CN112986546A - 一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，包括：S1，制备具有微电极阵列的导电芯片；S2，将环形结构围设于导电芯片四周，形成细胞培养腔；S3，对导电芯片进行表面处理；S4，在细胞培养腔的微电极阵列上铺满细胞及形成聚合水凝胶；S5，实时进行细胞阻抗检测，获取细胞的阻抗信息，进而得到细胞侵袭过程的信息。本公开通过自组装纤维化过程在铺满细胞的微电极阵列导电芯片上制备了适于肿瘤侵袭模型的胶原蛋白I型凝胶，结合阻抗谱仪在线检测系统，有效实现了细胞阻抗传感检测过程中高效稳定的电荷转移，使得三维基质中群体细胞侵袭检测达到了实时、定量、无标记、全程动态分析的技术效果。

Description

一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法

技术领域

本公开涉及细胞阻抗传感检测技术领域，具体涉及一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法。

背景技术

肿瘤的特征是细胞异质性，而导致肿瘤致死率的主要因素是癌扩散。转移过程使肿瘤细胞能够从原发性肿瘤中脱离出来并播种在人体的远处。细胞迁移以及降解细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的能力则是入侵的关键要求，通过开发体外三维(3D)分析技术用以区分更多的侵袭性或迁移性表型，可形成评估药物效价、常规生化和免疫学检测的潜在指标。细胞的群体迁移通常在二维(2D)单层中进行研究，而ECM的生化和物理参数，如弹性、拓扑和维度，控制着细胞行为(如分化、增殖和迁移)，故2D单层培养不能为确定3D迁移提供生理学上的相关背景。了解肿瘤细胞在转移过程中的迁移机制，无疑将有助于设计更好的肿瘤治疗方案。同时，细胞运动的定量描述也有助于对细胞迁移在转移、发育和创伤愈合中的作用有更深入的了解。然而，到目前为止，稳健迁移三维模型的开发还没有得到足够的重视。用于监测细胞迁移和侵袭动态的体外新方法的发展带来了相当大的挑战。精确复制体内ECM环境是开发模型系统的理想目标，为了满足测定的稳健性，此类系统应尽可能地可复制。胶原蛋白I型(type I collagen，缩写为Coll I)是一种普遍存在的基质ECM物种，其很容易从滋养胶原通过自组装重组成纤维网络，是包含在癌症侵袭和迁移模型中的合适候选生物材料。

细胞迁移可以通过几种不同的方法进行评估，包括划痕法、细胞排斥区分析、基于微流体的测定和Boyden小室实验。最广泛接受的细胞迁移技术是Boyden小室实验。通常，将细胞放置在无血清培养基的上室中，并使其通过具有特定孔径的聚碳酸酯膜迁移到有血清或类似化学趋化剂的下室中。经过适当的孵育时间后，将两个隔室之间的膜固定并染色，并确定已迁移到膜下侧的细胞数量。利用上下室之间的趋化因子梯度来驱动细胞的侵袭和迁移的Boyden小室实验，可以通过简单的涂覆过程很容易地适应于特定的ECM(Coll I，Matrigel)化学反应的模型。然而，在这些系统中，利用组织学技术对3D细胞侵袭或迁移机制进行全面评估是困难的，因为这些指标通常局限于膜下侧细胞数量的端点求和，无法满足动态同步监控，人为计数误差较大，重复率低。电子细胞基质阻抗传感(Electricalcell-substrate impedance sensing，ECIS)是一种基于交流阻抗技术的细胞分析方法，其原理是通过测量细胞与基底电极之间的阻抗值变化来评估细胞的生理和病理状态。因为细胞膜的特性使得细胞在电性质上接近绝缘体，所以阻抗会随着电极上细胞的覆盖面积的增加而增大，进而可以测量得到细胞的数据，细胞发生多种生理和病理状态变化均可通过阻抗值的变化来反应。ECIS通过实时、无标记和无损的方式全程动态地监测细胞和电极之间界面的电流变化来研究细胞的各种活动，如附着、增殖、毒性、生长及形态变化等动态生物学过程。本公开则通过将ECIS与Boyden小室实验设计理念相结合，采用最先进的技术提供3D ECM中细胞迁移和侵袭过程中的实时定量的动力学信息。

发明内容

(一)要解决的技术问题

针对上述问题，本公开提供了一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，用于至少部分解决传统Boyden小室实验局限于膜下侧细胞数量的端点求和，进而影响组织学技术对3D细胞侵袭机制的全面评估的技术问题。

