JP2016015912A - 細胞外電位計測デバイス及び細胞外電位計測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞組織の長期の電位計測、及び細胞組織への薬剤刺激の制御を可能とする細胞外電位計測デバイス及び細胞外電位計測方法を提供する。
【解決手段】細胞外電位計測デバイス１０は、表面に細胞Ａを載置して培養する細胞培養膜１１を備え、細胞培養膜１１が、絶縁材料から形成される膜本体１４と、膜本体１４の表面に露出して配置される少なくとも１つの微小電極１５と、微小電極１５に接続される電極配線１６とを有する細胞外電位計測デバイス１０において、膜本体１４には、裏面側から所定成分Ｂを細胞Ａへ供給するための少なくとも１つの供給孔１７が形成されている。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞外電位計測デバイス及びこれを用いた細胞外電位計測方法に関する。

細胞外の多点の電位を同時計測することが可能なデバイスが、再生医療分野における細胞機能評価、創薬分野における薬効評価、神経生理学分野における細胞機能の解明などを目的に広く利用されている。このデバイスは、細胞培養面に多数の微小電極がアレイ状に配置された構造を有し、この面上に載置された神経系細胞や心筋細胞及びこれらの組織の細胞外電位を測定することができる（特許文献１〜４参照）。

しかしながら、上述の従来の細胞外電位計測デバイスにおいては、比較的大きな細胞組織片の電位計測を行う際に、細胞組織と細胞培養面とが接触する領域で、栄養分や酸素等が枯渇して細胞組織が部分的に壊死してしまうことがある。そのため、長期的に安定した電位計測を行うことが困難である。また、従来の細胞外電位計測デバイスにおいては、細胞組織に対して薬剤刺激を行う際に、薬剤を均一に溶解した溶液を全ての細胞に対して均等に作用させることしかできず、薬剤刺激を時間及び場所的に制御することが難しい。例えば、細胞組織の特定部位に対して局所的に薬剤刺激をするためには、外部からガラスピペットなどの先端をその特定部位に近づけ、その先端から薬剤放出するなどの手法をとらざるを得ない。この手法は、複雑かつ慎重な操作を伴い、薬剤刺激の量や位置の制御性が良くない。

特開平０６−７８８８９号公報 特開平０６−２９６５９５号公報 特開平０８−６２２０９号公報 特開平１１−１８７８６５号公報

本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、細胞又は細胞組織の長期の電位計測、及び細胞又は細胞組織への薬剤刺激の制御を可能とする細胞外電位計測デバイス及び細胞外電位計測方法を提供することを目的とする。

前記目的に沿う第１の発明に係る細胞外電位計測デバイスは、表面に細胞を載置して培養する細胞培養膜を備え、該細胞培養膜が、絶縁材料から形成される膜本体と、該膜本体の表面に露出して配置される少なくとも１つの微小電極と、該微小電極に接続される電極配線とを有する細胞外電位計測デバイスにおいて、前記膜本体には、裏面側から所定成分を前記細胞へ供給するための少なくとも１つの供給孔が形成されている。

第１の発明に係る細胞外電位計測デバイスによれば、細胞培養膜表面に載置して培養している細胞に、供給孔から所定成分として、栄養分や酸素、薬剤等を供給することができる。ここで、培養及び計測対象である「細胞」には、細胞の集合体である細胞組織も含まれ、細胞組織を形成していない細胞の電位計測も、細胞組織の電位計測も可能である。すなわち、単に「細胞」と記載している場合も「細胞組織」を含んで意味することがあり、逆に「細胞組織」と記載している場合も「細胞」を含んで意味することがある。
供給孔から栄養分や酸素を供給することで、細胞組織（単に細胞である場合も含む。以下同様）と細胞培養膜とが接する領域においても細胞組織が部分的に壊死することなく、細胞組織の生存期間を延ばすことができる。これにより、長期的な電位計測が可能となる。また、供給孔から刺激薬剤を添加させることで、薬剤刺激の制御性が高まる。例えば、供給孔を特定の箇所にのみ形成したり、特定の箇所の供給孔からのみ薬剤を供給したりすることで、細胞組織の特定箇所を局所的に薬剤刺激すること、すなわち薬剤刺激の空間的（位置的）制御が可能になる。また、供給孔の配置密度や各孔径に勾配を設けることなどにより、薬剤刺激強度を変化させることもできる。さらに、供給する薬剤の種類を時間的に切り替えることなどにより、薬剤刺激の時間的制御が可能になる。

