JP2009204407A - パッチクランプ素子用基板、平面基板型パッチクランプ素子及び細胞イオンチャンネル活性測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】装置の小型化が容易で使用が簡単であり、しかも高感度で正確な測定が可能とされる平面基板型パッチクランプ素子の技術を提供する。
【解決手段】電気絶縁性の基板の両方の表面側を連通させる貫通孔における片方の開口部は細胞より小さい口径とされ、この開口部の周縁には細胞外マトリックス形成物質を有するパッチクランプ素子用基板。この基板の貫通孔の両方の表面側に、導電性液体を保持する液溜部と、この導電性液体に対して通電可能に配置された電極を設けた平面基板型パッチクランプ素子。
【選択図】図２

Description

本発明は、パッチクランプ素子用基板、平面基板型パッチクランプ素子及び細胞イオンチャンネル活性測定方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、装置の小型化が容易であり、使用が簡単かつ容易であり、高感度で正確な測定が可能とされ、集積回路化も可能なパッチクランプ素子用基板と平面基板型パッチクランプ素子（プレーナーパッチクランプ素子）、及びこれらを利用する細胞イオンチャンネル活性測定方法に関する。

生命体を構成する細胞の表面には種々の膜タンパク質が配置されており、細胞表面の特定サイトへの化学物質（リガンドなどの信号伝達物質）の結合や電気あるいは光の刺激（ゲートトリガー）により膜タンパク質の開口部であるチャンネルが変形し、細胞膜の外側と内側の間でのイオンや化学物質の輸送（チャンネルカレント）が制御されている。

上記の制御を行うタンパク質をチャンネルタンパク質といい、このチャンネルタンパク質が脂質膜に埋め込まれた状態で存在するチャンネルとして生命機能を保っている。このチャンネルタンパク質の電気的変化を測定することにより、そのチャンネルタンパク質を含む細胞の活動状態や細胞外の物質との相互作用を検出できるようになる。

チャンネルタンパク質をシリコン固体表面に保持して電気的結合を作ることにより、集積化された測定素子を作ることができるので、従来、それらの提案が多くなされている。

特に近年、シリコンチップのような固体基板上のパッチクランプ装置を開発することに多大な努力がなされている。通常、これらの基板は、従来のパッチクランプ電極の開口部に相当する細胞の配置及び固着のための一つ以上の貫通孔を備えている。

特表２００３−５１１６６８公報 特表２００５−５３６７５１公報 例えば上記の特許文献１には、複数のパッチクランプ細胞にてパッチクランプ記録を実施するための複数の電極からなる平面的パッチクランプ電極配列について記載されている。

しかし、特許文献１に記載された発明では、細胞を基板貫通孔の入り口に置く際に細胞を吸引して誘導するため、細胞を弱らせ寿命を短くさせている。従って、測定対象である細胞の良好な生理状態を十分な時間にわたって維持し難く、ひいては細胞イオンチャンネル活性の信頼性ある測定結果を得ることが難しい。

又、上記の特許文献２には、シリコン基板の上下の表面に電極を設け、二つの電極の間に電気的に連通させるための孔を貫通し、貫通孔の入り口に置いた細胞の電気的変化を測定するプレーナー型パッチクランプ装置が開示されている。

しかし、特許文献２に記載された発明では、細胞との電気的な連通を確立するために細胞を置く部分に突起を設けるため、細胞に無用の力学的ストレスを与え、イオンチャンネル活性に悪影響を与える。そのため、測定精度を低下させ、更に細胞の状態をも変えてしまう恐れを有している。

以上のように、平面基板の両側の表面に微細な孔を貫通させて導電性を持たせる公知のプレーナー型パッチクランプ装置を使用する方法では、下記の問題点があった。

（１）測定対象とする細胞の寿命が１時間から３０分以下と短いため、創薬スクリーニングなどの限られた応用しかできなく、ピペットパッチクランプが活躍している細胞の機能解析などへの応用が不可能である。

（２）平面基板上の両側の表面を連通する孔に細胞をトラップする工程（トラップ工程）において（2-1）穴がつまる、（2-2）細胞をうまく運べない、などの問題が生じる。

（３）なお、いわゆるホールセルクランプモードの測定では、基板に設けた貫通孔の一方の表面側の開口部に細胞を固着させた後、その開口部に接するところで細胞膜に穴を開ける工程が必要である。即ち、通常、細胞外がアース電位で細胞内に所定の電圧を印可するが、基板に設けた孔のところの細胞膜に孔を開けることにより、基板の反対側のチャンバー内が細胞内と同じ電位、即ち、反対側チャンバーに設置した電極が細胞内に導通することになる。このような穴あけ工程では、従来、物理的に細胞膜を破壊して穴を開けるのが一般的であるが、このような穴あけ工程も細胞にはストレスを与えることになり、細胞の状態を変化させ、また細胞の寿命を縮めてしまう。

