CN115644164A

CN115644164A - 细胞保存液的制备方法及制备获得的细胞保存液

Info

Publication number: CN115644164A
Application number: CN202210501843.4A
Authority: CN
Inventors: 朱智彬; 魏明军; 雷思佳; 陈依琳; 肖小玲; 洪柳妮; 朱理圳; 叶妙妙; 雷大庆; 陈塨仪
Original assignee: Shenzhen Cell Inspire Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Cell Inspire Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2023-01-31

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞保存液的制备方法及制备获得的细胞保存液。本发明的一个目的在于提供一种制备细胞保存液的方法，获得一种能够在长期运输维持细胞活性，且能够用于高浓度针剂的细胞保存液。通过3D化形成细胞球后在生理盐水中以一定的条件下进行培养，细胞球在该条件下会分泌大量有利于细胞存活的分泌因子，在培养一定的时间后去除细胞，只保留细胞的分泌产物，在常规的细胞运输过程中使用该培养上清，有利于细胞在运输过程中的保护。可延长保存时间，提高细胞活率。

Description

细胞保存液的制备方法及制备获得的细胞保存液

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞保存液的制备方法及制备获得的细胞保存液。

背景技术

MSCs或者成纤维细胞在临床使用过程中往往需要长途运输，细胞在运输过程中细胞活率和活性均会受到运输环境的影响而导致下降，如使用的细胞经历过冻存复苏，细胞的活率及活性比较低，在生理盐水中的保存时间较短。而在临床应用的过程中往往需要10小时乃至2-3天的运输时间，不利于细胞的运输应用。

生理盐水是最常用的细胞重悬液，是细胞运输过程中的保存液体最常用的液体，本身属于临床用品，优势在于实验室制备好细胞重悬后不需要再次处理，可直接用于临床。生理盐水在短期运输可以使用，其保证细胞的活性时间约10h，但在长期运输过程中细胞活性会随时间逐渐下滑，无法进行长途运输，尤其是在制备成高浓度针剂的情况下。

因此，亟需开发一种能够在长期运输维持细胞活性，且能够用于高浓度针剂的细胞保存液。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种制备细胞保存液的方法，获得一种能够在长期运输维持细胞活性，且能够用于高浓度针剂的细胞保存液。

通过3D化形成细胞球后在生理盐水中以一定的条件下进行培养，细胞球在该条件下会分泌大量有利于细胞存活的分泌因子，在培养一定的时间后去除细胞，只保留细胞的分泌产物，在常规的细胞运输过程中使用该培养上清，有利于细胞在运输过程中的保护。可延长保存时间，提高细胞活率。

为此，本发明第一方面提供一种细胞保存液的制备方法。根据本发明的实施方案，所述制备方法包括：

(1)制备3D细胞球；

(2)对所述3D细胞球进行重悬，并进行孵化，以便获得细胞球悬液；

(3)去除所述细胞球悬液中的细胞组分，以便获得细胞保存液，

其中，所述孵化的温度为0℃-37℃，孵化时间为2h-170h。

细胞保护液是一种专门配制的用于细胞保存的液体，细胞在保存其中的活性能够相对较长时间的保护。使得细胞可以在0℃-20℃区间内在较长的时间内维持细胞的活性。但重悬液本身成分上往往由非临床药品组成，长途运输后在使用前往往需要重新去除重悬液后再使用，一方面增加了使用负担，也增加了使用成本，常规细胞保存液的浓度往往为1～2*10^6cells/mL密度，无法用于高浓度针剂。本发明提供一种细胞保存液，在不使用外源性添加物的条件下使得细胞在重悬液中以高浓度的状态下存活时间延长，并使细胞经过运输后无需进行额外处理即可满足临床上的使用要求。

通过3D化形成细胞球后在生理盐水中以一定的条件下进行培养，细胞球在该条件下会分泌大量有利于细胞存活的分泌因子，在培养一定的时间后去除细胞，只保留细胞的分泌产物，在常规的细胞运输过程中使用该培养上清，有利于细胞在运输过程中的保护。可延长保存时间，提高细胞活率。使用该保护液的细胞活率仍能在72h内保持80％以上的活率，适用于长时间的运输。有利于细胞的临床使用。本发明通过3D细胞球制备注射剂级别的细胞保护剂。

根据本发明的实施方案，所述3D细胞球中含有的细胞选自间充质细胞。

根据本发明的实施方案，所述3D细胞球中含有的细胞选自所成纤维母细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的至少之一。

