WO2019087991A1 - 細胞外電位計測補助装置 - Google Patents

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WO2019087991A1
WO2019087991A1 PCT/JP2018/040014 JP2018040014W WO2019087991A1 WO 2019087991 A1 WO2019087991 A1 WO 2019087991A1 JP 2018040014 W JP2018040014 W JP 2018040014W WO 2019087991 A1 WO2019087991 A1 WO 2019087991A1
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extracellular potential
potential measurement
extracellular
layer portion
auxiliary device
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PCT/JP2018/040014
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晃輔 堀
紀之 河原
Original Assignee
株式会社幹細胞＆デバイス研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular potential measurement auxiliary device used to measure an extracellular potential based on cell activity of a cell to be measured, and more particularly to an apparatus capable of measuring an extracellular potential with high sensitivity.
  • the MEGA system 10 shown in the example comprises a grid 1 shaped bottom surface.
  • the grid 1 comprises at least an electrical and / or optical multi-electrode array.
  • the multi-electrode array comprises an electrode array, which is represented by black dots 8 in the example shown.
  • the MEGA system 10 further comprises a top surface of the second grid 4 shape.
  • the grid 4 also comprises at least an electrical and / or optical multi-electrode array.
  • the multi-electrode array comprises an array of electrodes, represented by black dots 9 in the example shown.
  • the grids 1 and 4 are provided with electronic components, for example provided with the electronic components and provided with chips electrically connected to the electrodes 8, 9. Furthermore, the base 2 is provided below the grid 1.
  • the base 2 provides mechanical support and mechanical strength to the system 10.
  • the platform 2 is further provided with a microfluidic system 3.
  • the microfluidic system 3 may be comprised of a biocompatible polymer.
  • the grids 1, 4 may be positioned on the bottom and top of one another and held in place using means 5 for fixing the tissue section 6 or cell culture between both substrates.
  • Such means 5 may be, for example, a micro drive for adapting in a direction perpendicular to either of the grids 1 and 4 (see Patent Document 1 above).
  • the aforementioned MEGA system 10 has the following points to be improved.
  • the means 5 is a means for aligning the grids 1 and 4 with the bottom and top of each other and securing the tissue section 6 or cell culture between both substrates.
  • it does not press cells against the electrodes 8 and 9 and fix the target to the electrodes, nor does it improve the signal intensity. Therefore, there is a point to be improved that, when the cell to be detected has a low signal, it is not possible to obtain analysis data that can be analyzed.
  • an object of this invention is to provide the extracellular potential measurement auxiliary
  • An extracellular potential measurement auxiliary device used to measure an extracellular potential based on cell activity of a cultured cell comprising: A first layer located on the cell side, A second layer portion positioned above the first layer portion, Extracellular electrical potential measurement auxiliary device.
  • the first hierarchical portion further includes A through hole connecting the lower surface of the first layer portion and the upper surface of the first layer portion and / or connecting the lower surface of the first layer portion and the side surface of the first layer portion Having, Extracellular potential measurement auxiliary device characterized by [3]
  • the second hierarchical portion further includes A through hole connecting the lower surface of the second layer portion and the upper surface of the second layer portion and / or connecting the lower surface of the second layer portion and the side surface of the second layer portion Having, Extracellular potential measurement auxiliary device characterized by [Claim 4]
  • the first layer unit is Having insulation, Extracellular potential measurement auxiliary device characterized by [5]
  • the first layer unit is Having flexibility, Extracellular potential measurement auxiliary device characterized by [6] In any of the extracellular potential measurement assisting devices according to [1]
  • the extracellular potential measurement assisting device is an extracellular potential measurement assisting device used when measuring an extracellular potential based on the cell activity of a cultured cell, wherein the first layer portion located on the cell side And a second hierarchical portion positioned above the first hierarchical portion.
  • the predetermined pressure can be applied to the cells to be measured when measuring the extracellular potential, the position of the cells can be fixed.
  • the cell to be measured can be pressed toward the measurement electrode (described later), the intensity of the signal generated by the cell activity can be increased as compared with the conventional case. That is, the signal intensity can be improved, and the S / N ratio at the time of measuring the extracellular potential can be improved, and as a result, the extracellular potential can be measured with high sensitivity. In this way, it is possible to measure the extracellular potential even in a cell in which the signal intensity generated by the cell activity is weak.
  • the first layer portion further connects the lower surface of the first layer portion and the upper surface of the first layer portion, and / or It is characterized by having a through hole which connects the lower surface of the layer portion and the side surface of the first layer portion.
  • the culture medium can be provided to the cells located under the upper surface to the lower surface of the first layer portion, and thus the cells can be maintained in an appropriate state.
  • the second layer portion further connects the lower surface of the second layer portion and the upper surface of the second layer portion, and / or the second layer portion It is characterized by having a through hole which connects the lower surface of the layer portion and the side surface of the second layer portion.
  • the culture medium can be provided from the upper surface to the lower surface of the second layer portion.
  • the fresh medium outside the extracellular potential measurement auxiliary device can be provided to the cells located under the lower surface of the first layer, and thus the cells can be maintained in an appropriate state.
  • the extracellular potential measurement assisting device is characterized in that the first layer portion has flexibility.
  • the extracellular potential measurement assisting device is characterized in that the first layer portion has insulating properties.
  • the extracellular potential measurement assisting device is characterized in that the second layer portion is formed of a material having a weight property.
  • the second layer portion can be miniaturized, and in turn, the extracellular potential measurement assisting device can be miniaturized.
  • the extracellular potential measurement method is an extracellular potential measurement auxiliary device used when measuring an extracellular potential based on cell activity of cultured cells, which is a first layer portion located on the cell side.
  • the extracellular potential is measured using an extracellular potential measurement auxiliary device having a second hierarchical portion located above the first hierarchical portion.
  • FIG. 2 is a diagram showing a first layer unit 101 of the extracellular potential measurement auxiliary device 100.
  • FIG. 2 is a diagram showing a second layer unit 103 of the extracellular potential measurement auxiliary device 100.
  • It is a figure which shows the cell culture apparatus C.
  • FIG. It is a figure which shows MEA probe P.
  • FIG. It is a figure which shows the state which measures extracellular potential using MEA probe P, the cell culture apparatus C, and the extracellular potential measurement auxiliary
  • FIG. It is a figure which shows the result of having measured the extracellular potential of the cardiac muscle cell using the extracellular potential measurement auxiliary
  • FIG. It is a figure which shows the result of having measured the extracellular potential of the cardiac muscle cell using the extracellular potential measurement auxiliary
  • FIG. It is a figure which shows the extracellular potential of the cardiac muscle cell measured using the extracellular potential measurement auxiliary
  • FIG. It is a figure which shows the other Example of the extracellular potential measurement auxiliary
  • the extracellular potential measurement auxiliary device will be described using an extracellular potential measurement auxiliary device 100 which is an example.