そこで本発明は、平面基板型パッチクランプ素子を用いる細胞イオンチャンネル活性測定において、基板に形成された貫通孔の一方の開口部を細胞膜で覆う状態を素早く簡単に作り出し、覆った状態での電極間の抵抗を十分に低くし、かつ電気容量を小さくバックグランドノイズを小さくし、また貫通孔の開口部を覆う細胞の寿命を有効に延長することを、解決すべき技術的課題とする。

又、本発明は、平面基板型パッチクランプ素子を用いる細胞イオンチャンネル活性測定において、測定対象である細胞へのストレスを低減することも、解決すべき技術的課題とする。

更に本発明は、熟練が不要で簡便に操作できるイオンチャンネル活性測定用の平面基板型パッチクランプ素子と、そのためのパッチクランプ素子用基板を提供することも、解決すべき技術的課題とする。

（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、電気絶縁性の基板であって、基板の両方の表面側を連通させる貫通孔を備え、この貫通孔における第一の表面側への開口部は測定対象である細胞より小さい口径を持つ細胞定着用開口部とされ、この細胞定着用開口部の周縁における細胞とほぼ同じ大きさの領域の表面には細胞外マトリックス形成物質を有する、パッチクランプ素子用基板である。

（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る貫通孔が、前記細胞定着用開口部から第二の表面側への開口部に向かって次第に口径が大きくなる、パッチクランプ素子用基板である。

（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る電気絶縁性の基板がシリコン基板である、パッチクランプ素子用基板である。

（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係るシリコン基板が、第一の表面側のシリコン層と、中間の酸化シリコン層と、第二の表面側のシリコン層とが順次に積層された構造を有する、パッチクランプ素子用基板である。

（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る基板が、第一の表面側に前記細胞外マトリックス形成物質を有する前記貫通孔を複数備え、かつ、これらの貫通孔が電気絶縁壁構造を介在させ得る相互間隔をもって形成されている、パッチクランプ素子用基板である。

（第６発明）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、第１発明〜第４発明のいずれかに記載したパッチクランプ素子用基板の貫通孔の第一の表面側と第二の表面側にそれぞれ、導電性液体を保持するための液溜部と、この液溜部の導電性液体に対して通電可能に配置された電極とを設け、前記貫通孔により第一の表面側の液溜部と第二の表面側の液溜部とを導電的に連通させた、平面基板型パッチクランプ素子である。

（第７発明）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、第５発明に記載したパッチクランプ素子用基板の複数の貫通孔について、それらの第一の表面側と第二の表面側にそれぞれ、導電性液体を保持するための液溜部と、この液溜部の導電性液体に対して通電可能に配置された電極とを設け、前記貫通孔により第一の表面側の液溜部と第二の表面側の液溜部とを導電的に連通させると共に、第一の表面側及び第二の表面側において各貫通孔に設けた液溜部の相互間を電気的に絶縁した、平面基板型パッチクランプ素子である。

（第８発明）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、第６発明に記載した平面基板型パッチクランプ素子の第二の表面側の液溜部に導電性液体を導入したもとで、第一の表面側の液溜部には測定対象細胞を分散させた導電性液体を導入して、細胞外マトリックス形成物質の作用により前記測定対象細胞を無負荷で細胞定着用開口部に誘導・定着させることにより細胞定着用開口部を塞ぎ、これらの液溜部に通電可能な前記電極によって測定対象細胞の細胞膜におけるイオンチャンネルの開閉を測定する、細胞イオンチャンネル活性測定方法である。

（第９発明）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、第７発明に記載した平面基板型パッチクランプ素子の各貫通孔について設けた第二の表面側の液溜部に導電性液体を導入したもとで、第一の表面側の液溜部には複数の種類の測定対象細胞をそれぞれ分散させた導電性液体を導入して、細胞外マトリックス形成物質の作用によりそれぞれの前記測定対象細胞を無負荷で細胞定着用開口部に誘導・定着させることにより細胞定着用開口部を塞ぎ、これらの液溜部に通電可能な前記電極によって複数種類の測定対象細胞の細胞膜におけるイオンチャンネルの開閉を同時に測定する、細胞イオンチャンネル活性測定方法である。

（第１０発明）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第８発明又は第９発明に係るイオンチャンネル活性の測定をホールセルクランプモードで行うに当たり、細胞膜穿孔性物質の溶液を第二の表面側の液溜部から貫通孔に供給することにより細胞膜穴あけ工程を行う、細胞イオンチャンネル活性測定方法である。

