CN205120654U

CN205120654U - 感光干膜-铟锡氧化物电极及细胞阻抗传感器

Info

Publication number: CN205120654U
Application number: CN201520253089.2U
Authority: CN
Inventors: 李�远; 刘北忠; 龚放
Original assignee: Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2025-04-23

Abstract

本实用新型属于细胞阻抗传感器技术领域，具体涉及一种基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器。所述感光干膜-铟锡氧化物电极包括导电基底层和位于所述导电基底层上的绝缘层，所述绝缘层上设置有电极孔，所述导电基底层上还设置有引线接口，所述导电基底层为铟锡氧化物导电玻璃，所述绝缘层为感光干膜；所述的基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器包括感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池；本实用新型的感光干膜-铟锡氧化物电极细胞阻抗传感器结构简单、易于加工，能够同时获取感光干膜-铟锡氧化物电极上细胞的形态学和阻抗特征值，可在普通实验室推广并用于细胞生理病理行为、药物筛选等研究领域。

Description

感光干膜-铟锡氧化物电极及细胞阻抗传感器

技术领域

本实用新型属于细胞阻抗传感器技术领域，具体涉及一种基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器,该细胞阻抗传感器实现细胞形态学和阻抗信息的同时检测。

背景技术

细胞阻抗传感器作为一种具有连续性、无侵袭性特点的体外细胞分析技术能够对细胞粘附、增殖、凋亡等生物学行为进行检测，在药物筛选、毒物测试、细胞生理参数分析研究等领域中得到广泛研究及应用。

细胞阻抗传感器技术最先由Giaever和Keese等报道，该技术构建的细胞阻抗生物传感器由一对金材质的双电极系统构建，包括一个面积为250μm直径的工作电极和一个大面积的对电极。当细胞在电极表面发生形态学改变时，细胞作为具有频率依赖性的电学元件，它的存在导致系统的阻抗谱发生改变，通过对系统阻抗谱进行解析来获取细胞对应的生物学行为，该技术被称为电子细胞-基底阻抗传感技术(electriccell-substrateimpedancesensing,ECIS)。在细胞阻抗传感器研究中，金电极具有优良的导电性、生物相容性而被广泛用于检测细胞粘附、增殖、肿瘤细胞间质转化、细胞对药物响应等信息，其基本策略是将测量得到的阻抗数据谱数据与理论等效电路拟合来间接获取细胞信息，具有无侵入性、连续性检测的优点。然而以贵金属金作为电极材料，不但成本高，而且透光性差，限制了金材料电极上细胞形态学的观察。而事实上，细胞的形态学数据是一类重要的细胞生物学行为信息，通过形态学数据获取细胞的增殖、凋亡、亚细胞微观结构、细胞蛋白表达等信息。相比阻抗学数据，形态学数据更为直观、更易理解。因此，构建一种能够同时获取细胞的阻抗信息和形态学的细胞阻抗生物传感器将有助于提高生物传感器的准确性和多功能性。

铟锡氧化物(ITO)具有良好透光性、生物相容性的导电材料，因此可作为一种电极材料构建各种细胞生物传感器。铟锡氧化物导电膜通过平面磁控技术溅射在玻璃表面，具有表面电阻均匀、良好透光率和热稳定性，市场上可获得不同导电率的商品化铟锡氧化物导电玻璃。铟锡氧化物能够在中性电解质溶液中保持电势稳定性，因此可作为电极材料检测培养环境中的细胞的电学特性，同时铟锡氧化物电极材料良好的透光性能与光学显微镜集成，通过数字图像技术获取铟锡氧化物电极上细胞的形态学信息。此外，现有技术中已报到了将聚硅氧烷树脂涂覆的铟锡氧化物微电极用于记录神经元细胞峰电位的应用，及通过光刻技术和反应离子蚀刻技术加工光学透明的铟锡氧化物氮化硅电极作为内皮细胞阻抗生物传感器的应用，并且研究发现，铟锡氧化物电极材料比金电极具有更优的透光性，能够检测细胞松弛素D对猪肺动脉内皮细胞的响应行为。尽管上述研究报道了铟锡氧化物电极材料在细胞阻抗生物传感器的应用价值，但铟锡氧化物电极加工需依赖昂贵的溅射和光刻设备，且工艺复杂，限制了铟锡氧化物电极在细胞阻抗生物传感器的制备及推广。

