CN113005170A - 一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法 - Google Patents

一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，包括：S1，对设有微电极阵列的导电芯片进行表面处理；S2，在导电芯片表面铺设肿瘤细胞；S3，对肿瘤细胞进行饥饿处理及其后的加药作用；S4，在肿瘤细胞上形成聚合水凝胶并加入趋化因子；S5，实时进行细胞阻抗检测，获取细胞的阻抗信息，根据阻抗信息进行药物筛选。本公开通过将不同浓度梯度的紫杉醇作用于人乳腺癌细胞，诱导胶原蛋白I型凝胶中群体细胞侵袭，有效实现了三维基质中细胞侵袭过程中高效稳定的细胞阻抗传感检测，使得抗肿瘤药物定量筛选达到了实时、无标记、持续动态检测的技术效果。

Description

一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法
技术领域
本公开涉及细胞阻抗传感检测技术领域，具体涉及一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法。
背景技术
药物筛选系指通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程，主要的技术有基因组学、蛋白质组学、代谢组学、计算生物学、生物芯片技术、微流控芯片技术等方法。药物筛选的实验流程是以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。药物筛选是生化水平(分子水平)和细胞水平的筛选。细胞水平的筛选则包括：离子通道监测(包括离子浓度、膜电位、pH值等)、报告基因检测以及酵母双杂交技术。细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确和大规模筛选等优点。快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。目前，在细胞水平上对抗肿瘤药物的高通量筛选主要是采用选取肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，采用液闪计数、比色法、化学发光及荧光检测等检测技术，以细胞增殖、细胞毒作用、细胞周期调控及信号转导等为检测对象进行药物筛选。然而，由于标记物的限制以及采用终点检测的方法，大大限制了药物筛选的范围和准确性。成功的筛选能够缩短创新药物的研究与开发的周期、降低成本、减少风险和提高效率，因而需要加速体外细胞药物筛选方法的创新。
生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基于生物芯片的细胞阻抗传感技术(Electric Cell Impedance Sensing，简称ECIS)是一种基于电子阻抗的实时细胞检测系统，可通过细胞粘附、形态及生长等表型特点进行高通量的药物筛选。该方法是基于细胞的无标记分析方法，可通过细胞与检测板底部电极的相互作用，在近似生理环境下连续几天至几周实时、无标记、非侵入性动态地记录细胞增殖、细胞毒性和细胞形态的变化，为全面了解细胞的活性和侵袭性提供了一个更加准确、敏感地检测平台，可在新药研发的早期，合成出少量先导化合物进行细胞毒性的评价，具有很好的应用前景。除了无标记应用的技术优势外，ECIS的另一个特点是实时动态检测，相比于传统的终点法优势明显，能够以定量数据分析细胞增殖、形态变化、凋亡和坏死等生物学特点。因此，基于ECIS的用于体外三维(3D)基质中细胞水平的药物筛选可整合高通量、小型化筛选平台进行无标记全程动态定量监测，该方法易于操作且将为细胞药物相互作用提供新的视角。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对上述问题，本公开提供了一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，用于至少部分解决传统方法对细胞活体产生破坏，进而大大局限了生物信息的全程动态收集等技术问题。
(二)技术方案
本公开提供了一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，包括：S1，对设有微电极阵列的导电芯片进行表面处理；S2，在导电芯片表面铺设肿瘤细胞；S3，对肿瘤细胞进行饥饿处理及其后的加药作用；S4，在肿瘤细胞上形成聚合水凝胶并加入趋化因子；S5，实时进行细胞阻抗检测，获取细胞的阻抗信息，根据阻抗信息进行药物筛选。
进一步地，S1具体包括：以甲醇清洗导电芯片；以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的导电芯片表面修饰氨基；以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对导电芯片表面修饰酸酐基团。
