CN115558598A - 基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法 - Google Patents

基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，可应用于生物芯片传感检测技术领域。该方法包括：制备高通量力电耦合芯片；对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养；在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系；测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值；基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪。本公开通过将趋化因子作用于肿瘤细胞，诱导三维细胞外基质中群体细胞在不同力学性能的I型胶原蛋白凝胶中侵袭，有效实现了三维基质中细胞侵袭过程中高效稳定的细胞阻抗传感检测，使得三维群体细胞侵袭定量追踪达到了实时、无标记、持续动态检测的技术效果。

Description

基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法
技术领域
本公开涉及生物芯片传感检测技术领域，尤其涉及一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法。
背景技术
生物有机体内的细胞生活在多物理场耦合的环境中。受多因素驱动的细胞定向迁移与细胞外基质微环境的各种特征密切相关，如化学梯度、机械刚度梯度、配体浓度梯度、基质排列的微观结构、细胞外电场和磁场刺激等。群体细胞在三维细胞外基质中的迁移不仅是各种正常生理过程所必需的，如胚胎发育、机体免疫功能、伤口的愈合和再生，也在各种病理过程中发挥关键作用，包括恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。离开原发肿瘤，侵入周围的细胞外基质是恶性肿瘤细胞侵袭的关键步骤。同样重要的是转移的步骤，即肿瘤细胞迁移到远处的健康组织，在另一个微环境中形成一个新的肿瘤。然而，到目前为止，这些肿瘤细胞的扩散、侵袭和转移过程仍未被很好地认识。由于所涉及的信号级联的复杂性、相关细胞群的异质性和模型系统的缺陷，仍难以深入理解力学特性与肿瘤形成及肿瘤进展之间的潜在关联机制。体内系统很难在高信息深度下进行研究，体外系统又往往缺乏体内情况的重要仿生参数，如适当的力学参数和维数。由于这一事实，培养在三维仿生基质中的体外细胞研究是一个逐渐兴起的方向，因为它提供了一个更好的表现自然细胞微环境的生理和病理相关条件。
细胞侵袭的检测方法在肿瘤生物学、免疫学、血管生物学、细胞生物学和发育生物学等生物医学研究中具有重要的应用价值。常用的易获得的方法来测量这些过程包括：细胞培养伤口闭合试验，在该试验中，在融合的二维单层细胞上产生划痕，伤口闭合和细胞迁移的速度可以通过用常规倒置显微镜在几个时间间隔拍摄快照来量化，更详细的细胞迁移行为可以使用延时显微镜系统记录；另一种方法是transwell细胞迁移和侵袭试验，该试验测量细胞的运动能力和对化学引诱剂梯度的侵袭能力。以上方法的缺点是二维培养细胞不能模拟细胞在体内三维组织、器官中所居住的复杂三维细胞外微环境，或是终点检测不能实时监测细胞的三维侵袭过程，并且传统的成像技术难以实现三维细胞培养对厚样品中细胞行为的动态和无标记监测。然而，基于力电耦合芯片的细胞阻抗传感技术(ElectricCell Impedance Sensing，ECIS)是一种基于电子阻抗的实时细胞检测系统，可通过细胞粘附、形态及迁移等表型特点进行三维基质微环境中群体细胞侵袭的实时无标记定量追踪。
发明内容
有鉴于此，本公开的主要目的在于提供了一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，以解决传统体外系统不能模拟体内细胞所居住的复杂三维细胞外微环境，进而大大局限了重要仿生参数的全程动态收集等技术问题。
根据本公开的一个方面，提供了一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，该方法包括：
制备高通量力电耦合芯片；
对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养；
在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系；
测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值；以及
基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪。
根据本公开的实施例，所述制备高通量力电耦合芯片的步骤，包括：采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列；以及将具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃与无底细胞培养孔板、印刷电路板组装为高通量力电耦合芯片。
根据本公开的实施例，所述采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列的步骤之前，还包括：在auto-CAD软件上绘制所设计的叉指电极阵列图案；其中，所述叉指电极阵列图案中单个电极的长度和宽度分别为7mm和100μm，相邻电极之间的间隙为100μm。