基于上述原因和现有的技术，仍然需要进一步开发及优化铟锡氧化物电极及其制备方法，使其工艺简单、制作成本降低，广泛适用于细胞阻抗生物传感器，并且实现细胞形态学和阻抗信息同时检测。

实用新型内容

感光干膜作为一种光聚合物材料主要应用于印刷板电路板工艺。相对于液体光刻胶，感光干膜具有诸多优势，如良好的适应性，基材粘附性、平整性、感光材料均匀分布性、低曝光功耗及低成本。更为重要的是，感光干膜光刻不需要超洁净空间和昂贵的光刻设备，作为液态光刻胶的替代物还可应用在微流体通道加工、电铸模具等。基于感光干膜的上述特性，本申请的发明人发现将感光干膜应用于铟锡氧化物电极加工，不仅不需要对铟锡氧化物进行刻蚀，降低了工艺复杂性，而且还降低了铟锡氧化物电极的接触电阻，且能够获得最小直径为100μm的铟锡氧化物电极。采用感光干膜制备的感光干膜-铟锡氧化物(DFP-ITO)电极作为细胞阻抗传感器能实现细胞形态学和阻抗信息的双通道获取。本实用新型正是基于发明人的上述发现而完成的。

因此，本实用新型首先提供了一种感光干膜-铟锡氧化物电极，该电极透光性好，其制备方法简单；本实用新型的目的之二在于提供一种基于感光干膜-铟锡氧化物(DFP-ITO)电极的细胞阻抗传感器，该细胞阻抗传感器结构简单，可实现细胞形态学和阻抗信息的双通道获取，操作简单。

为实现上述目的，本实用新型的技术方案为：

感光干膜-铟锡氧化物电极，包括导电基底层和位于所述导电基底层上的绝缘层，所述绝缘层上设置有电极孔，所述导电基底层上还设置有引线接口，通过引线接口与电源连接；所述导电基底层为铟锡氧化物导电玻璃，所述绝缘层为感光干膜。

铟锡氧化物(ITO)具有良好透光性、生物相容性的导电材料，铟锡氧化物导电膜通过平面磁控技术溅射在玻璃表面，具有表面电阻均匀、良好透光率和热稳定性，市场上可获得不同导电率的商品化铟锡氧化物导电玻璃。铟锡氧化物能够在中性电解质溶液中保持电势稳定性，可作为电极材料检测培养环境中的细胞的电学特性，同时铟锡氧化物电极材料良好的透光性能与光学显微镜集成，通过数字图像技术获取铟锡氧化物电极上细胞的形态学信息。因此，铟锡氧化物电极具有实现细胞阻抗谱信息和形态学信息同时检测的潜力。

为实现细胞阻抗谱信息采集，需要加工铟锡氧化物工作电极。现有技术中，加工铟锡氧化物电极主要采用两类方法：一类是top-down途径，即在铟锡氧化物板上通过化学刻蚀加工出铟锡氧化物电极；另一类是bottom-up途径(approach)，即在图形化的基底上通过溅射方式加工出铟锡氧化物电极。然而，蚀刻和溅射形成的铟锡氧化物电极接触电阻较大,导致细胞阻抗传感器灵敏度降低；另外，蚀刻和溅射途径加工铟锡氧化物电极采用液态光刻胶作为电极图像牺牲层，以光刻技术为基础，加工工艺、成本较高。

感光干膜是一种基于丙烯酸酯的光聚合物，具有诸如良好的适应性、基材粘附性、平整性、感光材料均匀分布性、低曝光功耗及低成本等特点，除应用于PCB工艺中，在其它细胞生物学研究领域中也有报道，如微流控芯片。然而，感光干膜的细胞生物相容性却未见报道。本申请的发明人从细胞粘附和细胞毒性考察了感光干膜细胞生物相容性，结果显示细胞能在感光干膜粘附并铺展,罗丹明123对细胞线粒体荧光染色显示粘附在感光干膜表面的细胞具有良好的生物活性，说明感光干膜可为细胞提供适宜的生长界面。并且，实验发现，未经曝光步骤的感光干膜细胞毒性显著高于经过曝光处理的感光干膜，且随孵育时间延长，细胞毒性效率更为明显。