第１の発明に係る細胞外電位計測デバイスにおいて、前記細胞培養膜表面側に、前記微小電極及び前記供給孔を含む領域を囲むように配置された細胞培養用筒状体を備えることが好ましい。この細胞培養用筒状体内に配置した細胞組織を培養液に浸すことにより、細胞組織の長期培養及び長期計測をより好適に行うことができる。

第１の発明に係る細胞外電位計測デバイスにおいて、前記細胞培養膜裏面側に、前記供給孔を含む領域を囲むように配置された所定成分供給用容器をさらに備えることが好ましい。このように所定成分供給用容器を配置することで、所定成分を連続的に供給孔から供給することができる。

前記目的に沿う第２の発明に係る細胞外電位計測方法は、第１の発明に係る細胞外電位計測デバイスを用い、前記細胞培養膜の裏面側から前記供給孔を介して、前記細胞培養膜の表面に載置された前記細胞に前記所定成分を供給する工程、及び前記細胞の前記微小電極と接触する部位の電位を計測する工程を有する。

第２の発明に係る細胞外電位計測方法によれば、供給孔から計測対象の細胞へ栄養分や薬剤等を供給することができるため、細胞組織の長期電位計測及び細胞組織への薬剤刺激の制御を行うことができる。

第１の発明に係る細胞外電位計測デバイス及び第２の発明に係る細胞外電位計測方法によれば、細胞又は細胞組織の長期の電位計測、及び電位計測の際の細胞又は細胞組織への薬剤刺激の制御を行うことができる。

本発明の一実施の形態に係る細胞外電位計測デバイスを示す模式図である。 同細胞外電位計測デバイスの細胞培養膜を示す模式図である。 同細胞培養膜の部分拡大模式図である。 （ａ）〜（ｆ）は、同細胞培養膜の製造過程を示す説明図である。

続いて、添付した図面を参照しながら本発明を具体化した実施の形態について説明する。
（細胞外電位計測デバイス）
図１に示すように、本発明の一実施の形態に係る細胞外電位計測デバイス１０は、細胞培養膜１１、細胞培養用筒状体１２（細胞培養用チャンバ）及び所定成分供給用容器１３（所定成分供給用チャンバ）を主に備えている。

図２、図３に示すように、細胞培養膜１１は、膜本体１４、複数の微小電極１５、複数の電極配線１６及び複数の供給孔１７を有する。細胞培養膜１１の表面には、計測対象の細胞組織Ａ（細胞）が載置され、培養される。細胞培養膜１１の平面視した形状としては特に限定されず、方形のほか、円形等であってもよい。

膜本体１４は、透明な絶縁材料から形成されている。このような材料としては、窒化ケイ素、酸化ケイ素、ガラス等のケイ素化合物、その他の無機化合物、アクリル、ポリスチレン等の有機化合物が挙げられるが、耐熱性、耐腐食性、耐薬品性等の点から無機化合物が好ましい。さらに、加工性等の点から、ケイ素化合物、さらには窒化ケイ素又は酸化ケイ素が好ましく、窒化ケイ素が特に好ましい。窒化ケイ素等は、表面（培養面）への有機分子の化学吸着による自己組織化単分子膜形成などによる表面処理を容易に行うことができ、かつその安定性が高く、自家蛍光も少ない。なお、透明な材料を用いることで、載置した細胞組織Ａの裏面側からの視認性を高めることができる。なお、膜本体１４は、例えばセラミックス等の不透明絶縁材料から形成されていてもよい。

膜本体１４（細胞培養膜１１）の厚さＴとしては、特に限定されないが、例えば、０．１μｍ以上１０μｍ以下であり、１μｍ以上３μｍ以下とすることができる。膜厚が小さすぎると、加工性や強度が低下する。逆に膜厚が大きすぎると、視認性等が低下する傾向にある。膜本体１４（細胞培養膜１１）の単層部分の平面視の大きさは、用途等に応じて適宜設定できるが、例えば、１ｍｍ^２以上１００ｍｍ^２以下であり、５ｍｍ^２以上２０ｍｍ^２以下とすることができる。正方形である場合、一辺の長さＬは例えば１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であり、２ｍｍ以上５ｍｍ以下とすることができる。

微小電極１５は、膜本体１４の表面（細胞培養面）の中心部分（縁部ではない領域：単層部分）に露出して配置されている。微小電極１５の数及びその配置形状は特に限定されないが、例えば、６４個（８個×８個）の微小電極１５をアレイ状に配置することができる。微小電極１５を形成する材料は、導電性を有するものであれば特に限定されず、白金、銅、銀等の金属等のほか、炭素等の導電性材料を用いることができる。微小電極１５表面を形成する材料としては、白金黒が好ましい。白金黒を用いた場合、広い周波数帯域にわたってインピーダンスが低く、様々な細胞の活動シグナルを検出することが可能となる。各微小電極１５の平面視の大きさとしては、例えば、１００μｍ^２以上５０，０００μｍ^２以下であり、１，０００μｍ^２以上１０，０００μｍ^２以下とすることができる。

