CN113652389B - 一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开是一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，包括：制备超疏水非粘附细胞培养界面；制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列。利用本公开，通过利用超疏水非粘附界面，将三维培养有待测细胞的三维水凝胶高通量地悬浮于培养基中并形成阵列，以三维水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果，对以细胞收缩力为靶点的药物筛选具有高度的灵敏性，具有通量大、细胞消耗量小，且无需标记、实时动态分析的优势。

Description

一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法
技术领域
本公开涉及高通量药物筛选技术领域，具体而言，涉及一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法。
背景技术
将体外三维培养的微组织应用于药物筛选体系，比传统的使用生化、基因、单细胞分析作为药物筛选指标的筛药平台更接近体内的真实情况。传统的2D药物筛选平台经常出现药物在动物或临床实验中失败的情况。基于组织工程的药物筛选平台虽然不能完全取代动物体内药物追踪，但对于减少实验成本、缩短研究周期和降低实验动物消耗至关重要。高含量药物筛选(HCS)可以展示大量细胞的平均药物反应，在药物筛选方面具有独特的优势。将HCS与细胞-微环境复杂交互途径相结合，能更好地预测药物体内反应。
由细胞产生的物理力介导伤口愈合、免疫应答、肿瘤转移，驱动发育过程中的形态变化，并可反馈调节细胞表型。细胞的力量感受器和效应器(细胞骨架、黏着斑、整合素等)与细胞力水平直接相关。细胞力、细胞外基质重塑和细胞表型之间存在复杂而动态的关系。一些药物，如抑制肌肉收缩类药物、降压类药物、瘢痕治疗药物、抗纤维化药物，直接以细胞力、或细胞对细胞外基质(ECM)的重组作为药物治疗的目标和最终靶点。三维培养有细胞的“模拟细胞外基质水凝胶”会在其内部细胞力的作用下发生体积收缩，通过测量包埋有待测细胞的“模拟细胞外基质水凝胶”的体积(直径)变化，可以映射细胞和细胞微环境间的力学关系。在药物研发过程中，这种直接反映细胞力或细胞-细胞外基质相互作用的系统，将药物功能直接作为药物筛选结果的靶标，具有更大的潜在应用价值。
基于宏观直径变化的药物检测系统，不需要对细胞进行染色、蛋白提取等操作，是一种无损且高效的药物筛选方法。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题，本公开的目的在于提供一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法。
本公开提供了一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，包括：制备超疏水非粘附细胞培养界面；以及制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列。
在本公开的实施例中，所述超疏水非粘附细胞培养界面，采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)修饰法、普兰尼克(Pluronic)自组装法或硅烷试剂化学修饰法。
在本公开的实施例中，所述采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)修饰法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：将聚二甲基硅氧烷(PDMS)前驱体和交联剂均匀混合后，采用旋涂方法将其均匀涂覆在目标界面表面，加热固化后紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
在本公开的实施例中，所述采用普兰尼克(Pluronic)自组装法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：制备普兰尼克质量百分比为0.05％-0.5％的PBS溶液，将其浸润于亲水材料表面；可选地，在PBS溶液中普兰尼克质量百分比为0.2％；普兰尼克作为亲水-疏水-亲水三嵌段聚合物，其亲水段与亲水表面发生自组装，将疏水的环氧丙烷段裸露在基底表面，并抑制细胞粘附。以F127为例，可预先制备2％的F127储液，在使用时稀释到0.2％；将F127工作液加入到孔板或培养皿中，静置至少1小时后，用DI水彻底清洗后晾干，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