进一步地，甲醇为无水甲醇，清洗次数至少为2次；3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的配比为3-氨基丙基三乙氧基硅烷∶丙酮＝3∶25～4∶25；聚(苯乙烯-co-马来酸酐)为重均分子量2000～3000，质量百分比0.14～0.15％的酸酐共聚物，其酸酐溶液配比为聚(苯乙烯-co-马来酸酐)∶丙酮＝0.9∶2～1.1∶2。
进一步地，S2具体包括：所选肿瘤细胞系为人乳腺癌细胞；将肿瘤细胞悬液接种到表面预处理后的导电芯片上，以完全培养基培养。
进一步地，S3具体包括：用含胚牛血清的培养基饥饿处理细胞，用杜氏磷酸盐缓冲液清洗细胞；以不同浓度的紫杉醇溶液对饥饿处理后的细胞进行加药作用。
进一步地，含胚牛血清的培养基为添加了青霉素链霉素混合双抗的改良伊格尔高糖培养基；不同浓度的紫杉醇溶液为浓度范围为10nmol/L～30nmol/L。
进一步地，S4具体包括：依据预设配比，将胶原蛋白I型溶液、改良伊格尔培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合形成聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合；趋化因子为完全培养基中的胚牛血清。
进一步地，稀释后的胶原蛋白I型的预设浓度为3～5.6mg/mL；依据预设配比混合后的溶液中胶原蛋白I型的终浓度为2～4.5mg/mL；依据预设配比混合后的溶液pH中和至7.3～7.5。
进一步地，S5具体包括：以输出频率为10kHz～100kHz、输出正弦电压为10mV～30mV对抗肿瘤药物作用后三维基质中正在进行群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量；获取定量的细胞阻抗信息是以在水凝胶加入趋化因子为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，以获得不同频率不同时间点的细胞阻抗值。
进一步地，S5中根据阻抗信息进行药物筛选具体包括：获取不同频率下细胞阻抗值，以相对阻抗值变化表征三维基质中群体细胞随时间的侵袭距离，进而得到细胞侵袭过程的信息，由此进行药物筛选。
(三)有益效果
本公开实施例提供的一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，通过加药作用于肿瘤细胞，诱导胶原蛋白I型凝胶中群体细胞侵袭，有效实现了三维基质中细胞侵袭过程中高效稳定的细胞阻抗传感检测，使得抗肿瘤药物定量筛选达到了实时、无标记、持续动态检测的技术效果。
附图说明
图1示意性示出了根据本公开实施例基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法的流程图；
图2示意性示出了根据本公开实施例制备具有微电极阵列的导电芯片及细胞培养腔的流程示意图；
图3示意性示出了根据本公开实施例抗肿瘤药物定量筛选方法的细胞阻抗传感系统的组成示意图；
图4示意性示出了根据本公开实施例导电芯片表面进行细胞阻抗检测的示意图；
图5示意性示出了根据本公开实施例中细胞在抗肿瘤药物作用后单细胞的荧光标记图；
图6-a示意性示出了根据本公开实施例中小室下侧面的实物图；
图6-b示意性示出了根据本公开实施例中倒置显微镜IX41下穿过8μm孔径聚碳酸酯膜的细胞染色图；
图6-c示意性示出了根据本公开实施例中不同浓度紫杉醇作用后侵袭细胞数目的统计结果图；
图6-d示意性示出了根据本公开实施例中不同浓度紫杉醇作用后吸光度值(细胞活性)统计结果图；
图7a～d示意性示出了根据本公开实施例中胶原蛋白I型凝胶的形貌特征图；
图7e～f示意性示出了根据本公开实施例中定量拓扑分析的结果图；
图8示意性示出了根据本公开实施例中细胞在抗肿瘤药物作用后在三维基质中侵袭距离和速度与时间的对应关系图；
图9-a示意性示出了根据本公开实施例中细胞在抗肿瘤药物作用后阻抗传感检测获得的侵袭距离与时间的对应关系图；
图9-b示意性示出了根据本公开实施例中细胞在抗肿瘤药物作用后阻抗传感检测获得的相对阻抗值与时间的对应关系图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
细胞毒性是抗癌药物作用的关键所在，细胞毒性引起的细胞死亡有程序性和非程序性之分，后者即坏死。药物可以针对相应的细胞死亡信号通路进行调控，从而抑制或诱导细胞的死亡，对细胞死亡信号通路的深入研究，可为药物研发提供新的靶点，反之，在抗肿瘤药物作用机制的研究过程中，密切关注其对细胞死亡通路影响，则可进一步认识细胞的死亡。
传统细胞毒性测定方法有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法以及ATP检测法等。但这些细胞学研究检测形式多是终点检测法，仅给实验提供一个最终结果，且经常需要标记，从而对细胞产生破坏。由于细胞是活体，生物细胞进程是动态地而非静态的，终点检测法大大局限了生物信息的全程动态收集。