(二)技术方案

本公开一方面提供了一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，包括：S1，制备具有微电极阵列的导电芯片；S2，将环形结构围设于导电芯片四周，形成细胞培养腔；S3，对导电芯片进行表面处理；S4，在细胞培养腔的微电极阵列上铺满细胞及形成聚合水凝胶；S5，实时进行细胞阻抗检测，获取细胞的阻抗信息，进而得到细胞侵袭过程的信息。

进一步地，S1具体包括：在导电衬底的导电膜层上形成光刻胶层；在具有光刻胶层的导电衬底上形成光刻胶图案；以及基于光刻胶图案在导电衬底上形成具有导电膜图案的导电芯片，其中，导电膜图案为微电极阵列。

进一步地，S2具体包括：在导电芯片上形成围设微电极阵列的环形结构，其中，环形结构的内表面和微电极阵列所在的导电芯片表面形成细胞培养腔。

进一步地，S3具体包括：以无水甲醇清洗细胞培养腔；以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的细胞培养腔的导电芯片表面进行硅烷化处理；以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对细胞培养腔的导电芯片表面修饰酸酐基团。

进一步地，S4中铺满细胞具体包括：将一定细胞数目的细胞悬液接种到细胞培养腔中，以完全培养基培养；继续使用含有胚牛血清的培养基饥饿处理。

进一步地，S4中形成聚合水凝胶具体包括：以乙酸溶液稀释高浓度的胶原蛋白I型到预设浓度；依据预设配比，将稀释后的胶原蛋白I型、改良伊格尔培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液混合形成聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合。

进一步地，稀释后的胶原蛋白I型的预设浓度为3～5.6mg/mL；依据预设配比混合后的溶液中胶原蛋白I型的终浓度为2～4.5mg/mL；依据预设配比混合后的溶液pH中和至7.3～7.5。

进一步地，S4中还包括：聚合水凝胶经自组装纤维化过程形成的具有纳米和微观结构特征的水凝胶。

进一步地，自组装纤维化过程具体包括：将依据预设配比混合后的溶液吸入细胞培养腔中，以替换含胚牛血清的培养基，同时覆盖附着在导电芯片表面的细胞；以及将细胞培养腔置于一定湿度的细胞培养箱中成胶，经自组装纤维化过程制备适于群体细胞侵袭的三维胶原蛋白I型凝胶。

进一步地，S5具体包括：以输出正弦电压为10mV～30mV、输出频率为10kHz～100kHz对三维基质中群体细胞侵袭的微电极阵列的导电芯片进行扫频测量，以获得不同频率下细胞阻抗值；获取细胞阻抗信息是以在胶原蛋白I型凝胶中加入完全培养基为零时刻，进行多时间段的阻抗扫频测量。

(三)有益效果

本公开实施例提供的一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，通过自组装纤维化过程在铺满细胞的微电极阵列导电芯片上制备了适于肿瘤侵袭模型的type I collagen凝胶，结合阻抗谱仪在线检测系统，有效实现了细胞阻抗传感检测过程中高效稳定的电荷转移，使得三维基质中群体细胞侵袭检测达到了实时、定量、无标记、全程动态分析的技术效果。

附图说明

图1示意性示出了根据本公开实施例用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法的流程图；

图2示意性示出了根据本公开实施例制备具有微电极阵列的导电芯片及细胞培养腔的流程示意图；

图3示意性示出了根据本公开实施例进行表面处理、铺满细胞及形成聚合水凝胶的流程示意图；

图4示意性示出了根据本公开实施例进行细胞阻抗检测的流程示意图；

图5示意性示出了根据本公开实施例细胞阻抗传感芯片的实物图；

图6示意性示出了根据本公开实施例细胞阻抗传感检测的扫频测量获得的相对阻抗值与时间的对应关系图；

图7示意性示出了根据本公开实施例激光共聚焦显微镜表征细胞在三维凝胶基质中侵袭的三维共建图；

图8示意性示出了根据本公开实施例细胞在三维凝胶基质中Z方向上侵袭的距离和速度与时间的对应关系图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

本公开的实施例一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，请参见图1，包括：S1，制备具有微电极阵列的导电芯片；S2，将环形结构围设于导电芯片四周，形成细胞培养腔；S3，对导电芯片进行表面处理；S4，在细胞培养腔的微电极阵列上铺满细胞及形成聚合水凝胶；S5，实时进行细胞阻抗检测，获取细胞的阻抗信息，进而得到细胞侵袭过程的信息。