本申请发明人将现有文献报道的采用铟锡氧化物微电极构建细胞阻抗生物传感器涉及到的加工工艺及参数与本实用新型的感光干膜-铟锡氧化物电极加工工艺进行比较，结果见表1，本实用新型的以感光干膜作为绝缘层，以商品化铟锡氧化物导电玻璃为基底，通过对感光干膜进行选择性紫外照射、显影获得铟锡氧化物电极的方法不需要对铟锡氧化物进行刻蚀，降低了工艺复杂性和铟锡氧化物电极的接触电阻，且能够获得最小直径为100μm的铟锡氧化物电极。

基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器，包括感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池，所述测量小池置于感光干膜-铟锡氧化物电极的电极孔上，并与电极孔连通。以感光干膜-铟锡氧化物电极为基础构建的细胞阻抗传感器能够耦合光学显微成像技术和电化学阻抗谱技术，实现细胞形态学和阻抗信息的同时检测。在同一电极上获取的细胞形态学数据和阻抗信息互为补充、验证，提高细胞信息检测的全面性和准确性。

进一步，所述的细胞阻抗传感器，在所述测量小池与电极孔之间还设置有垫圈。垫圈可以是硅胶环、橡胶环等，起防滑及防培养液渗漏的作用。

进一步，所述的细胞阻抗传感器，还包括固定感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池的夹具。为便于细胞培养及电化学阻抗谱测量，将感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池通过夹具固定。

进一步，所述的细胞阻抗传感器，所述夹具包括上夹板和下夹板，所述上夹板和下夹板通过螺栓连接。

进一步，所述夹具可为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)夹具。

进一步，所述的细胞阻抗传感器，所述感光干膜-铟锡氧化物电极的电极孔的直径为0.1mm-2mm。

本实用新型所述的感光干膜-铟锡氧化物电极采用如下的方法制备：通过对位于所述导电基底层上的感光干膜绝缘层进行选择性紫外照射、显影获得电极孔，从而得到感光干膜-铟锡氧化物电极。通过对感光干膜进行选择性紫外照射、显影获得铟锡氧化物电极的方法不需要对铟锡氧化物进行刻蚀，降低了工艺复杂性和铟锡氧化物电极的接触电阻，且能够获得最小直径为100μm的铟锡氧化物电极。

进一步，所述的制备方法，采用碳酸钠溶液进行显影；将获得的感光干膜-铟锡氧化物电极用去离子水冲洗，烘干，再经紫外照射使感光干膜完全固化。

进一步，所述的制备方法具体包括如下进行的步骤：

(1)将感光干膜压贴在铟锡氧化物导电玻璃表面，铟锡氧化物导电玻璃为导电基底层，感光干膜为绝缘层；

(2)绘制电极孔和引线接口图案，通过喷墨打印机打印在透明胶片上制成光掩膜，透过光掩膜对感光干膜进行紫外照射；

(3)将步骤(2)中紫外照射后的感光干膜进行显影，使未经紫外照射的区域暴露，进而获得感光干膜-铟锡氧化物电极。

本实用新型的细胞阻抗传感器可同时获取细胞的阻抗信息和形态学信息，其检测的方法按照如下步骤进行：

(1)将细胞悬液加载到测量小池内，静置使细胞沉降到电极孔的表面，放入培养箱进行培养；

(2)通过光学显微成像技术观察细胞培养过程中细胞形态学变化信息；

(3)通过电化学阻抗谱技术测量细胞培养过程中细胞阻抗信息，所述电化学阻抗谱技术测量是以接种了细胞的感光干膜-铟锡氧化物电极作为工作电极进行电化学阻抗谱测量。

本实用新型的有益效果：(1)本实用新型的感光干膜-铟锡氧化物电极透光性好，采用感光干膜作为绝缘层，不仅不需要对铟锡氧化物进行刻蚀，降低了工艺复杂性，而且还降低了铟锡氧化物电极的接触电阻，且能够获得最小直径为100μm的铟锡氧化物电极，即降低铟锡氧化物电极加工难度、成本和时间，且感光干膜表面适宜细胞粘附，对细胞生长无明显细胞毒副作用；感光干膜-铟锡氧化物电极结构简单、易于加工。(2)基于感光干膜-铟锡氧化物(DFP-ITO)电极的细胞阻抗传感器，结构简单、易于加工，能够耦合光学显微成像技术和电化学阻抗谱技术，实现细胞形态学和阻抗信息的同时检测，同一电极上获取的细胞形态学数据和阻抗信息互为补充、验证，提高细胞信息检测的全面性和准确性，本实用新型利用该细胞阻抗传感器实现细胞形态学和阻抗信息的同时检测的方法操作简单，可在普通实验室推广并用于细胞生理病理行为、药物筛选等研究领域。