本発明のパッチクランプ素子用基板は、基板に設けた貫通孔の第一の表面側への開口部（細胞定着用開口部）の周縁に細胞外マトリックス形成物質を有する。そのため、この基板を用いた平面基板型パッチクランプ素子による細胞イオンチャンネル活性測定において、第一の表面側の液溜部に保持された導電性液体（例えば、細胞培養液）中に分散させた測定対象細胞は、細胞外マトリックス形成物質の作用により細胞定着用開口部に誘導され定着する。即ち、細胞が細胞定着用開口部に定着するに当たり、吸引その他のイオンチャンネル活性に悪影響を与えるストレスが負荷されない。

そのため、測定対象である細胞を弱らせたり寿命を短くさせたりすることなく、細胞の良好な生理状態を測定に十分な時間にわたって維持することができ、ひいては細胞イオンチャンネル活性の信頼性ある測定結果を得ることができる。しかも、細胞定着用開口部への細胞の定着は自律的に行われるので、熟練した操作を何ら要しない。

更に、細胞定着用開口部は測定対象である細胞より小さい口径を持ち、かつ、細胞定着用開口部の周縁における細胞とほぼ同じ大きさの領域の表面には細胞外マトリックス形成物質を有するので、細胞定着用開口部が細胞によって完全に塞がれると共に、その周縁領域の表面にも細胞膜が密着する。このため、細胞定着用開口部の部分で十分な面積をもって導電性物質が完全に遮断され、細胞の吸引等を行うことなくギガオームシールを達成することができる。ギガオームシールとは、当該導電性物質の遮断すなわち絶縁性の程度がギガオームほどの高い抵抗値となっていることを端的に表現する技術用語である。

次に、パッチクランプ素子用基板の貫通孔が、細胞定着用開口部から第二の表面側への開口部に向かって次第に口径が大きくなる形状を備える場合、第１の表面側と第２の表面側との電極間の導電性が高まり、イオンチャンネルたんぱく質からの微弱電流に対する応答速度が速くなる。

電気絶縁性の基板としては、例えばシリコン基板が好ましい。第一の表面側のシリコン層と、中間の酸化シリコン層と、第二の表面側のシリコン層とが順次に積層された構造を有するシリコン基板（ＳＯＩ基板と称する)が、とりわけ好ましい。このような積層構造のシリコン基板においては、極めて絶縁性の高い中間層が二つのシリコン層間に存在するので、測定対象細胞のイオンチャンネル閉鎖時に高抵抗状態と低い寄生容量を確立でき、バックグランドのノイズを低減できる。

第７発明の平面基板型パッチクランプ素子を用いて第９発明の細胞イオンチャンネル活性測定方法を実施すると、複数種類ないし多数種類の測定対象細胞についての細胞イオンチャンネル活性測定を、同時に、かつ互いに独立に行うことができる。

第１０発明の細胞イオンチャンネル活性測定方法によれば、従来の穴あけ工程のように物理的に細胞膜を破壊して穴を開けるのではないため、測定対象細胞に余計なストレスを与えず、細胞の良好な生理状態を維持できる。従って細胞イオンチャンネル活性のより信頼性ある測定結果を得ることができる。

以下において、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。本発明の技術的範囲はこれらの実施形態によって限定されない。

(本実施形態の基本的な構成と作用・効果)
本発明の平面基板型パッチクランプ素子の具体的態様を図１に示し、図１における基板の要部の拡大図を図２に示す。

シリコン基板Ｐは、単結晶シリコンからなり第一の表面側を構成する第一シリコン層１と、酸化シリコンからなる絶縁層２と、第二の表面側を構成する第二シリコン層３が順次に積層された構造を有する。この三層構造を有するシリコン基板を、先にも述べたように、ＳＯＩ基板と呼ぶ。

このシリコン基板Ｐにおいて、第一シリコン層１と絶縁層２には測定対象である細胞４よりもかなり小さい口径を持つ極細孔５が貫通している。図２においては、細胞膜４ａと、この細胞膜４ａに埋め込まれた状態で存在する膜タンパク質４ｂによって細胞４を表現している。上記の極細孔５は第二シリコン層３を貫通する細孔６に連通している。細孔６は第二の表面側への開口部に向かって次第に口径が大きくなる円錐形に形成されている。そして、極細孔５と細孔６により、シリコン基板Ｐの第一の表面側と第二の表面側を連通させる貫通孔が構成されている。

極細孔５の第一の表面側への開口部（細胞定着用開口部）の周縁には、細胞４とほぼ同じ大きさの領域の表面にわたり、細胞外マトリックス形成物質７の薄い層が設けられている。

図１に示すように、シリコン基板Ｐの第一の表面側には上部流体回路基板８と上部チャンバー構成材９を重ね、かつ、上部チャンバー構成材９の上側の開口部をカバーグラス１０で閉鎖することにより、第一の表面側の液溜部１１を構成している。上部流体回路基板８には、液溜部１１に保持される導電性液体に対して通電可能な上部電極１２を設けている。なお、カバーグラス１０の上方近接位置には顕微鏡１３を設置することができる。