该阻抗传感方法以具有可三维培养细胞的Coll I凝胶的导电芯片作为检测电极，即细胞阻抗传感芯片，构建一细胞阻抗传感系统对导电芯片上Coll I凝胶中三维培养的群体细胞侵袭进行实时、无标记的高效检测。具体地，在导电芯片的微电极阵列上接种待检测细胞，待细胞长满后在细胞层上经自组装纤维化过程制备了适于肿瘤侵袭模型的Coll I凝胶。然后将阻抗谱仪通过导线经金属夹片与待检测细胞所在的检测电极(即细胞阻抗传感芯片)相连，以测量待检测细胞的阻抗值。

因此，本公开的细胞阻抗传感系统能完成其在三维基质中群体细胞迁移和侵袭中的监测应用。将具有三维培养细胞的Coll I凝胶的ITO导电玻璃芯片与阻抗谱仪构建在线联用系统，可实现对各种细胞迁移的监测。相对于细胞迁移实验中普遍接受的Boyden小室实验，其通过显微镜拍照后用Image J进行终端细胞计数；本公开所提供的细胞阻抗传感系统则可实时定量，动态监测细胞在三维基质中的侵袭过程，保证了细胞的瞬时响应及长时效应的获取，并可扩展应用于细胞治疗杀伤质控、环境毒理、食品毒理评价等研究领域。

在上述实施例的基础上，请参见图2，S1具体包括：在导电衬底的导电膜层上形成光刻胶层；在具有光刻胶层的导电衬底上形成光刻胶图案；以及基于光刻胶图案在导电衬底上形成具有导电膜图案的导电芯片，其中，导电膜图案为微电极阵列。

关于上述具有微电极阵列的导电芯片可以采用ITO导电玻璃作为该导电芯片的衬底进行制备，具体地，该导电芯片还选择其他具有导电薄膜结构的衬底。另外，关于形成具有微电极阵列的导电芯片，具体地，如图2所示，可以依据如下制备过程形成：

旋涂：选取尺寸为40mm×40mm×0.4mm、导电膜层厚度约为185nm的ITO导电玻璃作为导电芯片的衬底，以低速300rpm 20s、高速1000rpm 30s将紫外负性光刻胶旋涂在ITO导电玻璃的导电膜层上，即在导电衬底(ITO导电玻璃)的导电膜层上形成光刻胶层，以为下一步形成光刻胶图案做准备。

前烘：将上述具有光刻胶层的ITO导电玻璃设置在加热板上，以温度110℃对其烘烤60s，以将光刻胶层进行初步固化。

曝光：使用掩膜对准器通过打印的掩膜将进行固化了光刻胶层的ITO导电玻璃暴露于紫外光(UV)下20s。其中，掩膜的使用电极为叉指电极，尺寸可以为长1cm，宽30～100μm，相邻电极间距可以为30～100μm；所用曝光机为：紫外深度光刻机，曝光紫外光强可以为：18mW/cm²，即在具有光刻胶层的导电衬底上形成光刻胶图案。

中烘：将上述进行了曝光操作的具有光刻胶层的ITO导电玻璃设置在加热板上，以温度145℃将曝光后的ITO导电玻璃烘烤60s，以将光刻胶层作进一步固化。

显影：将上述中烘后的ITO导电玻璃浸入光刻胶显影液中显影75s，用去离子水清洗后氮气吹干，再次浸入光刻胶显影液中显影20s，再次水洗吹干以除去上述未被曝光的光刻胶层的部分，以露出未被光刻胶层图案保护的ITO导电膜层。

刻蚀：以比例HCl∶DDI Water∶FeCl3·6H2O＝4L∶1L∶50g配制刻蚀液，其中FeCl₃·6H₂O可以为分析纯，含量≥99.0％。使用上述刻蚀液摇晃刻蚀上述显影后的ITO导电玻璃8min，以除去未被光刻胶层保护的ITO导电膜层，用去离子水清洗后氮气吹干，即基于光刻胶图案在导电衬底上形成具有导电膜图案的导电芯片，其中，导电膜图案为微电极阵列。

