範圍第1項之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其中藉由前述多個突起部所規定的細胞固定部的內徑為可容納1~數個細胞體的尺寸。
3. 如申請專利範圍第1項之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其中藉由前述多個突起部所規定 的細胞固定部，係被多個配置於前述基板上。
4. 如申請專利範圍第1項之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其中於前述細胞固定部係配置1~數個細胞體，而且將其他細胞體播種於細胞固定部外。
5. 如申請專利範圍第1項之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其中前述神經細胞網路形成用培養裝置係使用於離子通道電流的測量、解析；或成像解析者。
6. 如申請專利範圍第1項之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置，其中前述神經網路解析用平面式片膜鉗制裝置，進一步具備下述者：神經細胞發出之光的受光裝置；及對神經細胞或基板表面照射光的照射裝置。
7. 一種神經細胞播種裝置，其是設置於神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置中的可填充細胞培養基的平坦裝置基板上，用於將神經細胞播種於被裝置基板中的複數個突起部所包圍的多數之細胞固定部之神經細胞播種裝置，其特徵係可設置於前述裝置基板上的板狀裝置本體，在其設置狀態下具有覆蓋前述多數之細胞固定部的大小，同時其平坦底面與多數之細胞固定部中的多個突起部的頂端接觸，裝置本體設置有(1)用於從外部供給以一定密度懸浮有神經細胞的神經細胞懸浮液的懸浮液供給口、(2)在裝置本體的內部，由前述懸浮液供給口成分枝狀延伸設置的 多數的微細之懸浮液流路、及(3)在前述各懸浮液流路的末端，向裝置本體的底面開口之用於將神經細胞懸浮液注入前述各細胞固定部的懸浮液注入口。
8. 如申請專利範圍第7項之神經細胞播種裝置，其中前述神經細胞播種裝置中，多數的前述懸浮液流路實質上設定成相同的長度，並且在神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置的裝置基板上設置前述神經細胞播種裝置時，各個前述懸浮液注入口被設計成正確地對應於各個前述細胞固定部而定位。
9. 如申請專利範圍第7項之神經細胞播種裝置，其中前述板狀的裝置本體係將設置有前述懸浮液供給口的上部板與設置有前述懸浮液注入口的下部板以密合狀態接合而成，並且在上部板與下部板的至少一者的接合面，形成有構成前述懸浮液流路的溝槽。
10. 如申請專利範圍第7項之神經細胞播種裝置，其中前述神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置係如申請專利範圍第1項之神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置。
11. 如申請專利範圍第7項之神經細胞播種裝置，其中前述裝置本體進一步具備用於對前述神經細胞網路形成用培養型平面式片膜鉗制裝置之裝置基板中的前述細胞固定部以外的區域，注入前述神經細胞懸浮液之第2懸浮液流路系統。