CN109959679A - 一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法。本发明采用MEMS工艺加工垂直多电极阻抗芯片；对具有迁移能力的肿瘤细胞进行3D培养；将一对垂直多电极阻抗芯片插入至3D肿瘤细胞培养腔内；随着3D肿瘤细胞数目的变化，垂直多电极阻抗芯片所检测到阻抗值也会产生变化。肿瘤细胞的迁移特性会导致同一个培养腔内不同空间位置的肿瘤细胞数目随着时间产生变化，垂直多电极阻抗芯片可同时监测同一培养腔内16个不同位置的阻抗值，并根据阻抗值绘制3D细胞阻抗热点图，实现对3D肿瘤细胞迁移的实时监测。

Description

一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器 及制备方法

技术领域

本发明涉及细胞迁移检测技术，尤其涉及一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法。

背景技术

细胞迁移也称为细胞爬行或细胞运动，是正常细胞的正常功能之一，是指细胞在感受到迁移信号之后产生的移动。肿瘤细胞的迁移属于肿瘤细胞的恶性行为，肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔部位，肿瘤细胞被血流、淋巴流带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。恶性肿瘤的转移特性给患者的诊断和治疗带来极大的危害，目前对于抗恶性肿瘤转移药物的研发需求十分巨大。传统2D细胞由于其培养环境与体内环境相去甚远，常丢失了其在生物体内的特性。为了提高基于细胞模型的药物筛选效率和准确性，越来越多的机构开始采取3D细胞进行药物筛选。而目前市场上只有监测2D细胞迁移的方法，如跨膜/Boyden小室、细胞划痕实验、细胞隔离迁移实验和微流体技术；缺乏针对3D细胞迁移有效监测的手段。因此在药物筛选领域，急需一种可以实时监测3D肿瘤细胞迁移的装置和方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器，该传感器以硅晶圆作为基底，在基底上依次覆盖SiO₂层、钛层、金层，金层作为电极层，在金层上刻蚀出8行2列共16个金电极；传感器芯片与PCB板粘合，金电极通过引线连接金属盘，通过飞线将金属盘和PCB板的焊盘电气连接。

进一步地，所述基底的厚度为0.5mm，SiO₂层的厚度为1μm，钛层的厚度为5nm，金层的厚度为200nm，金电极为边长1mm的正方形。

一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)选择厚度为0.5mm、直径为4英寸的硅晶圆作为基底，硅晶圆的晶向为100。

(2)采用热氧化技术对硅基底进行表面氧化，获得厚度为1μm的SiO₂层。

(3)利用磁控溅射技术在SiO₂层上先溅射一层5nm厚的钛层，然后溅射一层200nm厚的金层，用作电极层。

(4)采用正胶光刻技术刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，形成8行2列共16个金电极，每个金电极为边长1mm的正方形，此时得到垂直多电极阻抗传感器芯片；

(5)对传感器芯片进行划片，划片后采用环氧树脂将传感器芯片粘附于 PCB板上，采用飞线技术将电极引线引出的金属盘和PCB板上的焊盘电气连接。

(6)使用环氧树脂对飞线连接处进行金线保护。

(7)对金电极进行清洗，得到用于监测3D细胞迁移的垂直多电极阻抗传感器。

进一步地，所述步骤(7)中金电极的清洗方法具体如下：采用硫酸和双氧水溶液去除衬底材料上的有机物，氨水和双氧水溶液去除衬底材料上的非金属玷污，盐酸和双氧水溶液去除衬底材料上的金属玷污；最后采用双蒸水反复冲洗芯片表面，烘干后放置于紫外灯光照射下灭菌待用。

一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)3D肿瘤细胞培养：将肿瘤细胞培养成3D球体细胞，并加入到48孔细胞培养板中。

(2)3D细胞迁移检测：将两片加工好的垂直多电极阻抗传感器插入48孔细胞培养板的待测孔中，保持两片传感器芯片垂直相对间隔1厘米立于培养孔底部，保持两片传感器芯片上的16个金电极对齐，左边传感器芯片上的金电极作为工作电极，右边传感器芯片上的金电极作为参比电极，连接阻抗分析仪进行阻抗值检测；当3D肿瘤细胞刚开始培养时，基本均匀分布在培养腔内，各个工作电极所检测到的阻抗值接近一致；随着时间的变化，3D肿瘤细胞开始迁移，培养孔顶端的细胞会向培养孔底端移动，底部金电极所测到的阻抗值与其它位置所测到阻抗值大小将产生差异，根据不同电极检测到的阻抗值，绘制3D细胞阻抗值热度图，监测3D肿瘤细胞迁移的运动轨迹。