根据本发明的实施方案，所述3D细胞球的形成方法包括自成球和载体成球。

根据本发明的实施方案，在步骤(2)中，对所述3D细胞球进行重悬时所用的重悬液选自氯化钠注射液、复方氯化钠注射液、乳酸钠林格注射液、葡萄糖注射液中的至少之一。

使用的细胞悬液本身为临床级注射液，安全性可靠，不添加外源性的保护物质，降低了长途运输的使用难度，使得细胞在长途运输后可直接使用。成纤维母细胞冻存复苏的活率比较低，通过使用本技术方案悬液，成纤维母细胞在本技术方案悬液中可有效延长细胞数量及细胞活率，增加了使用方便性，而在间充质干细胞制备的悬液中，间充质干细胞在本技术方案制备的悬液中可延长在常温下细胞的活率。

根据本发明的实施方案，制备3D细胞球的方法包括：

1)取出冻存的细胞进行复溶和重悬；

2)将重悬后的所述细胞在含有4-8％FBS的DMEM培养基中培养；

3)对培养后的所述细胞进行胰酶消化，获得消化后的细胞；

4)将所述消化后的细胞进行重悬，获得细胞重悬液；

5)将所述细胞重悬液接种至培养皿中，进行培养，以便获得3D细胞球。

根据本发明的实施方案，步骤4)中，利用生理盐水对所述消化后的细胞进行重悬，重悬浓度为0.8-1.2万个细胞/30ul。

本发明第二方面提供一种细胞保存液。根据本发明的实施方案，通过第一方面所述的制备方法制备获得。

本发明第三方面提供一种针剂。根据本发明的实施方案，所述针剂含有第二方面所述的细胞保存液。

本发明第四方面提供一种针剂的保存方法。根据本发明的实施方案，所述保存方法包括将针剂中含有的细胞重悬在第二方面所述的细胞保存液中，其中，所述细胞保存液中细胞的浓度为1-2*10^7个细胞/ml。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了本发明一个实施方案的细胞球悬液制备流程图；

图2显示了本发明实施例1中MSCs 2D培养上清以及3D球培养上清中TNF-β、VEGF、透明质酸、ANG-1的含量；

图3显示了本发明实施例2中MSCs不同成球方式细胞球形态，其中A图为悬滴法成球光镜图10X；B图为悬滴法DAPI染色；C图为低吸附板制备的细胞球20X；D图为光镜下微载体细胞球10X；E图为微载体培养的活细胞染料染色后细胞图10X；

图4显示了本发明实施例3中不同细胞数成球后细胞形态大小，A图显示了A组5000细胞成球10X；B图显示了B组10000细胞成球10X；C图显示了C组20000细胞成球10X；D图显示了D组30000细胞成球10X；

图5展示了本发明实施例3中细胞球直径随时间变化图；

图6展示了本发明实施例4中传代细胞成球状态(A图)和复苏细胞成球状态(B图)；

图7展示了本发明实施例4中A组24小时成球状态10X(A图)；B组48h细胞成球状态20X(B图)；C组细胞72h成球状态20X(C图)；

图8展示了本发明实施例5中组别A细胞球状态(A图)和组别B细胞球状态(B图)；

图9展示了本发明实施例6中组别A-F细胞球状态(按顺序分别对应A-F图)；

图10展示了本发明实施例6中A-C组细胞球荧光显微镜下观察的状态(按顺序分别对应A-C图)，红色荧光为PI，蓝色荧光为DAPI；

图11展示了本发明实施例7中不同的孵化液种类探究对免疫细胞活性影响；

图12展示了本发明实施例7中A-D组的细胞球形态(按顺序分别对应A-F图)，蓝色荧光为DAPI，红色荧光为PI；。

图13展示了本发明实施例8中细胞球在正常培养瓶中结果图；

图14展示了本发明实施例8中MSCs表型流式检测图；

图15分别展示了本发明实施例8中成脂分化鉴定(A图)、成软骨分化鉴定(B图)和成骨分化鉴定(C图)结果；

图16展示了实施例9中悬液中MSCs的计数图；

图17展示了实施例11中细胞球悬液对肝细胞的毒性测试；

图18展示了采用本发明实施例中方法制备获得的1w细胞经过两天的培养转移到低吸附板中的细胞球形态；

图19展示了采用本发明实施例方法制备获得的1w细胞经过7天的孵化后细胞通过染色鉴定细胞球内细胞形态；

图20展示了采用本发明实施例方法制备获得的细胞球置于贴壁板中贴壁性能；

图21展示了采用本发明实施例方法制备获得的成球后的间充质干细胞在经过培养后通过流式鉴定，细胞表达间充质干细胞的标准标志物的状态；

图22展示了20h后MSCs用台盼蓝染色后细胞状态；

图23展示了MSCs悬液对免疫细胞的抑制作用。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 3D细胞球和2D培养细胞的对比

MSC细胞成球型成的3D结构有利于细胞分泌更高的细胞保护相关的因子，同时可以增加MSCs细胞对于环境的抗性，促进细胞的生存，为此，对3D的MSCs与2D培养的MSC细胞进行对比测试。