細胞のイオンチャンネル活性の測定時には、測定対象となる細胞４を分散させた導電性液体（培養液）を上記の液溜部１１に導入すると、細胞外マトリックス形成物質７の誘導・定着作用により、細胞４が培養液の中を移動していき、図２に示すように、極細孔５の細胞定着用開口部を塞ぐ状態で、細胞外マトリックス形成物質７に固着する。

一方、シリコン基板Ｐの第二の表面側には、下部流体回路基板１４と下部チャンバー構成材１５を重ねることによって、第二の表面側の液溜部１６を構成している。下部流体回路基板１４には、液溜部１６に保持される導電性液体に対して通電可能な下部電極１７を設けている。細胞のイオンチャンネル活性の測定時には、適宜な組成の導電性液体を上記の液溜部１６に導入する。

以上のように構成された平面基板型パッチクランプ素子においては、上記のように、第二の表面側の液溜部１６に導電性液体を導入したもとで、第一の表面側の液溜部１１には測定対象細胞４を分散させた導電性液体を導入して、細胞外マトリックス形成物質７の作用により測定対象細胞４を無負荷で細胞定着用開口部に誘導して定着させ、第一の表面側の液溜部１１に通電可能な上部電極１２と第二の表面側の液溜部１６に通電可能な下部電極１７によって、測定対象細胞４の細胞膜４ａにおけるイオンチャンネルの開閉を測定することができる。

(本実施形態の更に詳細な構成と作用・効果)
以上のように構成された平面基板型パッチクランプ素子の実施形態においては、細胞４とほぼ同じ大きさの領域の表面にわたり設けられた細胞外マトリックス形成物質７に従って細胞４が広がり、細胞外マトリックス形成物質７を介して第一シリコン層１の表面にきっちりと密着される。

図２においては、細胞膜４ａと膜タンパク質４ｂとを明瞭に図示するために、あえて細胞膜４ａと第一シリコン層１との間に空間が存在するかのように表現しているが、実際には、細胞膜４ａと第一シリコン層１との間には十分な面積で導電性物質を完全に遮断できる密着を確保することができる。従って、細胞４を強く吸引をすることなくギガオームシールを達成することができるので、密着のための強い細胞吸引が不要であり、細胞４への傷害の程度を低くすることができ、寿命を長くできる。

また、細胞外マトリックス形成物質７が極細孔５の細胞定着用開口部の周縁に、ほぼ細胞４の大きさ程度に配置されているので、細胞４が一つ素早く正確に細胞定着用開口部の周りに固着することができる。若し、二つ以上の細胞４が細胞定着用開口部を覆った場合には、二つの細胞４の接触部分でイオン性物質の移動が起きて、抵抗を小さくしノイズ発生の原因となる。しかし、本発明においては、このような不具合を生じない。

本発明では、第一シリコン層１の表面における細胞外マトリックス形成物質７を有する領域の大きさは、細胞４とほぼ同じ大きさであるのが適切であり、細胞外マトリックス形成物質７に固着するときの細胞４の面積の７５％以上で、かつ１５０％以下の面積であることが望ましい。

通常は、２０〜５０μｍのサイズの適宜な形状（例えば、円形または矩形）のパターン状に細胞外マトリックス形成物質７の層を設ける。

また、測定対象となる細胞４が固着するときに自然に取る形状に予め合わせたパターンに設けた細胞外マトリックス形成物質７を使用すると、細胞へのストレスをより少なくすることができて望ましい。

細胞外マトリックス形成物質７は、例えば、燐酸でバッファーされた生理的食塩水に溶かしてシリコン基板Ｐの上に直接塗布し、乾燥させることで、基板上に形成することができる。

また、例えば「ソフトマター（Soft Matter）２００７，３，１６８−１７７」に記載のマイクロコンタクトプリンティング法を利用して細胞外マトリックス形成物質７を所望の形、量でシリコン基板Ｐに配置することができる。

この細胞外マトリックス形成物質７の材料の塗布工程で極細孔５が詰まることを避けるため、細胞定着用開口部の周辺１〜数μｍの近傍領域では細胞外マトリックスを塗布しないパターンとするのも望ましい。

細胞外マトリックス形成物質７を設けることで、細胞４がこの細胞外マトリックス形成物質７を感知して移動してくるので、細胞４を極細孔５の部分に移動・定着させる際に吸引の必要がない。

前記したように、従来は基板に設けた微細な貫通孔からの吸引により細胞を貫通孔のところに運んでいて、これが貫通孔を詰まらせる原因のひとつであったが、本発明によれば、このような吸引を不要とし、あるいは強い吸引をしなくて済むので、貫通孔の詰まりを防止し、かつ吸引による細胞４へのストレスを解消ないし減少させることができる。