在本公开的实施例中，所述采用硅烷试剂化学修饰法制备用于细胞培养的超疏水非粘附界面，包括：采用硅烷试剂，例如二氯二甲硅烷、三甲基氯硅烷对玻璃基底进行修饰，对残余的硅烷进行彻底清洗，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
在本公开的实施例中，所述制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列，包括：采用细胞外基质成分为水凝胶骨架；对水凝胶的大分子骨架进行进一步化学修饰，使其更接近真实细胞微环境，并根据需要为细胞订制不同类型的微环境；对水凝胶预聚液进行均匀点样；以及待凝胶后，加入培养基，使凝胶自发悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列。
在本公开的实施例中，所述细胞外基质成分为水凝胶骨架的步骤中，采用天然细胞外基质大分子蛋白为水凝胶的基本材料，所述天然细胞外基质大分子蛋白包括胶原蛋白、纤维蛋白或纤连蛋白。
在本公开的实施例中，所述对水凝胶基材的大分子骨架进行进一步化学修饰的步骤中，选择巯基-马来酰亚胺反应进行修饰；或者选择包括紫外或催化剂引发的点击反应、席夫碱反应、碳二亚胺反应，对细胞外基质水凝胶进行修饰。
在本公开的实施例中，所述对对水凝胶预聚液进行均匀点样的步骤中，每个样本需要3μl～10μl预凝液。
在本公开的实施例中，所述待凝胶后，加入培养基，使凝胶自发悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列的步骤中，水凝胶悬浮在深度为1.57mm至2.1mm之间的培养基中。以12孔板为例，即该方法采用12孔板作为细胞培养装置，对于生长面积为3.8cm2的超疏水表面(每个孔的培养面积)，适宜的培养基体积为600μl～800μl。
在本公开的实施例中，所述制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列，还包括：设置保湿装置。
在本公开的实施例中，所述设置保湿装置包括：对孔板进行超疏水非粘附处理后，预留出最外围的孔进行加水；或者将筛药用的超疏水非粘附界面置于细胞培养皿中，再将该培养皿置于大一号的盛水培养皿中。
在本公开的实施例中，该方法在形成悬浮的三维水凝胶阵列之后，还包括：采集三维水凝胶阵列中的三维水凝胶直径变化数据；以及对采集的三维水凝胶直径变化数据进行分析，以三维水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果。
在本公开的实施例中，所述采集三维水凝胶阵列中的三维水凝胶直径变化数据，包括：固定焦平面为凝胶所在的疏水面；采用拍照设备对凝胶直径进行实时、无损、动态采集；在同一高度、同一焦平面对该疏水面上的标尺进行拍照，利用图像处理软件将凝胶照片转化为凝胶真实尺寸。
在本公开的实施例中，所述采用拍照设备对凝胶直径进行实时、无损、动态采集时，还包括：在透明的凝胶培养容器底部放置一块黑色的背景板，以增加图像对比度、清晰地采集水凝胶的边缘轮廓。
在本公开的实施例中，所述对采集的三维水凝胶直径变化数据进行分析，包括：采用图像处理软件Image J对凝胶直径进行测量，手动圈出或自动识别图像轮廓；采用FIJI插件，基于WEKA分割构建，实现高通量的凝胶直径变化率分析。
从上述技术方案可以看出，本公开提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，相对于现有技术具有以下有益效果：
本公开提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，通过利用超疏水非粘附界面，将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质水凝胶悬浮于培养基中，以三维水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果，对以细胞收缩力为靶点的药物筛选具有高度的灵敏性，具有通量大、细胞消耗量小，且无需标记、实时动态分析的优势。