去胶：使用光刻胶去胶液超声去除残留的光刻胶8min，用去离子水清洗后氮气吹干以备下一步导电芯片表面预处理。

在上述实施例的基础上，请参见图2，S2具体包括：在导电芯片上形成围设微电极阵列的环形结构，其中，环形结构的内表面和微电极阵列所在的导电芯片表面形成细胞培养腔。

为更好的在具有微电极阵列的导电芯片表面制备适于肿瘤侵袭模型的type Icollagen凝胶，同时为形成细胞阻抗传感检测过程中细胞的接种和培养条件，需要在导电芯片的导电面上围绕微电极阵列形成一细胞培养腔。具体地，在制得微电极阵列ITO导电玻璃芯片之后，选择石英玻璃圆环作为本公开的环形结构，围设导电芯片上的微电极阵列粘结在导电芯片上，形成初步的细胞培养腔。其中，粘结剂选择主剂∶固化剂＝20∶1的PDMS粘接剂，石英玻璃圆环的尺寸为内径27mm、外径30mm、壁厚1.5mm、深10mm。将粘结完毕的细胞培养腔结构放入70℃烘箱烘干，形成最终的细胞培养腔。

按照光刻和湿法刻蚀工艺制备上述具有微电极阵列的导电芯片及其对应的细胞培养腔。其中，结果如图5所示，其中图5-A为用于监测三维基质中群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片的实物照片，图5-B为ITO导电玻璃刻蚀后的整体电极在体式显微镜下的局部放大图，图5-C为ITO导电玻璃的叉指电极阵列在荧光倒置显微镜IX71下的局部放大图，图5-D为ITO导电玻璃的叉指电极阵列在体式显微镜下的局部放大图。在实物照片5-A中，用上下两层具有导电线路的印刷电路板(Printed circuit board，简称PCB)作为夹具以固定粘有细胞培养腔的ITO导电玻璃芯片，并通过锡焊的方式用直径0.2mm铜丝将ITO导电玻璃的导电面与PCB板的导电线路电连接。以及，通过锡焊的方式用电线将印有导电线路的PCB板与外部的阻抗谱仪电连接，用于后续的监测三维基质中群体细胞侵袭的细胞阻抗传感检测。在局部放大图5-C中，橙色条带是ITO玻璃的导电膜层，白色条带是ITO玻璃导电膜层被湿法刻蚀后下层的玻璃，其中叉指电极的宽度为100μm，相邻电极间距为100μm。在局部放大图5-D中，微电极阵列为47对长度为10mm的长条形叉指电极阵列。

在上述实施例的基础上，请参见图3，S3具体包括：以无水甲醇清洗细胞培养腔；以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的细胞培养腔的导电芯片表面进行硅烷化处理；以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对细胞培养腔的导电芯片表面修饰酸酐基团。

具体地，可以依据如下制备过程进行，包括：采用无水甲醇清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干。以3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-AminopropylTriethoxySilane，简称APTES)为硅烷偶联剂，配制APTES∶丙酮＝3∶25溶液对培养腔进行硅烷化处理。具体地，可以在27mm内径的玻璃皿加入405μL上述溶液，不加盖置于通风橱中等待1h彻底晾干。然后，用去离子水清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干。再将聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(Poly(styrene-alt-maleic anhydride)，简称PSMA)溶液以低速300rpm 20s旋涂在培养腔的导电芯片表面以修饰酸酐基团，配比为PSMA-copolymer：丙酮＝1：2，其中，PSMA为质量百分比0.14％，重均分子量2000～3000的酸酐共聚物。不加盖置于通风橱中等待30min彻底晾干，最后用去离子水清洗培养腔2次，每次3min，氮气吹干，用于后续三维基质中群体细胞侵袭的细胞阻抗传感检测。

在上述实施例的基础上，S4中铺满细胞具体包括：将一定细胞数目的细胞悬液接种到细胞培养腔中，以完全培养基培养；继续使用含有胚牛血清的培养基饥饿处理。

具体地，包括：用0.25％的Trypsin-EDTA溶液消化MDA-MB-231细胞1min，用血球计数板计数后，将40×10⁴数目的MDA-MB-231细胞的细胞悬液接种到导电芯片表面预处理的细胞培养腔中，置于37℃5％CO₂细胞培养箱中以完全培养基培养24h；用1×的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline，简称DPBS)清洗MDA-MB-231细胞2次，继续换用含0.5％胚牛血清(FBS)的培养基饥饿处理24h，此时，细胞培养腔中的细胞应该达到90％～100％的饱和度，用于后续细胞层上形成适于肿瘤侵袭模型的type I collagen凝胶。