实验流程：将培养瓶中的MSCs细胞用0.125％的胰酶进行消化3分钟，用培养上清进行终止消化。用生理盐水清洗一次细胞，离心收集细胞，用生理盐水定容至一定体积后进行计数，取出两管500w的MSC细胞，重新离心，去除上清，添加适量的新鲜MSC培养基，一管重悬后加入T75瓶中，另一管细胞用悬滴法添加至6cm平皿盖子上，使细胞悬液滴倒置在平皿内，置于5％的CO₂培养箱中培养48小时，之后取出培养瓶和平皿，将平皿内的细胞球全部进行收集至离心管中，去除上清培养液，培养瓶中的培养上清也一样去除，用生理盐水清洗两遍，之后用林格氏液进行重悬，之后置于1-10℃的冰箱中孵化5天，5天后收集上清，用过滤器进行过滤，排除细胞及细胞碎片，收集至新的离心管中作为测试备用。

表1展示了3D细胞球与2D培养对比实验设计方案。

表1

将制备的样品取出适量的样品，进行ELISA实验，实验方法按照ELISA试剂盒使用说明书进行实验操作。

3D细胞球与2D培养状态结果如表2所示

表2

细胞源	原始细胞数量	孵化时间	细胞状态
				T75培养瓶	5*10^6	5d	死亡
3D细胞球	5*10^6	5d	存活

比较MSCs 2D培养上清以及3D球培养上清中TNF-β、VEGF、透明质酸、ANG-1的含量，结果如图2所示。

结论：通过比较MSCs 2D培养上清以及3D球培养上清中TNF-β、VEGF的含量证明了3D培养的MSCs具有更高的TNF-β、VEGF、透明质酸含量，但ANG-1无明显差异性。

实施2MSCs成球方式实验

实验设计

3D化细胞培养有多种方法，通过不同的方法测试最佳的细胞球成球方式。

实验流程：将培养瓶中的细胞通过0.125％的胰酶进行消化收集，计数，按照下表分别取出足量的细胞，并分别按照不同方法制备细胞球。低吸附板：用适量培养基重悬后将细胞悬液加入到低吸附板中。悬滴法：用适量的培养基重悬后用排枪将细胞悬液滴于平皿皿盖上，倒转使液滴悬在平皿盖上。3D支架：将细胞离心后用1ml的培养基进行重悬，然后缓慢均匀滴到3D支架上，放于培养箱中静止30分钟，之后用适量的培养基加入到3D支架的容器内。3D微载体：用少量的培养基将3D微载体浸润，之后将细胞悬液添加到含3D微载体的容器内。2D培养：将细胞悬液接种至培养瓶中。

所有的样品处理完之后将全部样品置于含有5％CO₂的培养箱内培养48h。之后取出适量的细胞球，用DAPI染料添加到样品中，对细胞存活状态进行观察。表3展示了不同细胞成球方式。

表3

图3展示了表3中不同成球方式获得的细胞球形态，其中A图为悬滴法成球光镜图10X；B图为悬滴法DAPI染色，表明悬滴法制备的细胞球，大小较为均一，细胞直径适中，染色后观察细胞球内部形成致密细胞连接体，细胞密度较大。

C图为低吸附板制备的细胞球20X，表明细胞球用低吸附板制备，细胞球大小不均一，细胞球较小。

D图为光镜下微载体细胞球10X，E图为微载体培养的活细胞染料染色后细胞图10X，表明微载体培养的细胞球大小均一，细胞状态接近2D培养状态，微载体细胞球密度较低，细胞呈延展状态。

结论：通过不同的成球方式比较，带支架成球的方式形成的细胞球功能上更贴近于2D培养的细胞，而从细胞功能和形态上自发成球的方式则优于支架成球的方式，在自发成球的方法中，悬滴法形成的细胞球更均匀。后续实验均以悬滴法制备MSCs细胞球。

实施例3细胞球大小对细胞球直径和功能的影响

MSCs球的大小会影响细胞的功能以及存活能力，因此对不同细胞数量型成的细胞球的大小进行评估，并且对在林格氏液中细胞的大小变化进行测量。

实验流程：根据组别的设置分别取出对应的MSCs细胞，用培养基重悬成细胞悬液，按照实施例2悬滴法的制备方法制备出不同细胞数量的细胞球。在含有5％CO2的37℃培养箱中培养48h后，取出适量的细胞球在显微镜下用标尺对细胞球的直径进行测量。之后用林格氏液替换培养基，将细胞置于1-10℃的培养箱内进行孵化。每天取出适量的细胞球并在显微镜下进行观察测量。分别设置A、B、C、D四组进行比较，如表4所示设计方案，图4显示了不同细胞数成球后细胞形态大小。表5为细胞成球后的直径大小，图5展示了细胞球直径随时间变化图。

