WO2021045095A1 - 細胞の選別方法 - Google Patents

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WO2021045095A1
WO2021045095A1 PCT/JP2020/033246 JP2020033246W WO2021045095A1 WO 2021045095 A1 WO2021045095 A1 WO 2021045095A1 JP 2020033246 W JP2020033246 W JP 2020033246W WO 2021045095 A1 WO2021045095 A1 WO 2021045095A1
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drug
extracellular potential
responsive
responsiveness
nerve cells
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一博 饗庭
遥 佐藤
正樹 須藤
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株式会社幹細胞＆デバイス研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting nerve cells having excellent drug responsiveness based on an extracellular potential.
  • neurotoxicity is one of the main causes of discontinuation of drug development along with cardiotoxicity or hepatotoxicity. Therefore, accurate neurotoxicity evaluation is required from the initial stage of drug development, and in vivo evaluation methods such as behavior or symptom observation by animal experiments and brain histopathological evaluation are the mainstream for neurotoxicity evaluation in nonclinical studies. ..
  • the in vivo evaluation method is complicated, and from the viewpoint of animal protection, in recent years, the construction of an in vitro evaluation method using cultured neurons has been promoted for a simpler neurotoxicity evaluation.
  • specimens When cultured neurons are used for in vitro evaluation of drugs, cells with excellent drug responsiveness or cell populations per well of cell culture dishes or multi-well plates (hereinafter referred to as specimens) and specimens with poor drug responsiveness are included. Exists. When an in vitro evaluation of a drug is performed with different responsiveness to the drug between the specimens, the obtained evaluation results vary. As a result, the reproducibility and reliability of the evaluation results may be adversely affected. Moreover, it is often difficult to determine whether the cause of the variability is the quality of the cells used or the process of constructing an in vitro evaluation system such as cell seeding conditions, which is a problem in in vitro evaluation using nerve cells. It has become.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 are examples of human iPS cell-derived neurons and the like to be ready for drug evaluation.
  • the cell mass is based on spectral data of transmitted light or diffused reflected light from the cell mass.
  • Patent Document 1 A method for evaluating the quality of cells has been reported (Patent Document 1), and it is described that the proliferative ability, aggregation ability, differentiation ability and the like of cells can be evaluated by this method.
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 3
  • no method has been reported for non-invasively predicting the drug responsiveness of nerve cells before the test without affecting the cells.
  • Odawara A Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Communi. 2014; 443: 1176-1181. Alhebshi AH, et al. Thymoquinone protects cultured hippocampal and human induced pluripotent stem cells-derived neurons against ⁇ -synuclein-induced synapse damage. Neurosci Lett. 2014; 570: 126-131. Yamazaki K, et al. A novel method of selecting human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte clusters for assessment QT interval. Toxicol In Vitro. 2012; 26: 335-342.
  • An object of the present invention is to predict the drug responsiveness of nerve cells before conducting an in vitro test using nerve cells, and to select nerve cells having the same or similar drug responsiveness based on the prediction result. To provide.
  • a method of selecting nerve cells based on the extracellular potential of the nerve cells (1) Step of acquiring extracellular potential of nerve cell; (2) A step of classifying the extracellular potential obtained in the step (1); (3) A step of predicting the drug responsiveness of nerve cells based on the classification result obtained in step (2); and (4) A step of selecting nerve cells based on the prediction result obtained in the step (3); How to include.
  • the extracellular potential is acquired by a single channel and / or a multi-channel on the multi-point electrode array.
  • the extracellular potential is measured non-invasively with respect to nerve cells before conducting an in vitro test for evaluating drug responsiveness, and the nerve is based on the classification result of the measured extracellular potential.
  • the drug responsiveness of cells can be predicted.
  • nerve cells used for in vitro evaluation of drugs can be selected and tests can be performed using cells having the same or similar drug responsiveness, so that variation in evaluation results can be reduced.
  • highly reproducible and reliable evaluation results can be obtained in the evaluation of drug responsiveness of nerve cells.
  • FIG. 1C All extracellular potential parameters of neurons of unknown drug responsiveness, ie, drug-free (shown in light gray in the upper two rows of the figure), were classified by hierarchical clustering (McQuitty method) and added to FIG. 1C. It is a figure which shows the result.
  • (A) A diagram showing the results of classifying arbitrary extracellular potential parameters (1, 54 to 72 in FIG. 1A) before drug addition for nerve cells whose drug responsiveness was examined by a hierarchical clustering method (Ward method). is there. The numbers in the horizontal direction indicate the standard number of the nerve cell.
  • Low responsive specimens (Class: 1) for the number of synchronous bursts and spikes after drug addition are indicated by the "circle” symbol, and high responsive specimens (Class: 2) are indicated by the "square” symbol.
  • the score of the first principal component can distinguish between a low-responsive sample and a high-responsive sample to a drug.
  • Drug-free specimens are indicated by the "triangle” symbol (Class: 3), and can be classified into low-responsive and high-responsive specimens before drug addition according to the score of the first principal component.
  • the score of the first principal component can distinguish between a low-responsive sample and a high-responsive sample to a drug.
  • the drug responsiveness is unknown, that is, the IBI value and ASDR value (1, 54 to 56, 61 to 64 in FIG. 1A) are the main components from the measured values of the multi-channel extracellular potential parameters of the drug-free nerve cells. It is a figure which shows the result classified by analysis (PCA) and added to FIG. 5A (1). Drug-free specimens are indicated by the "triangle" symbol (Class: 3) and can be classified into low-responsive and high-responsive specimens before drug addition according to the score of the first principal component. Is shown.
  • PCA principal component analysis
  • the scores of the first and second principal components can distinguish between low and high response samples to drugs.
  • PCA Principal component analysis
  • Drug-free specimens are indicated by the "triangle" symbol (Class: 3), and the scores of the first and second principal components indicate that the specimens are low-responsive and high-responsive to the drug prior to drug addition. Indicates that it can be classified.
  • SD Standard deviation
  • PCA principal component analysis
  • the horizontal axis shows the first principal component (PC1) and the vertical axis shows the second principal component (PC2), and each analysis data is plotted based on the score of each principal component.
  • Low responsive specimens (Class: 1) for the number of synchronous bursts and spikes after drug addition are indicated by the "circle” symbol, and high responsive specimens (Class: 2) are indicated by the "square” symbol.
  • the scores of the first and second principal components can distinguish between low and high response samples to drugs.
  • SD standard deviation
  • PCA principal component analysis
  • CV coefficient of variation
  • PCA principal component analysis
  • the horizontal axis shows the first principal component (PC1) and the vertical axis shows the second principal component (PC2), and each analysis data is plotted based on the score of each principal component.
  • Low responsive specimens (Class: 1) for the number of synchronous bursts and spikes after drug addition are indicated by the "circle” symbol, and high responsive specimens (Class: 2) are indicated by the "square” symbol.
  • the first principal component can distinguish between low and high response specimens to drugs.
  • CV coefficient of variation
  • FIG. 5D Is classified by principal component analysis (PCA) and added to FIG. 5D (1).
  • Drug-free specimens are indicated by the "triangle" symbol (Class: 3), indicating that the first principal component can be classified into low-responsive and high-responsive specimens before drug addition.
  • .. (1) A diagram showing the results of classifying all extracellular potential parameters (54 to 72 in FIG. 1A) before drug addition by a hierarchical clustering method for nerve cells seeded on a MEA probe whose drug responsiveness was examined. Is. The name of the nerve cell is shown in the lateral direction. On the right side of the figure, the highly responsive samples for the number of synchronous bursts and spikes are shown in gray and the low responsive samples are shown in black.
  • Low responsive samples (Class: 1) for the number of synchronous bursts and spikes are indicated by the "circle” symbol, and high responsive samples (Class: 2) are indicated by the "square” symbol.
  • the score of the first principal component can distinguish between low-responsive and high-responsive samples.
  • All multi-channel extracellular potential parameter measurements (54-72 in FIG. 1A) of neurons of unknown drug responsiveness, that is, drug-free, were classified by principal component analysis (PCA), and FIG. 6A. It is a figure which shows the result added to (1).
  • Drug-free specimens are indicated by the "triangle" symbol (Class: 3), indicating that the score of the first principal component can be classified into low-responsive and high-responsive specimens prior to drug addition.
  • a nerve cell means a nerve unit composed of a cell body, dendrites and axons, and is also called a neuron. Nerve cells can be classified according to the difference in neurotransmitters produced by nerve cells. Neurotransmitters include monoamines such as dopamine, noradrenaline, adrenaline and serotonin, non-peptidic neurotransmitters such as acetylcholine, ⁇ -aminobutyric acid and glutamate, and adrenocorticotropic hormone (ACTH), ⁇ -endorphin and ⁇ -endorphin. , Gamma-endorphin, peptidic neurotransmitters such as vasopressin and the like.
  • monoamines such as dopamine, noradrenaline, adrenaline and serotonin
  • non-peptidic neurotransmitters such as acetylcholine, ⁇ -aminobutyric acid and glutamate
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • nerve cells that transmit dopamine, acetylcholine, and glutamic acid are referred to as dopaminergic neurons, cholinergic neurons, and glutamatergic neurons, respectively.
  • the nerve cell used in the present invention may be any neuron.
  • Examples of nerve cells used in the present invention include primary cultured cells.
  • Primary cultured cells retain many of the cell functions that they originally have in vivo, and are therefore important as cells for evaluating the effects of drugs and the like in vivo.
  • nerve cells of mammals such as rodents of mice or rats, or nerve cells of the central nervous system and peripheral nervous system of primates such as monkeys or humans can be used.
  • the animal dissection method, tissue collection method, nerve separation / isolation method, nerve cell culture medium, culture conditions, etc. are determined according to the type of cells to be cultured and the purpose of the cells. , Can be selected from known methods.