細胞外マトリックス形成物質７の構成材料としては、下記のものを例示することができる。

ポリリジン、コラーゲン（I型、II型、IV型）、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン（バーシカン、デコリンなど）、プロテオグリカン（アグリカン）、リンクタンパク質、エンタクチン、テネイシン、プロテオグリカン〔コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカンなど）、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン〕、ヒアルロン酸（グリコサミノグリカンの一種）、エラスチン、フィブリンなど。

第一の表面側の液溜部１１には、細胞４を極細孔５の部分に移動させる際等の細胞４に対して処理操作を加える際には生理的食塩水や培養液を使用し、電流測定（細胞イオンチャンネル活性測定）時には緩衝成分のみを含む液を使用する、というように溶液を入れ替えることが好ましく、そのため、液溜部１１には液の注入と排出を行い得る適宜な構成の液体流路系(図示省略)を設けることが望ましい。同様のことが、第二の表面側の液溜部１６についても言える。

図示する平面基板型パッチクランプ素子による細胞イオンチャンネル活性測定はセルアタッチモードで行うこともできるが、より好ましくはホールセルクランプモードで行うことができる。セルアタッチモードとは、細胞４を極細孔５の真上に固定した状態で、極細孔５に接した部分の細胞膜４ａの表面にあるイオンチャンネルを流れる電流を測定するモードである。一方、ホールセルクランプモードとは、細胞４を極細孔５の真上に固定した状態で、極細孔５に接した部分の細胞膜４ａに孔を開けて、細胞４の外部から細胞４の内部に流れる全電流を測定するモードである。

イオンチャンネル活性の測定をホールセルクランプモードで行うに当たり、細胞膜４ａを穿孔することができる物質の溶液を第二の表面側の液溜部１６から極細孔５に供給することにより、細胞膜穴あけ工程を行うことができる。

このような細胞穴開け工程として、細胞４が極細孔５の真上に固定された状態で、上下側の液溜部１１及び１６の溶液をチャンネル電流計測用の溶液（液溜部１１側を細胞外液相当の溶液、液溜部１６側を細胞内液相当の溶液）に置き換えた後、液溜部１６にナイスタチン(nystatin)、やアンフォテリシンＢ等の細胞膜４ａに孔を開ける性質を有する抗生物質の細胞内液による溶液を供給し、この溶液を極細孔５に通すことにより、細胞膜４ａに穴を開ける。

上記の細胞穴開け工程において、これらの抗生物質の拡散速度が非常に遅い。そのため、液溜部１６に差し込むように形成し先端が極細孔５の極めて近傍にある１ｍｍ又はそれ以下の細い内径のノズル１８を用い、このノズル１８から細胞穴開け用の溶液が細胞４に吹き付けるように噴き出される構成を採用することが好ましい。また、このノズル１８を表面をＡｇＣｌ化した銀などの金属で作成して前記下部電極１７の端子を兼ねさせることにより、よりコンパクトで安定な素子構成が可能になる。

本実施形態の平面基板型パッチクランプ素子によれば、セルアタッチモードとホールセルクランプモードのいずれの測定モードに対しても、細胞４とシリコン基板Ｐの密着している面積を大きくすることができ、かつ細胞外マトリックス形成物質７と細胞４の結合により細胞４がシリコン基板Ｐに強く密着するので、容易にギガオームシールが達成でき、且つ細胞４の寿命を長くできるので長時間の測定にも耐えることができる。また、シリコン基板ＰのＳＯＩ構造の故に、高い絶縁抵抗と十分小さい容量を容易に実現できる。

細胞４の周り、極細孔５、細孔６には導電性液体が充填されているが、細胞４は第一シリコン層１に固着していて、イオンが第一シリコン層１の表面と極細孔５との間を移動できないため、細胞４のイオンチャンネルが導電状態になった時のみ、電極と銀ノズル１８との間に電通状態が生じるように保たれている。

そして本願発明では、ＳＯＩ構造のシリコン基板Ｐを使用しているので、極めて絶縁性の高い絶縁層２が第一シリコン層１、第二シリコン層３の間に存在し、細胞４のイオンチャンネルが開いていないときは高抵抗状態を確立でき、バックグランドのノイズを低減でき、ピコアンペアレベルの電流を正確に測定することができる。

前記のように、絶縁層２には、通常ＳｉＯ_２が用いられる。その厚みはＳＯＩ基板利用により５ｎｍから１０μｍが可能であるが、寄生容量低減と絶縁抵抗増大の観点から、ＢＯＸ層（ＳＯＩ基板における酸化シリコンからなる絶縁層２）の膜厚は厚い方が好ましい。但し、ＢＯＸ層が厚すぎると、孔開け加工が簡単でなくなる。ＢＯＸ層が薄すぎれば、容量が大きくなり、抵抗は低くなってノイズが高くなる。