附图说明

图1感光干膜-铟锡氧化物电极的结构示意图。

图2实施例2所述的感光干膜-铟锡氧化物电极加工流程示意图，其中(a)：经过清洗后的铟锡氧化物导电玻璃；(b)：将感光干膜层压在铟锡氧化物导电玻璃表面；(c)：透过光掩膜对感光干膜进行紫外照射；(d)：干膜显影，获得感光干膜-铟锡氧化物电极。

图3基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器的结构示意图。

图4感光干膜的细胞生物相容性检测结果，其中(a)：A549细胞在感光干膜表面培养24h后的明场和罗丹明123荧光染色显微图片；(b)：后曝光处理对感光干膜A549细胞毒性的影响(n＝5)；图中*表示p<0.05，△表示p<0.01。

图5不同直径感光干膜-铟锡氧化物电极图片和阻抗谱特征，其中(a)：直径分别为0.5mm、1.0mm、1.5mm和2.0mm的感光干膜铟锡氧化物实物图片；(b)：直径分别为1.0mm、1.5mm和2.0mm的感光干膜铟锡氧化物电极自身阻抗谱数据，电化学阻抗谱测量在0.01MPBS溶液中进行。

图6利用光学显微镜观察感光干膜-铟锡氧化物电极表面的A549细胞在2h时的形态学信息。

图7利用光学显微镜观察感光干膜-铟锡氧化物电极表面的A549细胞在24h时的形态学信息。

图8利用光学显微镜观察感光干膜-铟锡氧化物电极表面的A549细胞在48h时的形态学信息。

图9感光干膜-铟锡氧化物电极上细胞粘附增殖行为电化学阻抗谱检测，其中(a)：接种在感光干膜-铟锡氧化物电极表面的A549细胞分别在0h、2h、24h和48h时的电化学阻抗谱复平面图；(b)：生物学细胞等效电路模型；(c)：对接种在感光干膜-铟锡氧化物电极上A549细胞不同时刻的细胞等效电路模型的曲线拟合结果(n＝4)。

具体实施方式

以下将参照附图，对本实用新型的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

以下实施例中所涉及的实验材料：

铟锡氧化物导电玻璃购于珠海凯为光电科技有限公司(中国)，铟锡氧化物导电膜厚2200±300埃，面电阻≤7Ω/square，玻璃基底厚度为1.1mm。

感光干膜型号为HQ-6100，购于长兴化学工业股份有限公司，感光层厚度为35um，是一种低成本负性光刻胶。

A549细胞培养：人肺癌上皮细胞A549由重庆医科大学附属永川医院中心实验室常规培养。细胞用含10％胎牛血清(杭州四季青)、100U/毫升青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液(Gibco)中在37℃，5％二氧化碳条件下进行培养。待细胞生长至对数生长期，0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化细胞，1500rmp离心4min，按1:3进行传代。本文使用的A549细胞传代次数为4至10代，使用时将A549细胞用DMEM细胞培养液制成不同浓度的细胞悬液。

实施例1感光干膜细胞相容性检测

感光干膜的细胞生物相容性采用细胞粘附实验和细胞毒性实验进行验证。

(1)细胞粘附实验流程：将感光干膜剪切为面积为8mm×8mm方片，按本实用新型的感光干膜-铟锡氧化物电极加工流程对感光干膜进行紫外照射、显影处理后，放置于96孔板内，70％(v/v)浓度乙醇消毒。将100μlA549细胞以浓度为2.5×10⁵cells/ml接种在感光干膜表面，37℃、5％浓度二氧化碳条件下培养24h使细胞贴壁，用浓度为10μM罗丹明123(Sigma)的PBS溶液对细胞线粒体进行荧光染色，倒置荧光显微镜(IX-71，奥林巴斯)观察感光干膜表面上贴壁的细胞形态学和细胞荧光图像。