  • primary cultured divine cell products for example, rat cerebral nerve cells manufactured by Thermofisher (USA) and human brain nerve cells manufactured by ScienCell Research Laboratories (USA) can be used.
  • nerve cells used in the present invention include nerve cells derived from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Various types of nerve cells can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells using known methods for inducing nerve differentiation.
  • nerve cells can be obtained by a differentiation induction method using a low molecular weight compound described in the literature (Honda M, et al. Biochem Biophys Res Communi. 2016; 469: 587-592).
  • pluripotent stem cell-derived neural cell products such as iCell neurons from Cellular Dynamics International (USA), various neural stem cells from Axol Bioscience (UK), and various neural cell precursors from BrainXell (USA). Cells and XCL-1 neurons from XCell Science (USA) can also be used.
  • SynFire neurons from NeuCyte (USA) and various neurons from Elixirgen Scientific (USA), which are products differentiated into neurons by introducing a predetermined gene into iPS cells can also be used.
  • These commercially available nerve cells can be cultured using the attached culture medium.
  • Nerve cells can be cultured with glial cells derived from mammalian brain or glial cells differentiated from mammalian iPS cells.
  • glial cells include astrocytes, oligodendrocytes, microglia and the like.
  • the culture solution after culturing astrocytes (astrocyte culture supernatant) can be added to the culture solution for nerve cells at a final concentration of 5 to 30% and cultured.
  • nerve cells are a culture vessel such as a cell culture dish or a well of a multi-well plate, or a polymer such as polylactic acid polyglycolic acid (PLGA), polystyrene (PS), polysulfone (PSU) and polytetrafluoroethylene (PTFE).
  • PLGA polylactic acid polyglycolic acid
  • PS polystyrene
  • PSU polysulfone
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • selection of nerve cells based on the extracellular potential of nerve cells is performed by seeding a nerve seeded in a culture vessel such as a cell culture dish or a well of a multi-well plate, a multipoint electrode array probe or a cell scaffold such as the fiber sheet. For cells or nerve cell populations, this is done in units of scaffolds that can be separated.
  • the extracellular potential of a nerve cell is obtained by measuring the potential applied between the microelectrode and the reference electrode that receive the signal of the cell to be measured.
  • the extracellular potential measuring device or apparatus is not particularly limited, but it is preferable to acquire the extracellular potential on a multi-electrodes-array (hereinafter abbreviated as MEA).
  • MEA is, for example, a flat electrode in which 64 microelectrodes are mounted on a flat surface of a glass substrate in 8 rows ⁇ 8 rows, and nerve cells are cultured on the flat electrode, or on a culture vessel or fiber sheet in advance.
  • the nerve cells cultured in 1 can be placed on a plane electrode and the extracellular potential of the cells can be measured.
  • the extracellular potential of a nerve cell may be acquired from one electrode (single channel) of MEA, or may be acquired from a plurality of electrodes (multichannel). Furthermore, extracellular potentials may be obtained from both single-channel and multi-channel.
  • the extracellular potential of a nerve cell obtained from a single channel and / or a multi-channel on the MEA is measured as a change in membrane potential due to the inflow and outflow of ions in the cell membrane, such as the synaptic potential and action potential of individual neurons. Will be done.
  • changes in membrane potential, which is neural activity are measured as spikes and synchronous bursts and recorded as firing patterns.
  • the parameters of the obtained ignition pattern can be calculated by various analysis software.
  • the extracellular potential in the present invention can be displayed as the extracellular potential parameter calculated in this way.
  • the parameters are the number of spikes obtained as measurements, the number of bursts, the number of spikes in a burst, the burst interval, the burst duration, the synchronization and periodicity of synchronous bursts, the number of synchronous bursts, the number of spikes in a synchronous burst, and the synchronous burst interval.
  • the peak of the spike potential in the synchronous burst, the duration of the synchronous burst, and the statistic values obtained for each of these measurements mean, median, and standard deviation (SD :). standard deviation (CV), coefficient of variation (CV), variance, maximum, minimum, kurtosis, skewness, standard error (SE) ) And the most frequent value (mode), but are not limited to these.
  • the analysis software that calculates the parameters from the ignition pattern is not particularly limited, and for example, MED64 Burstscope (registered trademark, Alphamed Scientific Co., Ltd., Ibaraki City, Osaka Prefecture) can be used.
  • MED64 Burstscope registered trademark, Alphamed Scientific Co., Ltd., Ibaraki City, Osaka Prefecture
  • the extracellular potential parameters output by the MED64 Burstscope are also classified into the parameters listed in any of Tables 1 and 2, but the MEA apparatus and parameters used are not limited thereto. (Table 1) (Table 2)
  • the extracellular potential of neurons obtained from single channel and / or multichannel on MEA before drug addition is classified to predict the drug responsiveness of neurons.
  • the classification of extracellular potential means that the extracellular potential parameters are combined and analyzed in a hierarchical clustering method or principal component analysis (PCA).
  • the analysis method is preferably, but is not limited to, a hierarchical clustering method and a principal component analysis.
  • Hierarchical clustering is a method of grouping in order from the most similar combination, that is, clustering, and principal component analysis shrinks information into a low-dimensional space without losing the information of multidimensional data as much as possible. It is a method of about.
  • a single connection method also called the shortest distance method
  • a complete connection method also called the longest distance method
  • a group averaging method a McQuitty method
  • a Ward method can be used.
  • singular value decomposition singular value decomposition with imputation
  • Nipals Non-linear Iterative Partial Least Squares
  • Probabilistic PCA Probabilistic PCA
  • the software that executes the hierarchical clustering method and the principal component analysis is not particularly limited as long as it can execute these analysis methods, but for example, ClustVis (https://biit.cs.ut.ee/clustvis/) is used. be able to.
  • the drug responsiveness of nerve cells is predicted based on the classification result based on the extracellular potential before drug addition.
  • the drug responsiveness of a nerve cell is the result of the inflow and outflow of ions such as Na ion, K ion, and chloride ion through the ion channel of the cell membrane, which is induced by the contact between the nerve cell and the drug.
  • the change in membrane potential is measured as an extracellular potential.
  • Drugs that induce changes in the membrane potential of nerve cells include K-channel blocking agents such as 4-aminopyridine and tetraethylammonium, K-channel opening agents such as Retigabine, and lidocaine. ), Na channel blocking agents such as procaine and tetrodotoxin, Na channel opening agents such as isopropyl unoprostone, and activating ion channels by binding to ion channel type receptors in nerve cells. Examples thereof include neurotransmitters, but the present invention is not limited to those that induce changes in the membrane potential of nerve cells.
  • Neurotransmitters include amino acids such as glutamic acid, ⁇ -aminobutyric acid, aspartic acid, and glycine, monoamines such as serotonin, noradrenaline, adrenaline, dopamine, and histamine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), ⁇ -endorphin, and ⁇ -. Examples thereof include, but are not limited to, endorphin, ⁇ -endorphin, substance P, vasopressin, peptides such as somatostatin, and acetylcholine.
  • combinations of drugs such as pilocarpine that bind to G protein-coupled (metabolic) receptors and drugs that are known to induce convulsions when used in combination (eg, a combination of enoxacin and fenbufen). Can also be mentioned.
  • Synchronous bursts are also called network bursts. Synchronous burst is a phenomenon in which burst-like action potentials are synchronized over the entire neural network, and is divided into an active phase in which the whole is ignited and a stationary phase in which almost no ignition is seen, and these two phases occur alternately. Is a feature. Synchronous bursts are detected on multiple electrodes at approximately the same time on a multi-point electrode array.
  • the drug responsiveness of nerve cells is observed as an increase or decrease in the number of synchronous bursts or spikes, but is not limited thereto.
  • Contact between a nerve cell and a drug is achieved by coexisting in a culture solution of a nerve cell (also referred to as a nerve cell device) cultured on a nerve cell or a fiber sheet in a state of being dissolved in the culture solution.
  • a nerve cell also referred to as a nerve cell device
  • the drug is dissolved in an organic solvent, physiological saline, a buffer solution, a culture solution, or the like, and added to the culture solution of nerve cells.
  • the drug responsiveness of nerve cells is predicted based on the classification result based on the extracellular potential before drug addition.
  • the extracellular potential of the nerve cell obtained without adding a drug to the nerve cell, that is, the extracellular potential based on spontaneous firing It is preferable to use.
  • the drug responsiveness of a nerve cell which correlates with the classification result of the extracellular potential of the nerve cell, can be defined according to the purpose of use of the nerve cell.
  • selection of nerve cells based on the extracellular potential of nerve cells can be performed as follows. First, the correlation between the classification of the extracellular potential of a nerve cell based on spontaneous firing before drug addition and the drug responsiveness of the nerve cell is registered as a cell responsiveness list in a database or an extracellular potential classification library. Next, the extracellular potential of the nerve cell to be selected before drug addition is measured, and various classification results are classified together with the cell responsiveness list of the above database or the extracellular potential classification library, and the nerve to be selected is selected. Determine if the cells have the desired drug responsiveness.
  • non-defective product having excellent drug responsiveness in the database it can be classified as a non-defective product, or if it is classified into the same category as a defective product having poor drug responsiveness in the database, it can be classified as a defective product.
  • Measurement of extracellular potential based on spontaneous firing before drug addition to nerve cells to be selected does not destroy cells and is non-invasive to cells. Moreover, since the treatment with a drug or the like is not performed, the influence of the drug on the function of nerve cells does not remain. Therefore, the cells to be selected after the measurement of the extracellular potential can be used as they are for in vitro evaluation.
  • Rat cerebral cortex neurons (ThermoFisher, product number A10840), which are primary cultured neurons, were seeded at a cell density of 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , and B-27 Plus Neuronal Culture System (ThermoFisher, catalog number A3653401) was seeded. ) was cultured in an incubator at 5% CO 2 , 37 ° C. for 3 weeks, and used for the subsequent analysis.