極細孔５の管路の中間での絶縁層２の配置により、極細孔５の部分のコンデンサー容量Ｃが小さくなり、ノイズを低減できる。

シリコン基板Ｐが誘電率の大きなシリコンだけであると、容量が大きくなり、雑音が大きくなり、バイオセンサーとして不利である（Ｓｉの比誘電率：１２．１、ＳｉＯ_２の比誘電率:４．５、真空の誘電率：８．８５×１０^−１２ Ｆｍ^−１）。誘電率 e 、ギャップ d 、面積 S の平衡平板コンデンサーの容量は、Ｃ=Ｓｘ（ε／ｄ）で与えられる。

液溜部１１、１６に保持される導電性液体はイオンを含むものであれば良いが、イオンチャンネルの開閉に係わる化学物質が運搬される緩衝液を使用することが好ましい。また細胞が生体内でさらされる外部イオン環境と同じ溶液が使用可能であり、さらに細胞の生体膜を通過するイオン電流を測定するために通常使用される溶液も使用できる。

図４の(ａ)〜(ｄ)にシリコン基板Ｐの形成方法の具体的態様を示す。図４において、第一シリコン層１側の極細孔５の形成には、電子ビーム露光とプラズマエッチングの組み合わせ、収束イオンビーム加工、レーザー加工、光露光とプラズマエッチング等の既知の各種の加工技術が適用可能である。

次いで、第二シリコン層３側からの細孔６の形成においては、ＳＯＩ基板であるＳｉ（１００）基板を用い、ダイアモンドドリルで一定の深さの、孔を開けた後、残部を、ＴＭＡＨエッチングで除去することにより、深さ方向に徐々に孔が小さくなる形状の加工が達成できる。ＴＭＡＨエッチングに代えてＸｅＦ_２ガスによるエッチングでも同様の加工が可能である。いずれも毎分０．１μｍ程度の速度のエッチングが可能である。

次いで、図１に示す上部流体回路基板８と下部流体回路基板１４、及び上部チャンバー構成材９と下部チャンバー構成材１５との間に、図４の（ｂ）の段階の基板をシリコン基板Ｐとしてセットし、第一の液溜部１１に１％〜１０％の希フッ酸を入れ、第二の液溜部１６に純水をいれ、絶縁層２の厚みとエッチング速度に応じて所定の時間だけ絶縁層２のエッチングを行い、ちょうど絶縁層２が完全にエッチングで除去される時点で、第一の液溜部１１に純水を添加してエッチングを停止する。

エッチング速度は１０％希フッ酸の場合で７０ｎｍ／ｍｉｎ．である。

このようにすると、絶縁層２が貫通すると同時に第一の液溜部１１の希フッ酸が第二の液溜部１６の純水により希釈されるため、絶縁層２が過剰に除去されるのを自動的に防ぐことが出来る。

さらに、シリコン基板Ｐの構造として、第一のシリコン層１における極細孔５の入り口付近の構造が、図４の（ｄ）の部分拡大図によって示すように、滑らかになっていることが、細胞膜４ａと極細孔５との間のシール抵抗を高くする。

図４に記載の例では、図４（ａ）の工程の前に全体を熱酸化し、表面に１ミクロンの熱酸化膜を形成しておき、（ｃ）の工程で、絶縁層２の除去と同時にこの最初の熱酸化膜が除去されるようにした。さらにこれに熱酸化を加えると（本実施例では膜の厚み１ミクロン）、（ｄ）に示すように、極細孔５の形状が滑らかになるとともに、電気容量が減少する。電気容量ＣはＣ＝ε(S/d)で与えられ、εは絶縁膜や熱酸化膜ＳｉＯ_２の誘電率（４．５×８．８５×１０^−１２Ｃ^２Ｎ^−１ｍ^−２）である。Ｓは導電性液体に接触するＳｉ基板の面積、ｄは酸化膜の厚さである。さらにこの基板にスパッターにより約１ミクロン厚のＳｉＯ_２膜を堆積した結果が（ｄ）である。さらに、微細孔の形状は滑らかになり、酸化膜は厚くなるため、電気容量は小さくなる。

本発明では、第二のシリコン層３を貫通する細孔６は、球状に絶縁層２との境界までえぐられた形をもち、そこで極細孔５につながっている。

この細孔６は形状が第二のシリコン層３側の表面から奥に行くほど徐々に口径が小さくなることが重要である。例えば、角錐あるいは円錐状である。

この作業はドリルを用いてもよいし、通常の電子ビーム露光も利用でき、さらに光露光によるリソグラフィによりパタン形成した後プラズマエッチングにより穴形成をしてもよい。

上記細孔６の径は第二のシリコン層３の表面で１００〜３０００μｍ程度である。この径が大きいほど、イオンセンサーを介して電通性を持っている電極間の導電性が高まり、イオンチャンネルたんぱく質からの微弱電流に対する応答速度が速くなる。