基于生物芯片的细胞阻抗传感技术(ECIS)通过电阻抗的形式，可以实现实时、无标记、持续动态检测细胞表型变化。在导电玻璃芯片的底部整合有微电极阵列，获得的细胞阻抗值可以细胞指数(Cell index，简称CI)的形式输出，可定量评估细胞生理状态包括细胞数量、存活率及细胞形态变化等。基于阻抗检测得到的动力学谱图能够提供化合物引起的细胞毒性作用的瞬时效应信息。此外，在细胞药物毒性试验中，ECIS检测能够精确确定化合物介导的细胞毒性作用发挥最大效应的时间点，有助于药物作用机理的研究及揭示。
本公开的实施例提供一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，请参见图1，包括：S1，对设有微电极阵列的导电芯片进行表面处理；S2，在导电芯片表面铺设肿瘤细胞；S3，对肿瘤细胞进行饥饿处理及其后的加药作用；S4，在肿瘤细胞上形成聚合水凝胶并加入趋化因子；S5，实时进行细胞阻抗检测，获取细胞的阻抗信息，根据阻抗信息进行药物筛选。
根据本公开的实施例，将上述公开的具有可三维培养细胞的胶原蛋白I型(type Icollagen，缩写为Coll I)凝胶的导电芯片作为检测电极与阻抗谱仪电连接，构建一细胞阻抗传感系统，对不同浓度抗肿瘤药物作用的群体细胞侵袭进行实时定量的细胞阻抗检测。具体地，在导电芯片的微电极阵列上接种肿瘤细胞，待细胞长满加不同浓度加药作用后在细胞层上经自组装纤维化过程制备了适于肿瘤侵袭模型的Coll I凝胶。然后将阻抗谱仪通过导线经金属夹片与待检测细胞所在的检测电极(即细胞阻抗传感芯片)相连，以测量待检测细胞的阻抗值。
图2为制备具有微电极阵列的导电芯片及细胞培养腔的流程图，具体包括：在导电衬底的导电膜层上形成光刻胶层；在具有光刻胶层的导电衬底上形成光刻胶图案；以及基于光刻胶图案在导电衬底上形成具有导电膜图案的导电芯片，其中，导电膜图案为微电极阵列。图3为抗肿瘤药物定量筛选方法的细胞阻抗传感系统的组成示意图。图4为导电芯片表面进行细胞阻抗检测的示意图。
在上述实施例的基础上，S1具体包括：以甲醇清洗导电芯片；以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的导电芯片表面修饰氨基；以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对导电芯片表面修饰酸酐基团。
根据本公开的实施例，需要对光刻有微电极阵列的导电芯片进行表面处理，以用于后续在玻璃皿中形成聚合水凝胶，在type I collagen凝胶纤维化过程中酸酐基团的存在使得赖氨酸侧链能够共价键合凝胶表面，从而将适于肿瘤侵袭模型的type I collagen凝胶固定在具有反应性共聚物涂层的导电芯片皿表面。
在上述实施例的基础上，甲醇为无水甲醇，清洗次数至少为2次；3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的配比为3-氨基丙基三乙氧基硅烷∶丙酮＝3∶25～4∶25；聚(苯乙烯-co-马来酸酐)为重均分子量2000～3000，质量百分比0.14～0.15％的酸酐共聚物，其酸酐溶液配比为聚(苯乙烯-co-马来酸酐)∶丙酮＝0.9∶2～1.1∶2。
采用无水甲醇清洗导电芯片2次，每次以摇床100rpm转速清洗3min，氮气吹干。以3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-AminopropylTriethoxySilane，简称APTES)为硅烷偶联剂，加入丙酮配制APTES∶丙酮＝3∶25溶液对预清洗的导电芯片皿表面修饰氨基。具体地，可以在27mm内径的玻璃皿中加入405μL上述溶液，不加盖置于通风橱中等待1h彻底自然晾干，此时，玻璃皿底部呈现白色。然后，用去离子水清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干。再将聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(Poly(styrene-alt-maleic anhydride)，简称PSMA)溶液以低速300rpm 20s旋涂在修饰了氨基的导电芯片皿表面以进一步修饰酸酐基团，配比为PSMA-copolymer：丙酮＝1∶2，其中，PSMA为质量百分比0.14％，重均分子量2000～3000的酸酐共聚物。不加盖置于通风橱中等待30min彻底自然晾干，最后用去离子水清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干。
在上述实施例的基础上，S2具体包括：所选肿瘤细胞系为人乳腺癌细胞；将肿瘤细胞悬液接种到表面预处理后的导电芯片上，以完全培养基培养。
在预处理的导电芯片表面铺满所选肿瘤细胞系细胞，所选的肿瘤细胞系可以为三阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-436。用DPBS清洗细胞2次后，以0.25％的Trypsin-EDTA溶液消化MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞1min，用血球计数板计数后，将40×104数目的MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞的细胞悬液接种到表面预处理的导电芯片皿中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中以改良伊格尔(DMEM)高糖完全培养基培养24h，以用于后续肿瘤细胞的饥饿处理及其后的加药作用。