在上述实施例的基础上，S4中形成聚合水凝胶具体包括：以乙酸溶液稀释高浓度的胶原蛋白I型到预设浓度；依据预设配比，将稀释后的胶原蛋白I型、改良伊格尔培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液混合形成聚合水凝胶，其中，所有试剂均在冰上保持并混合。

表1 type I collagen凝胶的制备配方组成

依据上述表1，可以分别进行不同配比的type I collagen水凝胶的制备。具体地，可以按照上述表1中不同序号对应的配比称取浓度为8.9～10.9mg/mL的type I collagen、摩尔浓度为0.02mol/L的乙酸溶液、浓度为1×的改良伊格尔(DMEM)培养基、浓度为10×的磷酸盐缓冲盐溶液、摩尔浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，将其涡旋均匀混合，即可得到混合水凝胶。

根据本公开的实施例，在上述原位自组装纤维化过程前，称取或配制的乙酸的溶液的摩尔浓度可以为0.02mol/L；高浓度的Coll I的浓度可以为8.9～10.9mg/mL；DMEM培养基的浓度可以为1×；磷酸盐缓冲盐溶液的浓度可以为10×；以及氢氧化钠的溶液的摩尔浓度可以为0.5mol/L。

在上述实施例的基础上，稀释后的胶原蛋白I型的预设浓度为3～5.6mg/mL；依据预设配比混合后的溶液中胶原蛋白I型的终浓度为2～4.5mg/mL；依据预设配比混合后的溶液pH中和至7.3～7.5。

其中，乙酸溶液可以稀释高浓度的type I collagen(Coll I)到预设浓度；氢氧化钠溶液可以中和依据预设配比混合后的溶液pH至7.3～7.5。

在上述实施例的基础上，S4中还包括：聚合水凝胶经自组装纤维化过程形成的具有纳米和微观结构特征的水凝胶。

所谓聚合水凝胶可以是经自组装纤维化过程形成的具有体内细胞外基质(ECM)的许多纳米和微观结构特征的type I collagen凝胶，具体可以通过原位自组装纤维化过程形成。

在上述实施例的基础上，自组装纤维化过程具体包括：将依据预设配比混合后的溶液吸入细胞培养腔中，以替换含胚牛血清的培养基，同时覆盖附着在导电芯片表面的细胞；以及将细胞培养腔置于一定湿度的细胞培养箱中成胶，经自组装纤维化过程制备适于群体细胞侵袭的三维胶原蛋白I型凝胶。

具体地，如图4所示，可以依据如下制备过程形成，包括：将上述称取的各组成材料或溶液进行混合之后，快速超声振荡30s，用移液枪吸取1mL溶液快速滴于细胞培养腔中，以替换含0.5％FBS的培养基，同时覆盖附着在导电芯片表面的MDA-MB-231细胞，注意避免在溶液中引入气泡，所有试剂均在冰上(4℃)保持并混合以防止type I collagen单体自聚；以及迅速将细胞培养腔转移至37℃5％CO₂以及95％湿度的细胞培养箱中成胶3h，经自组装纤维化过程制备适于群体细胞侵袭的三维Coll I凝胶。将聚合的Coll I凝胶保持在高湿度环境下对于避免基质表面出现任何干燥伪影至关重要。以及，用完全培养基浸没Coll I凝胶的顶部，以防止脱水，并在趋化因子胚牛血清(FBS)扩散后沿凝胶薄层产生趋化因子梯度，从而诱导三维基质中群体细胞侵袭。

本公开公开的聚合水凝胶的制备方法，其制备得到的type I collagen凝胶是细胞外基质中最丰富的成分，由于纤维状的特性，它具有体内细胞外基质(ECM)的许多纳米和微观结构特征，以适于肿瘤侵袭模型的构建。虽然人工ECM(artificial extracellularmatrices，简称aECMs)正越来越多地用于组织工程和3D细胞培养来补充自然来源基质(如I型胶原蛋白(type I collagen，简称Coll I)或基底膜基质(Matrigel))，但对于aECM的各种生物化学和生物物理特性在控制3D细胞迁移行为的相互作用方面所知甚少。实际上，细胞暴露于潜在的Coll I已被强调为癌症转移的重要启动事件，并且已证明3D Coll I晶格能够上调细胞分泌活性蛋白酶(如膜型基质金属蛋白酶(membrane-type matrixmetalloprotease-2，简称MMP-2))，从而允许细胞介导的底物修饰。