本公开提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，通过将细胞与细胞微环境间动态的相互作用纳入药物筛选的评价指标，水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果，与常规的筛药技术相比，将细胞与细胞外基质相互作用作为药物筛选的评价指标，结合了高含量药物筛选和基于靶标的药物筛选的优势，具有高通量、微体积的优势，且操作简便快捷。
本公开提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，结合了“高含量药物筛选(HCS)”、“基于三维细胞微环境的药物筛选”、“基于靶标的药物筛选”的优势，提供了操作便捷、高通量、微体积、高内涵的药物筛选技术。
附图说明
通过以下参照附图对本公开实施例的描述，本公开的上述以及其他目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1为依照本公开实施例的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法的流程图。
图2为依照本公开实施例的借助超疏水非粘附界面高通量生成阵列化微凝胶液滴的照片。
图3为依照本公开实施例的高通量生成悬浮态微凝胶阵列的照片。
图4为依照本公开实施例的高通量阵列化凝胶收缩筛药平台的照片。
图5为依照本公开实施例的高通量凝胶收缩阵列化检测及凝胶内细胞分布分析的照片。
图6为依照本公开实施例的模拟细胞微环境的三维水凝胶在不含细胞的情况下直径稳定的照片，其在培养基中不会自发的溶胀或皱缩，其中左图是三维水凝胶在培养基中1天的照片，右图是三维水凝胶在培养基中3天的照片。
图7为依照本公开实施例的三维培养有待测细胞的仿细胞微环境水凝胶阵列发生体积收缩的照片，其中左图是三维水凝胶悬浮培养1天的照片，右图是三维水凝胶悬浮培养3天的照片。
图8为依照本公开实施例的凝胶的收缩随时间的变化的示意图。
图9为依照本公开实施例的药物刺激改变凝胶的收缩程度的示意图。
具体实施方式
以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
并且图中各部件的形状和尺寸不反映真实大小和比例，而仅示意本公开实施例的内容。另外，在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。
再者，单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。位于元件之前的单词“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。说明书与权利要求书中所使用的序数例如“S1”、“S2”、“S3”等的用词，以修饰权利要求项的步骤，其本身并不意含及代表该请求步骤有任何之前的序数，也不代表某一请求步骤与另一请求步骤的顺序、或是制造方法上的顺序，这些序数的使用仅用来使具有某命名的一请求步骤得以和另一请求步骤能作出清楚区分。
本公开的实施例提供的一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，如图1所示，图1为依照本公开实施例的一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法的流程图。需要注意的是，图1所示仅为可以应用本公开实施例的应用场景的示例，以帮助本领域技术人员理解本公开的技术内容，但并不意味着本公开实施例不可以用于其他环境或场景。
如图1所示，本公开实施例提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：制备超疏水非粘附细胞培养界面；
步骤S2：制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列。
根据本公开的实施例，步骤S1中所述制备超疏水非粘附细胞培养界面，该超疏水非粘附界面具备以下的两个要素：(a)超疏水；(b)低粘附。其中，超疏水是为了在界面张力的作用下，制备圆度高、直径统一的圆形凝胶微液滴。非粘附是为了防止微凝胶贴附于界面上、或与界面产生摩擦，干扰细胞介导的“模拟细胞微环境的三维水凝胶”的收缩效应，提高测试的灵敏度和稳健性。