  • a nerve cell population obtained by culturing rat cerebral cortex nerve cells (ThermoFisher, product number A10840), which is a primary cultured nerve cell, using a fiber sheet made of polystyrene (PS) as a scaffold as a nerve cell device. Used for.
  • the fiber sheet was prepared as follows. PS (Fluka) dissolved in DMF (N, N-dimethylformamide, molecular biology grade, Wako Pure Chemicals) to 30% by weight at room temperature was added to a syringe (Norm-Ject Syringes 5 mL volume, Osaka Chemical).
  • a fiber sheet was prepared under the conditions.
  • the produced fiber sheet has a structure in which the fibers constituting the fiber sheet are arranged in one direction and have orientation.
  • the cells were seeded on an oriented PS fiber sheet, which is a cell scaffold, at a cell density of 9.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , and 5 using the B-27 Plus Neuronal Culture System (ThermoFisher, Catalog No. A3653401).
  • the cells were cultured in an incubator at% CO 2 , 37 ° C. for 3 weeks to obtain a nerve cell device, which is a cell sheet. (Measurement of extracellular potential)
  • the above nerve cell device is placed on a MEA probe (MED64-Quad II, Alphamed Scientific Co., Ltd., Ibaraki City, Osaka Prefecture) having 16 microelectrodes, and the cells are brought into contact with the electrodes of the MEA probe to cause nerves. Activity was measured as extracellular potential for 5 minutes.
  • MEA probe MED64-Quad II, Alphamed Scientific Co., Ltd., Ibaraki City, Osaka Prefecture
  • Example 1 [Drug responsiveness of nerve cells and hierarchical clustering method / Classification of extracellular potential by McQuitty method]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each neuronal specimen whose responsiveness to 4-AP was clarified (sample numbers 1 to 56, see FIG. 1B), all extracellular samples of each specimen before 4-AP addition were used. The potential parameters (see FIG.
  • FIG. 1C The classification result by the McQuitty method is shown in FIG. 1C.
  • the high-responsive sample with the increase in the number of synchronous bursts (SynBst) after 4-AP addition was shown in gray, and the low-responsive sample was shown in black.
  • a sample in which the increase in the number of spikes (Spike) after addition of 4-AP was 4 times or more was shown in gray, and a sample in which the increase was less than 4 times was shown in black.
  • Spike spikes
  • the nerve cells of specimen numbers 57 to 72 are shown in light gray in the first and second rows from the top of FIG. 1D.
  • 4 samples belong to the low response sample group in the left column and 6 samples belong to the low response sample group in the center column for the samples whose responsiveness to 4-AP is unknown. , These neurons are expected to be poorly responsive to 4-AP.
  • 6 specimens were found to belong to the highly responsive specimen group in the right column, and these neurons are predicted to be highly responsive to 4-AP.
  • the extracellular potential parameters were output using MED64 Burstscope (AlphaMed Scientific Co., Ltd., Ibaraki City, Osaka Prefecture).
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and classification of extracellular potential by hierarchical clustering method / Ward method (Multichannel parameter set: 54 to 72 in FIG. 1 (A))]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each neuron specimen (specimen numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, any extracellular of each specimen before addition of 4-AP.
  • the potential parameters (1, 54-72 in FIG. 1A) were classified by the hierarchical clustering method.
  • the classification result by the Ward method is shown in FIG. 2 (A) (the heat map for each parameter in each sample shown in Example 2 is omitted).
  • FIG. 2 (A) the high-responsive sample at the number of synchronous bursts (upper row, SynBst) is shown in gray, and the low-responsive sample is shown in black.
  • FIG. 2 (A) the high-responsive sample at the number of synchronous bursts (upper row, SynBst) is shown in gray, and the low-responsive sample is shown in black.
  • a sample in which the increase in the number of spikes (Spike) after addition of 4-AP was 4 times or more was shown in gray, and a sample in which the increase was less than 4 times was shown in black.
  • Spike spikes
  • FIG. 2 (A) the numbers in the horizontal direction indicate the standard numbers of nerve cells.
  • FIG. 2 (A) is divided into three cluster groups, the left column and the center column have a low response sample group (35 out of 37 samples), and the right column has a high response sample group (17 out of 19 samples).
  • FIG. 2 (A) all multichannel parameter measurements are shown in FIG. 2 (A) for specimens of unknown responsiveness to 4-AP (sample numbers 57-72, 16-sample neuronal device, see FIG. 1B).
  • the samples were classified by the hierarchical clustering method, and the results are shown in FIG. 2 (B).
  • the nerve cells of specimen numbers 57 to 72 are shown in light gray in FIG. 2 (B).
  • the samples whose responsiveness to 4-AP is unknown are 6 samples in the low response sample group in the left column and 5 samples in the low response sample group in the center column. It turns out that these neurons are expected to be less responsive to 4-AP. On the other hand, 5 specimens were found to belong to the highly responsive specimen group in the right column, and these neurons are predicted to be highly responsive to 4-AP.
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and hierarchical clustering method / classification of extracellular potential by McQuitty method (parameter set: Multichannel-IBI)]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each neuron specimen (specimen numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, any extracellular of each specimen before addition of 4-AP.
  • the potential parameters (1, 54-56, 61-64 in FIG. 1A) were classified by the hierarchical clustering method.
  • the classification result by the McQuitty method is shown in FIG. 3 (A) (the heat map for each parameter in each sample shown in Example 2 is omitted).
  • FIG. 3 (A) the high-responsive sample at the number of synchronous bursts (upper row, SynBst) is shown in gray, and the low-responsive sample is shown in black.
  • a sample in which the increase in the number of spikes (Spike) after addition of 4-AP was 4 times or more was shown in gray, and a sample in which the increase was less than 4 times was shown in black.
  • Spike spikes
  • the numbers in the horizontal direction indicate the standard numbers of nerve cells.
  • FIG. 3 (A) is divided into three cluster groups, the left column and the center column have a low response sample group (36 out of 37 samples), and the right column has a high response sample group (18 out of 19 samples).
  • the characteristic classification result that gathers is shown.
  • samples of unknown responsiveness to 4-AP sample numbers 57-72, 16-sample neuronal device, see FIG. 1B
  • selected extracellular potential parameters (1, 54-56, FIG. 1A,).
  • the measured values of 61 to 64) were classified by the hierarchical clustering method together with the sample of FIG. 3 (A), and the results are shown in FIG. 3 (B).
  • the nerve cells of specimen numbers 57 to 72 are shown in light gray in FIG. 3 (B).
  • the samples whose responsiveness to 4-AP is unknown are that 4 samples belong to the low response sample group in the left column and 6 samples belong to the low response sample group in the center column. It turns out that these neurons are expected to be less responsive to 4-AP.
  • 6 specimens were found to belong to the highly responsive specimen group in the right column, and these neurons are predicted to be highly responsive to 4-AP.
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and PCA: Classification of extracellular potentials by parameter set (Multichannel-all + ASDR parameters)]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each nerve cell sample (sample numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, each sample extracellular potential parameter (sample number 1 to 56, see FIG.
  • FIG. 4A Classes 1, 2 and 3 in FIGS. 4A and 4 represent "highly responsive specimens", “lowly responsive specimens” and “samples of unknown responsiveness", respectively. According to FIG. 4A, the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the score of PC1.
  • FIG. 4A the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the score of PC1.
  • 4B shows the results of PCA analysis of high-responsive and low-responsive specimens together with specimens of unknown responsiveness (sample numbers 57 to 72, see FIG. 1B).
  • Specimens of unknown responsiveness (Class: 3, indicated by the "triangle” symbol) are placed within the PC1 score distribution of high or low responsive samples, and depending on their respective PC1 scores, they are either highly responsive to the drug or Low responsiveness can be predicted.
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and PCA: Classification of extracellular potentials by parameter set (Multichannel-IBI + ASDR parameters)]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each nerve cell sample (sample numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, each sample extracellular potential parameter (sample number 1 to 56, see FIG.
  • FIG. 5A (1) Classes 1, 2 and 3 in FIGS. 5A (1) and 5A (1) and (2) represent "highly responsive sample”, “lowly responsive sample” and “sample of unknown responsiveness", respectively. According to FIG. 5A (1), the nerve cell sample could be classified into a high-responsive sample and a low-responsive sample according to the score of PC1.
  • FIG. 5A (1) the nerve cell sample could be classified into a high-responsive sample and a low-responsive sample according to the score of PC1.
  • 5A (2) shows the results of PCA analysis of high-responsive and low-responsive specimens together with specimens of unknown responsiveness (sample numbers 57 to 72, see FIG. 1B).
  • Specimens of unknown responsiveness (Class: 3, indicated by the "triangle” symbol) are placed within the PC1 score distribution of high or low responsive samples, and depending on their respective PC1 scores, they are either highly responsive to the drug or Low responsiveness can be predicted.
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and PCA: Classification of extracellular potentials by parameter set (Multichannel-mean parameters)
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each nerve cell sample (sample numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, each sample extracellular potential parameter (sample number 1 to 56, see FIG.
  • FIG. 5B Class 1, 2 and 3 in FIGS. 5B (1) and 5B (1) and (2) represent "highly responsive sample”, “lowly responsive sample” and “sample of unknown responsiveness", respectively.
  • the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the scores of PC1 and PC2.
  • FIG. 5B (1) the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the scores of PC1 and PC2.
  • 5B (2) shows the results of PCA analysis of high-responsive and low-responsive specimens together with specimens of unknown responsiveness (sample numbers 57 to 72, see FIG. 1B).