在上述实施例的基础上，S5具体包括：以输出正弦电压为10mV～30mV、输出频率为10kHz～100kHz对三维基质中群体细胞侵袭的微电极阵列的导电芯片进行扫频测量，以获得不同频率下细胞阻抗值；获取细胞阻抗信息是以在胶原蛋白I型凝胶中加入完全培养基为零时刻，进行多时间段的阻抗扫频测量。

根据本公开的实施例，进行细胞阻抗检测，包括：以输出正弦电压为10mV～30mV、输出频率为10kHz-100kHz的两端法阻抗测量模式(2-Terminal Impedance Measurement，简称2-Term Z)对三维基质中群体细胞侵袭的细胞阻抗传感芯片进行扫频测量，以获得不同频率下细胞阻抗值；获取细胞阻抗信息是以在Coll I凝胶中加入完全培养基为零时刻，进行多时间段的阻抗扫频测量，其中，阻抗扫频测量的时间间隔分别为10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min。对相应时间点和检测频率值采集到的实时待检测细胞阻抗信息进一步用实验室自定义编写的MATLAB脚本分析处理，用相对阻抗值变化即细胞指数(Cell index，简称CI)表征三维基质中群体细胞随时间的侵袭距离，细胞指数越大表示细胞距离微电极阵列的导电芯片表面越远，也即群体细胞在三维基质中的侵袭距离越大。对接种了40×10⁴MDA-MB-231细胞在37℃5％CO₂以及95％湿度的细胞培养箱中自组装了聚合水凝胶的导电芯片进行阻抗扫频测量。使用10kHz～100kHz频率范围进行扫频，施加的正弦电压为30mV。其中，结果如图6所示，在相同的时间点，随着CollI凝胶浓度的增加，细胞指数(CI)逐渐降低；当Coll I凝胶浓度相同时，随着侵袭时间的增加，CI趋于平台稳定期。

下面以一激光共聚焦显微镜定量表征细胞在三维凝胶基质中侵袭距离的实施例以验证本公开方法的有效性。

在上述制备的type I collagen凝胶中浸没含10％FBS的完全培养基以诱导群体细胞侵袭，可通过激光共聚焦显微镜定量表征细胞在三维凝胶基质中侵袭距离，包括：所测细胞在三维凝胶基质中的侵袭距离为Z方向上侵袭距离；Coll I凝胶在37℃5％CO₂以及95％湿度的细胞培养箱中成胶3h后，此时加入完全培养基以浸没Coll I凝胶，并立即转移至激光共聚焦显微镜的载物台培养器中，预先为MDA-MB-231细胞的培养提供温度为37℃，CO₂浓度为5％的环境控制，以此时刻为零时刻，利用激光共聚焦成像软件进行多点层扫模式的延时共聚焦成像和三维重建。其中，完全培养基中的10％FBS作为趋化因子，其在三维Coll I凝胶中在Z方向上的梯度分布会利用细胞的趋化性诱导群体细胞向上侵袭。

在本公开的实施例中，以完全培养基中的10％FBS作为趋化因子，诱导细胞在三维凝胶基质中侵袭。通过3D ECM进行细胞迁移是胚胎发生、免疫监测和伤口愈合等生理和病理过程的基本特征。有效的运动性取决于细胞突起，粘附和收缩机制的精确协调，这主要受细胞内信号网络支配，包括激活G蛋白或酪氨酸激酶，刺激Cdc42蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，激活脂质激酶以及随后招募活化的Rac蛋白。但是，3D迁移对局部细胞外信号也很敏感，这些信号可以与已建立的细胞内信号整合，从而影响迁移模式和效率，并通过诱导细胞极性来赋予迁移方向性。定向细胞迁移主要是由于细胞胞外线索的不对称性引起的，其中包括可溶性因子(趋化性)，流体流动(趋流性)，电场(趋电性)，刚度(趋硬性)和粘附配体(趋触性)。值得注意的是，肿瘤的进展与ECM的生化，机械和结构变化有关，推测这些变化会影响侵袭性癌细胞的迁移，因此了解这些变化影响肿瘤细胞行为的机制至关重要。