该超疏水非粘附界面可以采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)修饰法、普兰尼克(Pluronic)自组装法或硅烷试剂化学修饰法等方法来制备超疏水非粘附细胞培养界面。
其中，所述采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)修饰法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：将聚二甲基硅氧烷(PDMS)前驱体和交联剂均匀混合后，采用旋涂等手段将其均匀涂覆在目标界面表面，加热固化后紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。该方法方便快捷，生物相容性高、适用于几乎所有的表面。
所述采用普兰尼克(Pluronic)自组装法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：制备普兰尼克质量百分比为0.05％-0.5％的PBS溶液，将其浸润于亲水材料表面；可选地，在PBS溶液中普兰尼克质量百分比为0.2％；普兰尼克作为亲水-疏水-亲水三嵌段聚合物，其亲水段与亲水表面发生自组装，将疏水的环氧丙烷段裸露在基底表面，并抑制细胞粘附。以F127为例，可预先制备质量百分比为2％的F127储液，在使用时稀释到0.2％。将F127工作液加入到孔板或培养皿中，静置至少1小时后，用去离子水DI彻底清洗后晾干，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
所述采用硅烷试剂化学修饰法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：采用硅烷试剂，例如二氯二甲硅烷、三甲基氯硅烷对玻璃基底进行修饰，对残余的硅烷进行彻底清洗，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
根据本公开的实施例，步骤S2中所述制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列，包括：采用细胞外基质成分作为水凝胶的大分子骨架；对水凝胶基材的大分子骨架进行进一步化学修饰，使其更接近真实细胞微环境，并根据需要为细胞订制不同类型的微环境；对水凝胶预聚液进行均匀点样；以及待凝胶后，加入培养基，使凝胶自发悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列。
在本公开的一些实施例中，所述采用细胞外基质成分作为水凝胶的大分子骨架的步骤中，采用天然细胞外基质大分子蛋白为水凝胶的基本材料，所述天然细胞外基质大分子蛋白包括胶原蛋白、纤维蛋白或纤连蛋白。采用天然细胞外基质大分子蛋白为水凝胶的骨架，具体原则有二：(a)作为细胞外基质、是细胞微环境的主要成分之一；(b)凝胶体积稳定，不会在培养基中发生溶胀或皱缩。实验证明，胶原蛋白(Collagen)、纤维蛋白(fibrin)、纤连蛋白等均是理想的天然细胞外基质大分子蛋白，而胶原蛋白(Collagen)、纤维蛋白(fibrin)、基质胶(matrigel)等均是理想的大分子骨架材料。
在本公开的一些实施例中，所述对作为水凝胶基材的大分子骨架进行进一步化学修饰的步骤中，选择巯基-马来酰亚胺反应进行修饰；或者选择包括紫外或催化剂引发的点击反应、席夫碱反应、碳二亚胺反应，对细胞外基质水凝胶进行修饰。本公开首选巯基-马来酰亚胺反应进行修饰。该体系反应速度快，几乎在1min内完成反应；反应条件温和(ph＝7.4)，不需要催化剂、紫外光的引发手段，生物相容性高。而其他的接枝反应，包括紫外或其他催化剂引发的点击反应、席夫碱反应、碳二亚胺反应等，也可用于细胞外基质水凝胶的修饰。
在本公开的一些实施例中，所述对水凝胶预聚液进行均匀点样的步骤中，每个样本需要3μl～10μl预凝液。如图2所示，图2为依照本公开实施例的借助超疏水非粘附界面高通量生成阵列化微凝胶液滴的照片。
在本公开的一些实施例中，所述待凝胶后，加入培养基，使凝胶自发悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列的步骤中，三维水凝胶悬浮在深度为1.57mm至2.1mm之间的培养基中。以12孔板为例，即该方法采用12孔板作为细胞培养装置，对于生长面积为3.8cm2的超疏水表面(每个孔的培养面积)，适宜的培养基体积为600μl～800μl。