  • the extracellular potential measurement auxiliary device 100 is an auxiliary device used when measuring an extracellular potential based on the activity of a cell to be measured.
  • FIG. 1A shows a plan view of the extracellular potential measurement auxiliary device 100
  • FIG. 1B shows a front view of the extracellular potential measurement auxiliary device 100, respectively.
  • the extracellular potential measurement auxiliary device 100 includes a first layer unit 101 and a second layer unit 103.
  • the first hierarchy unit 101 and the second hierarchy unit 103 are arranged hierarchically.
  • the first layer unit 101 is disposed at a position closer to the cells than the second layer unit 103.
  • the second layer unit 103 is disposed above the first layer unit 101 so as to overlap the first layer unit 101.
  • FIG. 2A shows a plan view of the first layer portion 101
  • FIG. 2B shows an X1-X1 sectional view of the first layer portion 101 shown in FIG. 2A.
  • the first layer portion 101 has a square shape.
  • the first layer portion 101 has a lower surface 101a, an upper surface 101b, and a through hole 101c.
  • the lower surface 101a is a surface located closer to the cell.
  • the upper surface 101 b is a surface located opposite to the lower surface 101 a and located on the side far from the cells.
  • the through hole 101c is a hole connecting the lower surface 101a and the upper surface 101b.
  • the first layer portion 101 has a plurality of through holes 101 c.
  • the first layer portion 101 is formed of an insulating, flexible material, such as PDMS (PolyDiMethylSiloxane).
  • PDMS PolyDiMethylSiloxane
  • FIG. 3A shows a plan view of the second layer portion 103
  • FIG. 3B shows an X2-X2 sectional view of the second layer portion 103 shown in FIG. 3A
  • the second layer portion 103 has an annular disc shape.
  • the second layer portion 103 has a lower surface 103a, an upper surface 103b, and a through hole 103c.
  • the lower surface 103 a is a surface in contact with the first layer portion 101.
  • the upper surface 103b is a surface located opposite to the lower surface 103a.
  • the through hole 103c is a hole connecting the lower surface 101a and the upper surface 101b.
  • the second layer portion 103 has one through hole 103 c at the center.
  • the second layer portion 103 is formed of a material having a weight property, for example, a metal.
  • a material having a weight property for example, a metal.
  • the first layer portion 101 by forming the first layer portion 101 with a flexible material, it is possible to reduce the damage to the cells by the weight of the extracellular potential measurement assisting device 100.
  • the second layer portion is disposed.
  • a through hole 101 c and a through hole 103 c communicating with the lower surface 101 a of the first layer portion 101 from the upper surface 103 b of the portion 103 can be formed.
  • the fresh medium outside the extracellular potential measurement auxiliary device 100 can be provided to the cells located under the lower surface 101a of the first layer portion 101, and thus, the cells are maintained in an appropriate state.
  • the extracellular potential measurement assisting device 100 by forming the extracellular potential measurement assisting device 100 by a plurality of layer units, two factors such as the weight of each layer unit and the buoyancy of each layer unit can be adjusted. Thereby, the optimal pressure can be determined in measuring the extracellular potential according to the type and condition of the cell whose extracellular potential is to be measured.
  • the extracellular potential measurement assisting device 100 when measuring the extracellular potential, a predetermined pressure can be applied to the cells to be measured, so that the position of the cells can be fixed.
  • the intensity of the signal generated by the cell activity can be increased as compared with the conventional case. That is, the signal intensity can be improved, and the S / N ratio at the time of measuring the extracellular potential can be improved, and as a result, the extracellular potential can be measured with high sensitivity. In this way, it is possible to measure the extracellular potential even in a cell in which the signal intensity generated by the cell activity is weak.
  • the extracellular potential measurement auxiliary device 100 it is possible to provide a sufficiently fresh culture medium necessary for cell activity to the cells to be measured in extracellular potential measurement, and also to apply a slight load. Since it is only necessary to add, the extracellular potential can be measured without inhibiting cell activity. Furthermore, even when measuring the extracellular potential in the state where the drug is added, since the drug added together with the medium can be supplied to the cells, the extracellular potential can be measured without inhibiting the drug responsiveness.
  • the extracellular potential generated by the cell activity of cardiomyocytes formed in the cell culture device C is MEA (Multi-Electrode Array) probe
  • MEA Multi-Electrode Array
  • FIG. 4A shows a plan view of the cell culture device C
  • FIG. 4B shows an X3-X3 cross-sectional view of the cell culture device C shown in FIG. 4A.
  • the cell culture device C has a cell culture sheet CS and a frame CF.
  • the cell culture sheet CS functions as a scaffold for cell culture.
  • As the cell culture sheet CS a fiber sheet formed of a polymer material is used.
  • the cell culture sheet CS has an oriented structure with a polymer, a non-oriented structure, or a mixed structure of oriented and non-oriented.
  • the frame CF functions as a holding member that holds the cell culture sheet CS in a planar manner.
  • the frame CF has a rectangular tube shape having a cell culture sheet arrangement space F1 at the center.
  • the frame CF has a predetermined thickness TS and a predetermined height HS.
  • a cell culture sheet CS is attached to one end face of the frame CF. That is, the cell culture sheet CS is held in the cell culture sheet arrangement space CA.
  • Cell culture apparatus C is placed in a predetermined well into which a predetermined medium is poured, and cardiomyocytes are placed on cell culture sheet CS held in cell culture sheet arrangement space CA of cell culture apparatus C.
  • the cells are seeded at a density, and cardiomyocytes are cultured on the surface of the cell culture sheet CS.
  • cardiomyocytes are cultured on both surfaces of the cell culture sheet CS.
  • FIG. 5A shows a plan view of the MEA probe P
  • FIG. 5B shows an X4-X4 cross-sectional view of the MEA probe P shown in FIG. 5A.
  • the MEA probe P has a substrate portion PB and a melted wall portion PW.
  • the substrate portion PB has a thin plate shape.
  • the melted wall portion PW is formed on the substrate portion PB.
  • the dissolved wall portion PW has a cylindrical shape with one end released, stores a predetermined culture medium inside, and forms a cell arrangement space PS for arranging cells to be measured.
  • the MEA probe P has a measurement electrode E1 and a reference electrode E2.
  • the measurement electrode E1 is formed along the substrate portion PB substantially at the center of the melting wall portion PW.
  • the measurement electrodes E1 are arranged in a 4 ⁇ 4 matrix.
  • a predetermined number of reference electrodes E2 are arranged around the measurement electrode E1.