在上述实施例的基础上，S3具体包括：用含胚牛血清的培养基饥饿处理细胞，用杜氏磷酸盐缓冲液清洗细胞；以不同浓度的紫杉醇溶液对饥饿处理后的细胞进行加药作用。
进一步地，对导电芯片皿中的肿瘤细胞进行饥饿处理及其后的加药作用。当所选肿瘤细胞用完全培养基培养24h后，用1×DPBS清洗细胞2次后，用含0.5％胚牛血清(FBS)的培养基饥饿处理细胞24h，此时，芯片皿中的细胞量应该达到90％～100％的饱和度。再用1×DPBS清洗细胞2次以除去细胞杂质，接着以不同浓度的紫杉醇(PTX)溶液对饥饿处理后的细胞继续加药作用2h。
在上述实施例的基础上，含胚牛血清的培养基为添加了青霉素链霉素混合双抗的DMEM高糖培养基；不同浓度的紫杉醇溶液为浓度范围为10nmol/L～30nmol/L。
上述含0.5％FBS的培养基为添加了1％双抗(青霉素链霉素混合双抗)的DMEM高糖培养基，不同浓度的紫杉醇溶液为浓度梯度10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L的紫杉醇溶液。在紫杉醇溶液的配制过程中，先用1.17mL的DMSO溶解恢复至室温的10mg PTX粉末涡旋振荡得到10mmol/L的储存液，再以含0.5％FBS的培养基稀释储存液至工作浓度，以用于乳腺癌细胞的加药作用。其中，加药作用结果如图5所示，图5中a、b、c、d分别为对照组以及加了浓度为10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L的紫杉醇溶液作用2h后的单细胞荧光标记图。因此，可见随着紫杉醇浓度的升高，细胞骨架的铺展面积逐渐减小，细胞的侵袭性和活性也会相应地降低。
在本公开的实施例中，以不同浓度的紫杉醇溶液对饥饿处理后的乳腺癌细胞加药作用。紫杉醇可使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚，从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂和触发细胞凋亡，进而有效阻止癌细胞的增殖，起到抗癌作用。纺锤体微管短暂的瓦解能优先杀灭异常分裂的细胞，一些重要的抗癌药物如秋水仙碱、长春碱、长春新碱等就是通过阻止微管蛋白重聚合而起到抗肿瘤作用的。与抗有丝分裂的抗肿瘤药物相反，紫杉醇是通过稳定微管蛋白而起作用，同时发现紫杉醇对多种实体瘤显示出良好的作用。因而，可以通过紫杉醇探索细胞活性的未知领域和发现新的抗癌药物的新方法。
在上述实施例的基础上，S4具体包括：依据预设配比，将胶原蛋白I型溶液、改良伊格尔培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合形成聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合；趋化因子为完全培养基中的胚牛血清。
根据本公开的实施例，在铺满细胞层的微电极阵列上形成聚合水凝胶，包括：以乙酸溶液稀释高浓度的type I collagen(Coll I)到预设浓度；依据预设配比，将稀释后的type I collagen(Coll I)溶液、DMEM培养基、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、氢氧化钠溶液(NaOH)进行混合形成聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上(4℃)保持并混合，以防止typeI collagen单体自聚。
在本公开的实施例中，所谓聚合水凝胶可以是经自组装纤维化过程形成的具有体内细胞外基质(ECM)的许多纳米和微观结构特征的type I collagen凝胶，具体可以通过原位自组装纤维化过程形成。
表1 type I collagen凝胶的制备配方组成
Figure BDA0002958255280000081
Figure BDA0002958255280000091
依据上述表1，可以分别进行不同配比Coll I水凝胶的制备。具体地，可以按照上述表1中不同序号对应的配比称取浓度为8.9～10.9mg/mL的type I collagen、摩尔浓度为0.02mol/L的乙酸溶液、浓度为1×的DMEM培养基、浓度为10×的磷酸盐缓冲盐溶液、摩尔浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，将其涡旋均匀混合，即可得到混合水凝胶。
根据本公开的实施例，在上述原位自组装纤维化过程前，称取或配制的乙酸的溶液的摩尔浓度可以为0.02mol/L；高浓度的Coll I的浓度可以为8.9～10.9mg/mL；DMEM培养基的浓度可以为1×；磷酸盐缓冲盐溶液的浓度可以为10×；以及氢氧化钠的溶液的摩尔浓度可以为0.5mol/L。