  • Specimens of unknown responsiveness (Class: 3, indicated by the "triangle” symbol) are placed within the distribution of high or low responsive samples and, depending on their respective PC1 and PC2 scores, are highly responsive to the drug or Low responsiveness can be predicted.
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and PCA: Classification of extracellular potentials by parameter set (Multichannel-SD parameters)]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each nerve cell sample (sample numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, each sample extracellular potential parameter (sample number 1 to 56, see FIG.
  • FIG. 5C (1) Classes 1, 2 and 3 in FIGS. 5C (1) and 5C (1) and (2) represent "highly responsive sample”, “lowly responsive sample” and “sample of unknown responsiveness", respectively.
  • the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the scores of PC1 and PC2.
  • FIG. 5C (1) the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the scores of PC1 and PC2.
  • 5C (2) shows the results of PCA analysis of high-responsive and low-responsive specimens together with specimens of unknown responsiveness (sample numbers 57 to 72, see FIG. 1B).
  • Specimens of unknown responsiveness (Class: 3, indicated by the "triangle” symbol) are placed within the distribution of high or low responsive samples and, depending on their respective PC1 and PC2 scores, are highly responsive to the drug or Low responsiveness can be predicted.
  • Example 1 Drug responsiveness of nerve cells and PCA: Classification of extracellular potentials by parameter set (Multichannel-CV parameters)]
  • the responsiveness (synchronous burst number) of nerve cells (neuron cell device with 56 samples) to 4-aminopyridine (4-AP) was examined, and the sample (high) in which the increase in the number of synchronous bursts was more than doubled.
  • To classify the extracellular potential first, for each nerve cell sample (sample numbers 1 to 56, see FIG. 1B) whose responsiveness to 4-AP was clarified, each sample extracellular potential parameter (sample number 1 to 56, see FIG.
  • FIG. 5D (1) Classes 1, 2 and 3 in FIGS. 5D (1) and (2) represent "highly responsive sample”, “lowly responsive sample” and “sample of unknown responsiveness", respectively. According to FIG. 5D (1), the nerve cell specimen could be classified into a high-responsive specimen and a low-responsive specimen according to the score of PC1.
  • Figure 5D (2) shows the results of PCA analysis of high-responsive and low-responsive specimens together with specimens of unknown responsiveness (sample numbers 57-72, see FIG. 1B). Samples of unknown responsiveness (Class: 3, indicated by the "triangle” symbol) are placed within the distribution of high or low responsive samples, and depending on their PC1 score, high or low responsiveness is achieved. Can be predicted.
  • FIG. 6A (1) the high-responsive sample at the number of synchronous bursts (upper row, SynBst) is shown in gray, and the low-responsive sample is shown in black.
  • the description in the horizontal direction indicates a standard name of a nerve cell.
  • FIG. 6B (1) shows the results of PCA analysis of high-responsive and low-responsive samples together with samples of unknown responsiveness. Samples of unknown responsiveness (Class: 3, indicated by the "triangle” symbol) are placed within the distribution of high or low responsive samples, and depending on their PC1 score, high or low responsiveness is achieved. Can be predicted.

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Abstract

本発明は、細胞外電位に基づいて神経細胞を選別する方法に関する。具体的には、神経細胞を、薬剤添加前の細胞外電位パラメータを用いた階層クラスタリング法または主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）により分類する；得られた分類結果に基づいて、神経細胞の薬物応答性を予測する；得られた予測結果に基づいて、神経細胞を選別する。

Description

細胞の選別方法
　本発明は、細胞外電位に基づいて、薬物応答性の優れた神経細胞を選別する方法に関する。
　医薬品開発における安全性評価において、神経毒性は心毒性または肝毒性と並び医薬品開発が中止される主な原因の一つである。そのため、医薬品開発の初期段階から的確な神経毒性評価が必要であり、非臨床試験における神経毒性評価は、動物実験による行動または症状観察および脳の病理組織評価等のin vivo評価法が主流である。しかしながらin vivo評価法は煩雑でありかつ動物愛護の観点からも、近年は、より簡便な神経毒性評価のために培養神経細胞を用いるin vitro評価法の構築が進められている。
　培養神経細胞を薬物のin vitro評価に使用する場合、薬物に対する反応性に優れる細胞または細胞培養ディッシュもしくはマルチウェルプレートのウェル単位の細胞集団（以下、標本）と、薬物に対する反応性に劣る標本が存在する。標本間において薬物に対する反応性が異なる状態で薬物のin vitro評価を行うと、得られる評価結果にばらつきが生じる。その結果、評価結果の再現性および信頼性に悪影響を与える可能性がある。しかも、ばらつきを生じさせる原因が使用した細胞の品質にあるのか、または細胞播種条件などのin vitro評価系構築の過程にあるのか判断が難しい場合が多く、神経細胞を用いるin vitro評価における課題となっている。
　さらに、薬物効果には種差があるため、動物を使用した非臨床試験ではヒトで起こる有害事象を検知することができず、医薬品開発の第Ｉ相臨床試験で初めてヒト特異的な有害事象が発生する場合がある。このため、非臨床試験の段階でヒトiPS細胞などのヒト由来の細胞を利用することによりヒトにおける薬物効果の予測性を向上させ、被験者の安全性を確保することが望まれるが、薬物評価可能なヒトiPS細胞由来神経細胞などが、薬物評価ができる状態になるまでには、一般に長期間の培養が必要である（非特許文献１および２）。長期間培養することにより得た培養神経細胞であっても、薬物のin vitro評価に使用した場合、薬物に対する反応性に優れる標本と、薬物に対する反応性に劣る標本が存在し、長期培養では薬物に対する反応性のばらつきの課題を解決できない。このため、薬剤応答性に優れる標本をin vitro評価に使用する前に選別する方法の確立が求められている。
　細胞の品質を評価する方法として、例えば、細胞塊に対して近赤外光を含む測定光を照射することにより、当該細胞塊からの透過光または拡散反射光のスペクトルデータに基づき、当該細胞塊の品質を評価する方法が報告されており（特許文献１）、この方法によって、細胞の増殖能、凝集能、分化能等を評価できることが記載されている。また、多点平面電極システムを用いてhERGチャネルブロッカーであるシサプリドを添加した胚性幹細胞由来心筋細胞の細胞外電位を測定し、それに基づきシサプリド以外のhERGチャネルブロッカーに対して応答性の細胞と非応答性の細胞とを選別する方法が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、神経細胞の薬物応答性を、細胞に影響を与えることなく、試験前に非侵襲的に予測する方法は報告されていない。
WO2016/080442
Odawara A, et al. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 2014;443:1176-1181. Alhebshi AH, et al. Thymoquinone protects cultured hippocampal and human induced pluripotent stem cells-derived neurons against α-synuclein-induced synapse damage. Neurosci Lett. 2014;570:126-131. Yamazaki K, et al. A novel method of selecting human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte clusters for assessment of potential to influence QT interval. Toxicol In Vitro. 2012;26:335-342.