表4

组别	细胞数量/每球	成球时间
			A	0.5*10^4	48h
B	1*10^4	48h
			C	2*10^4	48h
D	3*10^4	48h

表5

结论：不同细胞数成球后细胞形态大小均有所不同，当细胞数较大或较小形成的细胞球体表面容易不规则，过小的细胞球功能较差，而过大的细胞球容易形成坏死中心不利于细胞存活，所有的组别在6天的时间内细胞球的直径变化不大，6天后细胞球的直径发生略微增长，细胞球越小细胞球直径增长越大，组别C在所有组别中细胞球状态及细胞球直径最为稳定，故后续实验均使用该方案。

实施例4细胞成球前状态对成球差异性和细胞成球时间最优测试

1、细胞成球前状态对成球差异性

成球前细胞的活性对细胞的成球性具有一定的影响，通过细胞球的成球性来测试复苏的细胞和传代的细胞哪个成球性更佳。

实验流程：冻存细胞球样品：取一支冻存的MSCs细胞，在水浴锅中快速复溶，之后添加到10ml的生理盐水中，离心清洗细胞，之后定容计数，取出适量的细胞按照实施例2中悬滴法的方案制备细胞球。

培养中的细胞成球：用0.125％的胰酶把在培养瓶中的细胞消化下来，培养上清终止消化，清洗细胞并计数。取出适量的细胞按照实施例2中悬滴法的方案制备细胞球。

表6展示了细胞成球性实验方案，表7展示了实验结果。

表6

表7

图6展示了传代细胞成球状态和复苏细胞成球状态，结论：直接复苏使用的细胞活性较差，在成球过程中不容易成一个单球，而传代而来的细胞成球在液滴中可稳定的形成一个独立的细胞球，有利于稳定细胞球的质量，后续形成细胞球所使用的细胞均来之培养中的细胞。

2、细胞成球时间最优测试

由于细胞需要一定的时间形成细胞球，但悬滴的培养基体积较小不利于细胞的生存，通过测试细胞成球的时间找出最佳的细胞球形成时间。

实验流程：用0.125％胰酶消化培养中的细胞，取出适量的细胞按照实施例2中悬滴法的方法制备成细胞球，将细胞球置于5％CO₂的培养箱中按照下表的时间进行培养。

表8展示了细胞成球时间方案实验及细胞球状态。图7中展示了不同组别成球状态。

表8

图7结果表明，细胞在24h内无法有效的形成细胞球，而72h的细胞球由于营养物质的缺乏导致坏死中心的产生，48h为最佳成球时间。

实施例5成球细胞液滴最优测试和孵化前是否经过低吸附板培养

1、成球细胞液滴最优测试

细胞用悬滴法成球培养过程中需要培养基作为重悬液，通过监测成球性来确认最佳的液滴体积。

实验流程：用0.125％胰酶消化培养中的细胞，取出适量的细胞按照下表中培养基的体积对细胞进行重悬，之后按照2.3.2中悬滴法的方法制备成细胞球。置于5％CO2的培养箱中进行48h的培养，48h后对细胞球的状态进行观察评估。表9展示了不同液滴对细胞成球影响。

表9

结论：细胞滴是通过悬滴法制备，其最大可悬挂液滴为40ul，过大或过小的液滴不利于细胞成球，30ul的液滴为最合适液滴量。

2、孵化前是否经过低吸附板培养

细胞球在转入林格氏液前如经过培养基的短暂培养可进一步促进细胞球的状态，因此对细胞球是否经过培养进行测试。

实验流程：用0.125％胰酶消化培养中的细胞，取出适量的细胞按照实施例2中悬滴法的方法制备成细胞球，在5％CO2的培养箱中进行培养48h培养，之后将细胞球进行收集，组别A的细胞球收集至培养板中，添加适量的培养基，再培养箱中培养48h，组别B的则使用生理盐水在1-10℃的冰箱中培养48h之后对两组的细胞球状态进行观察，组别A和B为2*10^4细胞数量/每球。

图8展示了组别A细胞球状态，细胞球边缘较为平滑；组别B细胞球状态，细胞球边缘较为粗糙。结论：细胞球直径上没有明显变化，但经过低吸附板培养的细胞球细胞球表面更光滑细胞球更紧密，更有利于细胞生存。

实施例6孵化温度和液体对细胞球的影响

1、孵化温度对细胞球的影响

细胞球形成后需要孵化进行收集细胞分泌能力，为了确保最佳孵化温度以细胞存活死亡作为测试目标测试最佳温度以及细胞孵化液。

实验流程：用0.125％胰酶消化培养中的细胞，取出适量的细胞按照悬滴法的方法制备成细胞球，在5％CO2的培养箱中进行培养48h培养，之后将细胞球进行收集，用生理盐水对细胞球进行清洗去除残余培养基，按照下表10进行分组，在不同孵化液体和不同的温度条件下进行48h的孵化，之后取出适量的细胞球用DAPI/PI对细胞的存活/死亡状态进行染色，并在显微镜下进行观察。表11展示了各组别细胞球孵化温度及孵化液体测试结果，图9展示了各组别细胞球状态。