各電極配線１６は、各微小電極１５と接続している。電極配線１６は、膜本体１４の内部をとおり、微小電極１５と反対側の端部が、パッド１８として、膜本体１４の縁部表面に露出している。このパッド１８にはリード線３０が接続され、リード線３０はアンプ３１を介して解析用のコンピュータ３２に接続される。電極配線１６を形成する材料は、導電性材料であれば特に限定されないが、ＩＴＯ（インジウム錫酸化物）、ＩＷＯ（インジウムタングステン酸化物）等の透明導電性材料を用いることが好ましい。透明導電性材料を用いることで、視認性を高めることができる。

複数の供給孔１７は、それぞれ膜本体１４の単層部分の表面から裏面に貫通して形成されている。後に詳述するように、この供給孔１７の裏面側から、所定成分Ｂが表面側に載置されている細胞組織Ａへ供給される。供給孔１７の配置箇所は特に限定されず、各微小電極１５間に配置されていてもよいし、複数の微小電極１５の群の周囲に配置されていてもよい。供給孔１７の個数も特に限定されない。供給孔１７の孔径としては、細胞組織Ａが落ちない程度のサイズであれば特に限定されず、例えば、０．１μｍ以上２０μｍ以下であり、１μｍ以上１０μｍ以下とすることができる。孔径が小さすぎると、所定成分Ｂの供給効率が低下するおそれなどもある。

複数の供給孔１７は、全面に均等に形成されていてもよいし、不均等に形成されていてもよい。同一サイズの供給孔１７を均等に形成した場合、全面均等に所定成分Ｂを供給することができる。一方、膜本体１４において、孔径を一方側から他方側にかけて拡大させたり、孔密度を一方側から他方側にかけて高くさせたりした場合、所定成分Ｂの供給量を一方側から他方側にかけて増やすことができる。このようにすることにより、所定成分Ｂ量が細胞組織Ａに与える影響を細胞外電位から調べることもできる。

ここで、細胞培養膜１１の製造方法の一例を、図４（ａ）〜（ｆ）を参照にしつつ説明する。まず、プラズマＣＶＤにより、シリコン基板４０の鏡面側（表面側）に膜厚１μｍのＳｉＮ膜４１を、非鏡面側（裏面側）に膜厚２μｍのＳｉＮ膜４２を順次成膜する（図４（ａ）参照）。この際、残留応力を小さくし、屈折率を下げるために、チャンバ圧力、ＲＦパワー、ステージ温度、アンモニアガス流量、シランガス流量、窒素ガス流量等を予め最適化しておく。

次に、シリコン基板４０表面側に、スパッタリングにより膜厚１００ｎｍのＩＴＯ膜４３を成膜し、王水によりＩＴＯ膜４３（電極配線）のパターニングを行う。その後、再びプラズマＣＶＤにより膜厚１μｍのＳｉＮ膜４４を成膜する（図４（ｂ）参照）。

ＣＦ_４プラズマにより、表面側ＳｉＮ膜４４をエッチングすることで、ＩＴＯ膜４３上に窓を開ける。次に、スパッタリングにより膜厚１００ｎｍのＴｉ膜と膜厚１００ｎｍのＡｕ膜を連続して成膜する。リフトオフによりこれらの膜をパターニングし、辺長５０μｍのＡｕ／Ｔｉ電極４５を形成する（図４（ｃ）参照）。

ＣＦ_４プラズマにより、シリコン基板４０表面側のＳｉＮ膜４１、４４をエッチングすることにより、直径５μｍの多数の微小穴１７ａを形成する。シリコン基板４０裏面側のＳｉＮ膜４２も同様にＣＦ_４プラズマでエッチングすることにより、シリコン基板４０の異方性エッチングのための窓を開ける（図４（ｄ）参照）。

２５％ＴＭＡＨ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）溶液を用いて、シリコン基板４０の異方性エッチングを行う。シリコン基板４０が貫通するまでエッチングを進め、供給孔１７アレイ及びＡｕ／Ｔｉ電極４５アレイを有するＳｉＮ製の自立膜（ＳｉＮ膜４６）を形成する（図４（ｅ）参照）。