根据本公开的实施例，所述采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列，包括：将auto-CAD所设计的叉指电极阵列图案直接导入到导电薄膜激光刻蚀机设备中，设置固体激光器的激光波长为1064nm，刻印速率为1000mm/s，激光频率为40kHz，对氧化铟锡导电玻璃进行干法激光蚀刻，得到具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃。
根据本公开的实施例，所述将具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃与无底细胞培养孔板、印刷电路板组装为高通量力电耦合芯片，包括：
使用聚二甲基硅氧烷预聚物组分将无底细胞培养孔板粘在具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃上；以及
将设计有电路的印刷电路板通过插针引脚连接到氧化铟锡导电玻璃的氧化铟锡电极上，组装获得高通量力电耦合芯片。
根据本公开的实施例，所述对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养的步骤，包括：以甲醇清洗导电芯片；以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗后的导电芯片表面修饰氨基；以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对导电芯片表面修饰酸酐基团；将肿瘤细胞悬液接种到表面预处理后的导电芯片上，以完全培养基培养，其中肿瘤细胞系为人乳腺癌细胞。
根据本公开的实施例，所述在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系的步骤，包括：依据预设配比，将I型胶原蛋白溶液、改良伊格尔培养基、10×磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合，铺在肿瘤细胞层的上方形成不同力学性能的聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合；以及在37℃的细胞培养箱中成胶后，加入完全培养基构建三维细胞培养体系，其中所用趋化因子为完全培养基中的胚牛血清。
根据本公开的实施例，所述稀释后的I型胶原蛋白的预设浓度为3～5.6mg/mL；所述依据预设配比混合后的溶液中I型胶原蛋白的终浓度为2.5～4mg/mL；所述依据预设配比混合后的溶液pH值中和至7.3～7.5。
根据本公开的实施例，所述测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值的步骤，包括：将高通量力电耦合芯片与电子阻抗分析仪电连接，以输出频率为10kHz～100kHz、输出正弦电压为10mV～30mV对三维细胞培养体系中正在进行群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量；以及获取定量的细胞阻抗信息是以在水凝胶加入趋化因子为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，以获得不同频率不同时间点的细胞阻抗值。
根据本公开的实施例，所述基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪的步骤，包括：基于不同频率下细胞阻抗值，以相对阻抗值变化表征三维细胞培养体系中群体细胞随时间的侵袭距离，进而得到细胞侵袭过程的位置信息，由此实现三维细胞侵袭实时定量追踪。
本公开实施例提供的这种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，通过将趋化因子作用于肿瘤细胞，诱导三维细胞外基质中群体细胞在不同力学性能的I型胶原蛋白凝胶中侵袭，有效实现了三维基质中细胞侵袭过程中高效稳定的细胞阻抗传感检测，使得三维群体细胞侵袭定量追踪达到了实时、无标记、持续动态检测的技术效果。
附图说明
通过以下参照附图对本公开实施例的描述，本公开的上述内容以及其他目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1示意性示出了根据本公开实施例的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法的流程图；
图2示意性示出了根据本公开实施例的激光刻蚀机干法蚀刻所制备的高通量力电耦合芯片的叉指电极阵列图；
图3示意性示出了根据本公开实施例的高通量力电耦合芯片实物图及其组装过程的流程示意图；
图4示意性示出了根据本公开实施例的不同力学性能的I型胶原蛋白凝胶的纤维结构扫描电镜图；
图5示意性示出了根据本公开实施例的不同力学性能的I型胶原蛋白凝胶的原子力显微镜力学表征的力-位移曲线图；
图6示意性示出了根据本公开实施例的定量追踪群体细胞在三维细胞外基质中侵袭的动态结果图。
具体实施方式
以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
肿瘤侵袭是一个细胞和组织驱动的过程，物理、细胞和分子决定因素参与反应到整个疾病的发展过程中。肿瘤侵袭是由信号通路启动和维持的，这些信号通路控制肿瘤细胞的细胞骨架动力学、细胞-基质和细胞-细胞连接的转换，随后细胞迁移到邻近组织。细胞-基质和细胞-细胞粘附、蛋白酶和细胞因子系统，它们是癌细胞组织入侵的基础。肿瘤细胞和周围组织结构的相互重编程不仅引导了侵袭，而且产生了不同的扩散模式。由此产生的“可塑性”有助于产生多样化的肿瘤侵袭途径和程序，增强肿瘤的异质性，并最终维持转移性扩散。