在本公开的实施例中，通过趋化因子FBS在凝胶中的梯度分布诱导细胞层以片状形式进行群体侵袭。类似于单细胞迁移，集体细胞运动是由肌动球蛋白聚合和收缩性耦合到细胞极性导致的，涉及一系列协同事件，包括伪足的突出，新粘连的形成，牵引力的发展和旧粘连的释放。在结缔组织中，胶原纤维网络是一种物理屏障，但当肿瘤细胞侵入肿瘤间质时，肿瘤细胞可通过两种不同的运动轻易通过ECM：变形运动(非蛋白水解)和间质运动(蛋白水解)，其中包括单个或集体迁移。与2D迁移不同，3D细胞必须克服其周围环境的生物物理阻力。在间质运动的迁移过程中，细胞分泌活性蛋白酶(如膜型基质金属蛋白酶(membrane-type matrix metalloproteases，MMPs))，分解ECM大分子，从而产生宏观的空腔，允许细胞的运动。另外，一些炎症细胞(如淋巴细胞、树突状细胞或肿瘤细胞)可通过必要的挤压或变形去克服生物物理基质的阻力而通过ECM，这是独立于蛋白水解的变形运动。尽管MMPs活性使细胞能够通过任何大小的孔迁移，但通过实际的变形迁移只能在较大或中等孔径的环境中发生。同样的细胞类型可根据特定ECM而利用这两种机制中的任何一种，而从一种机制转换到另一种机制的潜在机理仍然是一个开放的问题。

根据本公开的实施例，通过激光共聚焦成像软件进行多点层扫模式的延时共聚焦成像和三维重建，具体地，如图7所示，包括如下操作：在将浸没完全培养基的Coll I凝胶转移至激光共聚焦显微镜的载物台培养器中后，设置激光共聚焦成像软件的多点层扫模式；在3个独立的样本实验中，以微电极阵列的导电芯片表面为底，此处设为0μm处，每次选取4个不同的(x，y)位点，扫描方向为向上，以10μm的Z间隔捕获图片，扫描间距总长为300μm，所获得的31张图片栈的Z间距即为10μm，其中，激光共聚焦显微镜采用10×物镜，488通路进行多点层扫，每次成像时以样品实际荧光效果调节曝光的光强和增益以获得最佳的细胞荧光图；延时共聚焦成像采用时间间隔为30min，时间总长为3h，共计7个时间点；以及通过激光共聚焦成像软件的3D Opacity对所获得的二维的图片栈进行三维重建，获得不同时间点细胞片在三维Coll I凝胶中所在位置的三维重建图。

在本公开的实施例中，上述经多点层扫模式的延时共聚焦成像获得的二维的图片栈，可以通过实验室自定义编写的MATLAB脚本定量计算细胞片所在Z方向上的侵袭距离和速率，包括：使用自定义编写的MATLAB脚本计算图片栈中每一张图片的灰度值，通过插值法进行曲线拟合从而获得不同Z轴位置对应灰度值曲线，灰度峰值所在位置即为当前细胞片所在位置，也即细胞片在三维Coll I凝胶中Z方向上侵袭距离；通过将细胞片的侵袭距离除以其对应的时间，即获得细胞片在该时间段内的平均侵袭速率。其中，结果如图8所示，图8-A为不同浓度Coll I凝胶中细胞在不同时间所对应的Z方向上侵袭距离，图8-B为不同浓度Coll I凝胶中细胞在不同时间段内所对应的Z方向上的平均侵袭速率。在图8-A中，在相同的时间点，随着Coll I凝胶浓度的增加，细胞在Z方向上的侵袭距离递减，当时间为180min时，2.5mg/mL Coll I凝胶中细胞的侵袭距离明显大于4mg/mL；在图8-B中，在相同的时间段内，Coll I浓度越高，平均侵袭速率越低，当Coll I浓度相同时，总的趋势是侵袭过程开始时段速率快，后半部分速率慢。说明随着Coll I浓度的增加，基质的杨氏模量增加，凝胶的孔径逐渐降低，并且配体密度增加导致Coll I纤维与细胞会有更多的结合位点和键合力，使得细胞迁移会有更大的空间位阻，细胞的侵袭距离和平均速率就会相应的降低。