进一步地，所述步骤(1)具体为：

(1.1)将肿瘤细胞(SW480)培养在25cm²的培养瓶中，细胞培养液采用 DMEM培养基，其中添加了体积分数为10％的胎牛血清、质量分数为1％的丙酮酸钠、质量分数为1％的非必需氨基酸、质量分数为1％的谷氨酰胺、质量分数为1％的P/S双抗；SW480细胞需要每天更换新鲜的培养基，待细胞的融合度达到80-90％，使用质量浓度0.25％的胰酶将SW480细胞消化，形成细胞密度为 1x10⁷个/毫升的细胞悬液。

(1.2)加入预冷过的基质胶和培养基形成细胞密度为5×10⁷个/毫升的细胞基质胶混合液。

(1.3)将400μL细胞基质胶混合液加入48孔细胞培养板中，放置在37℃的细胞培养箱中进行凝固；经过30分钟后，细胞基质胶混合液凝结成团，然后加入200μL的细胞培养基作营养支持。

本发明的有益效果是：本发明利用微纳加工技术加工了一种具有16个金电极的垂直阻抗传感器，用于实时监测3D肿瘤细胞的迁移。本发明构建的垂直多电极阻抗传感器可以实时长时高通量的监测3D细胞的迁移能力。

附图说明

图1为本发明金电极阵列的电极排布图；

图2为本发明垂直多电极阻抗传感器的结构图；

图3为本发明垂直多电极阻抗传感器的使用效果图；

图4为利用垂直多电极阻抗传感器所监测到的细胞迁移阻抗值图谱。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。

本发明利用垂直对电极检测3D细胞凝胶团的总阻抗，由于凝胶阻抗值基本不变，因此3D细胞凝胶团的总阻抗值主要由细胞数目和状态决定。基于此原理，我们设计了垂直多电极阻抗传感器用于检测细胞培养腔内不同空间位置分布的 3D肿瘤细胞阻抗值。随着时间的变化，3D肿瘤细胞会产生细胞迁移运动，不同位点的阻抗值相较初始时刻会有差异。我们根据不同电极检测到的阻抗值，绘制不同时间点的3D细胞迁移图谱，用以评价细胞迁移能力。

一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)垂直多电极阻抗传感器的加工：传感器的加工采用标准的MEMS工艺。传感器以厚度为0.5mm、直径为4英寸的硅晶圆作为基底，硅晶圆的晶向为100。采用热氧化技术对硅基底进行表面氧化，获得一层厚度为1微米的SiO2 层。利用磁控溅射技术在SiO2层上先溅射一层5nm厚的钛层，然后溅射一层 200nm厚的金层，用作电极层。采用正胶光刻技术刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将非电极区域刻蚀掉。芯片电极图形如图1所示，一个芯片单元上共有8 行2列共16个金电极1，每个金电极为边长为1mm的正方形。划片后采用环氧树脂将芯片与PCB板进行粘合，然后使用飞线2一头将电极引线3引出的金属盘4和PCB板5上的焊盘进行电气连接。使用环氧树脂对飞线连接处进行金线保护，最终得到用于监测3D细胞迁移的垂直多电极阻抗传感器，如图2所示。

(2)金电极的清洗：采用硫酸和双氧水溶液去除衬底材料上的有机物，氨水和双氧水溶液去除衬底材料上的非金属玷污，盐酸和双氧水溶液去除衬底材料上的金属玷污。最后采用双蒸水反复冲洗芯片表面，烘干后放置于紫外灯光照射下灭菌待用。

一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D细胞迁移实时监测的方法，该方法包括以下步骤：

(1)3D肿瘤细胞培养，具体如下：人类结肠癌细胞(SW480)培养在25cm²的培养瓶中，细胞培养液采用了DMEM培养基，其中添加了体积分数为10％的胎牛血清、质量分数为1％的丙酮酸钠、质量分数为1％的非必需氨基酸、质量分数为1％的谷氨酰胺、质量分数为1％的P/S双抗；SW480细胞需要每天更换新鲜的培养基，待细胞的融合度达到80-90％，使用质量浓度0.25％的胰酶将 SW480细胞消化，形成细胞密度为1x10⁷个/毫升的细胞悬液；加入预冷过的基质胶和培养基形成细胞密度为5×10⁷个/毫升的细胞基质胶混合液。将400μL细胞基质胶混合液加入48孔细胞培养板中，放置在37℃的细胞培养箱中进行凝固。经过30分钟后，细胞基质胶混合液凝结成团，然后加入200μL的细胞培养基作营养支持。