電解めっきによりＡｕ／Ｔｉ電極４５上に白金黒４７を形成して、微小電極１５とする。めっき液として、塩化白金酸水溶液に酢酸鉛を添加したものを使用する。なお、縁部のＡｕ／Ｔｉ電極４５にはめっきを施さず、そのままパッド１８となる。これにより、細胞培養膜１１が得られる（図４（ｆ）参照）。

細胞培養用筒状体１２は、細胞培養膜１１表面側に、微小電極１５及び供給孔１７を含む領域を囲むように配置される。パッド１８は、細胞培養用筒状体１２の外側となるように配置される。細胞培養膜１１上の細胞培養筒状体１２で囲まれた領域に培養液Ｃが満たされ、細胞組織Ａが培養されるスペースとなる。

細胞培養用筒状体１２は、環状壁部１９及び蓋部２０を有する。環状壁部１９としては、例えば、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）等のシリコーン樹脂、アクリル、ポリスチレン等の材料から形成されたものを用いることができる。蓋部２０にはガス供給管２１が設けられ、細胞組織Ａの培養に必要な酸素、二酸化炭素等のガスＤを供給できるよう構成されている。また、細胞培養用筒状体１２には、液等を排出するための排出管２２が設けられている。

所定成分供給用容器１３は、細胞培養膜１１裏面側に、供給孔１７を含む領域を囲むように配置されている。すなわち、細胞培養膜１１は、所定成分供給用容器１３の上に載置されている。所定成分供給用容器１３は、ガラス、シリコーン樹脂、アクリル、ポリスチレン等の透明材料から形成されたもの等を用いることができる。

所定成分供給用容器１３には、栄養分や刺激薬剤等の所定成分Ｂの溶液が充填される。さらに、所定成分供給用容器１３には、細胞培養膜１１よりも上側から設けられた液供給管２３が連結されている。

（細胞外電位計測方法）
次いで、細胞外電位計測デバイス１０の使用方法（細胞外電位計測デバイス１０を用いた細胞外電位計測方法）について説明する。本方法は、細胞培養膜１１の裏面側から供給孔１７を介して、細胞培養膜１１の表面に載置された細胞（細胞組織Ａ）に所定成分Ｂを供給する工程、及び細胞（細胞組織Ａ）の微小電極１５と接触する部位の電位を計測する工程を有する。以下、具体的に説明する。

まず、細胞外電位計測デバイス１０の細胞培養膜１１表面中央部分に細胞（細胞組織Ａ）を載置する。この細胞組織Ａが細胞外電位の計測対象となるものであり、各部位の神経系細胞や心筋細胞等が対象となる。細胞組織Ａは培養液Ｃに浸されるが、完全に浸されていてもよいし、一部のみが浸された状態であってもよい。細胞組織Ａの裏面は、細胞培養膜１１表面の各微小電極１５と接している。培養の際には、ガス供給管２１から、酸素や二酸化炭素等のガスＤが細胞培養用筒状体１２（細胞培養用チャンバ）内に供給される。

さらに、細胞組織Ａには、長期の計測を可能とするため、あるいは、薬剤刺激を与えるため、供給孔１７を介して所定成分Ｂ（所定成分Ｂの溶液）が供給される。所定成分Ｂの溶液は所定成分供給用容器１３に充填されており、所定成分供給用容器１３には液供給管２３から所定成分Ｂの溶液が供給される。また、供給孔１７から供給された細胞培養用筒状体１２中の所定成分Ｂや培養液Ｃ等は、排出管２２から排出される。

所定成分Ｂは細胞組織Ａの培養に必要な栄養分や酸素、細胞組織Ａへ刺激を与えるための薬剤等である。また、新薬の影響評価のために、新薬を所定成分Ｂとして供給することもできる。この栄養分や薬剤は特に限定されるものではなく、公知のもの及び開発された新薬等を用いることができる。例えば、細胞組織Ａとしての海馬切片に対し、所定成分Ｂとして人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）に溶解したピクロトキシンを使用することなどができる。

このように、栄養分や薬剤を所定成分Ｂとして細胞組織Ａに供給しながら、細胞組織Ａの微小電極１５と接触する部位の電位を計測する。なお、細胞培養用筒状体１２中の溶液（所定成分Ｂ）中には、白金ワイヤー２４の一端側が差し込まれ、その他端側は接地されている。この接地された白金ワイヤー２４により、細胞培養用筒状体１２中の溶液（所定成分Ｂ）が計測の際の基準電位となる。微小電極１５により計測された電位は、アンプ３１により増幅され、コンピュータ３２に出力される。なお、白金ワイヤー２４を用いず、微小電極１５の一つを基準電極として他の微小電極１５の電位を計測してもよい。