表10

表11

结论：通过设计不同的温度对细胞球的孵化显示，在1-10℃组和高温组细胞球可以保持较好的活性，而只有在盐水作为孵化液可让细胞在低温中仍保持存活能力。

2、孵化液体对细胞球影响

细胞球在盐水中可以保存并发挥适当的功能，为选出保存效果最佳的细胞球孵化液，选用了常规临床上使用较多的回输液作为细胞的孵化液实验。

实验流程：用0.125％胰酶消化培养中的细胞，取出适量的细胞按照实施例2中悬滴法的方法制备成细胞球，在5％CO2的培养箱中进行培养48h培养，之后将细胞球进行收集，用生理盐水对细胞球进行清洗去除残余培养基，按照下表12进行分组，在不同孵化液体7天的孵化，之后取出适量的细胞球用DAPI/PI对细胞的存活/死亡状态进行染色，并在显微镜下进行观察。

表12

图10展示了A-C组细胞球荧光显微镜下观察的状态，结论：经过7天孵化林格和葡萄糖注射液中细胞球中的细胞存活率更高，但经过后续测试，葡萄糖注射液作为孵化液不利于细胞的存活。

实施例7不同孵化注射液对免疫细胞的存活影响和孵化时间测试

1、不同孵化注射液对免疫细胞的存活影响

不同孵化液制备的细胞保护液对细胞的保护能力有不同的影响，因此取制备的保护液与细胞进行24h孵化，观察不同孵化液对细胞的影响。

实验流程：取适量高活性的免疫细胞用生理盐水清洗两次去除残余培养基，取适量的所制备的细胞保护液作为细胞重悬液与免疫细胞进行混合重悬，置于1-10℃的环境中保存24h，24h后混匀取10ul的细胞悬液与10ul的台盼蓝染色液混合进行染色，通过细胞计数仪对细胞活率进行计算。

分别利用不同的孵化液种类探究对免疫细胞活性影响，结果如图11所示。结论：不同孵化液对细胞的保护效果不同，葡萄糖注射液对细胞球中细胞的状态保持更好，，但免疫细胞的细胞活率明显下降，说明该葡萄糖孵化液并不是对免疫细胞起到保护作用。

2、孵化时间测试

为了验证细胞球在最佳条件下可以存活的时间进行了测试。

实验流程：用0.125％胰酶消化培养中的细胞，取出适量的细胞按照实施例2中悬滴法的方法制备成细胞球，在5％CO2的培养箱中进行培养48h培养，之后将细胞球进行收集，用生理盐水对细胞球进行清洗去除残余培养基，按照下表13进行分组，在林格氏液中进行不同时间的孵化，之后取出适量的细胞球用DAPI/PI对细胞的存活/死亡状态进行染色，并在显微镜下进行观察。

表13

附图12展示了A-D组的细胞球形态。结论：细胞球在长时间的孵化过程中可长时间的保持细胞活率，直至组别C以前通过活细胞染色证明细胞球仍具有高活性，而到组别D的时间点细胞会被死细胞染色剂PI染上色，说明细胞球在组别D之前均处于细胞存活的状态。

实施例8细胞球孵化后的鉴定

细胞球经过培养后为鉴定细胞球中细胞是否仍为MSCs细胞，对细胞球的细胞进行鉴定。

实验流程：按照细胞球制备方法制备细胞球，在1-10℃的环境中孵化7天后将细胞球取出，将细胞球分成3份，第一份中加入MSC培养基，转入培养瓶中，置于含有5％CO2的37℃培养箱中进行培养。3天后观察细胞球中的细胞是否发生贴壁。第二份细胞球用0.125％胰酶进行消化，消化后用培养基进行终止，用生理盐水对消化的细胞进行清洗，之后用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测。第三份细胞球用0.125％胰酶进行消化，消化后用培养基终止，之后用生理盐水对细胞进行清洗，之后将细胞分别接种到成脂分化培养基、成骨分化培养基和成软骨分化培养基中，根据分化试剂盒说明书对MSC进行分化培养，最后用分化试剂盒中的染色剂对分化结果进行鉴定。表14展示了细胞鉴定方法。

表14

图13展示了细胞球在正常培养瓶中结果图，图14MSCs表型流式检测图，图15分别展示了成脂分化鉴定(A图)、成软骨分化鉴定(B图)和成骨分化鉴定(C图)结果。结论：细胞球经过3D培养后仍具备MSCs的特征，说明MSCs细胞在3D培养的过程中没有发生分化。