要するに、シリコン基板Ｐの構造として、第一のシリコン層１の極細孔５の入り口付近の構造が滑らかになっていることが、いわゆる細胞膜と孔部とのシール抵抗を高くするうえで重要である。また、基板の電気容量を減少することは、雑音低減の観点から重要である。

第一のシリコン層１の表面に配置される上部流体回路基板８は、基板の上に設置して極細孔５の上にある細胞４を液で浸す第１の液溜部１１を形成する。又、図３のように極細孔５を複数設ける場合には、複数の第１の液溜部１１を形成できるように作られている。図１の具体的構成では、上部流体回路基板８の上に上部電極１２が設けられて、上部の液溜部１１に保持された液体と電気的に連通している。

第二のシリコン層３の表面に配置される下部流体回路基板１４は第２の液溜部１６を形成する。図１の具体的構成では、第２の液溜部１６に差し込まれているノズル１８が下部電極１７の端子の役割をしているが、それに代えて、別途に下部電極を下部流体回路基板１４に設けてもよい。

上部流体回路基板８、下部流体回路基板１４等をアクリル樹脂やポリカーボネイト樹脂、ＰＤＭＳあるいはこれらの組み合わせ、などの透明な材料で構成することが望ましい。

図３は、シリコン基板Ｐに上記した構成に係る複数の貫通孔を設け、複数の細胞を同時に測定できるようにした態様である。即ち、図１及び図２において既に説明した構成についての詳細な再説明は省略するが、単一のシリコン基板Ｐに、極細孔５と細孔６からなる貫通孔が複数に設けられ、これらの各貫通孔ごとに、図１に示したものと同様の第一の表面側の液溜部１１に及び上部電極１２に関わる各種の構成要素と、第二の表面側の液溜部１６及び下部電極１７に関わる各種の構成要素とが形成されている。

そして、複数の第一の表面側の液溜部１１は隔壁１９により、複数の第二の表面側の液溜部１は隔壁２０により、互いに液密な状態で電気的に絶縁されている。これらの隔壁１９、２０は、絶縁状態を作るため電気抵抗を高める部材で作成することにより、各液溜部の電気的独立を維持できる。

この態様で、複数の下部電極を、それぞれ独立に信号測定回路２１（図１参照）につなげることで、細胞毎に独立のデータを同時に測定することができる。

以下に本発明の実施例を説明する。

Sigma-Aldrich Inc. (St.Louis, MO)製のフィブロネクティンを500 μg/mlの濃度で含む燐酸緩衝生理水（ＰＢＳ）を前記のシリコン基板Ｐの表面に塗布して乾燥させた。フィブロネクチンの塗布量は１平方センチあたり約５μｇであった。

このシリコン基板Ｐの上下に前記したように流体回路基板と液溜部を設置し、構成された流体回路の中に培養液を注入した。培養液の組成を下記に示す。

使用した細胞はHEK-293細胞で、まずDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM,
Sigma-Aldrish)の中で、10% (V/V) foetal bovine serum (FBS, Biological industries), 1% (V/V) gluta max (Gibco), 0.5% (V/V) penicillin - streptomycin
(Gibco) and 500 mg/ml geneticin (G418, Gibco)を供給しつつ培養した。培養液から遠心分離して分離されたHEK-293細胞は１０％のＦＢＳが供給されたＤＭＥＭの中に分散されて第一の液溜部１１中におかれた。細胞は、フィブロネクチンの塗布されているところに移動し固着した。

次いで、前記した実施形態の通り、すなわち、図１の液溜部１６にナイスタチン(nystatin)、やアンフォテリシンＢ等の細胞膜４ａに孔を開ける性質の抗生物質の細胞内液による溶液を供給し、この溶液を、極細孔５に通すことにより、細胞膜４ａに穴を開けた。

電流計測時には、第一の液溜部１１には、140ｍＭのNaCl, 5ｍＭの KCl, 10ｍＭのHEPES, 2ｍＭのMgCl₂, 2ｍＭのCaCl₂, 10ｍＭの Glucoseを含み、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した細胞外液を培養液と入れ替え、第二の液溜部１６には、140ｍＭのKCl, 5ｍＭのEGTA, 10ｍＭの HEPESを含み、ｐＨをＫＯＨで７．４に調整した細胞内液を培養液と入れ替えた。

０．５ｍＭのカプサイシンを上記の細胞外液に含ませて細胞を刺激して細胞のイオンチャンネルを開き、ついでＣａ^２＋を細胞外液に入れることでカプサイシンの影響を無効化する。これを繰り返したときの上部電極１２とノズル１８の銀との間の電流変化を図５に示す。このとき電圧は３０ｍＶに保持されている。

