CN112522199A - 一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3d凝胶载体及多细胞球培养方法 - Google Patents

一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3d凝胶载体及多细胞球培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体及多细胞球培养方法，本方法与传统不同，本发明通过控制抗/促细胞粘附成分的比例，基于PEGDA/GelMA粘附位点控制材料表面的细胞粘附位点密度，使细胞存在于有限粘附的微环境之中，自组织形成多细胞球，最大程度的模拟了肿瘤细胞组织的生理作用及其环境，更接近真实生物环境最终自组织形成多细胞球。

Description

一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体及多细胞 球培养方法
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，尤其涉及3D肿瘤细胞成球技术。
背景技术
药物筛选是指利用适当的筛选方法和技术，建立合适的筛选模型，从可能作为药物使用的天然或合成化合物中得到高效的先导化合物，对其进行药理及药效活性的检测，评价某一化合物的药用前景的方法，是新药研发中缩短时间、减少成本和降低风险的关键步骤。传统的细胞筛选模型所利用的细胞通常是由病理部位细胞通过细胞培养等手段得到的单层细胞或单细胞的悬浮液，呈平面生长，缺乏细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的接触，细胞所处的环境与实体微环境截然不同。同氨基酸的盘曲折叠形成不同构象的蛋白质功能不同一样，细胞的堆积方式不同，它的特性也不尽相同，通过普通的平面2D细胞筛选得到的结果不能非常准确地反应药物在人体内的作用效果。例如，多年来癌症药物的发现主要是基于它对癌细胞的杀伤能力和精确抑制癌细胞基因的能力，这些化合物在使肿瘤部分或完全消退的同时，会伴随着大量的细胞毒性累积。而利用2D筛选模型得到的抗癌药物在杀灭病理细胞之后，积累的毒性可能会转而攻击周围的正常细胞。这使得大部分的抗癌药物后期都无法通过临床试验，浪费了大量的人力、物力与时间。所以，2D细胞筛选模型已经无法满足人们的需要。随着组织工程学的发展，人们致力于开发能更好地代表体内生物学的3D培养技术培养肿瘤模型，同时更趋向于大批量和小型化。
现有主流的体外药效的评价方法是采用3D肿瘤成球技术，其依赖于通过剥夺细胞与培养皿间的粘附，迫使肿瘤细胞被动成球(如图1所示)，但该方法存在以下缺陷：(1)一些细胞只能形成松散的聚集体，而不能形成具有生理屏障的多细胞球，因此某些肿瘤细胞无法实现真正的三维培养。(2)这种方法给细胞提供的无粘附微环境在体内并不常见，无法真实模拟体内环境。(3)整个人体内的细胞外基质有很大差异，从细胞外环境的结构和生化组成来看，是每个器官高度特异性，因此无法真实模拟体内细胞和细胞外基质的相互作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的就是提供了一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体及多细胞球培养方法，
为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体，通过以下方法制备获得：
首先，将交联剂BIS、抗细胞粘附组分A和促细胞粘附组分B，加入PBS溶液中，然后加入交联引发剂，在振荡或搅拌条件下水浴加热至50-60℃完全溶解得到水凝胶溶液；
然后，将水凝胶溶液注入透明模具中，控制温度在20-35℃，进行波长为405nm的光照，发生固化反应得到3D凝胶；
最后，将得到3D凝胶浸入PBS溶液中，并通过环氧乙烷进行灭菌处理，备用；
所述抗细胞粘附组分为PEGDA、丙烯酰胺或聚乙烯醇；所述促细胞粘附组分为GelMA、丙烯酰氨基胶原、丙烯酰氨基纤维蛋白原。
进一步的，所述交联引发剂为LAP。
本发明还提供了一种结直肠癌细胞LOVO的多细胞球培养方法，将结直肠癌细胞LOVO 以0.1-0.2X106的密度接种在上述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃， 4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、10％、0.5％。
本发明还提供了一种胃癌细胞SGC7901多细胞球培养方法，将胃癌细胞SGC7901以0.1-0.2X106的密度接种在上述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、15％、0.5％。
本发明还提供了一种卵巢癌细胞SKOV3多细胞球培养方法，将卵巢癌细胞SKOV3以0.1-0.2X106的密度接种在上述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、5％、0.5％。
本发明还提供了一种乳腺癌细胞MCF-7多细胞球培养方法，将乳腺癌细胞MCF-7以0.1-0.2X106的密度接种在撒很述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、20％、0.5％。
有益效果：与传统通过完全剥夺细胞粘附的方法制备多细胞球的方法不同，本发明通过给细胞提供“有限粘附”的微环境，诱导细胞通过迁移、聚集等方式自组织形成多细胞球，最大程度的模拟了肿瘤细胞组织的生理作用及其环境。