实施例9细胞球悬液保护效果实验

对细胞保护液对细胞保存效果进行测试。

实验流程：制备成细胞球悬液，取出适量的冷冻保存的MSC细胞，在水浴锅中快速复溶，加到10ml的生理盐水中，清洗两次，用细胞计数仪对细胞进行计数，取出下表15所需的MSC细胞分成4组，分别用1ml的林格氏液和细胞球悬液作为重悬液对细胞进行重悬，之后将细胞保存于1-10℃的冰箱中保存，每隔一段时间从样品中取10ul的样品与10ul的台盼蓝染色液进行混合，用细胞计数仪对低浓度和高浓度保存细胞的活率和细胞数量进行计算。

表15

表16

表17

表17展示了悬液对MSCs的保护实验结果，图16展示了悬液中MSCs的计数图。

细胞球悬液对免疫细胞也具有一定的保护作用。表18展示了悬液对免疫细胞的保护作用实验结果，表19展示了悬液用于高浓度细胞重悬液的保护作用实验

表18

表19

结论：悬液对MSCs和免疫细胞均具有延长细胞在重悬液中的活率保持时间，而高浓度细胞保存实验结果，在4*10^7的浓度下在18h仍能保持79％的细胞活率，而细胞在2*10^7浓度下仍能在24小时保持大于80％的活率，而常规临床上使用的细胞密度为1-2*10^6/mL。本产品具有更好的应用范围。

实施例10不同细胞源测试

经过成球后孵化的盐水具有的功能，我们推测在其他间充质类型的细胞可能也具有类似效果，使用人成纤维母细胞作为对象进行进一步的测试该方案。

实验流程：用胰酶消化在培养瓶中生长的成纤维细胞，用培养上清终止消化，制备成纤维细胞球的细胞保护液。取出适量的冷冻保存的成纤维细胞，在水浴锅中快速复溶，加到10ml的生理盐水中，清洗两次，用细胞计数仪对细胞进行计数，取出下表20所需的成纤维细胞分成2组，分别用1ml的林格氏液和细胞球悬液作为重悬液对细胞进行重悬，之后将细胞保存于1-10℃的冰箱中保存，每隔一段时间从样品中取10ul的样品与10ul的台盼蓝染色液进行混合，用细胞计数仪对低浓度和高浓度保存细胞的活率和细胞数量进行计算。

表20成纤维细胞球悬液

表20结果表明，对同是间充质类的成纤维母细胞使用本方案产生的悬液与MSCs悬液具有相类似的效果。

实施例11细胞球悬液毒性实验

为了测试该方案下MSC球悬液是否对细胞有毒性，通过CCK-8测试本保护液对人肝细胞是否存在毒性。

实验流程：复苏人肝细胞，用肝细胞培养基培养至肝细胞成熟，按照实施例7制备成MSC球细胞悬液。将肝细胞培养孔中的培养基清除，加入新鲜的肝细胞培养基，之后加入等比例的细胞悬液到样品孔中，阴性对照孔添加林格氏液，阳性孔中除了添加等比例的林格氏液外再添加对肝细胞有毒性作用的环孢菌素A。在培养箱中孵化24h后每个孔中添加CCK-8.接着放回培养箱中继续孵化2h。之后将细胞板取出，用酶标仪对吸光度进行测试，计算肝细胞的活性。实验设计如下表21所示。结果见图17，表明细胞球悬液对肝细胞及免疫细胞无毒性。

表21

实施例12

取出冻存的成纤维细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，取样后离心。根据细胞计数的结果将离心好的成纤维细胞用含有5％FBS的DMEM培养基重悬接种至新的培养瓶中，并补充含有5％FBS 10ml的DMEM培养基，置于37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长至70％-80％的程度用0.125％的胰酶进行消化，消化时间为3分钟，用培养上清进行终止消化，消化后的细胞用生理盐水进行2遍清洗，之后用添加了5％FBS的DMEM培养基进行重悬，重悬浓度为1w细胞/30ul。重悬后用30ul的排枪将细胞重悬液滴至60mm平皿的内面盖子上，培养皿中加入少量的DPBS，快速将含有细胞重悬液的盖子翻转盖上，将培养皿缓慢放入培养箱中培养，培养箱条件为37℃5％CO2.培养2天待细胞形成细胞球后将细胞球转入低吸附板中添加适量培养基放入培养箱中培养一天，24h后收集细胞球，用pbs清洗2次，之后用生理盐水进行重悬，放入1-10℃冰箱中孵化，重悬液浓度为300个细胞球/50ml，在冰箱中放置4-9天。用0.22um滤网对孵化的生理盐水进行过滤，过滤后冷冻备用。