  • the MEA probe P measures the extracellular potential due to cell activity based on the potential difference between the measurement electrode E1 and the reference electrode E2. Note that lead lines (dotted lines in the drawing) are arranged from each of the measurement electrode E1 and the reference electrode E2.
  • the cell culture device C in which cardiomyocytes are cultured is arranged in the cell arrangement space PS.
  • the cell culture device C is arranged on the measurement electrode E1 of the MEA probe P so that the cell culture sheet arrangement space F1 is positioned.
  • FIG. 6A is a plan view of a state in which the extracellular potential measurement auxiliary device 100 is disposed on the cell culture sheet CS on which cardiomyocytes of the cell culture device C are cultured
  • FIG. 6B is a cross-sectional view of FIG. 6A. Show. As shown to FIG. 6A and FIG. 6B, in the cell culture sheet arrangement
  • the first layer portion 101 of the extracellular potential measurement assisting device 100 is located on the cell culture sheet CS side, that is, the lower surface 101a of the first layer portion 101 is located in the cell culture sheet arrangement space F1.
  • the cardiomyocytes cultured on the culture sheet CS are placed in contact with the cells.
  • the second hierarchy portion 103 is arranged on the first hierarchy portion 101.
  • the through holes 101c of the first layer unit 101 and the through holes 103c of the second layer unit 103 are communicated with each other, and a fresh culture medium is constantly provided to cells located under the extracellular potential measurement auxiliary device 100. .
  • the first layer unit 101 and the second layer unit 103 both adjust the amount of culture medium, if necessary, so as to be located in the culture medium.
  • the extracellular potential due to the cell activity of the cardiomyocytes cultured in the cell culture apparatus C is measured.
  • the extracellular potential measurement assisting device 100 the movement of cells can be measured without interfering with the activity of the cells.
  • the second hierarchical layer portion 103 in the extracellular potential measurement auxiliary device 100 seven kinds of metal discs having an outer diameter of 8 mm and an inner diameter of 5 mm and weights 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, and 700 mg. was used.
  • a cell culture apparatus C in which predetermined cardiomyocytes were cultured was placed in a cell arrangement space PS of MEA probe P filled with a predetermined medium.
  • the extracellular potential measurement assisting device 100 when the extracellular potential measurement assisting device 100 is not used, when the extracellular potential measurement assisting device (total weight 40 mg) having only the first hierarchy portion 101 is used, the extracellular fluid having the second hierarchy portion 103 weighing 100 mg
  • the potential measurement auxiliary device 100 (total weight 140 mg) is used
  • the extracellular potential measurement auxiliary device 100 (total weight 240 mg) having the weight 200 mg and the second layer portion 103 is used, the weight 300 mg second layer portion 103
  • the extracellular potential measurement auxiliary device 100 total weight 340 mg
  • the second floor having a weight of 600 mg is used.
  • FIG. 8A the result of having measured extracellular potential, when not using extracellular potential measurement auxiliary
  • FIG. 8B the result of having measured extracellular potential using the extracellular potential measurement auxiliary
  • FIG. 8C the result of having measured extracellular potential using the extracellular potential measurement auxiliary
  • the measurement time was 5 minutes for each measurement.
  • the S / N ratio in each measurement became 2.5, 2.0, 71, 420 in order from the experimental result of FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C, and FIG. 8D.
  • a predetermined pressure is applied to the cardiomyocytes in the direction of the measurement electrode E1 of the MEA probe P using the second layer unit 103 to fix the position of the cardiomyocytes to be measured, and the myocardium to be measured.
  • the signal intensity generated by the cell activity is increased and the signal intensity is improved, as a result, as a result, the S / N ratio at the time of extracellular potential measurement.
  • the extracellular potential measurement assisting apparatus 100 by using the extracellular potential measurement assisting apparatus 100, it can be seen that the extracellular potential can be measured even for a cell whose signal intensity is weak due to the cell activity. Also, it can be seen that the S / N ratio can be improved dramatically by increasing the weight of the second layer portion 103.
  • a potential difference V1 obtained in the first peak of one signal which is a potential change obtained by one pulsation of cardiomyocytes is used.
  • Through holes 101a of the first layer portion 101 In the first embodiment, 23 cylindrical through holes 101c each having a diameter of 1 mm are formed in the first layer portion 101.
  • the connection is not limited to the illustrated one as long as it connects the lower surface 101a and the upper surface 101b.
  • A is a plan view and B is a cross-sectional view taken along X6-X6 in FIG. 10A). Eighteen cylindrical through holes 201c may be formed.
  • FIG. 1 A is a plan view
  • B is a cross-sectional view taken along line X7-X7 of FIG. 11A.
  • the through grooves 301c1 and 301c2 may be formed so as to penetrate the side surface 301d and connect the lower surface 301a and the side surface 301d, as in the first hierarchical portion 301 shown in FIG.
  • the first layer portion 301 has a through groove 301c1 in communication with the upper surface 301b and a through groove 301c2 in communication with the lower surface 301a.
  • the through groove 301c1 and the through groove 301c2 are formed hierarchically in the upper and lower directions so that they are orthogonal to each other.
  • the through groove 301c1 and the through groove 301c2 can be communicated with each other. Further, by using the first layer portion 301, the culture medium can be provided from the upper surface 301b to the lower surface 301a of the first layer portion 301, and the culture medium can be provided from the side surface 301d to the lower surface 301a.
  • the first layer unit 301 can be formed by PDMS.
  • first layer portion 101 has a square shape in the first embodiment described above, other shapes, for example, a disk shape (see FIG. 11), an elliptical plate shape, It may have a polygonal disc shape.
  • the first layer portion 101 is formed of PDMS, but if it has flexibility and insulating properties, it is exemplarily illustrated. It is not limited to For example, silicon other than PDMS, polycarbonate, and other plastic materials may be used.
  • the first hierarchical portion may be formed.
  • first layer portion 101 In Example 1 described above, the lower surface 101a of the first layer portion 101 is in contact with the cell to be detected, but if it is located on the cell side, It is not limited to For example, a buffer such as a sheet may be placed on the cells to indirectly press the cells.
  • a buffer such as a sheet may be placed on the cells to indirectly press the cells.
  • the second layer 103 has one through hole 103c at the center, but the second layer shown in FIG. As indicated by 303, a plurality of through holes 303c may be formed. Further, the plurality of through holes 303c formed in the second layer portion 303 may not have the same shape but different shapes.
  • FIG. 12 shows an extracellular potential measurement auxiliary device 300 formed using the second layer unit 303 and the first layer unit 301.
  • A is a plan view
  • B is a front view
  • C is a right side view
  • D is a X10-X10 cross-sectional view of FIG. 12A
  • E is a X11-X11 cross-sectional view of FIG. 13A.
  • the through holes may not be formed in the second layer portion.