(2)3D细胞迁移检测：将两片加工好的垂直多电极阻抗传感器插入步骤 (1)48孔细胞培养板的待测孔中，保持两片传感器芯片垂直相对间隔1厘米立于培养孔底部，保持两片传感器芯片上的16个金电极对齐，如图3所示。左边传感器芯片上的金电极作为工作电极，右边传感器芯片上的金电极作为参比电极，连接阻抗分析仪进行阻抗值检测。当3D肿瘤细胞刚开始培养时，基本均匀分布在培养腔内，各个工作电极所检测到的阻抗值是接近一致的。随着时间的变化，3D培养的肿瘤细胞开始迁移。培养孔顶端的细胞会向培养孔底端移动，底部金电极所测到的阻抗值与其它位置所测到阻抗值大小会产生差异。根据这一差异，我们通过Matlab软件绘制了0天和4天时的3D细胞阻抗值热度图。。如图4所示，该传感器可以较为直观地反映出3D细胞迁移的运动轨迹和迁移能力。

本技术领域的人员根据本发明所提供的文字描述、附图以及权利要求书能够很容易在不脱离权利要求书所限定的本发明的思想和范围条件下，可以做出多种变化和改动。凡是依据本发明的技术思想和实质对上述实施例进行的任何修改、等同变化，均属于本发明的权利要求所限定的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器，其特征在于，该传感器以硅晶圆作为基底，在基底上依次覆盖SiO₂层、钛层、金层，金层作为电极层，在金层上刻蚀出8行2列共16个金电极；传感器芯片与PCB板粘合，金电极通过引线连接金属盘，通过飞线将金属盘和PCB板的焊盘电气连接。

2.根据权利要求1所述的一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器，其特征在于，所述基底的厚度为0.5mm，SiO₂层的厚度为1μm，钛层的厚度为5nm，金层的厚度为200nm，金电极为边长1mm的正方形。

3.一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)选择厚度为0.5mm、直径为4英寸的硅晶圆作为基底，硅晶圆的晶向为1 0 0。

(2)采用热氧化技术对硅基底进行表面氧化，获得厚度为1μm的SiO₂层。

(3)利用磁控溅射技术在SiO₂层上先溅射一层5nm厚的钛层，然后溅射一层200nm厚的金层，用作电极层。

(4)采用正胶光刻技术刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，形成8行2列共16个金电极，每个金电极为边长1mm的正方形，此时得到垂直多电极阻抗传感器芯片；

(5)对传感器芯片进行划片，划片后采用环氧树脂将传感器芯片粘附于PCB板上，采用飞线技术将电极引线引出的金属盘和PCB板上的焊盘电气连接。

(6)使用环氧树脂对飞线连接处进行金线保护。

(7)对金电极进行清洗，得到用于监测3D细胞迁移的垂直多电极阻抗传感器。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中金电极的清洗方法具体如下：采用硫酸和双氧水溶液去除衬底材料上的有机物，氨水和双氧水溶液去除衬底材料上的非金属玷污，盐酸和双氧水溶液去除衬底材料上的金属玷污；最后采用双蒸水反复冲洗芯片表面，烘干后放置于紫外灯光照射下灭菌待用。

5.一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)3D肿瘤细胞培养：将肿瘤细胞培养成3D球体细胞，并加入到48孔细胞培养板中。

(2)3D细胞迁移检测：将两片加工好的垂直多电极阻抗传感器插入48孔细胞培养板的待测孔中，保持两片传感器芯片电极垂直相对间隔1厘米立于培养孔底部，保持两片传感器芯片上的16个金电极对齐，左边传感器芯片上的金电极作为工作电极，右边传感器芯片上的金电极作为参比电极，连接阻抗分析仪进行阻抗值检测；当3D肿瘤细胞刚开始培养时，基本均匀分布在培养腔内，各个工作金电极所检测到的阻抗值接近一致；随着时间的变化，3D肿瘤细胞开始迁移，培养孔顶端的细胞会向培养孔底端移动，底部金电极所测到的阻抗值与其它位置所测到阻抗值大小将产生差异，根据不同电极检测到的阻抗值，绘制3D细胞阻抗值热度图，监测3D肿瘤细胞迁移的运动轨迹。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：

(1.1)将肿瘤细胞(SW480)培养在25cm²的培养瓶中，细胞培养液采用DMEM培养基，其中添加了体积分数为10％的胎牛血清、质量分数为1％的丙酮酸钠、质量分数为1％的非必需氨基酸、质量分数为1％的谷氨酰胺、质量分数为1％的P/S双抗；SW480细胞需要每天更换新鲜的培养基，待细胞的融合度达到80-90％，使用质量浓度0.25％的胰酶将SW480细胞消化，形成细胞密度为1x10⁷个/毫升的细胞悬液。

(1.2)加入预冷过的基质胶和培养基形成细胞密度为5×10⁷个/毫升的细胞基质胶混合液。

(1.3)将400μL细胞基质胶混合液加入48孔细胞培养板中，放置在37℃的细胞培养箱中进行凝固；经过30分钟后，细胞基质胶混合液凝结成团，然后加入200μL的细胞培养基作营养支持。