使用制剂准备：将细胞保护液提前取出置于1-10℃冰箱中解冻备用。取出冻存的成纤维细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，离心，离心完成后按照1-2*10^7细胞/ml的浓度添加细胞保护液，重悬细胞，制备成针剂，放入0℃-15℃的保温箱中即可长途运输并直接使用，细胞球悬液制备流程如图1所示。

实施例13

取出冻存的MSC细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，取样后离心。离心后去除上清，用MSC培养基进行重悬，然后根据细胞计数结果按照5000-7000个细胞/cm2的密度接种至培养瓶中，每个培养瓶中添加MSC培养基至10ml。转移到37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长至70％-80％的程度进行消化，消化胰酶使用浓度为0.125％，消化时间为3分钟，消化后的细胞用生理盐水进行2遍清洗，之后用MSC培养基进行重悬，重悬浓度为1w细胞/30ul。重悬后用30ul的排枪将细胞重悬液滴至60mm平皿的内面盖子上，培养皿中加入少量的DPBS，快速将含有细胞重悬液的盖子翻转盖上，将培养皿缓慢放入培养箱中培养，培养箱条件为37℃5％CO2.培养2天待细胞形成细胞球后将细胞球转入低吸附板中添加适量培养基放入培养箱中培养一天，培养后收集细胞球，用pbs清洗2次，之后用生理盐水进行重悬，放入1-10℃冰箱中孵化，重悬液浓度为300细胞球/50ml，在冰箱中放置4-9天。用0.22um滤网对培养的生理盐水进行过滤，之后冻存备用。

使用制剂准备：将细胞保护液提前取出置于1-10℃冰箱中解冻备用。取出冻存的成纤维细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，离心，离心完成后按照1-2*10^7细胞/ml的浓度添加细胞保护液，重悬细胞，制备成针剂，放入0℃-15℃的保温箱中即可长途运输并直接使用。

实施例14

取出冻存的成纤维细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，取样后离心。根据细胞计数的结果将离心好的成纤维细胞用含有5％FBS的DMEM培养基重悬接种至新的培养瓶中，并补充含有5％FBS 10ml的DMEM培养基，置于37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长至70％-80％的程度用0.125％的胰酶进行消化，消化时间为3分钟，用培养上清进行终止消化，消化后的细胞用生理盐水进行2遍清洗，之后用添加了5％FBS的DMEM培养基进行重悬，重悬浓度为2w细胞/30ul。重悬后用30ul的排枪将细胞重悬液滴至60mm平皿的内面盖子上，培养皿中加入少量的DPBS，快速将含有细胞重悬液的盖子翻转盖上，将培养皿缓慢放入培养箱中培养，培养箱条件为37℃5％CO2.培养2天待细胞形成细胞球后将细胞球转入低吸附板中添加适量培养基放入培养箱中培养一天，培养后收集细胞球，用pbs清洗2次，之后用林格氏液进行重悬，放入1-10℃冰箱中孵化，重悬液浓度为300细胞球/50ml，在冰箱中放置4-9天。用0.22um滤网对培养的林格氏液进行过滤，过滤后冻存备用。

实施例15

取出冻存的成纤维细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，取样后离心。根据细胞计数的结果将离心好的成纤维细胞用含有5％FBS的DMEM培养基重悬接种至新的培养瓶中，并补充含有5％FBS 10ml的DMEM培养基，置于37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长至70％-80％的程度用0.125％的胰酶进行消化，消化时间为3分钟，用培养上清进行终止消化，消化后的细胞用生理盐水进行2遍清洗，之后用添加了5％FBS的DMEM培养基进行重悬，重悬浓度为1w细胞/30ul。重悬后用30ul的排枪将细胞重悬液滴至60mm平皿的内面盖子上，培养皿中加入少量的DPBS，快速将含有细胞重悬液的盖子翻转盖上，将培养皿缓慢放入培养箱中培养，培养箱条件为37℃5％CO2.培养2天待细胞形成细胞球后将细胞球转入低吸附板中添加适量培养基放入培养箱中培养1天，培养后收集细胞球，用pbs清洗2次，之后用林格氏液进行重悬，置于10℃-30℃孵化，重悬液浓度为300细胞球/50ml，放置4-9天。用0.22um滤网对培养的林格氏液进行过滤，过滤后的林格氏液在成纤维细胞复苏或者传代消化后作为细胞的最后重悬液使用，按照1-2*10^7细胞/ml的浓度制备成针剂，放入0℃-15℃的保温箱中即可长途运输并直接使用。