　神経細胞を用いるin vitro薬物評価試験において、再現性および信頼性の高い評価結果を得るためには、薬物に対する反応性が同質または近似した神経細胞を使用することが求められる。本発明の目的は、神経細胞を用いるin vitro試験を行う前に、神経細胞の薬物応答性を予測し、その予測結果に基づいて、薬物応答性が同質または近似した神経細胞を選別する方法を提供することである。
　すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
神経細胞の細胞外電位に基づいて神経細胞を選別する方法であって、
（１）神経細胞の細胞外電位を取得する工程；
（２）工程（１）で得られた細胞外電位を分類する工程；
（３）工程（２）で得られた分類結果に基づいて、神経細胞の薬物応答性を予測する工程；および、
（４）工程（３）で得られた予測結果に基づいて、神経細胞を選別する工程；
を含む方法。
〔２〕
前記細胞外電位を、多点電極アレイ上で取得する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記工程（１）において、多点電極アレイ上のシングルチャネルおよび／またはマルチチャネルにより細胞外電位を取得する、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
前記工程（２）において、階層クラスタリング法または主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）により細胞外電位を分類する、〔１〕に記載の方法。
〔５〕
前記工程（３）において、神経細胞の薬物応答性が、同期バースト数もしくはスパイク数の増加または減少である、〔１〕に記載の方法。
〔６〕
シングルチャネルにより取得される細胞外電位が、表１に示される細胞外電位パラメータとして表示される、〔３〕に記載の方法。
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
〔７〕
マルチチャネルにより取得される細胞外電位が、表２に示される細胞外電位パラメータとして表示される、〔３〕に記載の方法。
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
〔８〕
前記階層クラスタリング法が、表１および表２に記載の細胞外電位パラメータからなる群より選ばれる任意の組み合わせのパラメータを使用する、〔４〕に記載の方法。
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
〔９〕
前記階層クラスタリング法が、単連結法、完全連結法、群平均法、McQuitty法またはWard法である、〔４〕に記載の方法。
〔１０〕
前記主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）が、表１および表２に記載の細胞外電位パラメータからなる群より選ばれる任意の組み合わせのパラメータを使用する、〔４〕に記載の方法。
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　本発明によれば、薬物応答性を評価するin vitro試験の実施前に、神経細胞に対して非侵襲的に細胞外電位を測定し、測定された細胞外電位の分類結果に基づいて、神経細胞の薬物応答性を予測することができる。これにより、薬物のin vitro評価に用いる神経細胞を選別して、薬物応答性が同質または近似する細胞を用いて試験を行うことができるため、評価結果のばらつきを低減することができる。本発明の方法を用いることにより、神経細胞の薬物応答性の評価において、再現性および信頼性の高い評価結果を得ることができる。
分類に使用した細胞外電位パラメータの一覧を示す図である。 神経細胞の標品番号の一覧を示す図である。 薬物応答性を調べた神経細胞について、薬物添加前のすべての細胞外電位パラメータを、階層クラスタリング法（McQuitty法）により分類した結果を示す図である。縦方向の数字は各細胞外電位パラメータを示し、横方向の数字は神経細胞の標品番号を示す。図の上２段において、同期バースト数（SynBst）およびスパイク数（Spike）に関する高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示す。 薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞（図の上２段において淡灰色で示す）のすべての細胞外電位パラメータを、階層クラスタリング法（McQuitty法）により分類し、図１Ｃに加えた結果を示す図である。 （Ａ）薬物応答性を調べた神経細胞について、薬物添加前の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける1、54～72）を、階層クラスタリング法（Ward法）により分類した結果を示す図である。横方向の数字は神経細胞の標品番号を示す。図の上段および下段において、それぞれ同期バースト数（SynBst）およびスパイク数（Spike）に関する高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示す。（Ｂ）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞（図の上段および下段において淡灰色で示す）の薬物添加前の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける1、54～72）を、階層クラスタリング法（Multichannel All-Ward法）により分類し、図２（Ａ）に加えた結果を示す図である。 （Ａ）薬物応答性を調べた神経細胞について、薬物添加前の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける1、54～56, 61～64）を、階層クラスタリング法（McQuitty法）により分類した結果を示す図である。横方向の数字は神経細胞の標品番号を示す。図の上段および下段において、それぞれ同期バースト数（SynBst）およびスパイク数（Spike）に関する高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示す。（Ｂ）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞（図の２段において淡灰色で示す）の薬物添加前の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける1、54～56、 61～64）を、階層クラスタリング法（McQuitty法）により分類し、図３（Ａ）に加えた結果を示す図である。 薬物応答性を調べた神経細胞について、薬剤添加前のすべてのマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値およびarray-wide signal detection rate（ASDR）値（図１Ａにおける1、54～72）を、主成分分析（PCA）により分類した結果を示す図である。横軸は第1主成分（PC1）、縦軸は第2主成分（PC2）を示し、各解析データを各主成分のスコアに基づいてプロットした。薬物添加後の同期バースト数およびスパイク数に関する低応答性標本（Class：１）を「丸」記号で、また高応答性標本（Class：２）を「四角」記号で示す。第1主成分のスコアによって、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本とを区別することができる。 薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞のすべてのマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値およびASDR値（図１Ａにおける1、54～72）を、主成分分析（PCA）により分類し、図４Ａに加えた結果を示す図である。薬物無添加標本は「三角」記号（Class：3）で示されており、第1主成分のスコアによって、薬物添加前に、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本とに分類することができることを示す。 （１）薬物応答性を調べた神経細胞について、薬剤添加前のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値からバースト間隔（inter-burst interval、IBI)値とASDR値（図１Ａにおける1、54～56、61～64）を、主成分分析（PCA）により分類した結果を示す図である。横軸は第1主成分（PC1）、縦軸は第2主成分（PC2）を示し、各解析データを各主成分のスコアに基づいてプロットした。薬物添加後の同期バースト数およびスパイク数に関する低応答性標本（Class：１）を「丸」記号で、また高応答性標本（Class：２）を「四角」記号で示す。第1主成分のスコアによって、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本とを区別することができる。（２）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値からIBI値とASDR値（図１Ａにおける1、54～56、61～64）を、主成分分析（PCA）により分類し、図５Ａ（１）に加えた結果を示す図である。薬物無添加標本は「三角」記号（Class：3）で示されており、第1主成分のスコアによって、薬物添加前に、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本に分類することができることを示す。 （１）薬物応答性を調べた神経細胞について、薬剤添加前のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値の平均値（図１Ａにおける54～57、61、65、69）を、主成分分析（PCA）により分類した結果を示す図である。横軸は第1主成分（PC1）、縦軸は第2主成分（PC2）を示し、各解析データを各主成分のスコアに基づいてプロットした。薬物添加後の同期バースト数およびスパイク数に関する低応答性標本（Class：１）を「丸」記号で、また高応答性標本（Class：２）を「四角」記号で示す。第1主成分および第2主成分のスコアによって、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本を区別することができる。（２）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値の平均値（図１Ａにおける54～57、61、65、69）を、主成分分析（PCA）により分類し、図５Ｂ（１）に加えた結果を示す図である。薬物無添加標本は「三角」記号（Class：3）で示されており、第1主成分および第2主成分のスコアによって、薬物添加前に、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本に分類することができることを示す。 （１）薬物応答性を調べた神経細胞について、薬剤添加前のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値の標準偏差（SD）の値（図１Ａにおける54～56、59、63、67、71）を、主成分分析（PCA）により分類した結果を示す図である。横軸は第1主成分（PC1）、縦軸は第2主成分（PC2）を示し、各解析データを各主成分のスコアに基づいてプロットした。薬物添加後の同期バースト数およびスパイク数に関する低応答性標本（Class：１）を「丸」記号で、また高応答性標本（Class：２）を「四角」記号で示す。第1主成分および第2主成分のスコアによって、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本を区別することができる。（２）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値の標準偏差（SD）の値（図１Ａにおける54～56、59、63、67、71）を、主成分分析（PCA）により分類し、図５Ｃ（１）に加えた結果を示す図である。薬物無添加標本は「三角」記号（Class：3）で示されており、第1主成分および第2主成分のスコアによって、薬物添加前に、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本に分類することができることを示す。 （１）薬物応答性を調べた神経細胞について、薬剤添加前のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値の変動係数（CV）の値（図１Ａにおける54～56、60、64、68、72）を、主成分分析（PCA）により分類した結果を示す図である。横軸は第1主成分（PC1）、縦軸は第2主成分（PC2）を示し、各解析データを各主成分のスコアに基づいてプロットした。薬物添加後の同期バースト数およびスパイク数に関する低応答性標本（Class：１）を「丸」記号で、また高応答性標本（Class：２）を「四角」記号で示す。