図５から、カプサイシン注入時から刺激持続中は電流が下がり、刺激を除くと電流が上がることが読み取れる。細胞のイオンチャンネルの導電の程度を測定できていることが示されている。図５において、ステージＩとステージIIIはカプサイシン注入時を示し、ステージIIとステージIVは液溜部の洗浄時すなわちカプサイシンを洗い流す行程時を示す。

本発明によって、装置の小型化が容易で使用が簡単であり、しかも高感度で正確な測定が可能とされる平面基板型パッチクランプ素子の技術が提供される。

本発明の平面基板型パッチクランプ素子の具体的態様の１例を示す。

図１における基板の要部を拡大して示す。

本発明の平面基板型パッチクランプ素子の他の具体的態様を示す。

貫通孔の形成工程を示す。

本発明の実施例の評価結果を示す。

符号の説明

Ｐ シリコン基板
１ 第一シリコン層
２ 絶縁層
３ 第二シリコン層
４ 細胞
５ 極細孔
６ 細孔
７ 細胞外マトリックス形成物質
１１ 第一の表面側の液溜部
１２ 上部電極
１６ 第二の表面側の液溜部
１７ 下部電極
１８ ノズル

Claims (10)

1. 電気絶縁性の基板であって、基板の両方の表面側を連通させる貫通孔を備え、この貫通孔における第一の表面側への開口部は測定対象である細胞より小さい口径を持つ細胞定着用開口部とされ、この細胞定着用開口部の周縁における細胞とほぼ同じ大きさの領域の表面には細胞外マトリックス形成物質を有することを特徴とするパッチクランプ素子用基板。
2. 前記貫通孔が、前記細胞定着用開口部から第二の表面側への開口部に向かって次第に口径が大きくなることを特徴とする請求項１に記載のパッチクランプ素子用基板。
3. 前記電気絶縁性の基板がシリコン基板であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のパッチクランプ素子用基板。
4. 前記シリコン基板が、第一の表面側のシリコン層と、中間の酸化シリコン層と、第二の表面側のシリコン層とが順次に積層された構造を有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のパッチクランプ素子用基板。
5. 前記基板が、第一の表面側に前記細胞外マトリックス形成物質を有する前記貫通孔を複数備え、かつ、これらの貫通孔が電気絶縁壁構造を介在させ得る相互間隔をもって形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載のパッチクランプ素子用基板。
6. 請求項１〜請求項４のいずれかに記載のパッチクランプ素子用基板の貫通孔の第一の表面側と第二の表面側にそれぞれ、導電性液体を保持するための液溜部と、この液溜部の導電性液体に対して通電可能に配置された電極とを設け、前記貫通孔により第一の表面側の液溜部と第二の表面側の液溜部とを導電的に連通させたことを特徴とする平面基板型パッチクランプ素子。
7. 請求項５に記載のパッチクランプ素子用基板の複数の貫通孔について、それらの第一の表面側と第二の表面側にそれぞれ、導電性液体を保持するための液溜部と、この液溜部の導電性液体に対して通電可能に配置された電極とを設け、前記貫通孔により第一の表面側の液溜部と第二の表面側の液溜部とを導電的に連通させると共に、第一の表面側及び第二の表面側において各貫通孔に設けた液溜部の相互間を電気的に絶縁したことを特徴とする平面基板型パッチクランプ素子。
8. 請求項６に記載の平面基板型パッチクランプ素子の第二の表面側の液溜部に導電性液体を導入したもとで、第一の表面側の液溜部には測定対象細胞を分散させた導電性液体を導入して、細胞外マトリックス形成物質の作用により前記測定対象細胞を無負荷で細胞定着用開口部に誘導・定着させることにより細胞定着用開口部を塞ぎ、これらの液溜部に通電可能な前記電極によって測定対象細胞の細胞膜におけるイオンチャンネルの開閉を測定することを特徴とする細胞イオンチャンネル活性測定方法。
9. 請求項７に記載の平面基板型パッチクランプ素子の各貫通孔について設けた第二の表面側の液溜部に導電性液体を導入したもとで、第一の表面側の液溜部には複数の種類の測定対象細胞をそれぞれ分散させた導電性液体を導入して、細胞外マトリックス形成物質の作用によりそれぞれの前記測定対象細胞を無負荷で細胞定着用開口部に誘導・定着させることにより細胞定着用開口部を塞ぎ、これらの液溜部に通電可能な前記電極によって複数種類の測定対象細胞の細胞膜におけるイオンチャンネルの開閉を同時に測定することを特徴とする細胞イオンチャンネル活性測定方法。
10. 前記イオンチャンネル活性の測定をホールセルクランプモードで行うに当たり、細胞膜穿孔性物質の溶液を第二の表面側の液溜部から貫通孔に供給することにより細胞膜穴あけ工程を行うことを特徴とする請求項８又は請求項９に記載の細胞イオンチャンネル活性測定方法。