实施例16

取出冻存的成纤维细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，取样后离心。根据细胞计数的结果将离心好的成纤维细胞用含有5％FBS的DMEM培养基重悬接种至新的培养瓶中，并补充含有5％FBS 10ml的DMEM培养基，置于37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长至70％-80％的程度用0.125％的胰酶进行消化，消化时间为3分钟，用培养上清进行终止消化，消化后的细胞用生理盐水进行2遍清洗，之后用添加了5％FBS的DMEM培养基进行重悬，重悬浓度为2w细胞/30ul。重悬后用30ul的排枪将细胞重悬液滴至60mm平皿的内面盖子上，培养皿中加入少量的DPBS，快速将含有细胞重悬液的盖子翻转盖上，将培养皿缓慢放入培养箱中培养，培养箱条件为37℃5％CO2.培养2天待细胞形成细胞球后将细胞球转入低吸附板中添加适量培养基放入培养箱中培养一天，培养后收集细胞球，用pbs清洗2次，之后用生理盐水进行重悬，放入0℃冰箱中孵化，重悬液浓度为300细胞球/50ml，在冰箱中放置4-9天。用0.22um滤网对培养的生理盐水进行过滤，过滤后冻存备用。

实施例17

取出冻存的间充质干细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，取样后离心。根据细胞计数的结果将离心好的成纤维细胞用MSC培养基重悬接种至新的培养瓶中，并补充至10ml的MSC培养基，置于37℃5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长至70％-80％的程度用0.125％的胰酶进行消化，消化时间为3分钟，用培养上清进行终止消化，消化后的细胞用生理盐水进行2遍清洗，之后用MSC培养基进行重悬，重悬浓度为2w细胞/30ul。重悬后用30ul的排枪将细胞重悬液滴至60mm平皿的内面盖子上，培养皿中加入少量的DPBS，快速将含有细胞重悬液的盖子翻转盖上，将培养皿缓慢放入培养箱中培养，培养箱条件为37℃5％CO2.培养2天待细胞形成细胞球后将细胞球转入低吸附板中添加适量培养基放入培养箱中培养一天，培养后收集细胞球，用pbs清洗2次，之后用林格氏液进行重悬，放入1-10℃冰箱中孵化，重悬液浓度为300细胞球/50ml，在冰箱中放置4-9天。用0.22um滤网对培养的林格氏液进行过滤，过滤后冻存备用。

使用制剂准备：将细胞保护液提前取出置于1-10℃冰箱中解冻备用。取出冻存的间充质干细胞在已预热至37℃的水浴锅中进行复溶，转移至10ml的生理盐水中，离心，去除上清液，再次加入生理盐水，重悬，取样做细胞计数，离心，离心完成后按照1-2*10^7细胞/ml的浓度添加细胞保护液，重悬细胞，制备成针剂，放入0℃-15℃的保温箱中即可长途运输并直接使用。

实施例18

图18展示了采用本发明实施例12-17中方法制备获得的1w细胞经过两天的培养转移到低吸附板中的细胞球形态，图19展示了采用本发明实施例方法制备获得的1w细胞经过7天的孵化后细胞通过染色鉴定细胞球内细胞均存活。图20展示了采用本发明实施例方法制备获得的细胞球置于贴壁板中仍能具有贴壁性能。图21展示了采用本发明实施例方法制备获得的成球后的间充质干细胞在经过培养后通过流式鉴定，细胞仍然表达间充质干细胞的标准标志物。

表22展示了生理盐水与成纤维细胞球悬液作为复苏细胞的悬浮液随时间变长其细胞活率及细胞数量变化。

表22

表23展示了林格氏液与MSCs细胞球悬液作为复苏细胞的悬浮液随时间变长其细胞活率及细胞数量变化。

表23

图22展示了20h后MSCs用台盼蓝染色后细胞状态，图23展示了MSCs悬液对免疫细胞的抑制作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括：

(1)制备3D细胞球；

其中，所述孵化的温度为0℃-37℃，孵化时间为2h-170h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述3D细胞球中含有的细胞选自间充质细胞；

任选地，所述3D细胞球中含有的细胞选自所成纤维母细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的至少之一。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述3D细胞球的形成方法包括自成球和载体成球。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，对所述3D细胞球进行重悬时所用的重悬液选自氯化钠注射液、复方氯化钠注射液、乳酸钠林格注射液、葡萄糖注射液中的至少之一。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备3D细胞球的方法包括：

1)取出冻存的细胞进行复溶和重悬；

2)将重悬后的所述细胞在含有4-8％FBS的DMEM培养基中培养；

3)对培养后的所述细胞进行胰酶消化，获得消化后的细胞；

4)将所述消化后的细胞进行重悬，获得细胞重悬液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述3D细胞球中含有的细胞选自间充质细胞；

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，利用生理盐水对所述消化后的细胞进行重悬，重悬浓度为0.8-1.2万个细胞/30ul。

8.一种细胞保存液，其特征在于，通过权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备获得。

9.一种针剂，其特征在于，含有权利要求8所述的细胞保存液。

10.一种针剂的保存方法，其特征在于，包括将针剂中含有的细胞重悬在权利要求8所述的细胞保存液中，其中，所述细胞保存液中细胞的浓度为1-2*10^7个细胞/ml。