  • the second layer portion 103 has an annular disc shape, but other shapes, for example, disc shape, elliptical plate shape, polygonal disc It may be shaped.
  • Example 1 Cells to be Measured: In Example 1 described above, cardiomyocytes were used as the cells to be detected, but any other cells may be used as long as they are suitable for measuring the extracellular potential. For example, it may be a nerve cell.
  • the cells to be measured may be single cells cultured in a planar sheet. Furthermore, cells cultured in a general cell sheet may be used instead of cells cultured in the cell culture sheet CS. Furthermore, cells cultured in a three-dimensional manner may be used instead of cells cultured in a planar manner on the cell culture sheet CS. Furthermore, it may not be cultured cells, but may be tissue sections collected from an organism such as a human.
  • Example 1 Use of Cell Culture Device C: In Example 1 described above, the cells to be measured are cultured using the cell culture device C, but if cells to be measured can be cultured, It is not limited to the illustrated one. For example, cells may be cultured directly in a predetermined container such as a dish for cell culture.
  • Example 1 Use of MEA Probe P: In Example 1 described above, the extracellular potential was measured using the MEA probe P. However, the method is not limited to the exemplified one as long as the extracellular potential can be measured.
  • the extracellular potential measurement assisting device can be used, for example, to measure an extracellular potential based on the cell activity of cultured cardiomyocytes.

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Abstract

【課題】　高感度で細胞外電位を計測できる細胞外電位計測補助装置の提供。 【解決手段】　細胞外電位計測補助装置１００は、第１階層部１０１、第２階層部１０３を有している。第１階層部１０１に貫通孔１０１ｃ、第２階層部１０３に貫通孔１０３ｃを形成し、両者を重ねて配置しても、第２階層部１０３の上面１０３ｂから第１階層部１０１の下面１０１ａに連通する貫通孔１０１ｃ、貫通孔１０３ｃを形成することができる。細胞外電位を計測する際に、外部の新鮮な培地を、第１階層部１０１の下に位置する細胞に提供することができ、細胞を適切な状態に維持できる。細胞外電位を測定する細胞の種類、状態に応じた、細胞外電位を計測するにあたり、最適な圧力を決定できる。細胞を計測電極に向かって押圧でき、細胞活動によって生ずるシグナル強度を大きくし、シグナル強度を改善でき、細胞外電位計測の際のＳ／Ｎ比を改善し、高感度で細胞外電位を計測できるので、シグナル強度が弱い細胞であっても細胞外電位を計測できる。

Description

細胞外電位計測補助装置
　本発明は、計測対象である細胞の細胞活動に基づく細胞外電位の計測に用いる細胞外電位計測補助装置に関し、特に、高感度で細胞外電位を計測できるものに関する。
　従来の細胞外電位計測について、図１４に示すＭＥＧＡシステム１０を用いて説明する。例に示すＭＥＧＡシステム１０は、グリッド１形状の底面を備える。このグリッド１は、少なくとも電気的および／または光学的多重電極アレイを備える。該多重電極アレイは、電極アレイを備えるが、図示した例においては黒ドット８で表している。ＭＥＧＡシステム１０は、第２グリッド４形状の頂面をさらに備える。また、このグリッド４は、少なくとも電気的および／または光学的多重電極アレイを備える。該多重電極アレイは、電極のアレイを備えるが、図示した例において黒ドット９で表している。グリッド１、４には、電子コンポーネントが設けられ、例えば該電子コンポーネントを備え、電極８、９に電気的に接続したチップが設けられる。さらに、土台２は前記グリッド１の下に設けられる。土台２は、機械的支持および機械的強度をシステム１０に提供する。土台２には、マイクロ流体システム３がさらに設けられる。マイクロ流体システム３は、生体適合ポリマーで構成してもよい。グリッド１、４は、互いに底面と頂面との位置を合わせ、組織切片６または細胞培養を両方の基板の間に固着させるための手段５を用いて適切な位置に保持してもよい。こうした手段５は、グリッド１、４のどちらかに垂直な方向に適合させるための、例えばマイクロドライブでもよい（以上、特許文献１参照）。
特開２０１１－２３９７７９号公報
　前述のＭＥＧＡシステム１０には、以下に示すような改善すべき点がある。ＭＥＧＡシステム１０において手段５は、グリッド１、４、互いの底面と頂面との位置を合わせ、組織切片６または細胞培養を両方の基板の間に固着させるための手段である。一方、細胞を、電極８、９に押圧し、電極に対して対象を固定するものでも、シグナルの強度を向上させるものでもない。したがって、検知対象である細胞が低シグナルである場合、解析可能な測定データを取得できない、という改善すべき点がある。
　そこで、本発明は、高感度で細胞外電位を計測できる細胞外電位計測補助装置を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明が、以下のとおりである。
[１]
　培養された細胞の細胞活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる細胞外電位計測補助装置であって、
　前記細胞側に位置する第１階層部、
　前記第１階層部の上方に重ねて位置する第２階層部、
　を有する細胞外電位計測補助装置。
[２]