在本公开的一些实施例中，所述制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列，还包括：设置保湿装置。具体而言，对孔板进行超疏水非粘附处理后，预留出最外围的孔进行加水；或者将筛药用的超疏水非粘附界面置于细胞培养皿中，再将该培养皿置于大一号的盛水培养皿中。
在本公开的一些实施例中，本公开提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，在形成悬浮的三维水凝胶阵列之后，还包括：
采集三维水凝胶阵列中的三维水凝胶直径变化数据；以及
对采集的三维水凝胶直径变化数据进行分析，以三维水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果。
根据本公开的实施例，所述采集三维水凝胶阵列中的三维水凝胶直径变化数据，包括：固定焦平面为凝胶所在的疏水面；采用拍照设备(例如手机、数码相机等)对凝胶直径进行实时、无损、动态采集；在同一高度、同一焦平面对该疏水面上的标尺进行拍照，利用图像处理软件将凝胶照片转化为凝胶真实尺寸。如图4所示，图4为依照本公开实施例的高通量阵列化凝胶收缩筛药平台的照片。
在本公开的一些实施例中，所述采用拍照设备对凝胶直径进行实时、无损、动态采集时，还包括：在透明的凝胶培养容器底部放置一块黑色的背景板，以增加图像对比度、清晰的拍出水凝胶的边缘轮廓。
根据本公开的实施例，所述对采集的三维水凝胶直径变化数据进行分析，包括：采用图像处理软件Image J对凝胶直径进行测量，手动圈出或自动识别图像轮廓；采用FIJI插件，基于WEKA分割构建，实现高通量的凝胶直径变化率分析。
如图5至图9所示，图5为依照本公开实施例的高通量凝胶收缩阵列化检测及凝胶内细胞分布分析的照片；图6为依照本公开实施例的模拟细胞微环境的三维水凝胶在不含细胞的情况下直径稳定的照片，其在培养基中不会自发的溶胀或皱缩，其中左图是三维水凝胶在培养基中1天的照片，右图是三维水凝胶在培养基中3天的照片；图7为依照本公开实施例的三维培养有待测细胞的仿细胞微环境水凝胶阵列发生体积收缩的照片，其中左图是三维水凝胶在培养基中1天的照片，右图是三维水凝胶在培养基中3天的照片；图8为依照本公开实施例的胶原凝胶的收缩随时间的变化的示意图；图9为依照本公开实施例的药物刺激改变胶原凝胶的收缩程度的示意图。
从上述图1至图9公开的技术方案可以看出，本公开提供的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，通过利用超疏水非粘附界面，将三维培养有待测细胞的仿细胞微环境水凝胶悬浮于培养基中，以三维水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果，对以细胞收缩力为靶点的药物筛选具有高度的灵敏性，具有通量大、细胞消耗量小，且无需标记、实时动态分析的优势。
基于图1所示的依照本公开实施例的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法的流程图，图2至图9显示了依照本公开实施例的基于模拟细胞微环境的三维水凝胶收缩的高通量药物筛选的具体工艺，该工艺将细胞-细胞微环境相互作用纳入药物筛选的考量范围、直接以细胞对细胞外基质的重组能力作为药物筛选的评价指标、操作简单快捷、可重复性高。该工艺的具体实现过程如下：
(一)采用“超疏水无粘附界面”实现“自动悬浮的微凝胶液滴”的高通量制备。
为了快速制备悬浮于培养基中，且在长期培养过程中不贴附于培养皿底部的“模拟细胞微环境的三维水凝胶”，本公开引入了超疏水非粘附界面，现给出以下实例：
实例一：PDMS涂覆法。本公开优先推荐使用PDMS法。实验证明，PDMS前驱体与交联剂比例并不会影响最终的筛药结果。本公开推荐使用PDMS前驱体与交联剂质量比在1∶10到1∶30之间。利用匀胶机将PDMS前驱体与交联剂混合均匀，除泡后采用匀胶机等手段将其均匀涂覆在目标界面表面，加热固化后紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
实例二：普兰尼克(Pluronic)自组装法。制备含有质量百分比为0.2％Pluronic的PBS溶液，将其浸润于亲水材料表面。Pluronic作为亲水-疏水-亲水三嵌段聚合物，其亲水段与亲水表面发生自组装，将疏水的环氧丙烷段裸露在基底表面，并抑制细胞粘附。以F127为例，可预先制备质量百分比为2％的F127储液，在使用时稀释到0.2％。将F127工作液加入到孔板或培养皿中，静置至少1小时后，用DI水彻底清洗后晾干，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