长期以来，研究人员一直试图在细胞水平上更好地理解肿瘤的增殖和侵袭。在研究肿瘤的侵袭性时，不能忽视肿瘤对周围微环境的影响。对于旨在研究这种现象的体外研究，必须经常使用生物材料来模拟周围的肿瘤微环境。细胞侵袭检测通常使用transwell腔设计，其中多孔膜涂有生物材料，如基质凝胶，以代表细胞外基质。评估细胞在生物材料中的迁移，以确定将细胞接种在凝胶顶部后细胞的侵袭能力。或者，可以通过在生物材料中植入肿瘤细胞或肿瘤球体作为真正的三维培养系统来研究细胞与基质的相互作用进而评估细胞侵袭。然而，与此同时，位于侵袭性肿瘤细胞附近的部分周围物质会受到向内的牵引力。因此，细胞侵袭以及降解细胞外基质的能力是侵袭-转移级联反应的一个关键方面，并且受到细胞外微环境的显著影响。
三维体外分析技术的发展可以区分更多的侵袭性或迁移表型，可以增强评估药物效力、常规生化和免疫学检测的潜在指标。然而，到目前为止，稳定的细胞三维侵袭模型的开发很少受到关注，现有的三维侵袭分析通常侧重于单个细胞的行为，例如体外培养的成纤维细胞或癌细胞。引导单个细胞侵袭的机制已被充分理解，包括趋化可溶性因子或触觉组织锚定因子的化学指导和物理指导。这些指导机制原则上也适用于群体细胞运动，而不同形式的群体侵袭背后的机制则不太为人所知。开发更具信息量的肿瘤细胞侵袭和迁移的三维体外分析方法，可进行动态分析，提高重复性，推进目前用于评估恶性肿瘤细胞侵袭状态，进一步服务于精确医学和个性化医疗。
本公开的实施例提供一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，如图1所示，该方法包括：
步骤S1：制备高通量力电耦合芯片；
步骤S2：对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养；
步骤S3：在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系；
步骤S4：测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值；
步骤S5：基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪。
根据本公开的实施例，将上述公开的通过I型胶原蛋白凝胶构建三维细胞培养体系的高通量力电耦合芯片与阻抗谱仪电连接，构建一细胞阻抗实时传感系统，对不同力学性能、不同孔径三维细胞外基质中的群体细胞侵袭进行实时定量的细胞阻抗检测。具体地，在阵列化导电芯片的微电极上接种肿瘤细胞，待细胞长满对细胞进行饥饿处理后在细胞层上经自组装纤维化过程制备了不同刚度的适于肿瘤侵袭模型的I型胶原蛋白凝胶；然后将阻抗谱仪通过插针引脚经金属夹片与待检测细胞所在的检测电极(即细胞阻抗传感芯片)相连，以测量待检测细胞的阻抗值；根据获取细胞的阻抗信息与侵袭距离的指数函数关系能进一步确定细胞的侵袭距离，从而进行三维细胞侵袭实时定量追踪。
图2为激光刻蚀机干法蚀刻所制备的高通量力电耦合芯片的叉指电极阵列图。图3为高通量力电耦合芯片实物图及其组装过程的流程示意图，具体包括：使用20∶1(主剂：固化剂)的聚二甲基硅氧烷预聚物组分将无底细胞培养板粘在具有微电极阵列结构的氧化铟锡导电玻璃上；设计有电路的印刷电路板通过插针引脚连接到制作好的氧化铟锡电极上，组装获得高通量微电极阵列芯片。
在本公开实施例中，步骤S1中所述制备高通量力电耦合芯片的步骤，包括：
S11：采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列；
S12：将具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃与无底细胞培养孔板、印刷电路板组装为高通量力电耦合芯片。
在本公开实施例中，步骤S11之前还包括：在auto-CAD软件上绘制所设计的叉指电极阵列图案；结果如图2所示，其中，叉指电极阵列图案总画板的长度和宽度分别为200mm和88mm，包含了48对叉指电极，相邻叉指电极对之间的间隙为13mm；单个电极的长度和宽度分别为7mm和100μm，相邻单电极之间的间隙为100μm。
在本公开实施例中，步骤S11具体包括：将auto-CAD所设计的叉指电极阵列图案直接导入到太阳能钙钛矿电池激光刻蚀机中，设置固体激光器的激光波长为1064nm，刻印速率为1000mm/s，激光频率为40kHz，聚焦光斑小于10μm，CCD自动定位精度为2μm，对氧化铟锡导电玻璃进行飞秒激光刻蚀，得到具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃。通过软件实时调节振镜与直线电机、电动升降工作台的设计，加上真空吸附托盘装置，保证激光刻蚀机在加工运行中的平稳性；打开防尘系统，保证导电玻璃与工作平面的清洁，保证激光刻蚀过程中无残留。
关于上述具有叉指电极阵列图案的导电芯片可以采用氧化铟锡导电玻璃作为该导电芯片的衬底进行制备，该导电芯片还选择其他具有导电薄膜结构的衬底。具体地，导电玻璃的尺寸为250×100×0.4mm，方阻小于6Ω，膜层厚度为185nm，透光率大于85％，膜层颜色为淡蓝色。
在本公开实施例中，步骤S12具体包括：使用20∶1(主剂：固化剂)的聚二甲基硅氧烷预聚物组分将无底细胞培养孔板粘在具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃上，其中，环形结构的内表面和叉指电极阵列所在的导电芯片表面形成细胞培养腔；将设计有电路的印刷电路板通过插针引脚连接到氧化铟锡导电玻璃的氧化铟锡电极上，组装获得高通量力电耦合芯片。