　[１]に係る細胞外電位計測補助装置において、
　前記第１階層部は、さらに、
　前記第１階層部の前記下面と前記第１階層部の前記上面とを接続する、及び／又は、前記第１階層部の前記下面と前記第１階層部の前記側面とを接続する貫通孔を有すること、
　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
[３]
　[１]または[２]に係る細胞外電位計測補助装置において、
　前記第２階層部は、さらに、
　前記第２階層部の前記下面と前記第２階層部の前記上面とを接続する、及び／又は、前記第２階層部の前記下面と前記第２階層部の前記側面とを接続する貫通孔を有すること、
　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
[請求項４]
　[１]～[３]に係るいずれかの細胞外電位計測補助装置において、
　前記第１階層部は、
　絶縁性を有すること、
　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
[５]
　[４]に係る細胞外電位計測補助装置において、
　前記第１階層部は、
　可撓性を有すること、
　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
[６]
　[１]～[５]に係るいずれかの細胞外電位計測補助装置において、
　前記第２階層部は、
　金属により形成されていること、
　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
[７]
　培養された細胞の細胞活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる細胞外電位計測補助装置であって、
　前記細胞側に位置する第１階層部、
　前記第１階層部の上方に重ねて位置する第２階層部、
　を有する細胞外電位計測補助装置を用いて細胞外電位を計測する細胞外電位計測方法。
　本発明における課題を解決するための手段及び発明の効果を以下に示す。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置は、培養された細胞の細胞活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる細胞外電位計測補助装置であって、前記細胞側に位置する第１階層部、前記第１階層部の上方に重ねて位置する第２階層部、を有する。
　これにより、各階層部の重量、及び、各階層部の浮力といった２つの要素を調整することができ、細胞外電位を測定する細胞の種類、状態に応じた、細胞外電位を計測するにあたり、最適な圧力を決定できる。よって、高感度で細胞外電位を計測できる。
　また、細胞外電位を計測する際に、計測対象である細胞に対して、所定の圧力を加えることができるので、細胞の位置を固定できる。
　さらに、計測対象である細胞を計測電極（後述）に向かって押圧できるので、従来に比して、細胞活動によって生ずるシグナルの強度を大きくすることができる。つまり、シグナル強度を改善し、細胞外電位計測の際のＳ／Ｎ比を改善でき、結果として、高感度で細胞外電位を計測できる。これにより、細胞活動によって生ずるシグナル強度が弱い細胞であっても、細胞外電位を計測することができる。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置では、前記第１階層部は、さらに、前記第１階層部の前記下面と前記第１階層部の前記上面とを接続する、及び／又は、前記第１階層部の前記下面と前記第１階層部の前記側面とを接続する貫通孔を有すること、を特徴とする。
　これにより、培地を、第１階層部の上面から下面の下に位置する細胞に提供することができ、ひいては、細胞を適切な状態に維持することができる。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置では、前記第２階層部は、さらに、前記第２階層部の前記下面と前記第２階層部の前記上面とを接続する、及び／又は、前記第２階層部の前記下面と前記第２階層部の前記側面とを接続する貫通孔を有すること、を特徴とする。
　これにより、培地を、第２階層部の上面から下面に提供することができる。
　したがって、第１階層部と第２階層部を重ねて配置したとしても、第２階層部の上面から第１階層部の下面に連通する貫通孔を形成することができる。つまり、細胞外電位計測補助装置の外部の新鮮な培地を、第１階層部の下面の下に位置する細胞に提供することができ、ひいては、細胞を適切な状態に維持することができる。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置では、前記第１階層部は、可撓性を有すること、を特徴とする。
　これにより、第１階層部の下に位置する細胞への細胞外電位計測補助装置１００の重量による影響を低減することができる。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置では、前記第１階層部は、絶縁性を有すること、を特徴とする。
　これにより、細胞外電位を計測する際に、計測する電位に影響を及ぼさないようにし、正確に細胞外電位を計測することができる。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置では、前記第２階層部は、重量性を有する材料により形成されていること、を特徴とする。
　これにより、第２階層部を小型化することができ、ひいては、細胞外電位計測補助装置を小型化できる。
　本発明に係る細胞外電位計測方法は、培養された細胞の細胞活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる細胞外電位計測補助装置であって、前記細胞側に位置する第１階層部、
　前記第１階層部の上方に重ねて位置する第２階層部、を有する細胞外電位計測補助装置を用いて細胞外電位を計測する。
　これにより、各階層部の重量、及び、各階層部の浮力といった２つの要素を調整することができ、細胞外電位を測定する細胞の種類、状態に応じた、細胞外電位を計測するにあたり、最適な圧力を決定できる。よって、高感度で細胞外電位を計測できる。
 
本発明に係る細胞外電位計測補助装置の一実施例である細胞外電位計測補助装置１００を示す図である。 細胞外電位計測補助装置１００の第１階層部１０１を示す図である。 細胞外電位計測補助装置１００の第２階層部１０３を示す図である。 細胞培養装置Ｃを示す図である。 ＭＥＡプローブＰを示す図である。 ＭＥＡプローブＰ、細胞培養装置Ｃ、及び、細胞外電位計測補助装置１００を用いて細胞外電位を計測する状態を示す図である。 細胞外電位計測補助装置１００を用いて心筋細胞の細胞外電位を計測した結果を示す図である。 細胞外電位計測補助装置１００を用いて心筋細胞の細胞外電位を計測した結果を示す図である。 細胞外電位計測補助装置１００を用いて計測する心筋細胞の細胞外電位を示す図である。 本発明に係る細胞外電位計測補助装置のその他の実施例を示す図である。 本発明に係る細胞外電位計測補助装置のその他の実施例を示す図である。 本発明に係る細胞外電位計測補助装置のその他の実施例を示す図である。 本発明に係る細胞外電位計測補助装置のその他の実施例を示す図である。 従来の細胞外電位計測補助装置を示す図である。
　以下、本発明の実施例について、図面を参照しながら詳細に説明していく。