实例三：硅烷试剂化学修饰法。采用硅烷试剂，如二氯二甲硅烷、三甲基氯硅烷等对玻璃基底进行修饰，同样可用于凝胶微液滴的制备。以二氯二甲基硅烷对玻璃表面进行疏水处理为例，首先在乙醇中对玻璃表面进行超声清洗并晾干。然后使用甲醇对二氯二甲基硅烷进行稀释，制成10％二氯二甲基硅烷的甲醇溶液。将清洗后的玻璃置于二氯二甲基硅烷工作液中，浸泡2h，再用甲醇对残余的硅烷试剂进行彻底清洗，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面。
(二)模拟细胞微环境的三维水凝胶的制备
本公开强调将“细胞-细胞微环境”相互作用引入药物筛选的测评范围，模拟细胞微环境的三维水凝胶的制备在本筛药平台的搭建过程中至关重要。现给出以下实例：
实例一：胶原水凝胶。
(1)细胞外基质是细胞微环境的非细胞部分，胶原蛋白是细胞外基质的重要组成成份。胶原水凝胶体积稳定，在培养基中不会自发进行溶胀或皱缩，其体积变化可直接反应细胞对细胞外基质的重组程度。
(2)与现有的其他胶原凝胶微液滴制备法(微流控芯片法、双液相体系法、微加工设备法)相比，本公开除了具有操作简单、易于将微凝胶悬浮于培养基中、无生物毒性的优势外，还有一个极大的优点：扩大了可用于制备胶原微凝胶的胶原浓度选择范围。以往的胶原微凝胶制备法，往往涉及一些会对胶原凝胶产生强烈冲击的步骤，如微流控芯片法中油相的脱除、双液相法中双液相体系的脱除、微加工设备中培养基的补入。为防止这些操作产生的冲击作用影响胶原微凝胶的形状和完整性，就要求胶原凝胶的模量较高，对应的预凝液中胶原的浓度也会相对较高(2mg/ml及以上)。而本公开对胶原凝胶的冲击性非常小，可用于制造0.5mg/ml甚至更低初始胶原浓度的胶原凝胶。
(3)通过氢氧化钠滴定法确定“将胶原溶液调整到pH为7.4所需的1M NaOH体积”。对于同一批次的胶原，固定该比值不变；对于不同批次的胶原，每次使用前要重新进行NaOH滴定。根据胶原初始浓度和目标浓度确定补加液体的总体积。根据目标细胞浓度确定细胞悬液的使用量。目标总体积减去细胞悬液的体积，再除以10，得到所需10×PBS的体积。其余体积用DI水补齐。在依次计算好以上各成份(胶原原液、1M NaOH、细胞悬液、10×PBS、DI水)的体积后，对以上成分进行预冷。在冰上将DI水、10×PBS、1M NaOH、胶原原液、细胞悬液的依次加入无菌EP管中，迅速混匀，得到混有细胞的胶原水凝胶预凝液。迅速用移液枪将预凝液滴在“超疏水无粘附界面上”，预凝液自发形成圆度高、直径均一的液滴，液滴的体积最小为3μl，如图2所示。可直接预留出孔板最外围的孔进行加水，或将该疏水界面置于较大的培养皿中，并在培养皿中加水，以防止凝胶在聚合过程中失水。37℃恒温一小时，胶原预凝液可完全凝胶。
(4)向“高疏水无粘附”处理的孔板或培养皿内加如完全培养基，胶原凝胶自动与界面脱离，悬浮在培养基中，如图3所示。确保孔内培基的深度控制在1.57mm至2.1mm之间。以12孔板为例，每孔适宜加入600μl到800μl培养基。
实例二：基质胶(Matrigel)水凝胶。
(1)根据目标细胞浓度确定细胞悬液的使用量。根据基质胶目标浓度确定基质胶使用体积，其余体积用细胞完全培养基补齐。依次计算好以上各成份(基质胶原液、细胞悬液、完全培养基)的体积。
(2)在冰上解冻基质胶原液。
(3)在冰上将基质胶原液、细胞悬液、完全培养基依次加入无菌EP管中，迅速混匀，得到混有细胞的基质胶预凝液。迅速用移液枪将预凝液滴在“超疏水无粘附界面上”，预凝液自发形成圆度高、直径均一的液滴，液滴的体积最小为3μl。可直接预留出孔板最外围的孔进行加水，或将该疏水界面置于较大的培养皿中，并在培养皿中加水，以防止凝胶在聚合过程中失水。37℃恒温一小时，基质胶预凝液可完全凝胶。
(4)向“高疏水无粘附”处理的孔板或培养皿内加如完全培养基，基质胶自动与界面脱离，悬浮在培养基中。确保孔内培基的深度控制在1.57mm至2.1mm之间。以12孔板为例，每孔适宜加入600μl到800μl培养基。
(三)数据采集与分析
(1)普通拍照设备(手机、数码相机)即可完成凝胶直径的实时、无损、动态采集。
(2)需要在培养容器底部放置一块黑色的背景板，以便清晰的拍出水凝胶的边缘轮廓，便于后续数据梳理。如图4所示，图4为依照本公开实施例的高通量阵列化凝胶收缩筛药平台的照片。
(3)采用图像处理软件Image J对凝胶直径进行测量，手动圈出或自动识别图像轮廓；或者采用FIJI插件，基于WEKA分割构建，实现高通量的凝胶直径变化率分析。