为更好的在具有叉指电极阵列的导电芯片表面制备适于肿瘤侵袭模型的I型胶原蛋白凝胶，同时为形成细胞阻抗传感检测过程中细胞的接种和培养条件，需要在导电芯片的导电面上围绕叉指电极形成细胞培养腔阵列。具体地，在制得叉指电极阵列氧化铟锡导电玻璃芯片之后，通过微精密激光打孔去掉48孔细胞培养板的底，选择无底孔板作为本公开的环形结构，围设导电芯片上的叉指电极阵列粘结在导电芯片上，形成初步的多孔细胞培养腔。其中，粘结剂选择主剂：固化剂＝20：1的聚二甲基硅氧烷粘接剂，48孔细胞培养板的孔直径为10.2mm，生长面积为0.8m2。将粘结完毕的细胞培养腔结构放入70℃烘箱烘干2小时，形成最终的多孔细胞培养腔。
在本公开实施例中，按照高速激光刻蚀工艺制备上述具有叉指电极阵列的导电芯片及其对应的细胞培养腔。其中，结果如图3所示，其中图3-a为具有叉指电极阵列的导电芯片的组装过程，图3-b为用于实时定量追踪三维基质中群体细胞侵袭的高通量力电耦合芯片的实物照片，图3-c为氧化铟锡导电玻璃的叉指电极阵列中的单个叉指电极在荧光倒置显微镜IX71下的局部放大图。在组装过程示意图3-a中，用上下两层具有导电线路的印刷电路板作为夹具以固定粘有细胞培养孔板的氧化铟锡导电玻璃芯片，并通过插针引脚的方式将氧化铟锡导电玻璃的导电面与印刷电路板的导电线路电连接。以及，通过锡焊的方式用电线将印有导电线路的印刷电路板与外部的阻抗谱仪电连接，用于后续的实时定量追踪三维基质中群体细胞侵袭的细胞阻抗传感检测。在局部放大图3-c中，单个电极的长度和宽度分别为7mm和100μm，相邻单电极之间的间隙为100μm。
在本公开实施例中，步骤S2中所述对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养，具体包括：以甲醇清洗导电芯片；以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的导电芯片表面修饰氨基；以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对导电芯片表面修饰酸酐基团；将肿瘤细胞悬液接种到表面预处理后的导电芯片上，以完全培养基培养，其中肿瘤细胞系为人乳腺癌细胞。
在本公开实施例中，需要对光刻有叉指电极阵列的导电芯片进行表面处理，以用于后续在细胞培养腔中形成聚合水凝胶，在I型胶原蛋白凝胶纤维化过程中酸酐基团的存在使得赖氨酸侧链能够共价键合凝胶表面，从而将适于肿瘤侵袭模型的I型胶原蛋白凝胶固定在具有反应性共聚物涂层的导电芯片皿表面。
在本公开实施例中，甲醇为无水甲醇，清洗次数至少为2次；3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液的配比为3-氨基丙基三乙氧基硅烷：丙酮＝3：25～4：25；聚(苯乙烯-co-马来酸酐)为重均分子量2000～3000，质量百分比0.14～0.15％的酸酐共聚物，其酸酐溶液配比为聚(苯乙烯-co-马来酸酐)：丙酮＝0.9∶2～1.1∶2。
采用无水甲醇清洗细胞培养腔2次，每次以摇床100rpm转速清洗3min，氮气吹干。以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂，加入丙酮配制3-氨基丙基三乙氧基硅烷：丙酮＝3：25溶液对预清洗的细胞培养腔表面修饰氨基。具体地，可以在10.2mm内径的细胞培养腔中加入200μL上述溶液，不加盖置于通风橱中等待1h彻底自然晾干，此时，细胞培养腔底部呈现白色。然后，用去离子水清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干。再将聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液以低速300rpm 20s旋涂在修饰了氨基的细胞培养腔表面以进一步修饰酸酐基团，配比为聚(苯乙烯-co-马来酸酐)∶丙酮＝1∶2，其中，聚(苯乙烯-co-马来酸酐)为质量百分比0.14％，重均分子量2000～3000的酸酐共聚物。不加盖置于通风橱中等待30min彻底自然晾干，最后用去离子水清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干。
在本公开实施例中，在预处理的导电芯片表面铺满所选肿瘤细胞系细胞，所选的肿瘤细胞系可以为三阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-436。用1×磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞2次后，以0.25％的Trypsin-EDTA溶液消化MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞1min，用血球计数板计数后，将40×104数目的MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞的细胞悬液接种到表面预处理并经紫外灭菌30min以上的细胞培养腔中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中以改良伊格尔高糖完全培养基培养24h，以用于后续肿瘤细胞的饥饿处理及其后的加药作用。