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置について、一実施例である細胞外電位計測補助装置１００を用いて説明する。細胞外電位計測補助装置１００は、計測対象である細胞の活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる補助装置である。
第１　構成
　細胞外電位計測補助装置１００の構成について、図１を用いて説明する。ここで、図１Ａは細胞外電位計測補助装置１００の平面図を、図１Ｂは細胞外電位計測補助装置１００の正面図を、それぞれ示す。図１Ａ、図１Ｂに示すように、細胞外電位計測補助装置１００は、第１階層部１０１、及び、第２階層部１０３を有している。
　第１階層部１０１と第２階層部１０３とは、階層状に配置される。第１階層部１０１は、第２階層部１０３に比して細胞に近い位置に配置される。第２階層部１０３は、第１階層部１０１の上方に、第１階層部１０１に重ねて配置される。
　第１階層部１０１の構成について、図２を用いて説明する。ここで、図２Ａは、第１階層部１０１の平面図を、図２Ｂは、図２Ａに示す第１階層部１０１のＸ１－Ｘ１断面図を、それぞれ示す。図２Ａに示すように、第１階層部１０１は、角盤形状を有している。図２Ｂに示すように、第１階層部１０１は、下面１０１ａ、上面１０１ｂ、及び、貫通孔１０１ｃを有している。下面１０１ａは、細胞に近い側に位置する面である。一方、上面１０１ｂは、下面１０１ａに対向して位置し、細胞から遠い側に位置する面である。貫通孔１０１ｃは、下面１０１ａと上面１０１ｂとを接続する孔である。第１階層部１０１は、複数の貫通孔１０１ｃを有している。
　第１階層部１０１は、絶縁性、可撓性を有する材料、例えば、ＰＤＭＳ（ＰｏｌｙＤｉＭｅｔｈｙｌＳｉｌｏｘａｎｅ）により形成されている。第１階層部１０１を、絶縁性を有する材料により形成することによって、計測する電位に影響を及ぼさないようにし、正確に細胞外電位を計測することができる。また、第１階層部１０１を、可撓性を有する材料により形成することによって、細胞外電位計測補助装置１００から細胞への重量によるダメージを減少することができる。
　第２階層部１０３の構成について、図３を用いて説明する。ここで、図３Ａは、第２階層部１０３の平面図を、図３Ｂは、図３Ａに示す第２階層部１０３のＸ２－Ｘ２断面図を、それぞれ示す。図３Ａに示すように、第２階層部１０３は、円環盤形状を有している。図３Ｂに示すように、第２階層部１０３は、下面１０３ａ、上面１０３ｂ、及び、貫通孔１０３ｃを有している。下面１０３ａは、第１階層部１０１に接する面である。一方、上面１０３ｂは、下面１０３ａに対向して位置する面である。貫通孔１０３ｃは、下面１０１ａと上面１０１ｂとを接続する孔である。第２階層部１０３は、中央に１つの貫通孔１０３ｃを有している。
　第２階層部１０３は、重量性を有する材料、例えば、金属により形成されている。第２階層部１０１を、絶縁性を有する材料により形成することによって、計測する電位に影響を及ぼさないようにし、正確に細胞外電位を計測することができる。
　また、第１階層部１０１を、可撓性を有する材料により形成することによって、細胞外電位計測補助装置１００から細胞への重量によるダメージを減少することができる。
　さらに、第１階層部１０１に貫通孔１０１ｃ、第２階層部１０３に貫通孔１０３ｃを形成することによって、第１階層部１０１と第２階層部１０３とを重ねて配置したとしても、第２階層部１０３の上面１０３ｂから第１階層部１０１の下面１０１ａに連通する貫通孔１０１ｃ及び貫通孔１０３ｃを形成することができる。これにより、細胞外電位計測補助装置１００の外部の新鮮な培地を、第１階層部１０１の下面１０１ａの下に位置する細胞に提供することができ、ひいては、細胞を適切な状態に維持することができる。
　このように、細胞外電位計測補助装置１００を複数階層部によって形成することによって、各階層部の重量、及び、各階層部の浮力といった２つの要素を調整することができる。これにより、細胞外電位を測定する細胞の種類、状態に応じた、細胞外電位を計測するにあたり、最適な圧力を決定できる。
　細胞外電位計測補助装置１００を用いることによって、細胞外電位を計測する際に、計測対象である細胞に対して、所定の圧力を加えることができるので、細胞の位置を固定できる。また、計測対象である細胞を計測電極（後述）に向かって押圧できるので、従来に比して、細胞活動によって生ずるシグナルの強度を大きくすることができる。つまり、シグナル強度を改善し、細胞外電位計測の際のＳ／Ｎ比を改善でき、結果として、高感度で細胞外電位を計測できる。これにより、細胞活動によって生ずるシグナル強度が弱い細胞であっても、細胞外電位を計測することができる。
　このように、細胞外電位計測補助装置１００を用いることによって、細胞外電位計測に際して、計測対象である細胞に対して、細胞活動に必要な、十分新鮮な培地を提供でき、また、軽微な荷重しか加える必要がないため、細胞活動を阻害することなく、細胞外電位を計測することができる。さらに、薬剤を添加した状態で細胞外電位を計測する際にも、培地とともに添加した薬剤を細胞に供給できるため、薬剤応答性を阻害することなく、細胞外電位を計測することができる。
第２　細胞外電位計測補助装置１００の使用方法
　細胞外電位計測補助装置１００の使用方法について、細胞培養装置Ｃに形成した心筋細胞の細胞活動により生ずる細胞外電位をＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ－Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　Ａｒｒａｙ）プローブＰを用いて測定する場合を例に、図４～図６を用いて説明する。
　ここで、細胞培養装置Ｃについて、図４を用いて簡単に説明する。ここで、図４Ａは、細胞培養装置Ｃの平面図を、図４Ｂは、図４Ａに示す細胞培養装置ＣのＸ３－Ｘ３断面図を、それぞれ示す。図４Ａ、図４Ｂに示すように、細胞培養装置Ｃは、細胞培養シートＣＳ及びフレームＣＦを有している。細胞培養シートＣＳは、細胞培養のための足場として機能する。細胞培養シートＣＳとしては、高分子材料で形成されたファイバーシートを用い呈する。細胞培養シートＣＳは、高分子による配向性構造、非配向性構造または配向性と非配向性との混合構造を有している。
　フレームＣＦは、細胞培養シートＣＳを平面状に保持する保持部材として機能する。フレームＣＦは、中央に細胞培養シート配置空間Ｆ１を有する角筒形状を有している。なお、フレームＣＦは、所定厚さＴＳ、所定高さＨＳを有している。フレームＣＦの一端面には、細胞培養シートＣＳが貼り付けられている。つまり、細胞培養シート配置空間ＣＡに細胞培養シートＣＳが保持される。
　細胞培養装置Ｃを所定の培地が注がれた所定のウェル内に配置し、心筋細胞を、細胞培養装置Ｃの細胞培養シート配置空間ＣＡに保持されている細胞培養シートＣＳ上に所定の細胞密度で播種し、細胞培養シートＣＳの表面に心筋細胞を培養する。なお、心筋細胞は、一般的には、細胞培養シートＣＳの両表面上に培養される。
　細胞外電位の計測には、ＭＥＡプローブＰを用いる。ＭＥＡプローブＰは、細胞活動により生ずる細胞外電位を計測するための装置である。ＭＥＡプローブＰについて、図５を用いて簡単に説明する。ここで、図５Ａは、ＭＥＡプローブＰの平面図を、図５Ｂは、図５Ａに示すＭＥＡプローブＰのＸ４－Ｘ４断面図を、それぞれ示す。図５Ａ、図５Ｂに示すように、ＭＥＡプローブＰは、基板部ＰＢ及び溶壁部ＰＷを有している。基板部ＰＢは、薄板形状を有している。溶壁部ＰＷは、基板部ＰＢ上に形成される。溶壁部ＰＷは、一端が解放された円筒形状を有し、内部に所定の培地を貯留し、計測対象の細胞を配置するための細胞配置空間ＰＳを形成する。