如图5至图9所示，图5为依照本公开实施例的高通量凝胶收缩阵列化检测及凝胶内细胞分布分析的照片；图6为依照本公开实施例的模拟细胞微环境的三维水凝胶在不含细胞的情况下直径稳定的照片，其在培养基中不会自发的溶胀或皱缩，其中左图是三维水凝胶在培养基中1天的照片，右图是三维水凝胶在培养基中3天的照片；图7为依照本公开实施例的三维培养有待测细胞的仿细胞微环境水凝胶阵列发生体积收缩的照片，其中左图是三维水凝胶在培养基中1天的照片，右图是三维水凝胶在培养基中3天的照片；图8为依照本公开实施例的胶原凝胶的收缩随时间的变化的示意图；图9为依照本公开实施例的药物刺激改变胶原凝胶的收缩程度的示意图。
至此，已经结合附图对本公开进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本公开有了清楚的认识。
需要说明的是，上述仅为“超疏水无粘附界面”的制备实例，不能理解为对本专利发明的限制。凡采用类似思路实现微凝胶的高通量制备的修改、替换、改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。
当然，根据实际需要，本公开还可以包含其他的部分，由于同本公开的创新之处无关，此处不再赘述。
类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个公开方面中的一个或多个，在上面对本公开的示例性实施例的描述中，本公开的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本公开要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多的特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，公开方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本公开的单独实施例。
此外，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。说明书中示例的各个实施例中的技术特征在无冲突的前提下可以进行自由组合形成新的方案，另外每个权利要求可以单独作为一个实施例或者各个权利要求中的技术特征可以进行组合作为新的实施例。再者，附图中未绘示或描述的元件或实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。
除非存在技术障碍或矛盾，本公开的上述各种实施方式可以自由组合以形成另外的实施例，这些另外的实施例均在本公开的保护范围中。
虽然结合附图对本公开进行了说明，但是附图中公开的实施例旨在对本公开优选实施方式进行示例性说明，而不能理解为对本公开的一种限制。附图中的尺寸比例仅仅是示意性的，并不能理解为对本公开的限制。
虽然本公开总体构思的一些实施例已被显示和说明，本领域普通技术人员将理解，在不背离本总体公开构思的原则和精神的情况下，可对这些实施例做出改变，本公开的范围以权利要求和它们的等同物限定。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，包括：
制备超疏水非粘附细胞培养界面；以及
制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列；
其中，所述制备超疏水非粘附细胞培养界面，采用聚二甲基硅氧烷修饰法、普兰尼克自组装法或硅烷试剂化学修饰法；
所述采用聚二甲基硅氧烷修饰法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：将聚二甲基硅氧烷前驱体和交联剂均匀混合后，采用旋涂方法将其均匀涂覆在目标界面表面，加热固化后紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面；
所述采用普兰尼克自组装法制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：制备普兰尼克质量百分比为0.05%-0.5%的PBS溶液，将其浸润于亲水材料表面；普兰尼克作为亲水-疏水-亲水三嵌段聚合物，其亲水段与亲水表面发生自组装，将疏水的环氧丙烷段裸露在基底表面，并抑制细胞粘附；