(2)细胞毒性实验流程：将100μlA549细胞以浓度为5×10⁴cells/ml密度接种在96孔板中，细胞培养箱中孵育2h使细胞贴壁。随后将感光干膜浸没于细胞培养液中作为实验组，同时以不含感光干膜的细胞孔为阴性对照组，只含感光干膜不含细胞的孔为空白组，每组设5个复孔，分别培养24h、48h、72h小时后，将感光干膜从孔中取出，并在每孔中加入10μlCellCountingKit-8(CCK-8)分析液(碧云天生物技术公司)，轻摇混匀，37％、5％二氧化碳细胞培养箱中孵育2h，多功能酶标仪(Varioskan,ThermoScientific)测定溶液在450nm的吸光度。感光干膜细胞毒性定义为：细胞毒性(％)＝1-(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)*100％。

本实施例从细胞粘附和细胞毒性考察了感光干膜细胞生物相容性，实验结果如图4所示。图4(a)为A549细胞接种在感光干膜24h细胞发生粘附的明场和荧光显微图片，结果显示细胞能在感光干膜粘附并铺展，罗丹明123对细胞线粒体荧光染色显示粘附在感光干膜表面A549细胞具有良好的生物活性，该结果说明感光干膜可为A549细胞提供适宜的生长界面。图4(b)为两种不同处理的感光干膜的细胞毒性结果。实验发现，未经过后曝光步骤的感光干膜细胞毒性显著高于经过后曝光处理的感光干膜，且随孵育时间延长，细胞毒性效率更为明显，孵育72h两种感光干膜的细胞毒性间比值约为4.86。该结果说明感光干膜的后曝光是影响其细胞毒性的关键因素，原因在于后曝光步骤能够使感光分子完全聚合，避免未聚合的光敏分子在细胞培养时释放进细胞培养液对细胞产生细胞毒性。同时，实验还发现未经过后曝光处理的感光干膜在培养液中浸泡24h后开始出现软化、表面开始皱褶，而后曝光处理的感光干膜形态未发生改变。事实上，后曝光处理的感光干膜仍具有轻微的细胞毒性(72h为12.6％)，推测原因为感光干膜吸附了培养液中蛋白分子对细胞生长造成轻微抑制。因此，细胞接种前用空白培养液对感光干膜进行预孵育降低其对细胞生长抑制效应。

实施例2感光干膜-铟锡氧化物电极的加工

将铟锡氧化物导电玻璃分别用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗各15min，烘干待用。

本实施例所制备的感光干膜-铟锡氧化物电极的结构示意图如图1所示。感光干膜-铟锡氧化物电极，包括导电基底层1和位于所述导电基底层1上的绝缘层2，所述绝缘层2上设置有电极孔3，所述电极孔3为四个，所述导电基底层1上还设置有引线接口4，通过引线接口4与电源连接；所述导电基底层1为铟锡氧化物导电玻璃，所述绝缘层2为感光干膜。

感光干膜-铟锡氧化物电极加工流程如图2所示，具体包括以下步骤：

(1)感光干膜通过办公覆膜机(100℃)压贴在导电玻璃铟锡氧化物膜表面，目测感光干膜与铟锡氧化物膜紧密贴附且两者间无气泡；

(2)矢量图绘制软件Coreldraw12.0(Corel公司,Canada)绘制出铟锡氧化物电极孔和引线接口图案，通过喷墨打印机打印(ESPON1390，Japan)以2880dpi分辨率打印在透明胶片上制成光掩膜，透过光掩膜对感光干膜进行紫外照射30s；

(3)将照射后的感光干膜在30℃下用1％的碳酸钠显影5min，使未经紫外照射的铟锡氧化物区域暴露，获得结构示意图如图1所示的感光干膜-铟锡氧化物电极。随后将电极用去离子水冲洗2次，60℃烘干，紫外照射60s使感光胶完全固化。

实施例3基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器

本实施例所制备的基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器的结构示意图如图3所示。

为便于细胞培养及电化学阻抗谱测量，将实施例2所制备的感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池5通过聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)夹具固定，使感光干膜-铟锡氧化物电极置于测量小池底部，测量小池体积为500μL。