　また、ＭＥＡプローブＰは、計測電極Ｅ１及び参照電極Ｅ２を有している。計測電極Ｅ１は、溶壁部ＰＷのほぼ中央に、基板部ＰＢに沿って形成される。なお、計測電極Ｅ１は、４×４のマトリクス状に配置される。参照電極Ｅ２は、計測電極Ｅ１を中心に、所定数配置される。ＭＥＡプローブＰは、計測電極Ｅ１と参照電極Ｅ２との電位差に基づき、細胞活動による細胞外電位を計測する。なお、計測電極Ｅ１、及び、参照電極Ｅ２のそれぞれから、引き出し線（図中点線）が配置される。
　ＭＥＡプローブＰの細胞配置空間ＰＳに所定量の培地を注いだ後、心筋細胞を培養した細胞培養装置Ｃを細胞配置空間ＰＳに配置する。このとき、ＭＥＡプローブＰの計測電極Ｅ１上に、細胞培養シート配置空間Ｆ１が位置するように細胞培養装置Ｃを配置する。
　さらに、細胞培養装置Ｃの心筋細胞が培養された細胞培養シートＣＳ上に、細胞外電位計測補助装置１００を配置する。細胞培養装置Ｃの心筋細胞が培養された細胞培養シートＣＳ上に、細胞外電位計測補助装置１００を配置した状態の平面図を図６Ａに、図６ＡのＸ５－Ｘ５断面を図６Ｂに、それぞれ示す。図６Ａ、図６Ｂに示すように、細胞培養装置Ｃの細胞培養シート配置空間Ｆ１内に、細胞外電位計測補助装置１００を配置する。このとき、細胞外電位計測補助装置１００の第１階層部１０１が細胞培養シートＣＳ側に位置するように、つまり、第１階層部１０１の下面１０１ａが、細胞培養シート配置空間Ｆ１に位置する細胞培養シートＣＳ上に培養された心筋細胞に接するように配置する。第１階層部１０１を配置した後、第２階層部１０３を第１階層部１０１上に配置する。これにより、第１階層部１０１の貫通孔１０１ｃと第２階層部１０３の貫通孔１０３ｃとを連通させ、細胞外電位計測補助装置１００の下に位置する細胞に、常時、新鮮な培地を提供する。
　なお、第１階層部１０１及び第２階層部１０３は、共に培地内に位置するよう、必要であれば培地量を調整する。
　その後、ＭＥＡプローブＰを用いて、細胞培養装置Ｃに培養した心筋細胞の細胞活動による細胞外電位を計測する。このように、細胞外電位計測補助装置１００を配置することによって、細胞の活動を妨げることなく、細胞の運動を計測することができる。
第３　実験例
　細胞外電位計測補助装置１００における第１階層部１０１として、直径１ｍｍの円筒の貫通孔１０１ｃを、２３個、形成した、８ｍｍ×８ｍｍ、厚さ１ｍｍ、重量４０ｍｇのＰＤＭＳ製の角盤を用いた。
　また、細胞外電位計測補助装置１００における第２階層部１０３として、外直径８ｍｍ、内直径５ｍｍの金属製の円環盤で、重量１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇの７種類を用いた。
　所定の心筋細胞を培養した細胞培養装置Ｃを、所定の培地を満たしたＭＥＡプローブＰの細胞配置空間ＰＳに配置した。そして、細胞外電位計測補助装置１００を用いないとき、第１階層部１０１のみを有する細胞外電位計測補助装置（総重量４０ｍｇ）を用いたとき、重量１００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量１４０ｍｇ）を用いたとき、重量２００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量２４０ｍｇ）を用いたとき、重量３００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量３４０ｍｇ）を用いたとき、重量４００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量４４０ｍｇ）を用いたとき、重量５００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量５４０ｍｇ）を用いたとき、重量６００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量６４０ｍｇ）を用いたとき、重量７００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量７４０ｍｇ）を用いたとき、それぞれで細胞外電位を計測した。その結果を図７に示す。
　図７の結果から、重量５００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００を用いたとき、つまり、細胞外電位計測補助装置１００の総重量が５４０ｍｇ以上からは、Ｓ／Ｎ比の改善の度合いが低下し、平衡状態となることが分かる。
　また、細胞外電位計測補助装置１００を用いないときに細胞外電位を計測した結果を図８Ａに示す。また、第１階層部１０１のみを有する細胞外電位計測補助装置（総重量４０ｍｇ）を用いて細胞外電位を計測した結果を図８Ｂに示す。さらに、重量１００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量１４０ｍｇ）を用いて細胞外電位を計測した結果を図８Ｃに示す。さらに、重量７００ｍｇの第２階層部１０３を有する細胞外電位計測補助装置１００（総重量７４０ｍｇ）を用いて細胞外電位を計測した結果を図８Ｄに示す。なお、各計測とも、計測時間は５分間とした。
　図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、また、図８Ｄの実験結果から、各計測におけるＳ／Ｎ比は、順に、２．５、２．０、７１、４２０となった。このことから、第２階層部１０３を用いて、心筋細胞にＭＥＡプローブＰの計測電極Ｅ１方向へ所定の圧力を加え、計測対象である心筋細胞の位置を固定し、また、計測対象である心筋細胞を計測電極Ｅ１に向かって押圧することによって、従来に比して、細胞活動によって生ずるシグナルの強度を大きくし、シグナル強度を改善し、結果として、細胞外電位計測の際のＳ／Ｎ比を改善できていることが分かる。つまり、細胞外電位計測補助装置１００を用いることによって、細胞活動によって生ずるシグナル強度が弱い細胞であっても、細胞外電位を計測することができることが分かる。また、第２階層部１０３の重量を増加させることによって、飛躍的にＳ／Ｎ比を改善できることが分かる。
　なお、心筋細胞において計測する細胞外電位は、図９に示すように、心筋細胞の１回の拍動によって得られる電位変化である１シグナルの第１ピークにおいて得られる電位差Ｖ１を用いている。
［その他の実施形態］
　（１）第１階層部１０１の貫通孔１０１ａ：前述の実施例１においては、第１階層部１０１に、直径１ｍｍの円筒の貫通孔１０１ｃを、２３個、形成したが、第１階層部１０１の下面１０１ａと上面１０１ｂとを接続するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、図１０（図１０おいて、Ａは平面図、Ｂは図１０ＡのＸ６－Ｘ６断面図を示す）に示す第１階層部２０１ように、８ｍｍ×８ｍｍの角盤に、直径１．５ｍｍの円筒の貫通孔２０１ｃを、１８個、形成するようにしてもよい。
　ここで、第１階層部２０１及び第２階層部１０３を用いて形成した細胞外電位計測補助装置２００を図１１に示す。図１おいて、Ａは平面図、Ｂは図１１ＡのＸ７－Ｘ７断面図を示す。
　また、図１２Ａ～Ｅ（図１２において、Ａは平面図、Ｂは正面図、Ｃは右側面図、Ｄは図１２ＡのＸ８－Ｘ８断面図、Ｅは図１２ＡのＸ９－Ｘ９断面図を示す）に示す第１階層部３０１のように、側面３０１ｄを貫通し、下面３０１ａと側面３０１ｄとを接続する貫通溝３０１ｃ１、３０１ｃ２を形成するようにしてもよい。第１階層部３０１は、上面３０１ｂに連通する貫通溝３０１ｃ１、及び、下面３０１ａに連通する貫通溝３０１ｃ２を有している。貫通溝３０１ｃ１、及び、貫通溝３０１ｃ２は、上下に階層的に、また、互いが直交するように形成されている。