在上述实施例的基础上，稀释后的胶原蛋白I型的预设浓度为3～5.6mg/mL；依据预设配比混合后的溶液中胶原蛋白I型的终浓度为2～4.5mg/mL；依据预设配比混合后的溶液pH中和至7.3～7.5。
其中，乙酸溶液可以稀释高浓度的type I collagen(Coll I)到预设浓度；氢氧化钠溶液可以中和依据预设配比混合后的溶液pH至7.3～7.5。
根据本公开的实施例，关于经原位自组装纤维化过程形成type I collagen凝胶，具体地，可以依据如下制备过程形成，包括：将上述称取的各组成材料或溶液进行混合之后，快速超声振荡30s，用移液枪吸取1mL溶液快速滴于芯片皿中，以替换含0.5％FBS的培养基，同时覆盖附着在微电极阵列上的MDA-MB-231或MDA-MB-436细胞，注意避免在溶液中引入气泡，所有试剂均在冰上(4℃)保持并混合以防止type I collagen单体自聚；以及迅速将导电芯片皿转移至37℃5％CO295％湿度的细胞培养箱中成胶3h，经自组装纤维化过程制备适于群体细胞侵袭的三维CollI凝胶。接着用完全培养基浸没Coll I凝胶的顶部，以防止凝胶脱水，并以完全培养基中的10％FBS作为趋化因子，当胚牛血清(FBS)扩散后沿凝胶薄层产生趋化因子梯度，从而诱导三维基质中群体细胞侵袭。
在本公开的实施例中，进一步地，对成胶后的type I collagen凝胶纤维进行NHS-Rhodamine荧光标记，以表征三维Coll I基质的拓扑形貌特征。所使用的荧光标记蛋白试剂为摩尔浓度50μ mol/L的NHS-Rhodamine(5-(and-6)-carboxytetramethylrhodaminesuccinimidyl ester，简称5(6)-TAMRA-SE)溶液。将NHS-Rhodamine粉末取出回温至室温，用1mL DMSO溶解25mg NHS-Rhodamine，充分超声振荡混匀即得到47.39mmol/L的储存液，使用前用1×PBS溶液稀释上述储存液至工作液浓度(50μmol/L)。为了可视化和分析拓扑参数，将三维Coll I基质在室温下用50μmol/L的NHS-Rhodamine染色1h并用1×PBS溶液漂洗3次，每次3min。通过激光共聚焦扫描显微镜以20×物镜4×zoom对三维Coll I基质成像。所获取的图像为12位深，分辨率为1024×1024像素，垂直堆栈大小为41张图像(相当于20μm)。所获取图像的体素尺寸为0.15×0.15×0.5μm(x×y×z)。在厚度约90μm Coll I凝胶层的近似垂直中心位置处获得堆叠。其中，Coll I纤维荧光标记结果如图7-a、b、c、d所示，可见随着Coll I单体浓度的升高，自组装获得的纤维增多。
在本公开的实施例中，通过实验室自定义编写的MATLAB脚本定量分析了不同浓度Coll I凝胶的拓扑参数，以计算基质的平均孔径尺寸和孔径分布。上述MATLAB脚本包括3个主要部分，即腐蚀算法，像素数和具有旋转高斯拟合的自相关算法。通过二进制转换和图像分割，再用腐蚀算法即可获得平均孔径大小及孔径分布。进行了3次独立的实验，每次至少对每个Coll I凝胶的4个位置做拓扑分析。定量拓扑分析的结果如图7-e、f所示，与纤维荧光染色后共聚焦显微镜扫描的图片结果相一致，即随着Coll I浓度的增加会有更小的孔径分布，平均孔径尺寸也相应降低。已知细胞命运是由来自细胞外基质的线索触发的，包括其化学，生物学和物理特性。特别地，机械和拓扑性质越来越被认为是重要的信号。本公开的实施例为拓扑定义的Coll I蛋白提供了一个易于访问的仿生体外平台，以在体外各种条件下解剖细胞行为。
根据本公开的实施例，以完全培养基中的10％FBS作为趋化因子，诱导细胞在三维凝胶基质中侵袭。趋化因子FBS在三维Coll I凝胶基质中产生梯度分布，肿瘤细胞由于趋化性会沿着趋化因子的浓度梯度朝浓度高的部位定向移动。细胞沿着以及通过3D细胞外基质(ECM)的迁移对于组织形成和再生，免疫细胞运输以及包括肿瘤入侵和转移在内的疾病至关重要。在高度突出的“前导细胞”的引导下，细胞可以通过维持细胞间的粘附而群体侵袭，也可以单细胞侵袭。侵袭性细胞采用间质运动和变形运动。3D ECM中，间质运动的标志是纺锤状形态和相对较慢的迁移速率(0.1至1μm/min)，ECM支架与细胞之间相互作用的黏着斑介导细胞牵引力，以及迁移过程中蛋白水解重塑ECM结构的能力。变形运动的特点是椭圆形的细胞形态，它们优先以比间质运动高10到40倍的速度穿过松散的间质组织，缺乏与基质的黏着斑，并且在迁移时不进行细胞周蛋白水解。群体细胞侵入组织是一个循环的五步过程，其次级适应反应取决于细胞的分子特性和所处ECM的生理条件。细胞极化和初始突起后(步骤1)，新形成的前缘附着在ECM纤维上(步骤2)，随后细胞表面局部的蛋白水解作用降解了下层或周围的ECM，从而为前进的细胞体生成空间(步骤3)。伴随地，肌动球蛋白收缩导致局部牵引和力的产生，使细胞体和ECM均变形(步骤4)，其随着细胞尾部附近的粘附键的翻转而后缘回缩(步骤5)。因此，肿瘤的扩散与ECM的生化，机械和结构变化有关，推测这些变化会影响侵袭性癌细胞的迁移，了解这些变化影响肿瘤细胞行为的机制至关重要。