附图说明
图1为现有技术多细胞球的培养流程示意图。
图2为本发明实施例1直肠癌细胞DLD1在本发明3D凝胶载体培养的细胞光学显微表征图，比例尺：200微米。
图3为通过本发明实施例1诱导形成的人结直肠癌LOVO和人卵巢癌细胞SKOV-3多细胞球的细胞凋亡数量柱状对比图(**P<0.01,***P<0.001)。
图4为本发明实施例1直肠癌细胞DLD1形成的多细胞球的激光共聚焦表征图。蓝色：细胞核；绿色：E钙粘素；比例尺，50微米。
图5为相同肿瘤化疗药物多比柔星处理下，通过本发明实施例1诱导形成的人结直肠癌 LOVO和人卵巢癌细胞SKOV-3多细胞球的细胞存活率柱状对比图；
图6为本发明实施例2胃癌细胞SGC7901培养于凝胶表面7天后形成多细胞球光学显微表征图，比例尺：200微米。
图7为本发明实施例3卵巢癌细胞SKOV3培养于凝胶表面7天后形成多细胞球光学显微表征图，比例尺：200微米。
图8为本发明实施例4乳腺癌细胞MCF-7培养于凝胶表面7天后形成多细胞球光学显微表征图，比例尺：200微米。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解这些实施例仅用于说明。本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
文中物质组分缩写解释：
PBS溶液：磷酸缓冲盐溶液
交联剂BIS：甲叉丙烯酰胺、N,N′二甲基双丙烯酰胺
PEGDA：聚乙二醇双丙烯酸酯
GelMA：甲基丙烯酸酐化明胶
LAP：蓝光引发剂
实施案例1：PEGDA/GelMA粘附位点可调凝胶的制备以及结直肠癌细胞LOVO多细胞球的形成：
步骤1、将PEGDA和GelMA，以及BIS加入PBS中，在55℃浴条件下充分搅拌使各组分溶解，充分溶解后加引发剂LAP，得到水凝胶溶液，其中PEGDA，GelMA和BIS的质量比 (wt％)分别为10％,10％,0.5％；
步骤2、将水凝胶溶液注入透明模具中，25℃下引发材料物理交联，使波405nm的光照射凝胶使其彻底固化，得到具有互穿网络的凝胶一；将凝胶一浸泡于PBS中，随后置于6孔板中环氧烷对其进灭菌，以备于细胞培养；
步骤3、将结直肠癌细胞LOVO以0.2X106的密度接种在经过灭菌处理的凝胶一表面，37℃5％二氧化碳的环境下培养，每两天更换一次培养液。7天后，多细胞结构形成，如图2所示光学显微表征图。
实施案例2：PEGDA/GelMA粘附位点可调凝胶的制备以及胃癌细胞SGC7901多细胞球的形成：
步骤1、将PEGDA和GelMA，以及BIS加入PBS中，在55℃浴条件下充分搅拌使各组分溶解，充分溶解后加引发剂LAP，得到水凝胶溶液，其中PEGDA，GelMA和BIS的质量比 (wt％)分别为10％,15％,0.5％；
步骤2、将水凝胶溶液注入透明模具中，25℃下引发材料物理交联，使波405nm的光照射凝胶使其彻底固化，得到具有互穿网络的凝胶一；将凝胶一浸泡于PBS中，随后置于6孔板中环氧烷对其进灭菌，以备于细胞培养；
步骤3、将胃癌细胞SGC7901以0.2X106的密度接种在经过灭菌处理的凝胶表面，37℃5％二氧化碳的环境下培养，每两天更换一次培养液。7天后，多细胞结构形成，如图6所示光学显微表征图。
实施案例3：PEGDA/GelMA粘附位点可调凝胶的制备以及卵巢癌细胞SKOV3多细胞球的形成：
步骤1、将PEGDA和GelMA，以及BIS加入PBS中，在55℃浴条件下充分搅拌使各组分溶解，充分溶解后加引发剂LAP，得到水凝胶溶液，其中PEGDA，GelMA和BIS的质量比 (wt％)分别为10％,5％,0.5％；
步骤2、将水凝胶溶液注入透明模具中，25℃下引发材料物理交联，使波405nm的光照射凝胶使其彻底固化，得到具有互穿网络的凝胶一；将凝胶一浸泡于PBS中，随后置于6孔板中环氧烷对其进灭菌，以备于细胞培养；
步骤3、将卵巢癌细胞SKOV3以0.2X106的密度接种在经过灭菌处理的凝胶表面，37℃5％二氧化碳的环境下培养，每两天更换一次培养液。7天后，多细胞结构形成，如图7所示光学显微表征图。
实施案例4：PEGDA/GelMA粘附位点可调凝胶的制备以及乳腺癌细胞MCF-7多细胞球的形成：
步骤1、将PEGDA和GelMA，以及BIS加入PBS中，在55℃浴条件下充分搅拌使各组分溶解，充分溶解后加引发剂LAP，得到水凝胶溶液，其中PEGDA，GelMA和BIS的质量比 (wt％)分别为10％,20％,0.5％；
步骤2、将水凝胶溶液注入透明模具中，25℃下引发材料物理交联，使波405nm的光照射凝胶使其彻底固化，得到具有互穿网络的凝胶一；将凝胶一浸泡于PBS中，随后置于6孔板中环氧烷对其进灭菌，以备于细胞培养；
步骤3、将乳腺癌细胞MCF-7以0.2X106的密度接种在经过灭菌处理的凝胶表面，37℃5％二氧化碳的环境下培养，每两天更换一次培养液。7天后，多细胞结构形成，如图8所示光学显微表征图。
本发明与传统通过完全剥夺细胞粘附的方法制备多细胞球不同，本发明的原理为通过给细胞提供“有限粘附”的微环境，诱导细胞通过迁移、聚集等方式自组织形成多细胞球。具体而言，通过控制抗/促细胞粘附成分的比例，控制材料表面的细胞粘附位点密度，使细胞存在于一个“有限粘附”的微环境之中，在这样的环境中细胞仍然能够在基质材料表面粘附、迁移，并最终自组织形成多细胞球。因此本发明通过在有限粘附表面(水凝胶)诱导形成的多细胞球，均匀分散，细胞凋亡数量显著低于悬滴法形成的多细胞球(图3所示)；形成的多细胞球具有更高的化疗药物抗性，如图4和5所示，诱导形成的人结直肠癌LOVO和人卵巢癌细胞SKOV-3 多细胞球在相同肿瘤化疗药物多比柔星处理下，细胞活性显著高于悬滴法形成的多细胞球。