在上述本公开实施例的基础上，进一步地，对细胞培养腔中的肿瘤细胞进行饥饿处理。当所选肿瘤细胞用完全培养基培养24h后，用1×磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞2次后，用含0.5％胚牛血清的培养基饥饿处理细胞24h，此时，芯片皿中的细胞量应该达到90％～100％的饱和度。再用1×磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞2次以除去细胞杂质。
在本公开实施例中，步骤S3中所述在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系，具体包括：依据预设配比，将I型胶原蛋白溶液、改良伊格尔培养基、10×磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合，铺在肿瘤细胞层的上方形成不同力学性能的聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合；在37℃的细胞培养箱中成胶后，加入完全培养基构建三维细胞培养体系，其中所用趋化因子为完全培养基中的胚牛血清。
在本公开实施例中，在铺满细胞层的叉指电极阵列上形成聚合水凝胶，包括：以乙酸溶液稀释高浓度的I型胶原蛋白溶液到预设浓度；依据预设配比，将稀释后的I型胶原蛋白溶液、改良伊格尔培养基、10×磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合形成聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上(4℃)保持并混合，以防止I型胶原蛋白单体自聚。
在本公开实施例中，所谓聚合水凝胶可以是经自组装纤维化过程形成的具有体内细胞外基质的许多纳米和微观结构特征的I型胶原蛋白凝胶，具体可以通过原位自组装纤维化过程形成。
表1I型胶原蛋白凝胶的制备配方组成
Figure BDA0003873461250000111
依据上述表1，可以分别进行不同配比I型胶原蛋白水凝胶的制备。具体地，可以按照上述表1中不同序号对应的配比称取浓度为8.9～10.9mg/mL的I型胶原蛋白原液、摩尔浓度为0.02mol/L的乙酸溶液、浓度为1×的改良伊格尔培养基、浓度为10×的磷酸盐缓冲盐溶液、摩尔浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，将其涡旋均匀混合，即可得到混合水凝胶。
在本公开实施例中，在上述原位自组装纤维化过程前，称取或配制的乙酸的溶液的摩尔浓度可以为0.02mol/L；高浓度的I型胶原蛋白原液的浓度可以为8.9～10.9mg/mL；改良伊格尔培养基的浓度可以为1×；磷酸盐缓冲盐溶液的浓度可以为10×；以及氢氧化钠的溶液的摩尔浓度可以为0.5mol/L。
在本公开实施例中，稀释后的I型胶原蛋白溶液的预设浓度为3～5.6mg/mL；依据预设配比混合后的溶液中I型胶原蛋白的终浓度为2～4mg/mL；依据预设配比混合后的溶液pH值中和至7.3～7.5。
其中，乙酸溶液可以稀释高浓度的I型胶原蛋白原液到预设浓度；氢氧化钠溶液可以中和依据预设配比混合后的溶液pH值至7.3～7.5。
在本公开实施例中，关于经原位自组装纤维化过程形成I型胶原蛋白凝胶，具体地，可以依据如下制备过程形成，包括：将上述称取的各组成材料或溶液进行混合之后，快速超声振荡30s，用移液枪吸取200μL溶液快速滴于细胞培养腔中，以替换含0.5％胚牛血清的培养基，同时覆盖附着在微电极阵列上的MDA-MB-231或MDA-MB-436细胞，注意避免在溶液中引入气泡，所有试剂均在冰上(4℃)保持并混合以防止I型胶原蛋白单体自聚；以及迅速将导电芯片皿转移至37℃5％CO295％湿度的细胞培养箱中成胶3h，经自组装纤维化过程制备适于群体细胞侵袭的三维I型胶原蛋白凝胶。接着用完全培养基浸没I型胶原蛋白凝胶的顶部，以防止凝胶脱水，并以完全培养基中的10％胚牛血清作为趋化因子，当胚牛血清扩散后沿凝胶薄层产生趋化因子梯度，从而诱导三维基质中群体细胞侵袭。
在本公开实施例中，进一步地，对成胶后的I型胶原蛋白凝胶纤维结构进行场发射扫描电子显微镜检测，以表征三维I型胶原蛋白基质的微观拓扑形貌特征。了解准确的细胞外基质的孔径至关重要，因为当孔径低于临界值时，细胞通过空间收缩的能力会急剧下降，变形运动时细胞所承受的空间位阻很大程度增加。此外，网络基质的孔径对细胞的特异性粘附和极化等行为也有很大的影响，因此需要精确测量。扫描电子显微镜显微照片用于在各种放大倍数下可视化I型胶原蛋白凝胶支架的微观孔结构。在扫描电子显微镜成像之前，将聚合的I型胶原蛋白生物聚合物网络经冻干机冷冻干燥，并经液氮淬断得到胶原纤维网络结构断面，然后在20mA的电流下将断裂的表面溅射镀金2min。所有显微照片均在具有钨源的TESCAN MAIA 3型超高分辨率场发射扫描电子显微镜上进行扫描，加速电压为5kV。其中，结果如图4所示，扫描电镜的图像表明，随着I型胶原蛋白凝胶浓度的增加，生物聚合物网络变得更加致密，会有更小的孔径分布，平均孔径也逐渐降低，并且原纤维直径似乎与I型胶原蛋白凝胶的浓度无关，与先前的研究相一致，这很好地模拟了间质组织中胶原基质的体内情况。已知细胞命运是由来自细胞外基质的线索触发的，包括其化学，生物学和物理特性。特别地，机械和拓扑性质越来越被认为是重要的信号。本公开的实施例为拓扑定义的I型胶原蛋白提供了一个易于访问的仿生体外平台，以在体外各种条件下解剖细胞行为。
在本公开实施例中，进一步地，对成胶后的I型胶原蛋白凝胶进行原子力显微镜检测，以表征三维I型胶原蛋白基质的力学性能差异。