供給孔１７から栄養分や酸素を供給することで、細胞組織Ａと細胞培養膜１１が接する領域においても細胞組織Ａが部分的に壊死することなく、細胞組織Ａの生存期間を延ばすことができる。これにより、長期的な電位計測が可能となる。また、供給する薬剤の種類を時間的に切り替えることなどにより、薬剤刺激の時間的制御が可能になる。

なお、計測及び所定成分Ｂの供給の際には、押さえつけ部材（図示しない）により、細胞組織Ａは上方から押さえつけられている。これにより、所定成分Ｂの供給孔１７からの供給により、細胞組織Ａが浮き上がること、すなわち、微小電極１５との接触性が低下することを抑えることができる。押さえつけ部材としては、特に限定されず、板状、棒状、網状等の非導電性部材などを用いることができる。

本発明は前記した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲でその構成を変更することもできる。例えば、微小電極及び供給孔は複数で無くてもよく、それぞれ１つであってもよい。微小電極及び供給孔の数は、計測対象の細胞（細胞組織）のサイズ等に応じて適宜設定することができる。また、供給孔から供給する所定成分は液体に限定されるものではなく、酸素等ガス状（気体）であってもよい。

また、細胞培養膜の上下に異なる溶液を供給してもよい。すなわち、細胞培養膜の上側に配置した細胞培養用筒状体に液供給管と排出管を共に配置し、細胞培養用筒状体内で栄養分を含む溶液の流れを作ると共に、細胞培養膜の下側に配置した所定成分供給用容器にも液供給管と排出管を共に配置し、所定成分供給用容器内で例えば刺激薬剤を含む溶液の流れを作ることで、供給孔から刺激薬剤を細胞組織に供給してもよい。これにより、大量の刺激薬剤が細胞培養膜の上側に供給されることがなくなるので、細胞組織の特定箇所を局所的に薬剤刺激する際などに、より精密な刺激制御が可能となる。

さらに、供給孔から供給する所定成分は１種類及び全て同量であることに限らない。例えば、各領域の供給孔毎に異なる薬剤等を供給したり、供給量を変えるようにしたりしてもよい。また、所定の供給孔からのみ薬剤等を供給したり、時間的に供給量を変化させたりしてもよい。このような制御は、例えば、複数に分割された所定成分供給用容器を用いることなどにより行うことができる。

１０：細胞外電位計測デバイス、１１：細胞培養膜、１２：細胞培養用筒状体、１３：所定成分供給用容器、１４：膜本体、１５：微小電極、１６：電極配線、１７：供給孔、１７ａ：微小穴、１８：パッド、１９：環状壁部、２０：蓋部、２１：ガス供給管、２２：排出管、２３：液供給管、２４：白金ワイヤー、３０：リード線、３１：アンプ、３２：コンピュータ、４０：シリコン基板、４１、４２：ＳｉＮ膜、４３：ＩＴＯ膜（電極配線）、４４：ＳｉＮ膜、４５：Ａｕ／Ｔｉ電極、４６：ＳｉＮ膜、４７：白金黒、Ａ：細胞組織（細胞）、Ｂ：所定成分、Ｃ：培養液、Ｄ：ガス

Claims (4)

1. 表面に細胞を載置して培養する細胞培養膜を備え、
   該細胞培養膜が、
   絶縁材料から形成される膜本体と、
   該膜本体の表面に露出して配置される少なくとも１つの微小電極と、
   該微小電極に接続される電極配線とを有する細胞外電位計測デバイスにおいて、
   前記膜本体には、裏面側から所定成分を前記細胞へ供給するための少なくとも１つの供給孔が形成されていることを特徴とする細胞外電位計測デバイス。
2. 請求項１記載の細胞外電位計測デバイスにおいて、
   前記細胞培養膜表面側に、前記微小電極及び前記供給孔を含む領域を囲むように配置された細胞培養用筒状体を備えることを特徴とする細胞外電位計測デバイス。
3. 請求項１又は２記載の細胞外電位計測デバイスにおいて、
   前記細胞培養膜裏面側に、前記供給孔を含む領域を囲むように配置された所定成分供給用容器をさらに備えることを特徴とする細胞外電位計測デバイス。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞外電位計測デバイスを用い、
   前記細胞培養膜の裏面側から前記供給孔を介して、前記細胞培養膜の表面に載置された前記細胞に前記所定成分を供給する工程、及び
   前記細胞の前記微小電極と接触する部位の電位を計測する工程
   を有することを特徴とする細胞外電位計測方法。

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