在上述实施例的基础上，S5具体包括：以输出频率为10kHz～100kHz、输出正弦电压为10mV～30mV对抗肿瘤药物作用后三维基质中正在进行群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量；获取定量的细胞阻抗信息是以在水凝胶加入趋化因子为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，以获得不同频率不同时间点的细胞阻抗值。
进行细胞阻抗检测，包括：以输出正弦电压为10mV～30mV、输出频率为10kHz～100kHz的两端法阻抗测量模式(2-Terminal Impedance Measurement，简称2-Term Z)对三维基质中不同浓度PTX作用的群体细胞侵袭过程进行扫频测量，以获得不同频率下细胞阻抗值；获取细胞阻抗信息是以在Coll I凝胶中加入完全培养基为零时刻，进行多时间段的阻抗扫频测量，其中，阻抗扫频测量的时间间隔分别为10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min。对相应时间点和检测频率值采集到的阻抗信息进一步用实验室自定义编写的MATLAB脚本分析处理，以相对阻抗值变化即细胞指数(Cell index，简称CI)表征三维基质中群体细胞随时间的侵袭距离，细胞指数越大表示细胞在三维基质中的侵袭距离越大。细胞指数(CI)根据如下公式计算：
Figure BDA0002958255280000121
其中，N是阻抗测量所设频率点的数目，Rt(fi)和R0(fi)是t时刻和零时刻导电芯片取决于频率的阻抗值。对接种了40×104MDA-MB-231细胞用不同浓度PTX处理后诱导群体细胞侵袭的导电芯片进行阻抗扫频测量，使用10kHz～100kHz频率范围进行扫频，步长为1kHz，施加的正弦电压为30mV。其中，结果如图8所示，在相同的时间点，随着PTX浓度的增加，细胞指数(CI)逐渐降低；当PTX浓度相同时，随着侵袭时间的增加，CI趋于平台稳定期。
在上述实施例的基础上，S5中根据阻抗信息进行药物筛选具体包括：获取不同频率下细胞阻抗值，以相对阻抗值变化表征三维基质中群体细胞随时间的侵袭距离，进而得到细胞侵袭过程的信息，由此进行药物筛选。
通过与阻抗谱仪电连接进行细胞阻抗检测，获取定量的细胞阻抗信息。应用ECIS技术检测不同的细胞系会得到不同的细胞增殖图谱，可基于细胞粘附、形态及生长等表型特点进行高通量的药物筛选。应用ECIS技术检测不同作用机制的细胞生长抑制剂可获得特征性细胞效应图谱，从而可在大规模筛选中预测药物的作用机制。ECIS技术检测的化合物药效特征与传统终点法具有良好的相关性。将某一化合物的细胞效应图谱与诱导凋亡的动力学特点相比，两种分析方法的结果具有良好的一致性，即ECIS可为终点法检测提示最优检测时间。ECIS技术为化合物筛选提供高通量、长时效的方法，并为不同生物学功能的化合物进行基于作用机制的聚类分析。
下面以一活细胞示踪探针荧光标记后进一步通过显微镜表征细胞在三维凝胶基质中侵袭距离的实施例以验证本公开方法的有效性。
进一步地，对加药作用后的肿瘤细胞进行了传统的Boyden小室实验，以评价紫杉醇对乳腺癌细胞侵袭性的影响。将标准型Matrigel在4℃过夜融化，在冰上用4℃预冷的无血清培养基按1∶8比例稀释Matrigel，在小室上室底部中央垂直加入100μL稀释后的Matrigel，注意避免产生气泡，37℃的细胞培养箱中温育4h使其干成胶状，使用前进行基底膜水化。以0.25％的Trypsin-EDTA溶液消化加药作用2h的乳腺癌细胞，用无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×104/mL。取100μL细胞悬液加入上室，24孔板的下室中加入700μL含20％FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液与小室间避免有气泡产生，继续在孵箱中培养24h。用镊子小心取出小室，吸干上室液体，转移到预先加入800μL多聚甲醛(paraformaldehyde，简称PFA)的孔中，室温固定30min。取出小室，吸干上室的固定液，转移到预先加入约800μL 0.1％的结晶紫溶液的孔中，室温染色30min。轻轻用DPBS冲洗浸泡3次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。在显微镜下随机取9个视野计算，统计结果。其中，细胞侵袭结果如图6所示，图6-a为小室下侧面的实物图，图6-b为倒置显微镜IX41下穿过8μm孔径聚碳酸酯膜的细胞染色图，图6-c为不同浓度紫杉醇作用后侵袭细胞数目的统计结果图。因此，可见随着紫杉醇浓度的升高，消化Matrigel后穿过8μm孔径聚碳酸酯膜的细胞数量也就越少，也即细胞的侵袭性逐渐降低。此传统终点检测法的结果有待与ECIS技术检测的化合物药效特征做进一步对比。