I型胶原蛋白基质的有效力学性能很大程度上受支架结构参数的影响。因此，我们使用胶体探针力谱研究了I型胶原网络的力学特性，测量了2.5、3、3.5和4mg/ml的I型胶原基质的弹性模量。在与共聚焦显微镜耦合的Catalyst BioScope上，通过原子力显微镜在1×磷酸盐缓冲盐溶液中重建和探测I型胶原的三维纤维状基质。用双组分聚氨酯胶将聚苯乙烯微球粘在弹性系数为0.08N/m的悬臂梁上，并干燥一夜。通过获取挠度灵敏度和热噪声数据(随后对V形悬臂进行拟合和校正)，在1×磷酸盐缓冲盐溶液中的玻璃上校准单个弹性系数。通过反复使功能化悬臂梁上的微球在相同位置与晶格表面接触(接触力)来测量基体刚度；其中，探针进出回缩距离为14μm；接近速度为10μm/s，采用闭合z形回路。在室温下，1×磷酸盐缓冲盐溶液中，在每个I型胶原基质的3个位置进行了至少16条力-位移曲线的测量，并进行了3次独立实验。作为基质模量的测量，通过使用赫兹模型拟合力-位移曲线的收缩部分来确定三维胶原基质的杨氏模量。在同一位置重复测量表明没有粘塑性行为，因为其产生了相似的力-位移曲线。其中，结果如图5所示，正如扫描电子显微镜分析支架结构所预期的那样，I型胶原基质的模量随着胶原浓度的增加而增加，即浓度为2.5、3、3.5和4mg/ml I型胶原基质的杨氏模量分别为60.2、134.6、161.6和385.6Pa，与在pH值7.4下重构的胶原基质的更小的孔径分布和平均孔径的降低有很好的相关性。因此，尽管在相同温度下重组，但胶原蛋白制剂在原纤维间空间、孔隙率或基质的网格空间尺寸方面存在显著差异，并且在网络刚度方面有适度差异，这与先前的研究相一致。
在本公开实施例中，以完全培养基中的10％胚牛血清作为趋化因子，诱导细胞在三维凝胶基质中侵袭。通过三维细胞外基质进行细胞迁移是胚胎发生、免疫监测和伤口愈合等生理和病理过程的基本特征。有效的运动性取决于细胞突起，粘附和收缩机制的精确协调。但是，三维迁移对局部细胞外信号也很敏感，这些信号可以与已建立的细胞内信号整合，从而影响迁移模式和效率，并通过诱导细胞极性来赋予迁移方向性。定向细胞迁移主要是由于细胞胞外线索的不对称性引起的，其中包括可溶性因子(趋化性)、流体流动(趋流性)、电场(趋电性)、刚度(趋硬性)和粘附配体(趋触性)。值得注意的是，肿瘤的进展与细胞外基质的生化、机械和结构变化有关，推测这些变化会影响侵袭性癌细胞的迁移，因此了解这些变化影响肿瘤细胞行为的机制至关重要。
在本公开实施例中，步骤S4中所述测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值，具体包括：将高通量力电耦合芯片与电子阻抗分析仪电连接，以输出频率为10kHz～100kHz、输出正弦电压为10mV～30mV对不同杨氏模量的三维基质中正在进行群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量；获取定量的细胞阻抗信息是以在水凝胶加入趋化因子为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，以获得不同频率不同时间点的细胞阻抗幅值和相角。
在本公开实施例中，所述进行细胞阻抗检测，包括：以输出正弦电压为10mV～30mV、输出频率为10kHz～100kHz的两端法阻抗测量模式(2-Terminal ImpedanceMeasurement，简称2-Term Z)对不同杨氏模量的三维基质凝胶中的群体细胞侵袭过程进行扫频测量，以获得不同频率下细胞阻抗值；获取细胞阻抗信息是以在I型胶原基质凝胶中加入完全培养基为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，其中，阻抗扫频测量的时间间隔分别为10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min。对相应时间点和检测频率值采集到的阻抗信息进一步用实验室自定义编写的MATLAB脚本分析处理，以相对阻抗值变化即细胞指数(Cell index，简称CI)表征三维基质中群体细胞随时间的侵袭距离，细胞指数越大表示细胞在三维基质中的侵袭距离越大。细胞指数(CI)根据如下公式计算：
Figure BDA0003873461250000151
其中，N是阻抗测量所设频率点的数目，Rt(fi)和R0(fi)是t时刻和零时刻导电芯片取决于频率的阻抗值。对接种了40×104MDA-MB-231细胞在不同杨氏模量的三维I型胶原基质中诱导群体细胞侵袭的导电芯片进行阻抗扫频测量，使用10kHz～100kHz频率范围进行扫频，步长为1kHz，施加的正弦电压为30mV。其中，结果如图6b所示，在相同的时间点，随着I型胶原浓度的增加，细胞指数(CI)逐渐降低；当I型胶原浓度相同时，随着侵袭时间的增加，细胞指数趋于平台稳定期。
在上述实施例的基础上，步骤S5中所述基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪，具体包括：基于不同频率下细胞阻抗值，以相对阻抗值变化表征三维细胞培养体系中群体细胞随时间的侵袭距离，进而得到细胞侵袭过程的位置信息，由此实现三维细胞侵袭实时定量追踪。
通过与阻抗谱仪电连接进行细胞阻抗检测，获取定量的细胞阻抗信息。应用电子细胞基质阻抗传感技术检测不同的细胞系会得到不同的细胞增殖图谱，可基于细胞粘附、形态及生长等表型特点进行高通量的生物信息采集。电子细胞基质阻抗传感技术检测的生物信息特征与传统终点法具有良好的相关性，即电子细胞基质阻抗传感技术可为终点法检测提示最优检测时间。电子细胞基质阻抗传感技术为定量追踪三维基质中群体细胞侵袭提供高通量、长时效的方法，并为不同侵袭能力的肿瘤细胞进行基于作用机制的聚类分析。