第1主成分によって、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本を区別することができる。（２）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞のマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値の変動係数（CV）の値（図１Ａにおける54～56、60、64、68、72）を、主成分分析（PCA）により分類し、図５Ｄ（１）に加えた結果を示す図である。薬物無添加標本は「三角」記号（Class：3）で示されており、第1主成分によって、薬物添加前に、薬物に対する低応答性標本と高応答性標本に分類することができることを示す。 （１）薬物応答性を調べたＭＥＡプローブ上に播種された神経細胞について、薬物添加前のすべての細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける54～72）を、階層クラスタリング法により分類した結果を示す図である。横方向に神経細胞の標品名を示す。図の右横において、同期バースト数およびスパイク数に関する高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示す。（２）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞（図の右横において淡灰色で示す）のすべての細胞外電位パラメータを、階層クラスタリング法により分類し、図６Ａ（１）に加えた結果を示す図である。 （１）薬物応答性を調べたＭＥＡプローブ上に播種された神経細胞について、薬物添加前のすべての細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける54～72）を、ＰＣＡにより分類した結果を示す図である。横軸は第1主成分（PC1）、縦軸は第2主成分（PC2）を示し、各解析データを各主成分のスコアに基づいてプロットした。同期バースト数およびスパイク数に関する低応答性標本（Class：１）を「丸」記号で、また高応答性標本（Class：２）を「四角」記号で示す。第1主成分のスコアによって、低応答性標本と高応答性標本を区別することができる。（２）薬物応答性が未知、すなわち薬物無添加の神経細胞のすべてのマルチチャネルの細胞外電位パラメータ測定値（図１Ａにおける54～72）を、主成分分析（PCA）により分類し、図６Ａ（１）に加えた結果を示す図である。薬物無添加標本は「三角」記号（Class：3）で示されており、第1主成分のスコアによって、薬物添加前に低応答性標本と高応答性標本に分類することができることを示す。
　本明細書において、神経細胞とは、細胞体、樹状突起及び軸索から構成される神経単位を意味し、ニューロンとも呼ばれる。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類することができる。神経伝達物質としては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンおよびセロトニン等のモノアミン、アセチルコリン、γ－アミノ酪酸、グルタミン酸等の非ペプチド性神経伝達物質、および副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、α－エンドルフィン、β－エンドルフィン、γ－エンドルフィン、バソプレッシン等のペプチド性神経伝達物質が挙げられる。例えば、ドーパミン、アセチルコリンおよびグルタミン酸を伝達物質とする神経細胞を、それぞれドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンおよびグルタミン酸作動性ニューロンという。本発明で使用される神経細胞は、いずれのニューロンであってもよい。
　本発明で使用される神経細胞としては、初代培養細胞が挙げられる。初代培養細胞は、生体内において本来有する細胞機能を多く保持しているため、生体内における薬物等の影響を評価する細胞として重要である。初代培養細胞としては、哺乳類、例えばマウスもしくはラットのげっ歯類、またはサルもしくはヒト等の霊長類の中枢神経系および末梢神経系の神経細胞を使用することができる。これらの神経細胞を調製および培養するに際し、動物の解剖方法、組織採取方法、神経分離・単離方法、神経細胞培養用培地、培養条件等は、培養する細胞の種類および細胞の目的に応じて、公知の方法より選択することができる。市販の初代培養神細胞製品としては、例えばThermofisher社（米国）のラット大脳神経細胞およびScienCell Research Laboratories社（米国）のヒト脳神経細胞を用いることができる。
　本発明で使用される神経細胞としては、さらに多能性幹細胞由来の神経細胞が挙げられる。多能性幹細胞としては、例えば胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞（iPS細胞）がある。多能性幹細胞を、公知の神経分化誘導方法を用いて分化誘導することにより、様々なタイプの神経細胞を得ることができる。例えば、文献（Honda M, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2016;469:587-592）に記載の低分子化合物を用いた分化誘導方法によって神経細胞を得ることができる。また、市販の多能性幹細胞由来の神経細胞製品、例えば、セルラーダイナミックスインターナショナル社（米国）のiCellニューロン、Axol Bioscience社（英国）の各種神経幹細胞、BrainXell社（米国）の各種神経細胞の前駆細胞およびXCell Science社（米国）のXCL-1ニューロンを用いることもできる。さらに、iPS細胞に所定の遺伝子を導入することにより神経細胞へ分化させた製品であるNeuCyte社（米国）のSynFire神経細胞およびElixirgen Scientific社（米国）の各種神経細胞を用いることもできる。これらの市販神経細胞は、付属の培養液を使用して培養することができる。
　神経細胞は、哺乳類の脳由来のグリア細胞または哺乳類のiPS細胞から分化させたグリア細胞と共に培養することができる。グリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア等が挙げられる。また、アストロサイトを培養したあとの培養液（アストロサイト培養上清）を神経細胞用培養液に、終濃度5～30％で添加し培養することもできる。また神経細胞は、細胞培養ディッシュもしくはマルチウェルプレートのウェルなどの培養容器、またはポリ乳酸ポリグリコール酸（PLGA）、ポリスチレン（PS）、ポリスルホン（PSU）およびポリテトラフルオロエチレン（PTFE）等の高分子材料により構成される生分解性または非生分解性のファイバーシートを足場として培養してもよい。
　本発明において、神経細胞の細胞外電位に基づく神経細胞の選別は、細胞培養ディッシュもしくはマルチウェルプレートのウェルなどの培養容器、多点電極アレイプローブまたは前記ファイバーシートなどの細胞足場に播種された神経細胞または神経細胞集団について、分離することのできる足場単位で行う。
　神経細胞の細胞外電位は、測定対象細胞の信号を受け取る微小電極と参照電極との間にかかる電位を測定することにより得られる。本発明において、細胞外電位の測定機器または装置に特に制限はないが、多点電極アレイ（multi-electrodes-array、以下ＭＥＡと略す）上で細胞外電位を取得することが好ましい。ＭＥＡとは、例えば64点の微小電極が、ガラス基板の平面上に8列×8列で装着された平面電極であり、神経細胞を平面電極上で培養し、または予め培養容器またはファイバーシート上で培養した神経細胞を平面電極上に置き、細胞の細胞外電位を測定することができる。本発明において、神経細胞の細胞外電位の取得は、ＭＥＡの１電極（シングルチャネル）から取得してもよく、または複数の電極（マルチチャネル）から取得してもよい。さらには、シングルチャネルおよびマルチチャネルの両方から細胞外電位を取得してもよい。
　本発明において、ＭＥＡ上のシングルチャネルおよび／またはマルチチャネルから取得された神経細胞の細胞外電位は、個々のニューロンのシナプス電位および活動電位など、細胞膜におけるイオンの流出入による膜電位の変化として測定される。細胞外電位を連続して測定すると、神経活動である膜電位の変化がスパイクおよび同期バーストとして計測され、発火パターンとして記録される。得られた発火パターンは、種々の解析ソフトウェアによりパラメータを算出することができる。本発明における細胞外電位は、このように算出された細胞外電位パラメータとして表示することができる。パラメータは、測定値として得られるスパイク数、バースト数、バースト内のスパイク数、バースト間隔、バースト持続時間、同期バーストの同調性および周期性、同期バースト数、同期バースト内のスパイク数、同期バースト間隔、同期バースト内のスパイク電位のピーク、同期バースト持続時間、ならびに、これらの測定値のそれぞれに対して得られる統計値である平均値（mean）、中央値（median）、標準偏差値（SD: standard deviation）、変動係数（CV: coefficient of variation）、分散（variance）、最大値（maximum）、最小値（minimum）、尖度（kurtosis）、歪度（skewness）、標準誤差（SE: standard error）および最頻値（mode）などに基づくものであるが、これらに限定されない。本発明において、前記発火パターンからパラメータを算出する解析ソフトウェアに特に制限はないが、例えば、MED64 Burstscope（登録商標、アルファメッドサイエンティフィック社、大阪府茨木市）を使用することができる。MED64 Burstscopeにより出力される細胞外電位パラメータも、表１および２のいずれかに記載されたパラメータに分類されるが、使用するMEA装置やパラメータは、これらに限定されない。
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　本発明において、ＭＥＡ上のシングルチャネルおよび／またはマルチチャネルから取得された神経細胞の薬物添加前の細胞外電位は、神経細胞の薬物応答性を予測するために分類される。細胞外電位の分類とは、前記細胞外電位パラメータを、階層クラスタリング法または主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）において組み合わせて、解析することを意味する。なお、解析方法は、階層クラスタリング法および主成分分析が好ましいが、これらに限定されない。階層クラスタリング法は、最も似ている組み合わせから順番にまとまりにする、すなわちクラスターにする方法であり、主成分分析は、多次元データのもつ情報をできるだけ損失せずに、低次元空間に情報を縮約する方法である。階層クラスタリング法におけるクラスター間の距離測定方法としては、単連結法（最短距離法ともいう）、完全連結法（最長距離法ともいう）、群平均法、McQuitty法およびWard法を用いることができるが、これらに限定されない。主成分分析としては、インピュテーションのある特異値分解（SVD（Singular Value Decomposition）with imputation）、Nipals（Non-linear Iterative Partial Least Squares）PCAおよびProbabilistic PCAを用いることができるが、これらに限定されない。いずれの方法であっても、細胞外電位パラメータの組み合わせは任意である。階層クラスタリング法および主成分分析を実行するソフトウェアは、これらの解析方法を実行できるソフトウェアであれば特に限定されないが、例えば、ClustVis（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/）を用いることができる。