基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器，包括实施例2所制备的感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池5，所述测量小池5置于感光干膜-铟锡氧化物电极的电极孔3上，并与电极孔3连通，在所述测量小池5与电极孔3之间还设置有垫圈6，垫圈6为硅胶环，还包括固定感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池5的夹具7，所述夹具7包括上夹板71和下夹板72，所述上夹板71和下夹板72通过螺栓8连接，所述夹具7材质为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。

以感光干膜-铟锡氧化物电极为基础构建的细胞阻抗传感器能够耦合光学显微成像技术和电化学阻抗谱技术，实现细胞形态学和阻抗信息的同时检测。在同一电极上获取的细胞形态学数据和阻抗信息互为补充、验证，提高细胞信息检测的全面性和准确性。

实施例4本实用新型的细胞阻抗生物传感器与现有技术报道的铟锡氧化物电极构建细胞阻抗生物传感器比较

加工铟锡氧化物电极主要采用两类方法：一类是top-down途径,即在铟锡氧化物板上通过化学刻蚀加工出铟锡氧化物电极；另一类是bottom-up途径(approach)，即在图形化的基底上通过溅射方式加工出铟锡氧化物电极。然而，蚀刻和溅射形成的铟锡氧化物电极接触电阻较大,导致细胞阻抗传感器灵敏度降低；另外，蚀刻和溅射途径加工铟锡氧化物电极采用液态光刻胶作为电极图像牺牲层，以光刻技术为基础，加工工艺、成本较高。本实施例中，对本实用新型制备的细胞阻抗生物传感器与现有技术报道的铟锡氧化物电极构建细胞阻抗生物传感器涉及到的加工工艺及参数进行了比较，结果如表1所示，结果表明，本实用新型以感光干膜作为绝缘层，以商品化铟锡氧化物导电玻璃为基底，通过对感光干膜进行选择性紫外照射、显影获得铟锡氧化物电极的方法不需要对铟锡氧化物进行刻蚀，降低了工艺复杂性和铟锡氧化物电极的接触电阻，且能够获得最小直径为100μm的铟锡氧化物电极。

表1铟锡氧化物电极构建细胞阻抗生物传感器比较

实施例5细胞阻抗生物传感器工作电极面积对细胞阻抗传感器灵敏度的影响的研究

构建细胞阻抗生物传感器需要考虑一系列重要参数，其中工作电极面积是影响细胞阻抗传感器灵敏度重要参数之一。本实施例中，首先加工了0.5mm、1.0mm、1.5mm和2mm四种不同直径(即电极孔3的直径)的感光干膜-铟锡氧化物电极，研究了不同直径的感光干膜-铟锡氧化物电极对A549细胞阻抗传感器灵敏度的影响，研究方法如下：

在细胞加载到感光干膜-铟锡氧化物电极前，用70％乙醇对测量小池消毒5min，随后用灭菌去离子水清洗测量小池2次；将200μlA549细胞悬液以浓度2.5×10⁵cells/ml分别加载到含不同直径的感光干膜-铟锡氧化物电极的测量小池内，放置在超净台内室温条件下静止30min后使细胞均匀沉降到电极表面，随后放入37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养，感光干膜-铟锡氧化物电极上A549细胞阻抗信息通过电化学阻抗谱(ElectrochemicalImpedanceSpectroscopy,EIS)技术进行测量。电化学阻抗谱测量采用了CS315电化学工作站(武汉科斯特仪器有限公司)，电化学阻抗谱测量系统采用三电极系统，以接种了细胞的感光干膜-铟锡氧化物电极作为工作电极，将Ag/AgCl丝参比电极(直径：0.5mm,长度：10mm)和铂丝对电极(直径：1.0mm,长度：10mm)插入测量小池内进行电化学阻抗谱测量。测量以0.01MPBS作为支持电解质溶液，以幅值为10mV正弦波为激励信号，扫描频率范围为1-10⁵Hz，阻抗谱测量数据用ZView2.0软件进行分析。结果如图5所示。