所述硅烷试剂化学修饰法来制备超疏水非粘附细胞培养界面，包括：采用硅烷试剂对玻璃基底进行修饰，对残余的硅烷进行彻底清洗，再经过紫外辐照灭菌，即可得到超疏水非粘附细胞培养界面；其中，所述硅烷试剂为二氯二甲硅烷或三甲基氯硅烷；
所述制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列，包括：采用细胞外基质成分作为水凝胶的大分子骨架；对水凝胶的大分子骨架进行进一步化学修饰，使其更接近真实细胞微环境，并根据需要为细胞订制不同类型的微环境；对水凝胶预聚液进行均匀点样；以及待凝胶后，加入培养基，使凝胶自发悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列；所述水凝胶的大分子骨架采用天然细胞外基质大分子蛋白；
所述对水凝胶基材的大分子骨架进行进一步化学修饰的步骤中，选择包括紫外或催化剂引发的点击反应、席夫碱反应、碳二亚胺反应，对细胞外基质水凝胶进行化学修饰。
2.根据权利要求1所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述采用细胞外基质成分作为水凝胶的大分子骨架的步骤中，所述天然细胞外基质大分子蛋白为胶原蛋白、纤维蛋白或纤连蛋白。
3.根据权利要求1所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述对水凝胶预聚液进行均匀点样的步骤中，每个样本需要3μl ~10μl预凝液。
4.根据权利要求1所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述待凝胶后，加入培养基，使凝胶自发悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列的步骤中，三维水凝胶悬浮在深度为1.57mm至2.1mm之间的培养基中。
5.根据权利要求4所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，该方法采用12孔板作为细胞培养装置，对于每个孔的培养面积为3.8cm2的超疏水表面，适宜的培养基体积为600μl ~800μl。
6.根据权利要求1所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述制备模拟细胞微环境的仿细胞外基质三维水凝胶，利用所述超疏水非粘附细胞培养界面高通量地将三维培养有待测细胞的仿细胞外基质三维水凝胶悬浮于培养基中，形成悬浮的三维水凝胶阵列，还包括：设置保湿装置。
7.根据权利要求6所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述设置保湿装置包括：
对孔板进行超疏水非粘附处理后，预留出最外围的孔进行加水；或者
将筛药用的超疏水非粘附界面置于细胞培养皿中，再将该培养皿置于大一号的盛水培养皿中。
8.根据权利要求1所述所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，该方法在形成悬浮的三维水凝胶阵列之后，还包括：
采集三维水凝胶阵列中的三维水凝胶直径变化数据；以及
对采集的三维水凝胶直径变化数据进行分析，以三维水凝胶的面积收缩率作为药物筛选的读出结果。
9.根据权利要求8所述所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述采集三维水凝胶阵列中的三维水凝胶直径变化数据，包括：
固定焦平面为凝胶所在的疏水面；
采用拍照设备对凝胶直径进行实时、无损、动态采集；
在同一高度、同一焦平面对该疏水面上的标尺进行拍照，利用图像处理软件将凝胶照片转化为凝胶真实尺寸。
10.根据权利要求9所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述采用拍照设备对凝胶直径进行实时、无损、动态采集时，还包括：
在透明的凝胶培养容器底部放置一块黑色的背景板，以增加图像对比度、清晰的拍出水凝胶的边缘轮廓。
11.根据权利要求8所述的用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法，其特征在于，所述对采集的三维水凝胶直径变化数据进行分析，包括：
采用图像处理软件Image J对凝胶直径进行测量，手动圈出或自动识别图像轮廓；
采用FIJI插件，基于WEKA分割构建，实现高通量的凝胶直径变化率分析。
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