　本発明では、薬物添加前の細胞外電位による分類結果に基づいて神経細胞の薬物応答性を予測する。神経細胞の薬物応答性の予測には、神経細胞の薬物添加前の細胞外電位の分類結果と神経細胞の薬物応答性との相関関係の理解が必要となる。本発明において、神経細胞の薬物応答性は、神経細胞と薬物とが接触することにより誘導される、細胞膜のイオンチャネルを通したＮａイオン、Ｋイオン、塩化物イオン等のイオンの流出入の結果である膜電位の変化を、細胞外電位として測定する。神経細胞の膜電位の変化を誘導する薬物としては、4-アミノピリジン（4-aminopyridine）およびテトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium）などのＫチャネル遮断薬、レチガビン（Retigabine）などのＫチャネル開口薬、リドカイン（lidocaine）、プロカイン（procaine）およびテトロドトキシン（tetrodotoxin）等のＮａチャネル遮断薬、イソプロピルウノプロストン（isopropyl unoprostone）等のＮａチャネル開口薬、ならびに神経細胞のイオンチャネル型レセプターに結合してイオンチャネルを作動させる神経伝達物質などが挙げられるが、神経細胞の膜電位の変化を誘導するものであればこれらに限定されない。神経伝達物質としては、グルタミン酸、γ-アミノ酪酸、アスパラギン酸、グリシンなどのアミノ酸類、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、ヒスタミンなどのモノアミン類、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、α－エンドルフィン、β－エンドルフィン、γ－エンドルフィン、サブスタンスＰ、バソプレッシン、ソマトスタチンなどのペプチド類、アセチルコリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、Gタンパク質共役型（代謝型）レセプターに結合するピロカルピン（pilocarpine）など、また併用により痙攣を誘発することが知られている薬物の組合せ（たとえばエノキサシン（enoxacin）およびフェンブフェン（fenbufen）の組合せ）も挙げることができる。
　神経細胞の膜電位の変化を誘導する上記の薬物が神経細胞（ニューロン）と接触すると、細胞は発火（興奮）し、膜電位変化はスパイクとして観察される。培養神経細胞は、回路網の形成等の過程において、同期バーストと呼ばれる特徴的な発火パターンを生じるようになる。同期バーストは、ネットワークバーストとも呼ばれる。同期バーストとは、バースト状の活動電位が神経回路網全体にわたって同期する現象であり、全体が発火する活動フェーズと、ほとんど発火が見られない静止フェーズに分かれ、この二つのフェーズが交互に生じることが特徴である。同期バーストは、多点電極アレイ上では、複数の電極でほぼ同一時間に検出される。本発明の一実施態様において、神経細胞の薬物応答性を、同期バースト数もしくはスパイク数の増加または減少として観察するが、これらに限定されるわけではない。神経細胞と薬物の接触は、神経細胞またはファイバーシート上に培養した神経細胞（神経細胞デバイスともいう）の培養液に、培養液に溶解した状態で共存させることにより達成される。通常は、薬物を有機溶剤、生理食塩水、緩衝液または培養液などに溶解して、神経細胞の培養液に添加する。
　本発明では、薬物添加前の細胞外電位による分類結果に基づいて神経細胞の薬物応答性を予測する。神経細胞の薬物応答性の予測には、神経細胞の薬物応答性に則した神経細胞の細胞外電位による分類方法の確立が必要となる。そのため、作製した標本の薬物応答性を調べた後、薬剤添加前の細胞外電位を用いて薬剤応答性に相関する分類方法を見出した。細胞外電位による分類は、薬物添加後の細胞外電位を取得した後、種々の方法により行うことができるので、当業者であれば、得られた薬物応答性に基づいて、薬物応答性の予測に適した分類を容易に見いだすことができる。しかし、薬物応答性の予測のための神経細胞の細胞外電位の分類には、神経細胞に対して薬物を添加することなく得られた神経細胞の細胞外電位、すなわち自発発火に基づく細胞外電位を使用することが好ましい。神経細胞の細胞外電位の分類結果と相関付ける神経細胞の薬物応答性は、神経細胞の使用目的に応じて定義することができる。
　本発明において、神経細胞の細胞外電位に基づく神経細胞の選別は、以下の通りに行うことができる。まず、薬物添加前の自発発火に基づく神経細胞の細胞外電位の分類と、神経細胞の薬物応答性との相関関係をデータベースまたは細胞外電位分類ライブラリーの細胞応答性リストとして登録する。次に、選別対象となる神経細胞の薬物添加前の細胞外電位を測定して種々の該分類結果を上記データベースまたは細胞外電位分類ライブラリーの細胞応答性リストと共に分類し、選別対象となる神経細胞が所望の薬物応答性を有するか否かを判定する。例えば、データベースの薬物応答性が優れた良品と同じ部類に分類されれば良品、またはデータベースの薬物応答性が劣る不良品と同じ部類に分類されれば不良品と選別することができる。
　選別対象となる神経細胞に対する薬剤添加前の自発発火に基づく細胞外電位の測定は、細胞を破壊することがなく、細胞に対して非侵襲的である。また、薬物等による処理を行わないため、神経細胞の機能に対して薬物の影響が残存するということがない。そのため、細胞外電位の測定後の選別対象となった細胞は、そのままin vitro評価に用いることができる。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
〔ＭＥＡによる神経細胞の細胞外電位の測定〕
（ＭＥＡプローブへ神経細胞の播種）
　初代培養神経細胞であるラット大脳皮質神経細胞（ThermoFisher社、製品番号A10840）を、6.0×105 cells/cm2の細胞密度で播種し、B-27 Plus Neuronal Culture System（ThermoFisher社、カタログ番号A3653401）を用いて、5％CO2、37℃のインキュベータ中で３週間培養し、その後の解析に使用した。
（神経細胞デバイスの作製）
　初代培養神経細胞であるラット大脳皮質神経細胞（ThermoFisher社、製品番号A10840）を、ポリスチレン（PS）を材料とするファイバーシートを足場として培養した神経細胞集団を、神経細胞デバイスとして細胞外電位の測定に使用した。ファイバーシートは次の通りに作製した。室温で、ＤＭＦ（N,N-ジメチルホルムアミド、分子生物学グレード、和光純薬）により30重量％になるように溶解したPS（Fluka）を、シリンジ（Norm-Ject Syringes 5 mL容量、大阪ケミカル）に充填後、ナノファイバー電界紡糸装置NANON-03（株式会社メック）に設置して、ドラムコレクター上に針直径25 G、電圧：10 kV、送り速度：1.5 ml/h、回転速度：2000 rpmの条件下でファイバーシートを作製した。作製されたファイバーシートは、ファイバーシートを構成するファイバーが一方向に配置され、配向性を有する構造をとった。細胞は、細胞足場である配向性PSファイバーシート上に、9.0×105 cells/cm2の細胞密度で播種し、B-27 Plus Neuronal Culture System（ThermoFisher社、カタログ番号A3653401）を用いて、5％CO2、37℃のインキュベータ中で３週間培養し、細胞シートである神経細胞デバイスを得た。
（細胞外電位の測定）
　上記の神経細胞デバイスを、16点の微小電極を有するＭＥＡプローブ（MED64-Quad II、アルファメッドサイエンティフィック社、大阪府茨木市）上に乗せ、細胞とＭＥＡプローブの電極とを接触させ、神経活動を細胞外電位として5分間測定した。
（神経細胞の薬物応答性の測定）
　標本として細胞外電位を測定した神経細胞に、種々のＫチャネルを阻害する作用を有し、神経の活動電位を持続させることが知られている4-アミノピリジンを終濃度100μMで添加し、ＭＥＡによりスパイクおよび同期バーストを測定した。
（測定データの解析）
　MED64 Burstscope（アルファメッドサイエンティフィック社、大阪府茨木市）を用いて、ＭＥＡ上のシングルチャネルおよびマルチチャネルにより取得された電位に基づく解析を行った。解析した細胞外電位パラメータは表１および２に示した。
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
〔神経細胞の薬物応答性および階層クラスタリング法／McQuitty法による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本のすべての細胞外電位パラメータ（図１Ａ参照）を、階層クラスタリング法によって分類した。McQuitty法による分類結果を図１Ｃに示した。図１Ｃの上から１段目において、4-AP添加後の同期バースト数（SynBst）の増加が高応答性の標本を灰色で、また低応答性の標本を黒色で示した。また、参考データとして図１Ｃの上から２段目において、4-AP添加後のスパイク数(Spike)の増加が4倍以上の標本を灰色、4倍未満の標本を黒色で示した。図１Ｃにおいて、縦方向の数字は各細胞外電位パラメータを示し、横方向の数字は神経細胞の標品番号を示す。図1Ｃを3つのクラスター群に分けると、左カラムおよび中央カラムには低応答性標本群（標品数37中36）が、右カラムは高応答性標本群（標本数19中18）が集まる特徴的な分類結果が示された。次に、4-APに対する応答性が未知の標本（標本番号57～72、標本数16の神経細胞デバイス、図１Ｂ参照）について、すべての細胞外電位パラメータを図1Ｃの標本と共に階層クラスタリング法により分類し、その結果を図１Ｄに示した。標本番号57～72の神経細胞は、図１Ｄの上から１段目および２段目において淡灰色で示した。階層クラスタリング法によるクラスタリングの結果、4-APに対する応答性が未知の標本は左カラムの低応答性標本群に4つの標本が、中央カラムの低応答性標本群に6つの標本が属することが分かり、これらの神経細胞は4-APに対し低応答性であることが予測される。一方、6つの標本が右カラムの高応答性標本群に属することが分かり、これらの神経細胞は、4-APに対し高応答性であることが予測される。なお、細胞外電位パラメータは、MED64 Burstscope（アルファメッドサイエンティフィック社、大阪府茨木市）を用いて出力した。
〔神経細胞の薬物応答性および階層クラスタリング法／Ward法（Multichannelパラメータセット：図１（Ａ）における５４～７２）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける1、54～72）を、階層クラスタリング法によって分類した。そのWard法による分類結果を図２（Ａ） に示した（実施例２で示した各サンプルにおけるパラメータ毎のヒートマップについては省略した）。図２（Ａ）において、同期バースト数（上段、SynBst）における高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示した。また、参考データとして図２（Ａ）下段において、4-AP添加後のスパイク数(Spike)の増加が4倍以上の標本を灰色で、また4倍未満の標本を黒色で示した。図２（Ａ）において、横方向の数字は神経細胞の標品番号を示す。図２（Ａ）を3つのクラスター群に分けると、左カラムおよび中央カラムには低応答性標本群（標品数37中35）が、右カラムには高応答性標本群（標本数19中17）が集まる特徴的な分類結果が示された。次に、4-APに対する応答性が未知の標本（標本番号57～72、標本数16の神経細胞デバイス、図１Ｂ参照）について、すべてのマルチチャネルパラメータ測定値を図２（Ａ）に示される標本と共に階層クラスタリング法により分類し、その結果を図２（Ｂ）に示した。標本番号57～72の神経細胞は、図２（Ｂ）において淡灰色で示した。Ward法によるクラスタリングの結果、4-APに対する応答性が未知の標本は、左カラムの低応答性標本群に6つの標本が、また中央カラムの低応答性標本群に5つの標本が属することが分かり、これらの神経細胞は4-APに対し低応答性であることが予測される。一方、5つの標本が、右カラムの高応答性標本群に属することが分かり、これらの神経細胞は、4-APに対し高応答性であることが予測される。
〔神経細胞の薬物応答性および階層クラスタリング法／McQuitty法（パラメータセット：Multichannel-IBI）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａにおける1、54～56, 61～64）を、階層クラスタリング法によって分類した。そのMcQuitty法による分類結果を図３（Ａ） に示した（実施例２で示した各サンプルにおけるパラメータ毎のヒートマップについては省略した）。図３（Ａ）において、同期バースト数（上段、SynBst）における高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示した。また、参考データとして図３（Ａ）下段において、4-AP添加後のスパイク数(Spike)の増加が4倍以上の標本を灰色、4倍未満の標本を黒色で示した。図３（Ａ）において、横方向の数字は神経細胞の標品番号を示す。図３（Ａ）を3つのクラスター群に分けると、左カラムおよび中央カラムには低応答性標本群（標品数37中36）が、右カラムは高応答性標本群（標本数19中18）が集まる特徴的な分類結果が示された。次に、4-APに対する応答性が未知の標本（標本番号57～72、標本数16の神経細胞デバイス、図１Ｂ参照）について、選択した細胞外電位パラメータ（図１Ａの1、54～56, 61～64）の測定値を図３（Ａ）の標本と共に階層クラスタリング法により分類し、その結果を図３（Ｂ）に示した。標本番号57～72の神経細胞は、図３（Ｂ）において淡灰色で示した。McQuitty法によるクラスタリングの結果、4-APに対する応答性が未知の標本は、左カラムの低応答性標本群に4つの標本が、また中央カラムの低応答性標本群に6つの標本が属することが分かり、これらの神経細胞は4-APに対し低応答性であることが予測される。一方、6つの標本が、右カラムの高応答性標本群に属することが分かり、これらの神経細胞は、4-APに対し高応答性であることが予測される。