如图5(a)所示，实验发现，0.5mm直径感光干膜铟锡氧化物电极与参比电极间在支持电解质溶液中出现过高的开路电位(opencircuitpotential)，提示0.5mm直径的感光干膜-铟锡氧化物电极与电解质溶液接触阻抗大，推测其原因与感光干膜厚度和疏水性质有关。图5(b)所示为直径分别为1.0mm、1.5mm、2.0mm的感光干膜-铟锡氧化物电极阻抗谱，显示不同直径电极间具有相似的频率依赖特性，其整个频率范围内电极阻抗值与直径成反向关系，其原因在于铟锡氧化物电极与电解质溶解界面形成的电荷双分子层有关。该结果与文献报道的金电极结果相似。当细胞在铟锡氧化物电极表面粘附与铺展时，由于面积小的铟锡氧化物电极对细胞形态学变化表现出更高的灵敏性。

实施例6利用基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器同时检测A549细胞形态学和电化学阻抗信息

铟锡氧化物作为电极材料构建细胞阻抗生物传感器最具吸引力的特点在于可实现细胞形态学和阻抗信息的双通道检测。本实施例对本实用新型的基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器进行了验证，利用该细胞阻抗传感器同时检测了A549细胞的粘附、增殖过程中细胞形态学和阻抗信息。

本实施例采用的细胞阻抗传感器选择直径为1.0mm铟锡氧化物电极。

按照下述方法进行检测：

在细胞加载到感光干膜-铟锡氧化物电极前，用70％乙醇对测量小池5消毒5min，随后用灭菌去离子水清洗测量小池5两次；将200μlA549细胞悬液以浓度2.5×10⁵cells/ml加载到含感光干膜-铟锡氧化物电极的测量小池5内，放置在超净台内室温条件下静止30min后使细胞均匀沉降到电极孔3表面，随后放入37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养，分别在2h、24h、48后将感光干膜-铟锡氧化物电极取出放置到倒置荧光显微镜载物台上进行细胞形态学观察和图像获取。结果如图6-8所示，A549细胞接种在铟锡氧化物电极上2h(图6)、24h(图7)和48h(图8)时的形态学显微图片，显示A549细胞在铟锡氧化物电极上均匀铺展，通过显微镜能够观察到细胞的铺展(2h)、增殖(24h)及细胞单层形成(48h)。该结构说明铟锡氧化物作为电极材料适宜细胞粘附与增殖，其良好的透光性便于获取细胞形态学数据。

感光干膜-铟锡氧化物电极上A549细胞阻抗信息通过电化学阻抗谱(ElectrochemicalImpedanceSpectroscopy,EIS)技术进行测量。当A549细胞在感光干膜-铟锡氧化物电极表面粘附和增殖时，细胞作为具有频率依赖性的电学原件导致系统阻抗谱发生改变，因此可通过阻抗谱技术对感光干膜-铟锡氧化物电极上细胞的粘附、增殖行为进行检测和解析。电化学阻抗谱测量采用了CS315电化学工作站(武汉科斯特仪器有限公司)，电化学阻抗谱测量系统采用三电极系统，以接种了细胞的感光干膜-铟锡氧化物电极作为工作电极，将Ag/AgCl丝参比电极(直径：0.5mm,长度：10mm)和铂丝对电极(直径：1.0mm,长度：10mm)插入测量小池内进行电化学阻抗谱测量。测量以0.01MPBS作为支持电解质溶液，以幅值为10mV正弦波为激励信号，扫描频率范围为1-10⁵Hz，阻抗谱测量数据用ZView2.0软件进行分析。结果如图9(a)所示，A549细胞接种在感光干膜-铟锡氧化物电极上0h、2h、24h、48h对应的电化学阻抗谱复平面图，可见A549细胞在铟锡氧化物电极上的增殖导致系统阻抗谱高频部分发生改变。在复平面图扩展标度(expandedscales)中更清楚显示A549细胞增殖导致系统阻抗谱的高频部分形成半圆，且随着细胞增殖高频部分半圆直径增大。该结果说明电极界面上细胞增殖导致电极界面上离子电荷转移过程速度减慢，其原因与细胞质膜电容特征有关。另外，在低频区域，A549细胞的增殖未对系统阻抗谱产生明显变化，其原因在于细胞在低频部分其电学特性为典型绝缘体，电极与电解质溶液的离子电流主要通过细胞间隙进行转移而未穿过细胞，因此阻抗谱的低频区域不能够反映出细胞行为学变化。