在本公开的实施例中，也对加药作用后的肿瘤细胞进行了MTT细胞毒性实验，以评价紫杉醇对乳腺癌细胞活性的影响。用5mL MTT溶剂溶解25mg MTT，配制成5mg/mL的MTT溶液。在96孔板中每孔加入5000个细胞，按照实验需求，先用完全培养基培养24h后用含0.5％FBS的培养基继续饥饿处理24h。以浓度梯度为10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L的紫杉醇溶液及对照组作用2h后，每孔加入10μL MTT溶液，在细胞培养箱中继续孵育4h。每孔加入100μLFormazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan完全溶解。通常37℃孵育3～4h左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大，溶解的时间会长一些，此时为了加速溶解可以适当摇晃数次。用酶标仪在570nm处测定吸光度，图6-d为不同浓度紫杉醇作用后吸光度值(细胞活性)统计结果图。因此，可见随着紫杉醇浓度的升高，细胞的活性逐渐降低。
根据本公开的实施例，对加药作用后的肿瘤细胞用活细胞示踪探针荧光标记，包括：吸除含不同浓度紫杉醇的培养基；用DPBS清洗细胞2次；轻轻加入37℃预热的探针工作液；于37℃5％CO2孵箱条件下孵育45min；换用新鲜含0.5％FBS的培养基继续培养30min，用于后续细胞层上形成适于肿瘤侵袭模型的type I collagen凝胶。
在本公开的实施例中，探针工作液为浓度5～25μmol/L的绿色活细胞示踪探针(Cell-Tracker Green，简称CMFDA)溶液。将CMFDA粉末取出回温至室温，短暂离心以保证粉末落入管底，用10.8μL DMSO溶解50μg CMFDA，充分混匀即得到10mmol/L的储存液。使用前用无血清培养基稀释上述储存液至工作液浓度(5～25μmol/L)，并将探针工作液于37℃预热。CMFDA试剂是可透过活细胞膜自由扩散的荧光氯甲基衍生物。进入细胞后，这些温和的硫醇反应性探针就会与细胞内组分反应，形成可在上样后存活至少24h的荧光细胞，以用于后续三维基质中群体细胞侵袭的追踪。
通过激光共聚焦显微镜定量表征细胞在三维凝胶基质中侵袭距离和速度。利用成像软件进行多点层扫模式的延时共聚焦成像和三维重建，所测细胞在三维凝胶基质中的侵袭距离为Z方向上侵袭距离。Coll I凝胶成胶3h后加入完全培养基以浸没Coll I凝胶，并立即转移至激光共聚焦显微镜的载物台培养器中，设置成像软件的多点层扫模式。将微电极阵列的导电芯片表面设为0μm处，每次选取4个不同的(x，y)位点，扫描方向设为向上，以10μm的Z间隔捕获图片，扫描间距总长为300μm，其中，激光共聚焦显微镜采用10×物镜，488通路进行多点层扫；以及以此时刻为零时刻，设置延时共聚焦成像的时间间隔为30min，时间总长为3h，共计7个时间点，至少进行3个独立的样本实验。其中，载物台培养器为MDA-MB-231或MDA-MB-436细胞的培养提供温度为37℃，CO2浓度为5％的环境控制。
在本公开的实施例中，上述经多点层扫模式的延时共聚焦成像获得的二维的图片栈，可通过实验室自定义编写的MATLAB脚本定量计算细胞层所在Z方向上的侵袭距离和速率，包括：使用MATLAB脚本计算图片栈中每一张图片的灰度值，通过插值法进行曲线拟合从而获得不同Z轴位置对应灰度值曲线，灰度峰值所在位置即为当前细胞层在三维Coll I凝胶中Z方向上侵袭距离；通过将细胞层的侵袭距离除以其对应的时间，即获得细胞层在该时间段内的平均侵袭速率。结果如图9所示，图9-a为不同浓度PTX加药作用的MDA-MB-231细胞在不同时间所对应的Z方向上侵袭距离，图9-b为不同浓度PTX加药作用的MDA-MB-231细胞在不同时间段内所对应的Z方向上的平均侵袭速率，其中，Coll I凝胶所采用的单体浓度为2.5mg/mL。在图9-a中，在相同的时间点，随着所施加PTX浓度的增加，细胞在Z方向上的侵袭距离递减，也即细胞的侵袭性逐渐降低，此结果与Boyden小室实验的终点计数结果相一致；在图9-b中，在相同的时间段内，PTX浓度越高，平均侵袭速率越低，就单一PTX浓度而言，总的趋势是侵袭过程开始时段速率快，后半部分速率慢。
CI的检测结果与图9定量表征细胞层的侵袭距离结果相吻合，基于阻抗的动态检测细胞侵袭性与相应的Boyden小室实验终点细胞计数及MTT法得到的结果一致。因此，本公开的细胞阻抗传感系统能完成抗肿瘤药物作用后群体细胞在三维基质中迁移和侵袭中的监测应用，从而用于抗肿瘤药物的定量筛选。
本公开公开了一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物定量筛选方法。具体而言，本公开以不同浓度PTX作用于肿瘤细胞，制备了适于肿瘤侵袭模型的Coll I凝胶，进一步加入趋化因子以诱导群体细胞在三维基质中的侵袭，将具有上述Coll I凝胶的导电芯片与阻抗谱仪联用构建细胞阻抗传感检测系统和在线分析系统，实现了三维基质中抗肿瘤药物作用的群体细胞侵袭过程中细胞阻抗信息的实时、无标记监测，从而获得了抗肿瘤药物的定量筛选新方法。相比于传统的Boyden小室实验终点计数法，本公开的这种加药作用后细胞侵袭的实时监测方法，提供了药物作用机理、药物细胞毒性作用的脱靶效应等方面的重要信息。