〔神経細胞の薬物応答性およびPCA：パラメータセット（Multichannel-all ＋ ASDR parameters）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本細胞外電位パラメータ（多点電極アレイ上のシングルチャネルおよびマルチチャネルにより取得された細胞外電位に基づく。図１Ａ参照）から任意のパラメータ（図１Ａにおける1と54～72）を選択し、選択されたパラメータについてＰＣＡにより分析した。その結果を図４Ａ に示した。図４ＡおよびＢにおけるClass：１、２および３は、それぞれ「高応答性標本」、「低応答性標本」および「応答性が未知の標本」を表す。図４Ａによれば、PC1のスコアによって、神経細胞標本を高応答性標本と低応答性標本とに分類可能であった。高応答性標本および低応答性標本を、応答性が未知の標本（標本番号57～72、図１Ｂ参照）と共にPCA解析を行った結果を図４Ｂに示す。応答性が未知の標本（Class：３、「三角」記号で表示）は、高応答性標本または低応答性標本のPC1スコア分布内に配置され、それぞれのPC1スコアによって、薬物に対する高応答性または低応答性が予測できる。
〔神経細胞の薬物応答性およびPCA：パラメータセット（Multichannel-IBI ＋ ASDR parameters）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本細胞外電位パラメータ（多点電極アレイ上のシングルチャネルおよびマルチチャネルにより取得された細胞外電位に基づく。図１Ａ参照）から任意のパラメータ（図１Ａの1、54～56、61～64）を選択し、選択されたパラメータについてＰＣＡにより分析した。その結果を図５Ａ（１） に示した。図５Ａ（１）および（２）におけるClass：１、２および３は、それぞれ「高応答性標本」、「低応答性標本」および「応答性が未知の標本」を表す。図５Ａ（１）によれば、PC1のスコアによって、神経細胞標本を高応答性標本と低応答性標本とに分類可能であった。高応答性標本および低応答性標本を、応答性が未知の標本（標本番号57～72、図１Ｂ参照）と共にPCA解析を行った結果を図５Ａ（２）に示す。応答性が未知の標本（Class：３、「三角」記号で表示）は、高応答性標本または低応答性標本のPC1スコア分布内に配置され、それぞれのPC1スコアによって、薬物に対する高応答性または低応答性が予測できる。
〔神経細胞の薬物応答性およびPCA：パラメータセット（Multichannel-mean parameters）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本細胞外電位パラメータ（多点電極アレイ上のシングルチャネルおよびマルチチャネルにより取得された細胞外電位に基づく。図１Ａ参照）から任意のパラメータ（図１Ａの1、54～57、61、65、69）を選択し、選択されたパラメータについてＰＣＡにより分析した。その結果を図５Ｂ（１） に示した。図５Ｂ（１）および（２）におけるClass：１、２および３は、それぞれ「高応答性標本」、「低応答性標本」および「応答性が未知の標本」を表す。図５Ｂ（１）によれば、PC1およびPC2のスコアによって、神経細胞標本を高応答性標本と低応答性標本とに分類可能であった。高応答性標本および低応答性標本を、応答性が未知の標本（標本番号57～72、図１Ｂ参照）と共にPCA解析を行った結果を図５Ｂ（２）に示す。応答性が未知の標本（Class：３、「三角」記号で表示）は、高応答性標本または低応答性標本の分布内に配置され、それぞれのPC1とPC2スコアによって、薬物に対する高応答性または低応答性が予測できる。
〔神経細胞の薬物応答性およびPCA：パラメータセット（Multichannel-SD parameters）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本細胞外電位パラメータ（多点電極アレイ上のシングルチャネルおよびマルチチャネルにより取得された細胞外電位に基づく。図１Ａ参照）から任意のパラメータ（図１Ａの1、54～56、59、63、67、71）を選択し、選択されたパラメータについてＰＣＡにより分析した。その結果を図５Ｃ（１） に示した。図５Ｃ（１）および（２）におけるClass：１、２および３は、それぞれ「高応答性標本」、「低応答性標本」および「応答性が未知の標本」を表す。図５Ｃ（１）によれば、PC1およびPC2のスコアによって、神経細胞標本を高応答性標本と低応答性標本とに分類可能であった。高応答性標本および低応答性標本を、応答性が未知の標本（標本番号57～72、図１Ｂ参照）と共にPCA解析を行った結果を図５Ｃ（２）に示す。応答性が未知の標本（Class：３、「三角」記号で表示）は、高応答性標本または低応答性標本の分布内に配置され、それぞれのPC1とPC2スコアによって、薬物に対する高応答性または低応答性が予測できる。
〔神経細胞の薬物応答性およびPCA：パラメータセット（Multichannel-CV parameters）による細胞外電位の分類〕
　実施例１に従って、4-アミノピリジン（4-AP）に対する神経細胞（標本数56の神経細胞デバイス）の応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本（標本番号1～56、図１Ｂ参照）について、4-AP添加前の各標本細胞外電位パラメータ（多点電極アレイ上のシングルチャネルおよびマルチチャネルにより取得された細胞外電位に基づく。図１Ａ参照）から任意のパラメータ（図１Ａの1、54～56、60、64、68、72）を選択し、選択されたパラメータについてＰＣＡにより分析した。その結果を図５Ｄ（１） に示した。図５Ｄ（１）および（２）におけるClass：１、２および３は、それぞれ「高応答性標本」、「低応答性標本」および「応答性が未知の標本」を表す。図５Ｄ（１）によれば、PC1のスコアによって、神経細胞標本を高応答性標本と低応答性標本とに分類可能であった。高応答性標本および低応答性標本を、応答性が未知の標本（標本番号57～72、図１Ｂ参照）と共にPCA解析を行った結果を図５Ｄ（２）に示す。応答性が未知の標本（Class：３、「三角」記号で表示）は、高応答性標本または低応答性標本の分布内に配置され、それぞれのPC1スコアによって、高応答性または低応答性が予測できる。
〔ＭＥＡプローブに直接播種した神経細胞標本の階層クラスタリング、ならびに神経細胞標本の薬剤処理前におけるＰＣＡによる「高応答性標本」および「低応答性標本」の予測〕
　実施例１に従って準備されたＭＥＡプローブに神経細胞を直接播種した標本において、4-APに対する応答性（同期バースト数）を調べ、同期バースト数の増加が２倍以上の標本（高応答性標本）および同期バースト数の増加が２倍未満の標本（低応答性標本）を分けた。細胞外電位の分類は、まず、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本について、4-AP添加前の各標本の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａの54～72）を、階層クラスタリング法によって分類した。そのMcQuitty法による分類結果を図６Ａ（１） に示した。
　図６Ａ（１）において、同期バースト数（上段、SynBst）における高応答性標本を灰色で、また低応答性標本を黒色で示した。また、参考データとして図６Ａ（１）下段において、4-AP添加後のスパイク数(Spike)の増加が4倍以上の標本を灰色で、また4倍未満の標本を黒色で示した。図６Ａにおいて、横方向の記載は神経細胞の標品名を示す。図６Ａ（１）を3つのクラスター群に分けると、左カラムには低応答性標本群（標品数18中９）が、中央カラムおよび右カラムには高応答性標本群（標本数18中７）が集まる特徴的な分類結果が示された。次に、4-APに対する応答性が未知の標本について、選択した細胞外電位パラメータ（図１Ａの54～72）の測定値を図６Ａ（１）の標本と共に階層クラスタリング法により分類し、その結果を図６Ａ（２）に示した。4-APに対する応答性が未知の６標本は、図６Ａ（２）において淡灰色で示した。McQuitty法によるクラスタリングの結果、4-APに対する応答性が未知の標本は、右カラムの低応答性標本群に２つの標本が属することが分かり、これらの神経細胞は4-APに対し低応答性であることが予測される。一方、中央カラムおよび右カラムの高応答性標本群に、それぞれ２つの標本が属することが分かり、これらの神経細胞は、4-APに対し高応答性であることが予測される。
　次に、4-AP に対する応答性が明らかになった各神経細胞標本について、4-AP添加前の各標本の任意の細胞外電位パラメータ（図１Ａの54～72）を、ＰＣＡによって分類した。その結果を図６Ｂ（１） に示した。図６Ｂ（１）および（２）におけるClass：１、２および３は、それぞれ「高応答性標本」、「低応答性標本」および「応答性が未知の標本」を表す。図６Ｂ（１）によれば、PC1のスコアによって、神経細胞標本を高応答性標本と低応答性標本とに分類可能であった。高応答性標本および低応答性標本を、応答性が未知の標本と共にPCA解析を行った結果を図６Ｂ（２）に示す。応答性が未知の標本（Class：３、「三角」記号で表示）は、高応答性標本または低応答性標本の分布内に配置され、それぞれのPC1スコアによって、高応答性または低応答性が予測できる。

 

Claims (10)

  1. 　神経細胞の細胞外電位に基づいて神経細胞を選別する方法であって、
    （１）神経細胞の細胞外電位を取得する工程；
    （２）工程（１）で得られた細胞外電位を分類する工程；
    （３）工程（２）で得られた分類結果に基づいて、神経細胞の薬物応答性を予測する工程；および、
    （４）工程（３）で得られた予測結果に基づいて、神経細胞を選別する工程；
    を含む方法。
  2. 　前記細胞外電位を、多点電極アレイ上で取得する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（１）において、多点電極アレイ上のシングルチャネルおよび／またはマルチチャネルにより細胞外電位を取得する、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記工程（２）において、階層クラスタリング法または主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）により細胞外電位を分類する、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記工程（３）において、神経細胞の薬物応答性が、同期バースト数もしくはスパイク数の増加または減少である、請求項１に記載の方法。
  6. 　シングルチャネルにより取得される細胞外電位が、表１に示される細胞外電位パラメータとして表示される、請求項３に記載の方法。
    （表１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
  7. 　マルチチャネルにより取得される細胞外電位が、表２に示される細胞外電位パラメータとして表示される、請求項３に記載の方法。
    （表２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
  8. 　前記階層クラスタリング法が、表１および表２に記載の細胞外電位パラメータからなる群より選ばれる任意の組み合わせのパラメータを使用する、請求項４に記載の方法。
    （表１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （表２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
  9. 　前記階層クラスタリング法が、単連結法、完全連結法、群平均法、McQuitty法またはWard法である、請求項４に記載の方法。
  10. 　前記主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）が、表１および表２に記載の細胞外電位パラメータからなる群より選ばれる任意の組み合わせのパラメータを使用する、請求項４に記載の方法。
    （表１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （表２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006

     
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