下面以一活细胞示踪探针荧光标记后进一步通过显微镜表征细胞在三维凝胶基质中侵袭距离的实施例以验证本公开方法的有效性。
根据本公开的实施例，对加药作用后的肿瘤细胞用活细胞示踪探针荧光标记，包括：吸除含0.5％胚牛血清的培养基；用1×磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞2次；轻轻加入37℃预热的探针工作液；于37℃5％CO2孵箱条件下孵育45min；换用新鲜含0.5％胚牛血清的培养基继续培养30min，用于后续细胞层上形成适于肿瘤侵袭模型的I型胶原蛋白凝胶。
在本公开的实施例中，探针工作液为浓度5-25μmol/L的绿色活细胞示踪探针(Cell-Tracker Green，简称CMFDA)溶液。将绿色活细胞示踪探针粉末取出回温至室温，短暂离心以保证粉末落入管底，用10.8μL DMSO溶解50μg绿色活细胞示踪探针，充分混匀即得到10mmol/L的储存液。使用前用无血清培养基稀释上述储存液至工作液浓度(5～25μmol/L)，并将探针工作液于37℃预热。绿色活细胞示踪探针试剂是可透过活细胞膜自由扩散的荧光氯甲基衍生物。进入细胞后，这些温和的硫醇反应性探针就会与细胞内组分反应，形成可在上样后存活至少24h的荧光细胞，以用于后续三维基质中群体细胞侵袭的追踪。
通过激光共聚焦显微镜定量表征细胞在三维凝胶基质中侵袭距离和速度。利用成像软件进行多点层扫模式的延时共聚焦成像和三维重建，所测细胞在三维凝胶基质中的侵袭距离为Z方向上侵袭距离。I型胶原蛋白凝胶成胶3h后加入完全培养基以浸没I型胶原蛋白凝胶，并立即转移至激光共聚焦显微镜的载物台温控装置中，设置成像软件的多点层扫模式。将微电极阵列的导电芯片表面设为0μm处，每次选取4个不同的(x，y)位点，扫描方向设为向上，以10μm的Z间隔捕获图片，扫描间距总长为300μm，其中，激光共聚焦显微镜采用10×物镜，488通路进行多点层扫；以及以此时刻为零时刻，设置延时共聚焦成像的时间间隔为30min，时间总长为3h，共计7个时间点，至少进行3个独立的样本实验。其中，载物台温控装置为MDA-MB-231或MDA-MB-436细胞的培养提供温度为37℃，CO2浓度为5％的环境控制。
在本公开的实施例中，上述经多点层扫模式的延时共聚焦成像获得的二维的图片栈，可通过实验室自定义编写的MATLAB脚本定量计算细胞层所在Z方向上的侵袭距离和速率，包括：使用MATLAB脚本计算图片栈中每一张图片的灰度值，通过插值法进行曲线拟合从而获得不同Z轴位置对应灰度值曲线，灰度峰值所在Z轴位置即为当前细胞层在三维I型胶原蛋白凝胶中Z方向上的侵袭距离；通过将细胞层的侵袭距离除以其对应的时间，即获得细胞层在该时间段内的平均侵袭速率。结果如图6所示，图6a为不同浓度I型胶原蛋白凝胶中的MDA-MB-231细胞在不同时间所对应的Z方向上侵袭距离，在相同的时间点，随着I型胶原蛋白凝胶浓度的增加，细胞在Z方向上的侵袭距离递减，也即细胞的侵袭性逐渐降低；就单一I型胶原蛋白凝胶浓度而言，总的趋势是侵袭过程开始时段速率快，后半部分速率慢。
细胞指数的检测结果与图6a表征细胞层的侵袭距离结果相吻合。如图6c所示，基于阻抗的动态检测细胞指数(CI)与活细胞示踪探针荧光标记测得的侵袭距离之间具有良好的指数函数关系。因此，本公开的基于细胞阻抗传感的高通量力电耦合芯片能完成群体细胞在不同杨氏模量三维基质中所在位置信息的监测应用，从而用于三维细胞侵袭的实时定量追踪。
本公开提供了一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法。具体而言，本公开制备了适于肿瘤侵袭模型的不同力学性能的I型胶原蛋白凝胶，进一步加入趋化因子以诱导群体细胞在三维基质中的侵袭，将具有上述I型胶原蛋白凝胶的高通量力电耦合芯片与阻抗谱仪联用构建细胞阻抗传感检测系统和在线分析系统，实现了群体细胞在不同拓扑结构、不同力学性能的三维基质中的侵袭过程的细胞阻抗信息的实时、无标记采集，从而获得了细胞侵袭的实时定量追踪新方法。与使用荧光、放射性同位素、发光或光吸收的经典终点检测方法不同，本公开所使用的无标记检测无需使用标记分子即可直接测量细胞功能，其优点包括简单的均相测定形式，无创测量，对正常细胞功能的干扰较小，动力学测定以及缩短测定开发时间。开发了更有信息性的不同力学性能三维细胞外基质中的肿瘤细胞侵袭的三维体外分析方法，使细胞追踪具有定量性和无标记，这可能推动目前细胞侵袭能力测定方法的发展。本公开所提供的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，不仅对于细胞水平迁移和侵袭能力检测具有重要的意义，而且拥有重要的商业推广价值，有望在肿瘤恶性程度评估、药物安全性评价等方面发挥特点作用，产生良好的社会和经济价值。
以上对本公开的实施例进行了描述。但是，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而并非为了限制本公开的范围。尽管在以上分别描述了各实施例，但是这并不意味着各个实施例中的措施不能有利地结合使用。本公开的范围由所附权利要求及其等同物限定。不脱离本公开的范围，本领域技术人员可以做出多种替代和修改，这些替代和修改都应落在本公开的范围之内。

Claims (10)

1.一种基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，该方法包括：
制备高通量力电耦合芯片；