为进一步分析感光干膜-铟锡氧化物电极上不同阶段A549细胞的容抗特性，本实用新型采用了文献[KarimullahAS,CummingDRS,RiehleM,etalDevelopmentofaconductingpolymercellimpedancesensor[J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2013,176:667-674]报道的细胞等效电路模型，如图9(b)所示，细胞等效电路由一个RC并联电路和一个R元件串联组成，其中，R′s理论上解释为细胞-电极的间隙电阻，R_cell解释为细胞-细胞电阻，C_cell解释为细胞质膜的电容效应。通过曲线拟合技术将系统阻抗谱半圆部分与细胞等效电路模型进行拟合，A549细胞不同生长阶段等效电路元件值如图9(c)所示。从结果可知，随着A549细胞在铟锡氧化物电极界面的粘附和增殖，C_cell值缓慢增加，而R_cell值和R's值逐渐增加。形成细胞单层后C_cell值约为2.8nF，R_cell值约为754Ω，约为216Ω。同时，当A549细胞从贴壁后(2h)至形成细胞单层(48h)间，R_cell值持续增加说明细胞-细胞间的间隙逐渐缩小，细胞融合度增加；R's值持续增加则提示细胞-铟锡氧化物电极间距离缩小，细胞粘附强度增强。相反，C_cell值对A549细胞的增殖至形成细胞单层的形态学变化不敏感。此外，仔细分析本实施例数据还发现从细胞接种(0h)至细胞贴壁(2h)间的各元件值改变较小，说明本系统对于该过程的细胞生物学行为检测灵敏度不足，其原因在于本系统使用铟锡氧化物电极面积(0.785mm²)较大，A549细胞在铟锡氧化物电极表面粘附不足以改变系统的阻抗谱。因此，在不影响电极透光性的前提下可进一步通过电极修饰提高检测细胞阻抗传感器检测灵敏度。

由以上结果分析可知，以感光干膜-铟锡氧化物电极为基础构建的细胞阻抗传感器能够耦合光学显微成像技术和电化学阻抗谱技术，实现细胞形态学和阻抗信息的同时检测。在同一电极上获取的细胞形态学数据和阻抗信息互为补充、验证，提高细胞信息检测的全面性和准确性。

因此，本实用新型的感光干膜-铟锡氧化物电极，采用感光干膜作为绝缘层降低铟锡氧化物电极加工难度、成本和时间，且感光干膜表面适宜细胞粘附，对细胞生长且无明显细胞毒副作用；本实用新型的细胞阻抗传感器以铟锡氧化物作为电极，结构简单、易于加工，通过光学显微镜可对电极上细胞的形态学信息进行观察，利用电化学阻抗谱技术和细胞等效电路拟合能够检测感光干膜-铟锡氧化物电极上细胞的粘附和增殖过程中阻抗信息；即本实用新型的基于感光干膜-铟锡氧化物电极的细胞阻抗传感器能够同时获取细胞形态学和阻抗特征值，可在普通实验室推广并用于细胞生理病理行为、药物筛选等研究领域。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本实用新型进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本实用新型技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本实用新型的权利要求范围当中。

Claims

1.感光干膜-铟锡氧化物电极，其特征在于，包括导电基底层(1)和位于所述导电基底层(1)上的绝缘层(2)，所述绝缘层(2)上设置有电极孔(3)，所述导电基底层(1)上还设置有引线接口(4)，通过引线接口(4)与电源连接；所述导电基底层(1)为铟锡氧化物导电玻璃，所述绝缘层(2)为感光干膜。

2.一种细胞阻抗传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池(5)，所述测量小池(5)置于感光干膜-铟锡氧化物电极的电极孔(3)上，并与电极孔(3)连通。

3.根据权利要求2所述的细胞阻抗传感器，其特征在于，在所述测量小池(5)与电极孔(3)之间还设置有垫圈(6)。

4.根据权利要求2所述的细胞阻抗传感器，其特征在于，还包括固定感光干膜-铟锡氧化物电极和测量小池(5)的夹具(7)。

5.根据权利要求4所述的细胞阻抗传感器，其特征在于，所述夹具(7)包括上夹板(71)和下夹板(72)，所述上夹板(71)和下夹板(72)通过螺栓(8)连接。

6.根据权利要求2所述的细胞阻抗传感器，其特征在于，所述感光干膜-铟锡氧化物电极的电极孔(3)的直径为0.1mm-2mm。