与使用荧光、放射性同位素、发光或光吸收的经典检测方法不同，本公开所使用的无标记检测无需使用标记分子即可直接测量细胞功能，其优点包括简单的均相测定形式，无创测量，对正常细胞功能的干扰较小，动力学测定以及缩短测定开发时间。开发了更有信息性的加药作用后肿瘤细胞侵袭的3D体外分析方法，使药物筛选具有定量性和无标记，这可能推动目前细胞水平药物筛选方法的发展。本公开所公开的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物定量筛选方法，不仅对于细胞水平药物筛选和临床药物毒性检测具有重要的意义，而且拥有重要的商业推广价值，有望在新药筛选、药物安全性评价等方面发挥特点作用，产生良好的社会和经济价值。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，包括：
S1，对设有微电极阵列的导电芯片进行表面处理；
S2，在所述导电芯片表面铺设肿瘤细胞；
S3，对所述肿瘤细胞进行饥饿处理及其后的加药作用；
S4，在所述肿瘤细胞上形成聚合水凝胶并加入趋化因子；
S5，实时进行细胞阻抗检测，获取所述细胞的阻抗信息，根据所述阻抗信息进行药物筛选。
2.根据权利要求1所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述S1具体包括：
以甲醇清洗所述导电芯片；
以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的导电芯片表面修饰氨基；
以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对所述导电芯片表面修饰酸酐基团。
3.根据权利要求2所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述甲醇为无水甲醇，清洗次数至少为2次；
所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的配比为3-氨基丙基三乙氧基硅烷∶丙酮＝3∶25～4∶25；
所述聚(苯乙烯-co-马来酸酐)为重均分子量2000～3000，质量百分比0.14～0.15％的酸酐共聚物，其酸酐溶液配比为聚(苯乙烯-co-马来酸酐)∶丙酮＝0.9∶2～1.1∶2。
4.根据权利要求2所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述S2具体包括：
所选肿瘤细胞系为人乳腺癌细胞；
将所述肿瘤细胞悬液接种到表面预处理后的导电芯片上，以完全培养基培养。
5.根据权利要求4所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述S3具体包括：
用含胚牛血清的培养基饥饿处理细胞，
用杜氏磷酸盐缓冲液清洗细胞；
以不同浓度的紫杉醇溶液对饥饿处理后的细胞进行加药作用。
6.根据权利要求5所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述含胚牛血清的培养基为添加了青霉素链霉素混合双抗的改良伊格尔高糖培养基；
所述不同浓度的紫杉醇溶液为浓度范围为10nmol/L～30nmol/L。
7.根据权利要求5所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述S4具体包括：
依据预设配比，将胶原蛋白I型溶液、改良伊格尔培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合形成聚合水凝胶，
其中，所有试剂均在冰上保持并混合；
所述趋化因子为完全培养基中的胚牛血清。
8.根据权利要求7所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述稀释后的胶原蛋白I型的预设浓度为3～5.6mg/mL；
所述依据预设配比混合后的溶液中胶原蛋白I型的终浓度为2～4.5mg/mL；
所述依据预设配比混合后的溶液pH中和至7.3～7.5。
9.根据权利要求1所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述S5具体包括：
以输出频率为10kHz～100kHz、输出正弦电压为10mV～30mV对抗肿瘤药物作用后三维基质中正在进行群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量；
所述获取定量的细胞阻抗信息是以在所述水凝胶加入趋化因子为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，以获得不同频率不同时间点的细胞阻抗值。
10.根据权利要求9所述的基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法，其特征在于，所述S5中根据所述阻抗信息进行药物筛选具体包括：
获取不同频率下细胞阻抗值，以相对阻抗值变化表征三维基质中群体细胞随时间的侵袭距离，进而得到所述细胞侵袭过程的信息，由此进行药物筛选。
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