对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养；
在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系；
测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值；以及
基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪。
2.根据权利要求1所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述制备高通量力电耦合芯片的步骤，包括：
采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列；以及
将具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃与无底细胞培养孔板、印刷电路板组装为高通量力电耦合芯片。
3.根据权利要求2所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列的步骤之前，还包括：
在auto-CAD软件上绘制所设计的叉指电极阵列图案；
其中，所述叉指电极阵列图案中单个电极的长度和宽度分别为7mm和100μm，相邻电极之间的间隙为100μm。
4.根据权利要求3所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述采用高速激光刻蚀氧化铟锡导电玻璃制备叉指电极阵列，包括：
将auto-CAD所设计的叉指电极阵列图案直接导入到导电薄膜激光刻蚀机设备中，设置固体激光器的激光波长为1064nm，刻印速率为1000mm/s，激光频率为40kHz，对氧化铟锡导电玻璃进行干法激光蚀刻，得到具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃。
5.根据权利要求4所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述将具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃与无底细胞培养孔板、印刷电路板组装为高通量力电耦合芯片，包括：
使用聚二甲基硅氧烷预聚物组分将无底细胞培养孔板粘在具有叉指电极阵列的氧化铟锡导电玻璃上；以及
将设计有电路的印刷电路板通过插针引脚连接到氧化铟锡导电玻璃的氧化铟锡电极上，组装获得高通量力电耦合芯片。
6.根据权利要求1所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述对该高通量力电耦合芯片进行表面预处理及肿瘤细胞前培养的步骤，包括：
以甲醇清洗导电芯片；
以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗后的导电芯片表面修饰氨基；
以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对导电芯片表面修饰酸酐基团；
将肿瘤细胞悬液接种到表面预处理后的导电芯片上，以完全培养基培养，其中肿瘤细胞系为人乳腺癌细胞。
7.根据权利要求1所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述在肿瘤细胞层上聚合细胞外基质构建三维细胞培养体系的步骤，包括：
依据预设配比，将I型胶原蛋白溶液、改良伊格尔培养基、10×磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液进行混合，铺在肿瘤细胞层的上方形成不同力学性能的聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合；以及
在37℃的细胞培养箱中成胶后，加入完全培养基构建三维细胞培养体系，其中所用趋化因子为完全培养基中的胚牛血清。
8.根据权利要求7所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，
所述I型胶原蛋白溶液在稀释后的预设浓度为3～5.6mg/mL；
所述依据预设配比混合后的溶液中I型胶原蛋白的终浓度为2.5～4mg/mL；
所述依据预设配比混合后的溶液pH值中和至7.3～7.5。
9.根据权利要求1所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述测量细胞阻抗，获取不同频率下细胞阻抗值的步骤，包括：
将高通量力电耦合芯片与电子阻抗分析仪电连接，以输出频率为10kHz～100kHz、输出正弦电压为10mV～30mV对三维细胞培养体系中正在进行群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量；以及
获取定量的细胞阻抗信息是以在水凝胶加入趋化因子为零时刻，进行多时间点的阻抗扫频测量，以获得不同频率不同时间点的细胞阻抗值。
10.根据权利要求1所述的基于高通量力电耦合芯片的三维细胞侵袭定量追踪方法，其特征在于，所述基于不同频率下细胞阻抗值确定三维细胞侵袭距离，实现三维细胞侵袭实时定量追踪的步骤，包括：
基于不同频率下细胞阻抗值，以相对阻抗值变化表征三维细胞培养体系中群体细胞随时间的侵袭距离，进而得到细胞侵袭过程的位置信息，由此实现三维细胞侵袭实时定量追踪。
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