由此可见，CI的检测结果与图8定量表征细胞片的侵袭距离结果相吻合，因此，本公开的细胞阻抗传感系统能完成其在三维基质中群体细胞迁移和侵袭中的监测应用。

本公开以自组装纤维化过程制备了适于肿瘤侵袭模型的Coll I凝胶，进一步加入趋化因子FBS以诱导群体细胞在三维基质中的侵袭，将具有上述Coll I凝胶的导电芯片与阻抗谱仪构建细胞阻抗传感检测系统和在线联用分析系统，实现了三维基质中群体细胞侵袭过程的细胞阻抗信息数据的实时、无标记、动态监测新方法。相比于传统的Boyden小室实验端点求和法，本公开的这种3D ECM中细胞迁移的实时监测方法，提供了细胞迁移初始阶段的信息，能够定量实时全程动态的表征细胞的侵袭过程，有助于阐明肿瘤侵袭-转移级联反应。开发更有信息性的肿瘤细胞侵袭和迁移的3D体外分析方法，使高通量分析具有更高的可重复性，这可能推动目前评估肿瘤细胞侵袭性和迁移状态的体外方法的发展。本公开所公开的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的细胞阻抗传感方法，不仅对于实验室细胞迁移实验和临床药物毒性检测具有重要的意义，而且拥有重要的商业推广价值，有望在新药开发、药物安全性评价和二次开发等方面发挥特点作用，产生良好的社会和经济价值。

以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，包括：

S1，制备具有微电极阵列的导电芯片；

S2，将环形结构围设于所述导电芯片四周，形成细胞培养腔；

S3，对所述导电芯片进行表面处理；

S4，在所述细胞培养腔的微电极阵列上铺满细胞及形成聚合水凝胶；

S5，实时进行细胞阻抗检测，获取所述细胞的阻抗信息，进而得到所述细胞侵袭过程的信息。

2.根据权利要求1所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S1具体包括：

在所述导电衬底的导电膜层上形成光刻胶层；

在所述具有光刻胶层的导电衬底上形成光刻胶图案；以及

基于所述光刻胶图案在所述导电衬底上形成具有导电膜图案的导电芯片，

其中，所述导电膜图案为所述微电极阵列。

3.根据权利要求2所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S2具体包括：

在所述导电芯片上形成围设所述微电极阵列的环形结构，

其中，所述环形结构的内表面和所述微电极阵列所在的导电芯片表面形成所述细胞培养腔。

4.根据权利要求3所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S3具体包括：

以无水甲醇清洗所述细胞培养腔；

以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂对预清洗的细胞培养腔的导电芯片表面进行硅烷化处理；

以聚(苯乙烯-co-马来酸酐)溶液对所述细胞培养腔的导电芯片表面修饰酸酐基团。

5.根据权利要求4所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S4中铺满细胞具体包括：

将一定细胞数目的细胞悬液接种到所述细胞培养腔中，以完全培养基培养；

继续使用含有胚牛血清的培养基饥饿处理。

6.根据权利要求4所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S4中形成聚合水凝胶具体包括：

以乙酸溶液稀释高浓度的胶原蛋白I型到预设浓度；

依据预设配比，将稀释后的胶原蛋白I型、改良伊格尔培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、氢氧化钠溶液混合形成聚合水凝胶，

其中，所有试剂均在冰上保持并混合。

7.根据权利要求6所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述稀释后的胶原蛋白I型的预设浓度为3～5.6mg/mL；

所述依据预设配比混合后的溶液中胶原蛋白I型的终浓度为2～4.5mg/mL；

所述依据预设配比混合后的溶液pH中和至7.3～7.5。

8.根据权利要求6所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S4中还包括：

所述聚合水凝胶经自组装纤维化过程形成的具有纳米和微观结构特征的水凝胶。

9.根据权利要求8所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述自组装纤维化过程具体包括：

将所述依据预设配比混合后的溶液吸入细胞培养腔中，以替换所述含胚牛血清的培养基，同时覆盖附着在导电芯片表面的细胞；以及

将所述细胞培养腔置于一定湿度的细胞培养箱中成胶，经自组装纤维化过程制备适于群体细胞侵袭的三维胶原蛋白I型凝胶。

10.根据权利要求1所述的用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法，其特征在于，所述S5具体包括：

以输出正弦电压为10mV～30mV、输出频率为10kHz～100kHz对三维基质中群体细胞侵袭的所述微电极阵列的导电芯片进行扫频测量，以获得不同频率下细胞阻抗值；

所述获取细胞阻抗信息是以在胶原蛋白I型凝胶中加入完全培养基为零时刻，进行多时间段的阻抗扫频测量。

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