　これにより、貫通溝３０１ｃ１と貫通溝３０１ｃ２とを連通させることができる。また、第１階層部３０１を用いることによって、第１階層部３０１の上面３０１ｂから下面３０１ａに培地を提供できると共に、側面３０１ｄから下面３０１ａに培地を提供することができる。なお、第１階層部３０１は、ＰＤＭＳにより形成することができる。
　（２）第１階層部１０１の形状：前述の実施例１においては、第１階層部１０１は、角盤形状としたが、その他の形状、例えば、円盤形状（図１１参照）、楕円板形状、多角形盤形状であってもよい。
　（３）第１階層部１０１の材料：前述の実施例１においては、第１階層部１０１は、ＰＤＭＳにより形成されているとしたが、可撓性、絶縁性を有するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、ＰＤＭＳ以外のシリコン、ポリカーボネイト、その他のプラスチック材料であってもよい。
　また、計測対象である細胞の細胞活動により得られる電位、細胞の大きさ、厚さ、種類、重量に対する強さ等の条件から、可撓性が低く、絶縁性を有する材料、例えば、ポリカーボネイトにより、第１階層部を形成するようにしてもよい。
　（４）第１階層部１０１の位置：前述の実施例１においては、第１階層部１０１の下面１０１ａが検知対象である細胞に接するとしたが、細胞側に位置するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、細胞上に何らかのシート等の緩衝物を配置し、間接的に細胞を押圧するものであってもよい。
　（５）第２階層部１０３の貫通孔１０３ｃ：前述の実施例１においては、第２階層部１０３は、中央に１つの貫通孔１０３ｃを有していたが、図１３に示す第２階層部３０３のように、複数の貫通孔３０３ｃを形成するようにしてもよい。また、第２階層部３０３に形成する複数の貫通孔３０３ｃは、同一形状でなく、異なる形状であってもよい。
　なお、図１２には、第２階層部３０３及び第１階層部３０１を用いて形成した細胞外電位計測補助装置３００を示している。図１３において、Ａは平面図、Ｂは正面図、Ｃは右側面図、Ｄは図１２ＡのＸ１０－Ｘ１０断面図、Ｅは図１３ＡのＸ１１－Ｘ１１断面図を示す。
　また、図１１に示す第１階層部３０１のように側面３０１ｄから培地を細胞に提供できるものであれば、第２階層部に貫通孔を形成しなくともよい。
　（６）第２階層部１０３の形状：前述の実施例１においては、第２階層部１０３は、円環盤形状としたが、その他の形状、例えば、円盤形状、楕円板形状、多角形盤形状であってもよい。
　（７）計測対象の細胞：前述の実施例１においては、検知対象である細胞として心筋細胞を用いたが、細胞外電位の計測に適するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、神経細胞であってもよい。
　また、計測対象である細胞は、平面状シートに培養されたシングル細胞であってもよい。さらに、細胞培養シートＣＳに培養した細胞でなくとも、一般的な細胞シートに培養した細胞でもよい。さらに、細胞培養シートＣＳに平面状に培養した細胞でなくとも、３次元状に培養した細胞であってもよい。さらに、培養した細胞でなくとも、生物、例えば人から採取した組織切片であってもよい。
　（８）細胞培養装置Ｃの使用：前述の実施例１においては、計測対象である細胞を、細胞培養装置Ｃを用いて培養するとしたが、計測対象である細胞を培養できるものであれば、例示のものに限定されない。例えば、細胞培養用のディッシュ等、所定の容器に、直接細胞を培養するようにしてもよい。
　（９）ＭＥＡプローブＰの使用：前述の実施例１においては、ＭＥＡプローブＰを用いて細胞外電位を計測したが、細胞外電位を計測できる方法であれば、例示のものに限定されない。
　（１０）細胞外電位：前述の実施例１においては、細胞外電位として、心筋細胞の１回の拍動によって得られる１シグナルの第１ピークにおいて得られる電位差Ｖ１を用いたが、計測できる細胞外電位であれば、例示のものに限定されない。
 
　本発明に係る細胞外電位計測補助装置は、例えば、培養した心筋細胞の細胞活動に基づく細胞外電位の計測に用いることができる。
 
１００　　　細胞外電位計測補助装置
　１０１　　　第１階層部
　　１０１ａ　　　下面
　　１０１ｂ　　　上面
　　１０１ｃ　　　貫通孔
　１０３　　　第２階層部
　　１０３ａ　　　下面
　　１０３ｂ　　　上面
　　１０３ｃ　　　貫通孔
Ｃ　　　細胞培養装置
Ｐ　　　ＭＥＡプローブ
２００　　　細胞外電位計測補助装置
　２０１　　　第１階層部
　　２０３ａ　　　下面
　　３０３ｂ　　　上面
　　４０３ｃ　　　貫通孔
３００　　　細胞外電位計測補助装置
　３０１　　　第１階層部
　　３０１ａ　　　下面
　　３０１ｂ　　　上面
　　３０１ｃ　　　貫通孔
　　３０１ｄ　　　側面
　３０３　　　第２階層部
　　３０３ａ　　　下面
　　３０３ｂ　　　上面
　　３０３ｃ　　　貫通孔

 

Claims (7)

  1. 　培養された細胞の細胞活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる細胞外電位計測補助装置であって、
    　前記細胞側に位置する第１階層部、
    　前記第１階層部の上方に重ねて位置する第２階層部、
    　を有する細胞外電位計測補助装置。
  2. 　請求項１に係る細胞外電位計測補助装置において、
    　前記第１階層部は、さらに、
    　前記第１階層部の前記下面と前記第１階層部の前記上面とを接続する、及び／又は、前記第１階層部の前記下面と前記第１階層部の前記側面とを接続する貫通孔を有すること、
    　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
  3. 　請求項１または請求項２に係る細胞外電位計測補助装置において、
    　前記第２階層部は、さらに、
    　前記第２階層部の前記下面と前記第２階層部の前記上面とを接続する、及び／又は、前記第２階層部の前記下面と前記第２階層部の前記側面とを接続する貫通孔を有すること、
    　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
  4. 　請求項１～請求項３に係るいずれかの細胞外電位計測補助装置において、
    　前記第１階層部は、
    　絶縁性を有すること、
    　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
  5. 　請求項４に係る細胞外電位計測補助装置において、
    　前記第１階層部は、
    　可撓性を有すること、
    　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
  6. 　請求項１～請求項５に係るいずれかの細胞外電位計測補助装置において、
    　前記第２階層部は、
    　金属により形成されていること、
    　を特徴とする細胞外電位計測補助装置。
  7. 　培養された細胞の細胞活動に基づく細胞外電位を計測する際に用いる細胞外電位計測補助装置であって、
    　前記細胞側に位置する第１階層部、
    　前記第１階層部の上方に重ねて位置する第２階層部、
    　を有する細胞外電位計測補助装置を用いて細胞外電位を計測する細胞外電位計測方法。
     
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