Claims (6)

1.一种用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体，其特征在于通过以下方法制备获得：
首先，将交联剂BIS、抗细胞粘附组分A和促细胞粘附组分B，加入PBS溶液中，然后加入交联引发剂，在振荡或搅拌条件下水浴加热至50-60℃完全溶解得到水凝胶溶液；
然后，将水凝胶溶液注入透明模具中，控制温度在20-35℃，进行波长为405nm的光照，发生固化反应得到3D凝胶；
最后，将得到3D凝胶浸入PBS溶液中，并通过环氧乙烷进行灭菌处理，备用；其中，所述抗细胞粘附组分为PEGDA、丙烯酰胺或聚乙烯醇；所述促细胞粘附组分为GelMA、丙烯酰氨基胶原、丙烯酰氨基纤维蛋白原。
2.根据权利要求1所述用于细胞诱导自组织成多细胞球的3D凝胶载体，其特征在于：所述交联引发剂为LAP。
3.一种结直肠癌细胞LOVO的多细胞球培养方法，将结直肠癌细胞LOVO以0.1-0.2X106的密度接种在权利要求1或2所述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、10％、0.5％。
4.一种胃癌细胞SGC7901多细胞球培养方法，将胃癌细胞SGC7901以0.1-0.2X106的密度接种在权利要求1或2所述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、15％、0.5％。
5.一种卵巢癌细胞SKOV3多细胞球培养方法，将卵巢癌细胞SKOV3以0.1-0.2X106的密度接种在权利要求1或2所述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、5％、0.5％。
6.一种乳腺癌细胞MCF-7多细胞球培养方法，将乳腺癌细胞MCF-7以0.1-0.2X106的密度接种在权利要求1或2所述3D凝胶载体的表面，并置于培养液中，在温度为37±2℃，4-5％二氧化碳浓度的环境下进行培养，每两天更换一次培养液，培养至少7天后，完成多细胞球结构培养；其中，在制备3D凝胶载体过程中，水凝胶溶液中添加的PEGDA、GelMA和交联剂BIS的质量比分别为10％、20％、0.5％。
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